Способ получения клеточных блоков для цитологической и иммуноцитохимической диагностики злокачественных новообразований Российский патент 2024 года по МПК G01N33/50 A61B5/00 

Изобретение относится к области медицины, в частности к диагностике физиологических состояний человеческого организма путем исследования клеточного материала, полученного при тонкоигольной аспирационной биопсии и при эндобронхиальной и эндоэзофагеальной ультрасонографии с тонкоигольной аспирационной биопсией и др. in vitro для цитологического и иммуноцитохимического (ИЦХ) исследований. Изобретение может быть использовано в онкологии, гематологии, терапии, фтизиатрии, акушерстве и гинекологии, клинической лабораторной диагностике.

Известно использование импортных дорогостоящих сред (Clear Prep фирмы Resolusion Biomedical, США; Е-Prep фирмы Celltrazone, Южная Корея; BD, США; Novoprep Solution, Великобритания и др.) для транспортировки и сохранности клеточного материала. Спирты, содержащиеся в транспортной среде изменяют морфологию клеток, тем самым затрудняют цитологическую диагностику и требуют специальной подготовки специалистов-цитологов [1, стр. 68].

Известен способ получения клеточных блоков на основе заливки клеточного материала желатином для изготовления из него срезов и микропрепаратов. Полученные таким способом микропрепараты не могут быть использованы для проведения ИЦХ исследования, так как желатин невозможно удалить из срезов при фиксации биологического материала в формалине [2, стр. 38].

Известен способ приготовления клеточных блоков для ИЦХ исследования основанный на заливке клеточного осадка агар-агаром [3, стр. 360]. Этот способ имеет недостаток связанный с необходимостью строгого соблюдения температурного режима, нарушение которого приводит к изменению морфологических характеристик клетки: образованию вакуолей, сморщиванию клеток, уплотнению или исчезновению цитоплазмы, что не всегда позволяет точно оценить цитоплазматические и мембранных ИЦХ реакции.

Известен способ получения клеточного сгустка с использованием тромбоцитарной массы [4, стр. 1-2, 4, 7]. Недостатками способа являются:

- трудоемкость технологии, так как необходимо предварительно подготовить тромбоцитарную массу путем постоянного перемешивания и разогревания до температуры 36-37°С, затем ее добавление к клеточному осадку, после ретракции сгустка центрифугирование в течение 3-6 минут при скорости 1500 об/мин и последующее удаление надосадочной жидкости;

- тромбоцитарная масса должна содержать не менее 50×10⁹ тромбоцитов в одном флаконе;

- необходимость соблюдения температурного режима хранения тромбоцитарной массы (до 20°С);

- ограниченный срок хранения тромбоцитарной массы (до 3 суток), так как по истечению это срока активность ее резко снижается;

- необходимость утилизации остатков тромбоцитарной массы, как биологических отходов.

Известен традиционный способ гистологической проводки, включающей обезвоживание, насыщение парафином, заливку в блок, микротоми-рование, изготовление срезов и микропрепаратов для морфологического исследования [5, стр. 53-83].

Техническая задача - повышение точности цитологической и ИЦХ диагностики злокачественных новообразований.

Для достижения указанной технической задачи предложен способ получения клеточных блоков для цитологической и ИЦХ диагностики злокачественных новообразований, характеризующийся тем, что клеточный материал полученный путем тонкоигольной аспирационной биопсии и при эндобронхиальной и эндоэзофагеальной ультрасонографии с тонкоигольной аспирационной биопсией и гистологической проводкой, включающей обезвоживание, насыщение парафином, заливку в блок, микротомирование, изготовление микропрепаратов для морфологического исследования, отличающийся тем, что клеточный материал помещают в эппендорф, содержащий транспортную среду, состоящую из раствора нейтрального формалина 10% и изотонического физиологического раствора хлорида натрия 0,9% в соотношении 1:1 в объеме 0,8-1,0 мл, центрифугируют клеточную суспензию в течение 5 минут со скоростью 4000 об/мин, отделяют клеточный осадок путем сливания надосадочной жидкости, к осадку добавляют 1,5 мл изопропилового спирта и 5-6 капель глицерина, центрифугируют в течение 5 минут при скорости 4000 об/мин, при этом сформированный клеточный сгусток располагается в центре эппендорфа на границе двухфазной жидкости, сливают надосадочную жидкость и препаровальной иглой его переносят в биопсийную кассету, на дне которой находится специальная губка для проводки биопсийного материала и сгусток накрывают этой же губкой, закрывают крышку кассеты, помещают ее в нейтральный забуференный раствор формалина 10% на 12-18 часов, затем кассету с клеточным сгустком переносят в гистологический процессор для гистологической проводки, проводят заливку в блок, изготовление микропрепаратов для цитологического и ИЦХ исследований.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи получения оптимальных клеточных блоков из клеточного материала без изменения его морфологической структуры и антигенных свойств, добытого путем тонкоигольной аспирационной биопсии и при эндобронхиальной и эндоэзофагеальной ультрасонографии с тонкоигольной аспирационной биопсией для цитологической и ИЦХ диагностики злокачественных новообразований.

Технический результат заключается в том, что обеспечивается сохранность морфологического строения и антигенных свойств клеточного материала, а также упрощается и ускоряется формирование клеточного сгустка.

Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что использование транспортной среды на основе раствора нейтрального формалина 10% и изотонического физиологического раствора хлорида натрия 0,9%, в которую помещается клеточный материал не изменяет строение клеток, в отличие от традиционных импортных транспортных сред, содержащих спирты, формальдегид, а способ получения клеточного сгустка на основе использования двухфазной жидкости (изопропиловый спирт и глицерин) без присутствия белковых фракций и полисахаридов в отличии от способов с использованием желатина, тромбоцитарной массы, парафина не изменяет морфологических и антигенных свойств клеток, упрощает и ускоряет технологию формирования клеточного сгустка. Полученный клеточный сгусток используется для приготовления клеточного блока путем проведения гистологической проводки, включающей обезвоживание, насыщение парафином, заливку в блок, микротомирование, изготовление микропрепаратов для цитологической и ИЦХ диагностики в сложных диагностических случаях с целью определения гистогенеза и органной принадлежности опухоли. Это имеет важное значение для установления точного клинического диагноза, выбора специальных методов лечения и в дальнейшем влияет на прогноз заболевания и качество жизни больных.

Использование в клинической онкологической, гематологической, терапевтической, фтизиатрической, акушерско-гинекологической практиках и клинической лабораторной диагностике заявляемого способа повышает точность морфологической диагностики злокачественных новообразований.

Применение в описанном способе получения клеточных блоков обеспечивает:

- сохранность морфологических структур и антигенных свойств клеток;

- упрощение и ускорение технологии получения клеточных блоков;

- возможность использования реактивов и расходных материалов отечественного производства, что дает возможность для импортозамещения;

- экономическую целесообразность за счет невысокой стоимости реактивов и расходных материалов;

- длительную сохранность клеточных блоков для последующего цитологического и ИЦХ исследований.

Преимущество изобретения заключается в том, что оно сохраняет морфологическую структуру и антигенные свойства клеток, упрощает и ускоряет технологию приготовления клеточных блоков, имеет экономическое значение, дает возможность для импортозамещения и повышает точность цитологической и ИЦХ диагностики злокачественных новообразований.

Способ реализуется следующим образом. Клеточный материал для исследования получают путем тонкоигольной аспирационной биопсии и при эндобронхиальной и эндоэзофагеальной ультрасонографии с тонкоигольной аспирационной биопсией, помещают в эппендрф с 0,8-1,0 мл транспортной среды, состоящей из раствора нейтрального формалина 10% и изотонического физиологического раствора хлорида натрия 0,9%, предназначенной для жидкостной цитологии. Содержимое эппендорфа аккуратно перемешивают (без образования пены) для большего соприкосновения клеток с средой. Биологический материал сразу используют для исследования или возможно его хранение при температуре 4-8°С до суток. Чем быстрее клеточный материал будет сформирован в клеточный блок, тем меньше вероятность гибели ИЦХ маркеров (особенно ядерных), которые используются для выполнения ИЦХ исследования. Клеточную суспензию центрифугируют в течение 5 минут при скорости 4000 об/мин, затем надосадочную жидкость сливают. К осадку добавляют 1,5 мл изопропилового спирта и 5-6 капель глицерина. Клеточную суспензию центрифугируют в течение 5 минут при скорости 4000 об/мин. Образовавшийся клеточный сгусток располагается в центре двухфазной жидкости. Надосадочная жидкость сливается, сгусток переносят препаровальной иглой в биопсийную кассету, на дне которой расположена фильтровальная прокладка, ею накрывают клеточный блок и закрывают крышку кассеты, которую помещают в нейтральный забуференный раствор формалина 10% на 12-18 часов, кассету с клеточным сгустком переносят в гистологический процессор для гистологической проводки, включающей обезвоживание, насыщение парафином, заливку в блок, микротомирование, изготовление микропрепаратов для цитологического и ИЦХ исследований.

Заявляемый способ получения клеточных блоков для цитологической и ИЦХ диагностики злокачественных новообразований является оптимальным и отвечает всем указанным требованиям.

Использование индифферентных реактивов для транспортной среды на основе раствора нейтрального формалина 10%, изотонического физиологического раствора хлорида натрия 0,9% и изопропилового спирта, глицерина для изготовления клеточного блока, в которых не содержатся белковые фракции и полисахариды не изменяют морфологическую структуру и антигенные свойства клеток представляют простой способ получения клеточного сгустка для цитологического и ИЦХ исследований. Применяемые растворы выпускаются отечественной промышленностью и обеспечивают соответствие заявляемого способа критерию промышленной применяемости.

Сущность заявляемого изобретения поясняется графическими материалами, которые представлены на:

ФИГ. 1. Традиционный цитологический препарат. Метастаз меланомы? Окраска по Романовскому. Ув. об. 10х

ФИГ. 2. Традиционный цитологический препарат. Метастаз меланомы? Окраска по Романовском. Об. ув. 10х

ФИГ. 3. ИЦХ. Экспрессия Melan А. Ув. об. 20х

ФИГ. 4. ИЦХ. Экспрессия НМВ45. Ув. об. 100х

ФИГ. 5. Традиционный цитологический препарат. Аденокарцинома низкой степени дифференцировки. Окраска по Романовскому. Ув. об. 10х

ФИГ. 6. Клеточный блок. Аденокарцинома. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. об. 20х

ФИГ. 7. ИЦХ. Экспрессия СК7. Ув. об. 20х

ФИГ. 8. ИЦХ. Экспрессия СК19. Ув. об. 20х

ФИГ. 9. ИЦХ. Экспрессия СК18. Ув. об. 10х

ФИГ. 10. ИЦХ. Экспрессия TTF-1. Ув. об. 20х

ФИГ. 11. Традиционный цитологический препарат. Мелкоклеточный рак. Окраска по Романовскому. Ув. об. 10х

ФИГ. 12. Клеточный блок. Среди фибрина небольшие скопления полуразрушенных опухолевых клеток с гиперхромными ядрами. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. об. 20х

ФИГ. 13. ИЦХ. Экспрессия CD56. Ув. об. 20х

ФИГ. 14. ИЦХ. Экспрессия АЕ1/АЕ3. Ув. об. 100х

Примеры использования способа

Пример 1. Больной С. 1946 г.р. Жалобы на наличие пигментного образования на правом плече в течение года.

Заключение КТ: Полисегментарно в обоих легких определяются очаговые образования до 8 мм. Правое легкое уменьшено в объеме за счет ателектаза средней доли. Средняя доля бронха и его ветви "ампутированы" патологическими массами. В медиастинальном отделе правого легкого (от нижнего края правой легочной артерии и до правой нижней легочной вены) определяются патологические массы с признаками инвазии суживающие правую верхнюю легочную вену. Патологические массы сливаются с ателектазированной паренхимой. Вероятно часть патологической масс - увеличенные бронхопульмональные лимфатические узлы. Внутригрудные лимфатические узлы - пре-, паратрахеальные, бифуркационные и бронхопульмональные с двух сторон до 10 мм. Подмышечные лимфатические узлы до 15 мм справа.

Фибробронхоскопия: Просвет средней доли бронха обтурирован бугристым новообразованием белого цвета. Инфильтрация распространяется по передней стенке нижней доли бронха справа, по передней, латеральной и медиальной стенкам промежуточного бронха на расстояние 0,5 см до нижнего края устья верхней доли бронха.

Заключение: Опухоль средней доли бронха с инфильтрацией нижней и промежуточной долей бронха.

Клеточный материал для исследования получен путем трансэзофагеальной ультрасонографии с тонкоигольной аспирационной биопсией. Часть клеточного материала перенесена на предметное стекло для традиционного цитологического исследования, а оставшаяся часть в эппендорф с 1,0 мл транспортной средой, состоящей из раствора нейтрального формалина и изотонического физиологического раствора хлорида натрия 0,9% в соотношении 1:1 для жидкостной цитологии и приготовления клеточного блока.

Предварительный диагноз: Новообразование заднего средостения.

Цитологическое заключение: Материал представлен полями разрозненно лежащих и обширными скоплениями злокачественных клеток с нежной обильной цитоплазмой, в которой имеется пылевидная зернистость, а так же встречаются двуядерные клетки с крупными нуклеолами и пигментом внутри цитоплазмы. Цитологическая картина позволяет подозревать метастаз меланомы (ФИГ. 1, 2).

Для уточнения морфологического диагноза проведено ИЦХ исследование. Микропрепарат получен из клеточного блока приготовленного по технологии заявляемого способа.

Результат ИЦХ исследования: Melan А - реакция положительная в клетках опухоли; НМВ45 - реакция положительная в клетках опухоли (ФИГ. 3, 4).

Патологогистологическое исследование. Биоматериал - фрагменты образования бронха.

Микроскопическое описание: В исследованных образцах определяются множественные очаги опухолевого роста, состоящие из полигональных клеток со светлой цитоплазмой и полиморфными гиперхромными ядрами.

Диагноз: Злокачественная мезенхимальная опухоль? Беспигментная меланома?

Для верификации морфологического диагноза проведено ИЦХ исследование.

Результаты ИГХ исследования: Cytokeratin, clone АЕ1/АЕ3 - реакция отрицательная в клетках опухоли; Vimentin, Clone V9, S-100, polyclonal, Melanosome, Clone HMB-45, Melan-A, Clone A103 - реакция положительная в клетках опухоли.

Иммунофенотип клеток опухоли исследованного материала соответствует иммунофенотипу меланомы.

Заключение: Метастазы беспигментной меланомы.

Пример 2. Больной К. 1941 г.р. Предъявляет жалобы на кашель, кровохарканье, одышку при небольшой физической нагрузке, клокочущие хрипы.

КТ: Солитарное очаговое образование нижней доли бронха левого легкого. В медиальном отделе правого легкого определяется объемное образование с бугристыми контурами до 39×38×52 мм, не отделяющееся от задней стенки правого главного бронха, медиастинальной плевры, пищевода. В S7 справа перифокально образованию располагаются участки "матового стекла". Внутригрудные лимфатические узлы - пре- и паратрахеальные до 11 мм, бифуркационные до 14 мм.

Заключение: Диссеминированный процесс легких. Лимфаденопатия средостения.

Клеточный материал для исследования получен путем эндоэзофагеальной ультрасонографии с тонкоигольной аспирационной биопсией. Часть клеточного материала перенесена на предметное стекло для традиционного цитологического исследования, а оставшаяся часть в эппендорф с 1,0 мл транспортной средой, состоящей из раствора нейтрального формалина и изотонического физиологического раствора хлорида натрия 0,9% в соотношении 1:1 для жидкостной цитологии и приготовления клеточного блока.

Цитологическое заключение: Аденокарцинома с низкой степенью дифференцировки (ФИГ. 5, 6).

Учитывая неясный гистогенез опухоли, решено провести ИЦХ исследование. Микропрепарат получен из клеточного блока приготовленного по технологии заявляемого способа.

Результат ИЦХ:

СК 7 - реакция положительная в клетках опухоли;

СК 18 - реакция положительная в клетках опухоли;

СК 19 - реакция положительная в клетках опухоли;

TTF1 - реакция положительная в клетках опухоли.

Иммунофенотип опухолевых клеток соответствует аденокарциноме легкого (ФИГ. 7-10).

Пример 3. Больная М., 68 лет. Предъявляет жалобы на повышение температуры тела до 37,4°С по вечерам, влажный кашель с прожилками крови, повышенную утомляемость.

Заключение компьютерной томографии: Выраженная внутригрудная лимфаденопатия с признаками инвазии в левую брахиоцефальную вену и развитием коллатералей. Очаговые образования правого легкого, вероятно, метастаз. Объемное образование правого надпочечника. Лимфаденопатия забрюшинного пространства.

Протокол эндосонографии: В проекции 2L группы медиастинальных лимфоузлов определяется объемное изоэхогенное новообразование с четкой гиперэхогенной капсулой, занимающее все эхо-окно.

Предварительный диагноз: Очаговые новообразования правого легкого. Лимфаденопатия средостения.

Для морфологической верификации диагноза биологический материал для исследования получен путем эндобронхиальной ультрасонографии с тонкоигольной аспирационной биопсией. Часть клеточного материала перенесена на предметное стекло для традиционного цитологического исследования, часть в эппендорф с 1,0 мл транспортной средой, состоящей из раствора нейтрального формалина 10% и изотонического физиологического раствора хлорида натрия 0,9% в соотношении 1:1 для жидкостной цитологии и приготовления клеточного блока.

Полученный гистологический материал помещен в забуференный нейтральный раствор формалина 10% для патологогистологического исследования.

Цитологическое заключение: в препарате элементы крови, обширные скопления разрушенных опухолевых клеток, а в сохранных местах - поля с дистрофически измененными, разрозненно лежащими однотипными клетками злокачественной опухоли. Недифференцированный рак? Лимфопролиферативный процесс? (ФИГ. 11).

Для верификации морфологического диагноза проведено ИЦХ исследование. Микропрепарат получен из клеточного блока, приготовленного по технологии заявляемого способа.

Морфологическое исследование клеточного блока: среди фибрина скопления полуразрушенных опухолевых клеток с гиперхромными ядрами, в отдельных клетках различим узкий ободок цитоплазмы (ФИГ. 12).

Результат ИЦХ исследования:

Cytokeratin, clone АЕ1/АЕ3 - реакция положительная в клетках опухоли;

CD56, clone MRQ-42 - реакция положительная в клетках опухоли.

Иммунофенотип сохранившихся клеток опухоли соответствует иммунофенотипу мелкоклеточного рака (ФИГ. 13-14).

Патологогистологическое заключение: аденокарцинома легкого.

Приведенные примеры могут служить подтверждением того, что использование способа получения клеточных блоков для цитологической и ИЦХ диагностики злокачественных новообразований сохраняет морфологическую структуру и не изменяет антигенных свойств клеток, упрощает и упрощает технологию приготовления клеточных блоков, имеет экономическое значение, создает условия для импортозамещения, длительно сохраняет клеточный блок для ИЦХ исследования и повышает точность цитологической и ИЦХ диагностики злокачественных новообразований.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Гилл Г.У. Клиническая цитология. Теория и практика цитотехнологии / Г.У. Гилл: пер. с англ. под ред. А.В. Безрукова. - М.: Практическая медицина, 2015, - 384 с.

2. Волченко Н.Н. Технология «клеточный блок» в цитологической практике / Н.Н. Волченко, О.В. Борисова, И.Б. Баранова // Клиническая лабораторная диагностика. - 2015. - №8. - С. 39-41.

3. Jan D. Cell blocks in cytopathology: a review of preparative methods, utility in diagnosis and role in ancillary studies / D. Jan, S.R. Mathur, V.K. Iyer // Cytopathology. - 2014. - №25. - P. 356-371.

4. Тихонов Я.Н. Способ изготовления клеточного блока клеточного материала / Я.Н. Тихонов, И.В. Назарова, И.В. Рева и соавт./ Государственный патент на изобретение №2722661 от 02.02.2020 г. // Официальный бюллетень ФСПИС (Роспатент). - 2020. - №16.

5. Стандартные технологические процедуры при проведении патологоанатомического исследования. Клинические рекомендации RPS1.1. - М., 2016. - 119 с.

Изобретение относится к области медицины и касается способа получения клеточных блоков для цитологической и иммуноцитохимической (ИЦХ) диагностики злокачественных новообразований. Клеточный материал, полученный путем тонкоигольной аспирационной биопсии и при эндобронхиальной и эндоэзофагеальной ультрасонографии с тонкоигольной аспирационной биопсией и гистологической проводкой, помещают в эппендорф, содержащий транспортную среду, состоящую из раствора нейтрального формалина 10% и изотонического физиологического раствора хлорида натрия 0,9% в соотношении 1:1 в объеме 0,8-1,0 мл. Затем центрифугируют клеточную суспензию в течение 5 минут со скоростью 4000 об/мин. Отделяют клеточный осадок путем сливания надосадочной жидкости, к осадку добавляют 1,5 мл изопропилового спирта и 5-6 капель глицерина, центрифугируют в течение 5 минут при скорости 4000 об/мин. При этом сформированный клеточный сгусток располагается в центре эппендорфа на границе двухфазной жидкости. Сливают надосадочную жидкость и препаровальной иглой его переносят в биопсийную кассету, на дне которой находится губка для проводки биопсийного материала, и сгусток накрывают этой же губкой. Закрывают крышку кассеты, помещают ее в нейтральный забуференный раствор формалина 10% на 12-18 часов, затем кассету с клеточным сгустком переносят в гистологический процессор для гистологической проводки для проведения цитологического и ИЦХ исследований. Изобретение обеспечивает сохранность морфологического строения и антигенных свойств клеточного материала, а также упрощение и ускорение формирования клеточного сгустка. 14 ил., 2 пр.

Способ получения клеточных блоков для цитологической и иммуноцитохимической (ИЦХ) диагностики злокачественных новообразований, характеризующийся тем, что клеточный материал, полученный путем тонкоигольной аспирационной биопсии и при эндобронхиальной и эндоэзофагеальной ультрасонографии с тонкоигольной аспирационной биопсией и гистологической проводкой, включающей обезвоживание, насыщение парафином, заливку в блок, микротомирование, изготовление микропрепаратов для морфологического исследования, отличающийся тем, что клеточный материал помещают в эппендорф, содержащий транспортную среду, состоящую из раствора нейтрального формалина 10% и изотонического физиологического раствора хлорида натрия 0,9% в соотношении 1:1 в объеме 0,8-1,0 мл, центрифугируют клеточную суспензию в течение 5 минут со скоростью 4000 об/мин, отделяют клеточный осадок путем сливания надосадочной жидкости, к осадку добавляют 1,5 мл изопропилового спирта и 5-6 капель глицерина, центрифугируют в течение 5 минут при скорости 4000 об/мин, при этом сформированный клеточный сгусток располагается в центре эппендорфа на границе двухфазной жидкости, сливают надосадочную жидкость и препаровальной иглой его переносят в биопсийную кассету, на дне которой находится губка для проводки биопсийного материала, и сгусток накрывают этой же губкой, закрывают крышку кассеты, помещают ее в нейтральный забуференный раствор формалина 10% на 12-18 часов, затем кассету с клеточным сгустком переносят в гистологический процессор для гистологической проводки, проводят заливку в блок, изготовление микропрепаратов для цитологического и ИЦХ исследований.