Способ оценки персонифицированной радиочувствительности человека на основе определения реакции его гемопоэтических стволовых клеток на радиационное воздействие с использованием гуманизированных мышей Российский патент 2024 года по МПК G01N33/577 

Изобретение относится к медицине, в частности, к исследованиям биологических материалов путем физического анализа крови и может использоваться в радиационной медицине и онкологии.

Известен «Способ определения индивидуальной чувствительности генома человека к воздействию радона», представленный в п. РФ №2415427.

Известный способ характеризуется следующей формулой.

«Способ определения индивидуальной чувствительности генома человека к воздействию радона, включающий определение полиморфных маркеров генов-кандидатов, путем генотипического исследования крови человека, отличающийся тем, что определяют предрасполагающие и протективные генотипы генов-кандидатов: маркер Arg280His гена XRCC1 - предрасполагающий генотип Arg/Arg, протективный генотип Arg/His; маркер Arg194Trp гена XRCC1 - предрасполагающий генотип Arg/Arg, протективный генотип Arg/Trp; маркер Asnl48Glu гена АРЕ1 -предрасполагающий генотип Glu/Glu, протективные генотипы Asn/Asn, Asn/Glu; маркер A2455G гена CYP1A1 - предрасполагающий генотип A/G, протективные генотипы А/А и G/G; маркер делеция в гене GSTM1 - предрасполагающий генотип о/о, протективный +, и делают заключение о высокой индивидуальной чувствительности к действию повышенных доз радона при количественном преобладании предрасполагающих генотипов или равном количестве предрасполагающих и протективных генотипов, а о высокой индивидуальной устойчивости к воздействию повышенных доз радона - при количественном преобладании протективных генотипов.

Недостатком известного способа является то, что производимая с его помощью оценка совокупности полиморфизмов генов ферментов репарации ДНК и биотрансформации ксенобиотиков, хотя и позволяет определять потенциальный риск формирования хромосомных аберраций у лиц, подвергающихся воздействию природной радиации и может использоваться для оценки индивидуальной чувствительности к действию радона внутри жилых помещений, так и в промышленных условиях, например у шахтеров, работающих в условиях воздействия очень высоких доз радона, однако все же не является достоверно персонифицированной, потому что делается одноразово в условиях природной радиации. К тому же способ является достаточно сложным.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является способ использования мышей линии NOD SCID в качестве модели для радиобиологических исследований клеток человека in vivo, представленный в ст.Атаманюк Н.И. и др. «Оценка возможности использования химер человек- мышь на основе линии NOD SCID для радиобиологических исследований клеток крови человека» в журн. «Вопросы радиационной безопасности», 2019 г, №1, стр. 58-68 и выбранный в качестве прототипа.

Известный способ заключается в следующем.

Берут человека - донора, производят забор у него периферической крови, из которой выделяют лейкоциты, затем формируют 4 группы гуманизированных мышей линии NOD SCID, три из них подвергают ионизирующему облучению (γ - облучение) в дозе 0,5 Гр или 1 Гр либо 2 Гр, другую группу - ложному облучению в дозе 0 Гр, затем вводят им внутрибрюшинно лейкоциты человеческой крови этого донора, выдерживают облученных мышей несколько суток, берут у них периферическую кровь из хвостовой вены, подсчитывают в ней количество лейкоцитов и эритроцитов производят идентификацию человеческих и мышиных лейкоцитов методом проточной цитофлуорометрии, определяют снижение числа лейкоцитов и эритроцитов периферической крови, умерщвляют обе группы мышей, извлекают их бедренную кость, вымывают из нее костный мозг и суспензируют до получения равномерной взвеси клеток затем также производят подсчет лейкоцитов и сравнивают количество числа лейкоцитов в кроветворных органах (селезенке и костном мозге) облученных мышей и ложнооблученных мышей, анализируя приживляемость человеческих клеток.

Принцип использования химер здесь состоит в следующем: после приживления человеческих клеток животное подвергается действию изучаемого фактора (определенный тип излучения, химический агент, лекарственный препарат), через некоторое время после воздействия человеческие клетки выделяются из крови мыши путем позитивной или негативной селекции и используются для оценки ожидаемого эффекта (например, такие показатели как радиационно-индуцированные повреждения ДНК, эффективность систем репарации, апоптоз, иммунологинческие реакции). В данном способе оценивается эффективность приживления человеческих клеток периферической крови при внутрибрюшинном введении, влияние дозы облучения на радиационно-индуцированные повреждения клеток человека.

Приживление человеческих клеток крови у иммунодефицитных мышей дает возможность исследовать в эксперименте влияние ионизирующего излучения, химических агентов, комбинированного действия различных факторов на выживаемость и состояние человеческих клеток в модели in vivo. После воздействия исследуемого фактора на химерное животное из крови мыши можно выделять человеческие клетки и оценивать в них интересующие параметры, такие как степень повреждения ДНК, эффективность работы систем репарации, функционирование определенных генов и т.п. Такие модели могут быть использованы также в целях отбора и тестирования лекарственных средств защиты человека от ионизирующих излучений.

Недостатком известного решения является невозможность его конкретного практического применения, оно предназначено чисто для исследовательских целей.

Задачей является разработка технического решения для конкретного практического применения гуманизированных мышей, в частности, для оценки персонифицированной радиочувствительности человека.

Поставленная задача решается тем, что предложен способ оценки персонифицированной радиочувствительности человека на основе определения реакции его гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) на радиационное воздействие с использованием гуманизированных мышей, заключающийся в том, что берут человека-донора, получают определенные клетки его крови, которые вводят группе гуманизированных мышей линий с тяжелым комбинированным иммунодефицитом, которых подвергают ионизирующему облучению в дозе 0,5 Гр, выдерживают облученных мышей несколько суток, берут у них кровь, идентифицируют человеческие клетки крови, подсчитывают их количество и делают выводы по итогам эксперимента, ОТЛИЧАЮЩИЙСЯ тем, что от человека-донора получают гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) и вводят их мышам, облучение которых производят сразу после трансплантации этих клеток, затем измеряют доли ГСК (CD45lowCD34+ клеток) среди всех лейкоцитарных (CD45low/+) клеток человека в большой берцовой кости мышей на 3-и и 14-ые сутки после облучения; производят расчет отношения доли ГСК среди всех лейкоцитарных клеток человека на 14-е сутки к этому показателю на 3-й сутки в виде коэффициента К14/3, при этом более высокое значение коэффициента ассоциировано с более высокой радиорезистентностью, затем клетки ГСК человека и, соответственно кроветворной системы и организма человека в целом, относят к радиорезистентным, если коэффициент К14/3 больше 2,5 или к радиочувствительным, если коэффициент К14/3 меньше 2,5.

При этом гемопоэтические стволовые клетки крови (ГСК) могут выделять из периферической крови человека - донора методом иммуномагнитной сепарации клеток CD34⁺, либо получать их из материала биопсии костного мозга или из материала биопсии костного мозга либо путем лейкафереза после мобилизации ГСК или без мобилизации или выделять методом клеточного сортинга активируемого флуоресценцией или получать иными методами антител-опосредованной сортировки клеток

Кроме того, ГСК могут вводить мышам внутривенно либо в костномозговой канал их большой берцовой кости.

При этом мышей могут подвергать однократному внешнему общему рентгеновскому облучению или однократному внешнему гамма-облучению

Получение в заявляемом способе от человека-донора гемопоэтических стволовых клетки (ГСК) и введение их мышам, облучение которых производят сразу после трансплантации этих клеток, с последующим измерением доли ГСК (CD45lowCD34 + клеток) среди всех лейкоцитарных (CD45low/+) клеток человека в большой берцовой кости мышей на 3-й и 14-е сутки после облучения в совокупности с проведением расчета отношения доли ГСК среди всех лейкоцитарных клеток человека на 14-е сутки к этому показателю на 3-й сутки в виде коэффициента К14/3, при том, что более высокое значение коэффициента ассоциировано с более высокой радиорезистентностью, дает возможность отнести затем клетки ГСК человека и, соответственно кроветворной системы и организма человека в целом, к радиорезистентным, если коэффициент К14/3 больше 2,5 или к радиочувствительным, если коэффициент К14/3 меньше 2,5, обеспечивая тем самым получение персонифицированной оценки радиочувствительности человека.

Технический результат - получение персонифицированной оценки радиочувствительности человека.

Заявляемый способ обладает новизной в сравнении с прототипом, отличаясь от него такими существенными признаками как получение от человека-донора гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), введение их мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом внутривенно или в костномозговой канал большой берцовой кости, проведение облучения мышей сразу после трансплантации этих клеток, измерение доли ГСК (CD45lowCD34+ клеток) среди всех лейкоцитарных (CD45low/+) клеток человека в большой берцовой кости мышей на 3-й и 14-е сутки после облучения; проведение расчета отношения доли ГСК среди всех лейкоцитарных клеток человека на 14-е сутки к этому показателю на 3-й сутки в виде коэффициента К14/3, при том, что более высокое значение коэффициента ассоциировано с более высокой радиорезистентностью, клетки ГСК человека и, соответственно кроветворной системы и организма человека в целом относят к радиорезистентным, если коэффициент К14/3 больше 2,5 или к радиочувствительным, если коэффициент К14/3 меньше 2,5, обеспечивающими достижение заданного результата..

Заявителю неизвестны технические решения, обладающие указанными отличительными признаками, которые давали бы в совокупности достижение заявленного результата, поэтому он считает, что заявляемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ может найти широкое применение в радиационной медицине и онкологии и потому соответствует критерию «промышленная применимость».

Изобретение иллюстрируется графиком, где показан коэффициент для краткосрочных моделей периферической и пуповинной крови. (А - модели ГСК периферической и пуповинной крови; Б - объединенные данные).

Заявляемый способ заключается в следующем.

Получают от человека-донора гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) и вводят их мышам, облучение которых производят сразу после трансплантации этих клеток. Затем измеряют доли ГСК (CD45lowCD34+ клеток) среди всех лейкоцитарных (CD45low/+) клеток человека в большой берцовой кости мышей на 3-й и 14-е сутки после облучения. Далее производят расчет отношения доли ГСК среди всех лейкоцитарных клеток человека на 14-е сутки к этому показателю на 3-и сутки в виде коэффициента К14/3. Учитывают тот факт, что более высокое значение коэффициента ассоциировано с более высокой радиорезистентностью и затем клетки ГСК человека и, соответственно кроветворной системы и организма человека в целом, относят к радиорезистентным, если коэффициент К14/3 больше 2,5 или к радиочувствительным, если коэффициент К14/3 меньше 2,5.

При этом гемопоэтические стволовые клетки крови (ГСК) могут выделять из периферийной крови человека-донора методом иммуномагнитной сепарации клеток CD34⁺, либо получать их из материала биопсии костного мозга или из материала биопсии костного мозга либо путем лейкафереза после мобилизации ГСК или без мобилизации или выделять методом клеточного сортинга активируемого флуоресценцией или получать иными методами антител-опосредованной сортировки клеток

Кроме того, ГСК могут вводить мышам внутривенно либо в костномозговой канал их большой берцовой кости.

На практике способ выполняют в следующей последовательности:

Производят подготовку суспензии ГСК клеток человека для трансплантации мышам следующим образом.

ГСК идентифицируют как клетки с низкой экспрессией CD45 (CD45^low) и высокой экспрессией CD34 (CD34⁺) методом проточной цитометрии.

Рекомендуется вводить не менее 50 тысяч ГСК на одно животное, общее количество ГСК, полученное от одного обследуемого лица, должно составлять не менее 200 тысяч клеток.

ГСК необходимо выделять из мобилизованной или немобилизованной периферической крови обследуемых лиц [8]. Забор крови должен происходить с использованием шприцов, пробирок или систем для сбора крови, содержащих антикоагулянт.Возможны разные способы получения достаточного количества ГСК из периферической крови: забор венозной крови или использование продукта лейкафереза [8] из расчета получения 200-400 тысяч CD45^lowCD34⁺ клеток. После забора кровь необходимо хранить до выделения ГСК при температуре +4°С не более 4 часов, если не используются системы для сбора крови, содержащие консерванты.

ГСК периферической крови можно получать из суспензии мононуклеарных клеток методом иммуномагнитной сепарации клеток [9] или методом клеточного сортинга активируемого флуоресценцией [10], или иными методами антител-опосредованной сортировки клеток, соблюдая правила асептики и антисептики. Принцип методов основан на том, что целевые клетки специфически взаимодействуют с антителами к CD34.

После сепарации клеток необходимо определить количество CD34⁺ клеток в полученной клеточной суспензии. Следует использовать метод проточной цитометрии для подсчета количества CD45^lowCD34⁺ и CD45⁺CD34^- клеток. Доля CD45^lowCD34⁺ клеток должна составлять не менее 80% от количества всех CD45⁺ клеток.

Суспензию клеток, полученную после сепарации, необходимо однократно отмыть в питательной среде 199 - центрифугировать при 1500 об./мин. в течение 10 минут, слить надосадочную жидкость, осадок ресуспендировать в среде 199 до объема 200 мкл.

Далее выполняют трансплантацию ГСК человека мышам.

ГСК человека вводят мышам после облучения в большую берцовую кость через проксимальный эпифиз иглой с диаметром 30 G, обрабатывая поверхность кожи антисептиком до и после манипуляции. Для каждого животного используется индивидуальный шприц. Манипуляции производят с соблюдением правил асептики и антисептики.

Объем вводимой суспензии должен составлять не более 50 мкл на одно животное.

Процедура введения клеток требует наркотизации с помощью изофлуранового или другого наркоза [11].

Допускается хранение полученной после сепарации клеток суспензии ГСК человека не более 3 часов при температуре +4°С до трансплантации.

После трансплантации животное следует поместить в домашнюю клетку для постоянного содержания, снабженную этикеткой. Этикетка должна содержать следующую информацию: дату трансплантации, дозу облучения, закодированную информацию о доноре ГСК и количество введенных ГСК. При содержании в одной клетке животных, облученных до введения ГСК и облученных после введения ГСК, требуется индивидуальная маркировка мышей с помощью нанесения меток специальными маркерами или бирок [12].

После трансплантации производят облучение животных

Животных следует облучать через 20-30 минут после трансплантации ГСК.

Следует проводить равномерное внешнее гамма- или рентгеновское облучение с неравномерностью поля менее 10% и мощностью дозы не менее 20 сГр/мин.

Доза облучения составляет 0,5 Гр.

Перемещение животных из клеток постоянного содержания в установку для облучения следует выполнять, соблюдая правила асептики и антисептики: животных рекомендовано пересадить в стерильные контейнеры в чистом помещении или в ламинарном шкафу.

После облучения животные и контейнеры для их транспортировки не имеют остаточной радиации и не представляют опасности для персонала.

Для проведения анализа показателей выполняют следующие операции.

Для анализа необходимо получить костный мозг из большой берцовой кости, в которую производилась инъекция клеток. Костный мозг извлекают путем промывания кости 1 мл раствора хлорида натрия 0,9%.

В суспензии клеток костного мозга методом проточной цитометрии необходимо измерить CD45^lowCD34⁺ и CD45⁺ клеток человека в костном мозге.

Доля ГСК человека рассчитывается как отношение числа CD45^lowCD34⁺ клеток к сумме CD45^lowCD34⁺ клеток и CD45⁺CD34^- клеток человека, выраженное в процентах.

Коэффициент К14/3 рассчитывается как отношение доли ГСК человека на 14 сутки после облучения к доле ГСК человека на 3 сутки после облучения.

Для получения итоговых выводов производится следующая интерпретация результатов.

Чем выше коэффициент К14/3, тем более резистентным является система гемопоэза и, соответственно, организма к действию острого гамма-облучения.

Клетки ГСК человека и, соответственно кроветворной системы и организма человека в целом, относят к радиорезистентным, если коэффициент К14/3 больше 2,5.

Клетки ГСК человека и, соответственно кроветворной системы и человека в целом, относят к радиочувствительным если коэффициент К14/3 меньше 2,5.

В целях радиационной защиты выбор персонала, привлекаемого к выполнению работ, связанных с планируемым повышенным облучением, должен проходить на основе сравнительного анализа коэффициента К14/3 претендентов, отдавая предпочтение лицам с более высокими значениями коэффициента.

Для онкологических больных, которым показана лучевая терапия оценка индивидуальной радиочувствительности проводится до начала лучевой терапии с целью корректировки лечения и предупреждения развития нежелательных реакций со стороны здоровых органов и тканей. При этом для пациентов, клетки ГСК и, соответственно, кроветворной системы которых были отнесены к радиочувствительным, требуется корректировка лучевой терапии в сторону ее смягчения и применение мероприятий, направленных на профилактику осложнений здоровых органов и тканей.

Пример 1.

Для получения гуманизированных мышей использовали иммунодефицитных мышей линии NOD SCID из питомника SPF-вивария ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск.

Животным вводили ГСК из периферической крови и пуповинной крови. ГСК получали из проб пуповинной крови, отобранных в ГБУЗ Областной Перинатальный Центр, а также из продукта периферической донорской крови - лейкотромбослоя, изготовленного ГБУЗ Станция переливания крови ФМБА России в г. Челябинск. ГСК выделяли из крови методом иммуномагнитной сепарации с помощью набора EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II (Stem Cell Technologies, Канада), идентифицировали как CD45^lowCD34⁺ клетки.

ГСК, полученные из периферической крови, вводили внутрикостно в большую берцовую кость мышам после изофлуранового наркоза. ГСК, полученные от каждого донора, вводили в равном количестве 4 мышам (от 30 до 115 тыс. клеток на каждое животное). Всех мышей облучали после введения ГСК. Облучение проводили в дозах 0,5, 1 и 1,5 Гр (по шесть доноров на каждую дозу). У двух мышей измеряли содержание клеток человека через 3 суток и еще у двух мышей - через 14 суток после облучения. Облучение проводили на исследовательской радиобиологической гамма-установке ИГУР-1М (¹³⁷Cs-источники, мощность дозы 0,91 Гр/мин).

Методом проточной цитометрии в костном мозге мышей измеряли количество человеческих лейкоцитарных CD45⁺ клеток (окраска моноклональными мышиными антителами антиCD45-FITC, клон HI30, Stem Cell Technologies, Канада) и человеческих стволовых CD45^lowCD34⁺ клеток (окраска моноклональными мышиными антителами антиCD34-АРС, клон 581, Stem Cell Technologies, Канада). Измерения проводили на цитометре Accuri С6 (BD Biosciences, США). Рассчитывали процентное содержание ГСК от общего количества всех CD45^low/+ клеток человека для каждого гуманизированного животного. Также определяли коэффициент, равный отношению доли ГСК на 14 сутки после облучения к доле ГСК на 3 сутки после облучения (К_14/3), т.к. ранее этот показатель продемонстрировал связь с выживаемостью животных и репопуляцией клеток в костном мозге у негуманизированных мышей in vivo [13].

Для исследуемых показателей рассчитывали среднее значение и стандартную ошибку. Проводили регрессионный анализ для выявления зависимости исследуемых показателей от дозы с помощью программного пакета Microsoft office Excel. Коэффициенты уравнений в моделях регрессии сравнивали с помощью t-критерия Стьюдента. Результаты принимали статистически значимыми при вероятности нулевой гипотезы р<0,05.

Рассчитанный изменения доли ГСК на 14 сутки по отношению к доле ГСК на 3 сутки после облучения коэффициент К_14/3 имел линейную зависимость от дозы. Такая зависимость статистически значимо не отличалась для ГСК, полученных из периферической крови по сравнению с реакцией на облучение ГСК, полученных из пуповинной крови. Было выявлено, что коэффициент К_14/3 линейно снижается с повышением дозы гамма облучения (R²=0,35; F=8,07; р=0,01). На рисунке видно, что в каждой дозовой группе были доноры, характеризующиеся более высокими коэффициентами К_14/3, а наибольшие индивидуальные отличия коэффициента отмечаются при облучении в дозе 0,5 Гр. На рисунке приведен коэффициент для краткосрочных моделей периферической и пуповинной крови. А - модели ГСК периферической и пуповинной крови; Б - объединенные данные.

Снижение К_14/3 с дозой указывает на то, что коэффициент может быть использован для описания биологической реакции кроветворной ткани на облучение и что более низкие значения показателя ассоциированы с более выраженным влиянием ионизирующего излучения. Показатель К_14/3 рассматривается как интегральный показатель, отражающий изменение относительной доли ГСК среди других кроветворных клеток, а следовательно, связанный с выживаемостью ГСК и их репопуляцией, а также с количеством созревающих CD45⁺ клеток. Ассоциация более высокого значения К_14/3 с меньшими уровнями дозы и с более высокой радиорезистентностью может быть связана с более эффективной репопуляцией ГСК после облучения, более высоким пролиферативным потенциалом и более эффективным восстановлением пула стволовых клеток до того, как будут запущены процессы дифференцировки, созревания CD45⁺ клеток.

Как видно из рисунка, при облучении гуманизированных животных в дозе 0,5 Гр индивидуальные различия реакции ГСК человека являются более выраженными, чем при облучении в более высоких дозах. При этом персонифицированную реакцию ГСК человека на облучение в дозе 0,5 Гр в модели облученных гуманизированных мышей, для которой значение коэффициента К14/3 больше 2,5 можно интерпретировать как проявление радиорезистентности и, наоборот, реакцию ГСК, для которых значение коэффициента К14/3 меньше 2,5 можно интерпретировать как проявление радиочувствительности.

В сравнении с прототипом заявляемый способ дает возможность получить персонифицированную оценку радиочувствительности человека.

Изобретение относится к медицине, в частности к исследованиям биологических материалов путем физического анализа крови, и может использоваться в радиационной медицине и онкологии. Способ оценки персонифицированной радиочувствительности человека на основе определения реакции его гемопоэтических стволовых клеток на радиационное воздействие с использованием гуманизированных мышей заключается в том, что от человека-донора получают гемопоэтические стволовые клетки - ГСК и вводят их мышам в количестве от 30 до 115 тыс. клеток на каждое животное внутрикостно в большую берцовую кость. Через 20-30 минут после трансплантации клеток животных подвергают гамма-облучению в дозе 0,5 Гр с мощностью дозы 0,91 Гр/мин. Затем на 3-и и 14-е сутки после облучения измеряют долю ГСК CD45^lowCD34⁺ клеток среди лейкоцитарных CD45^low/+ клеток человека в пробе костного мозга, взятого из большой берцовой кости мышей, в которую производилась инъекция ГСК. Производят расчет отношения доли ГСК на 14-е сутки к показателю на 3-и сутки в виде коэффициента К14/3 и делают вывод о радиочувствительности, если коэффициент меньше 2,5, и о радиорезистентности, если коэффициента К14/3 больше 2,5. Изобретение обеспечивает получение персонифицированной оценки радиочувствительности человека. 4 з.п. ф-лы, 1 пр., 1 ил.

1. Способ оценки персонифицированной радиочувствительности человека на основе определения реакции его гемопоэтических стволовых клеток на радиационное воздействие с использованием гуманизированных мышей, заключающийся в том, что берут человека-донора, получают клетки его крови, которые вводят группе гуманизированных мышей линий с тяжелым комбинированным иммунодефицитом, которых подвергают ионизирующему гамма-облучению, выделяют у них костный мозг, идентифицируют человеческие клетки крови, подсчитывают их количество, отличающийся тем, что от человека-донора получают гемопоэтические стволовые клетки - ГСК и вводят их мышам в количестве от 30 до 115 тыс. клеток на каждое животное внутрикостно в большую берцовую кость, через 20-30 минут после трансплантации клеток животных подвергают гамма-облучению в дозе 0,5 Гр с мощностью дозы 0,91 Гр/мин, затем на 3-и и 14-е сутки после облучения измеряют долю ГСК CD45^lowCD34⁺ клеток среди лейкоцитарных CD45^low/+ клеток человека в пробе костного мозга, взятого из большой берцовой кости мышей, в которую производилась инъекция ГСК; производят расчет отношения доли ГСК на 14-е сутки к показателю на 3-и сутки в виде коэффициента К14/3 и делают вывод о радиочувствительности, если коэффициент меньше 2,5, и о радиорезистентности, если коэффициента К14/3 больше 2,5.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ГСК выделяют из периферической крови.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ГСК крови получают путем лейкофереза после мобилизации ГСК или без мобилизации.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ГСК выделяют методом клеточного сортинга, активируемого флуоресценцией.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ГСК получают методами антител-опосредованной сортировки клеток.