Способ комплексной дооперационной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных узловых образований щитовидной железы Российский патент 2023 года по МПК G01N33/574 G01N33/68 A61B5/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к молекулярно-генетической диагностике в онкологии и может быть использовано в комплексной предоперационной дифференциальной диагностике доброкачественной или злокачественной природы узловых образований щитовидной железы, определяющей выбор тактики лечения пациентов.

Высокая заболеваемость, сложность морфологической предоперационной диагностики и прогноза папиллярной карциномы щитовидной железы (ЩЖ) делает актуальными молекулярные и генетические исследования на данном этапе (Vargas-Pinto S., Minerva A., Arenas R. Lobectomy Compared to Total Thyroidectomy for Low-Risk Papillary Thyroid Cancer: A Systematic Review. Journal of Surgical Research. 2019).

Стандартный метод дооперационной диагностики, основанный на цитологическом исследовании препаратов, полученных методом тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАПБ), предполагает разделение узловых образований ЩЖ на 6 диагностических категорий, используя классификацию Bethesda (Е. Cibas, Syed Z. Ali, The Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology. Thyroid: official journal of the American Thyroid Association, 2009). Каждая из этих категорий определяет тактику ведения пациента: консервативное ведение и активное клиническое наблюдение, тотальная тиреоидэктомия или гемитиреоидэктомия. При этом существующие общепринятые методы диагностики имеют недостатки.

Так остается группа пациентов, у которых результаты цитологического исследования ТАПБ не позволяют дифференцировать доброкачественные и злокачественные новообразования из-за сложности оценки и наличия серой диагностической зоны. Заключение в 30% случаев оказывается неопределенным, поскольку цитологических признаков недостаточно для разделения доброкачественных и злокачественных фолликулярных опухолей. В соответствии с клиническими рекомендациями, большинство пациентов с неопределенным цитологическим заключением, в том числе все, относящиеся к категории Bethesda III и IV, направляются на диагностическую операцию. При этом от 70% до 80% узловых образований ЩЖ, по результатам послеоперационного гистологического исследования, оказываются доброкачественными, а сама операция - ненужной, либо объем ее преувеличен (Haugen B.R., Alexander E.K., Bible K.C. et al. American Thyroid Association Management Guidelines for Adult Patients with Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer: The American Thyroid Association Guidelines Task Force on Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer. Thyroid. 2016 Jan; 26(1): 1-133). При этом есть риск послеоперационных осложнений и послеоперационный гипотиреоз, требующий перманентной заместительной гормональной терапии, снижает качество жизни.

В связи с необходимостью совершенствования подходов к дооперационному типированию патологии ЩЖ, актуальной задачей является разработка способов диагностики узловых образований ЩЖ с использованием биомаркеров (Стяжкина С.Н. Возможности иммуногистохимического исследования для оценки пролиферативной активности ткани щитовидной железы. Современные проблемы науки и образования. 2017; 2:21).

Также в комплексной диагностике папиллярного рака ЩЖ перспективно использование молекулярно-генетических методов. До недавнего времени считалось, что папиллярные микрокарциномы являются опухолями с благоприятным прогнозом и медленной прогрессией и их можно лечить как хирургически, так и путем активного наблюдения. Однако часть из них проявляет агрессивность и имеет характеристики злокачественного роста, связанные с риском местных и отдаленных рецидивов. BRAF V600E мутация является генетической характеристикой опухоли, имеющей такие биологические характеристики. Среди различных изоформ киназы Raf RAF V600E типа В Мутация (BRAF V600E) встречается чаще всего. Эта генетическая аномалия вызывает чрезмерную пролиферацию опухолевых клеток и участвует не только в онкогенезе, но и в трансормации в агрессивную недифференцированную форму рака (Woon Won Kim, Тае Kwun На and Sung Kwon Bae. Clinical implications of the BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma and chronic lymphocytic thyroiditis. Journal of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 2018).

Совершенствование ультразвуковой диагностики и цитологического метода позволило чаще выявлять больных с ранними стадиями папиллярного рака, в том числе и микрокарцином размером менее 1,5 см в диаметре, часто ассоциированных с мутацией BRAF V600E (Jennifer A. Silver, Mariya Bogatchenko, Marc Pusztaszeri, Veronique-Isabelle Forest, Michael P. Hier, Ji Wei Yang, Michael Tamiliaand Richard J. Payne. BRAF V600E mutation is associated with aggressive features in papillary thyroid carcinomas ≤1,5 cm: Journal of Otolaryngology - Head & Neck Surgary. 2021).

Молекулярное тестирование может помочь в принятии решений лечебной тактики и идентифицировать микрокарциномы папиллярного рака ЩЖ с высоким риском, которые требуют радикального хирургического вмешательства, приоритетного по сравнению с клиническим мониторингом. Идентификация такой опухоли на ранней стадии чрезвычайно важна, однако часто это происходит только после операции, уже на биологическом материале парафинового блока.

Таким образом, молекулярное тестирование может помочь в принятии верных тактических решений и идентифицировать узловые образования с высоким риском.

Известен способ дифференциальной диагностики опухолей щитовидной железы с использованием иммуногистохимического метода (Патент РФ №2332172; Опубл. 2008), включающий определение экспрессии белков Ki-67, Bc1-2, p53 в клетках опухоли с помощью специфических моноклональных антител в комплексе с хромогеном, при этом определяют для каждого белка индекс мечения ядер клеток, дополнительно определяют индексы мечения цитоплазмы клеток для белков Вс1-2 и р53, оценивают коэффициент потенциальной возможности к пролиферативной активности по формуле, в которой используют индексы мечения ядер клеток опухоли для каждого из белков соответственно, причем оценивают коэффициент возможной атипии цитоплазмы (КВА) как отношение индекса мечения цитоплазмы клеток для белка Вс1-2 к индексу мечения цитоплазмы клеток для белка р53, и определяют коэффициент активности опухолевого роста и потенциальной злокачественности (КАОРЗ) как произведение КВА и коэффициента потенциальной возможности к пролиферативной активности и при величине 0 ≤ КАОРЗ ≤ 4,35 диагностируют атипическую фолликулярную аденому, а при величине КАОРЗ > 4,36 - фолликулярный рак.

Недостатками способа является то, что он недостаточно информативен и не обладает необходимой точностью при дифференциальной диагностике, что наиболее важно для врача и пациента.

Предложены способ и набор для обнаружения мутации Q61R в белке NRAS в образце опухолевой ткани человека (Патент РФ 2688189. Опубл. 2019). Способ включает получение образца биологического материала, взятого у пациента, выделение ДНК из указанного образца и проведение ПЦР с использованием набора для обнаружения мутации Q61R в белке NRAS. Предложенная группа изобретений позволяет повысить специфичность и чувствительность определения наличия мутантного аллеля в точке Q61R гена NRAS, а также снизить вероятность технологических ошибок во время лабораторных манипуляций.

К недостаткам данного способа относятся такие, как недостаточная информативность и эффективность для дооперационной диагностики узловых образований ЩЖ, так как способ ориентирован на анализ операционного материала и не определяет выбор способа лечения на данном этапе, также выбор маркера дискутабелен в силу низкой информативности.

Известен способ дифференциальной диагностики новообразований щитовидной железы (Патент РФ 2705110. Опубл. 2019), заключающийся в том, что выявляют узловые образования щитовидной железы, проводят пункционную биопсию, последующее цитологическое исследование пунктата и при неопределенных цитологических заключениях выполняют молекулярно-генетическое исследование, производя методом ОТ-ПЦР количественную оценку матричной РНК и микроРНК, и при условии показателей HMGA2 более 0.09, микроРНК-221 более 0,0105 и микроРНК-375 более -12,1213, определяют фолликулярную опухоль с признаками злокачественности, при условии показателей микроРНК-146b более 0.1721, определяют папиллярный рак, при показателях миРНК-375 более 5.2514, определяют медуллярный рак, а показатель соотношения митохондриальной ДНК/ядерной ДНК более 5716,3013 - В-клеточный рак, наличие мутации V600 в гене BRAF - папиллярный рак и является риском наличия высокой биологической агрессивности данного папиллярного рака.

Основными недостатками данного способа являются недостаточная точность, ограниченные функциональные возможности, так как он не позволяет дифференцировать узлы паращитовидной железы, узловые образования с присутствием клеток Гюртля.

Известен способ дооперационной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований щитовидной железы (Патент РФ №2614700; Опубл. 2017), включающий тонкоигольную аспирационную биопсию узловых образований щитовидной железы под контролем ультразвукового исследования, промывку и консервацию аспирата, центрифугирование, отбор супернатантов, проведение иммуноцитохимического (ИЦХ) анализа экспрессии Ki-67 и расчет диагностического показателя p по формуле, в которой HS=ΣP(i)×i, где i - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0 до 3, P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью, и при величине р > 0,5 - образование признают злокачественным, при величине р < 0,5 - доброкачественным.

К недостаткам его относятся следующие: недостаточная информативность, так как измерение уровня экспрессии Ki-67 в клинике эндокринной хирургии не является патогномоничным достоверным признаком опухолевого роста в тироцитах, а ИЦХ метод без изготовления клеточного блока (cell-block) в мазке по релевантности в клинике уступает методу клеточных блоков (Воробьев С.Л. Морфологическая диагностика заболеваний щитовидной железы. СПб.: Издательско-полиграфическая компания «КОСТА»; 2014).

В качестве прототипа выбран способ дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы человека (Патент РФ 2757347. Опубл. 2021), включающий взятие образца ткани узлового образования щитовидной железы, выделение суммарного пула РНК из образца, анализ уровня экспрессии гена HMGA2, митохондриальной ДНК, а также определение мутации V600E в гене BRAF. Измеряют уровень экспрессии микроРНК-146b, -221, -375. Дополнительно измеряют уровень экспрессии гена GCM2. Заключение о наличии и характере узлового образования составляют на основании дерева принятия решений, согласно которому анализируемый образец относят к одному, выбранному из следующей группы: узловое образование паращитовидной железы, доброкачественное узловое образование щитовидной железы, злокачественное узловое образование щитовидной железы, включающее папиллярный рак, медуллярный рак, гюртлеклеточный рак, фолликулярные опухоли с маркерами злокачественности. Изобретение обеспечивает повышение точности способа дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы и расширение его функциональных возможностей.

К недостаткам прототипа относится сложность, а также дороговизна метода, ведь большую часть онкопатологии ЩЖ составляет именно папиллярный рак и большое число маркеров для него излишне.

Проведенный патентно-информационный поиск не выявил способов дооперационной дифференциальной диагностики типов узловых образований щитовидной железы с существенными признаками заявляемого способа.

Исходя из вышеприведенного уровня техники, при дифференциальной диагностике узловых образований щитовидной железы проблемой является сложность оценки образцов с неопределенной цитологией на доброкачественные и злокачественные с оценкой степени злокачественности, что влияет на количество хирургических вмешательств и возможный последующий риск.

Разработка более эффективного способа дооперационной дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы путем использования дополнительных прогностических значимых критериев оценки опухоли ЩЖ за счет выявления трех молекулярно-генетических маркеров, позволит решить вышеуказанную проблему, а именно повысить достоверность верификации опухолевых поражений и, соответственно, достигнуть сокращения количества необоснованных хирургических вмешательств.

Технический результат заключается в повышении точности и информативности предоперационной дифференциальной диагностики природы узловых образований щитовидной железы, и, как следствие, оптимизации тактики ведения пациентов с улучшением их качества жизни.

Предлагается, как и в прототипе, выполнение тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБП) под контролем ультразвукового исследования (УЗИ) для забора образцов узловых образований ЩЖ, приготовление цитологического препарата.

Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что способ комплексной предоперационной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных узловых образований щитовидной железы, включающий выполнение ТАПБ узлов под контролем ультразвукового исследования, приготовление цитологического препарата, изготовление клеточного блока и проведение иммуноцитохимического анализа экспрессии маркера пролиферации Ki-67 и апоптоза Fas-R, отличается тем, что дополнительно на материале клеточного блока 1) вычисляют индекс злокачественности Z по формуле Z=Fas-R / (Ki-67+1), где Fas-R - среднее количество позитивных клеток, окрашенных маркером апоптоза, a Ki-67 - среднее количество позитивных клеток, окрашенных маркером пролиферации, по 10 полям зрения в препарате; 2) проводят молекулярно-генетическое исследование на наличие мутации BRAF в гене V600E; далее при величине индекса Z менее 1,1 и отсутствии мутации судят о низком риске злокачественного роста узлового образования щитовидной железы, при величине индекса Z более 2,8 или наличии мутации BRAF в гене V600E делают заключение о высоком риске злокачественности узлового образования щитовидной железы.

Причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков и обеспечиваемым изобретением техническим результатом, состоит в том, что проводят иммуноцитохимическое исследование гистологического препарата из цитологического материала, подготовленного методом клеточных блоков, причем ИЦХ реакцию ставят на клеточном блоке с двумя маркерами - маркером пролиферации Ki-67 и с дополнительным маркером апоптоза Fas-R, по соотношению уровней экспрессии которых вычисляют индекс злокачественного потенциала опухоли ЩЖ, что позволяет повысить точность и качестводифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований щитовидной железы, так как ИЦХ анализ динамики экспрессии Ki-67 и Fas-R с изготовлением клеточного блока cell-block является более информативным, и по релевантности в клинике значительно лучше по сравнению со способом-прототипом. Также выявление мутации V600E в гене BRAF позволяет обнаружить микрокарциномы с высоким риском злокачественного роста.

Использование метода клеточных блоков cell-block имеет преимущества, в отличие от мазков, он позволяет проводить обзорные и селективные окраски, получать серийные срезы, сохраняет структуру материала, молекулярные реакции при этом методе дают стабильный хорошо воспроизводимый результат, что позволяет проводить последовательно разные молекулярно-генетические исследования, сводя к минимуму повторные инвазивные манипуляции для пациента.

Выбор диагностических значимых маркеров Fas-R и Ki-67 для использования в комплексе с цитологическими характеристиками мазка для прогностической оценки злокачественного потенциала новообразования является более информативным и способствует повышению эффективности лечения больных с узловыми образованиями ЩЖ.

Так, например, низкие значения маркера Fas-R и повышенные значения маркера Ki-67 на фоне отсутствия признаков аутоиммунного тиреоидита свидетельствует об активации неопластических процессов, а при наличии цитологических характеристик фолликулярной опухоли, низкие показатели маркера Fas-R и повышенные Ki-67 сигнализируют о большей вероятности наличия фолликулярной карциномы.

Заявляемый способ дооперационной дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы разработан впервые.

Способ заключается в следующем.

При подозрении на опухоль щитовидной железы под контролем УЗИ выполняют ТАПБ, материал направляют для цитологии и изготовления клеточного блока cell-block. Для этого пунктат фиксируют, промывают, взвесь клеток помещают в стеклянную пробирку, добавляют 500 мкл цитратной плазмы и 5 мкл хлорида кальция, инкубируют в термостате 15-20 минут при 37°С, формируя тромбиновый сверток как связующую основу, далее обезвоживают и пропитывают парафином, изготавливают срезы по стандартной методике, и инструкциям гистологических реагентов и приборов.

Для верификации сомнительных цитологических изменений, например, таких как, папиллярные структуры, плазмоцитоидность цитоплазмы, наличие внутриядерных борозд, нагромождение ядер и их укрупнение, проводят иммуноцитохимическую реакцию с двумя маркерами на клеточном блоке cell-block. Ставят реакцию с маркером пролиферации Ki-67 и с апоптотическим маркером Fas-R. Данный этап выполняют по стандартной методике, включающей депарафинизацию, промывку, обработку первичным антителом, обработку системой детекции, демаскировку, окрашивание ядер, промывку и заключение под стекло.

По полученным значениям уровней экспрессии маркера Ki-67 и маркера Fas-R в абсолютных числах определяют злокачественный потенциал опухоли путем вычисления индекса злокачественности Z по формуле:

Z=Fas-R /(Ki-67+1),

где Fas-R - среднее количество позитивных клеток, окрашенных маркером апоптоза, Ki-67 - среднее количество позитивных клеток, окрашенных маркером пролиферации, по 10 полям зрения в препарате.

При подозрении на наличие мутации BRAF в гене V600E делают парафиновую стружку из материала клеточного блока, выполняют экстракцию ДНК, и методом ПЦР-РВ в пробе геномной ДНК определяют искомую мутацию.

При величине индекса Z менее 1,1 и отсутствии мутации BRAF в гене V600E судят о низком риске злокачественного роста. При этом рекомендуют динамическое наблюдение пациента с повторной ТАПБ в случаях увеличения размеров узла или изменении его эхогенности.

При величине индекса Z более 2,8 или (и) выявлении мутации BRAF в гене V600E делают заключение о высоком риске злокачественного роста, ассоциированном с развитием агрессивного типа опухоли.

При гипоэхогенности узла, а также нормальных показателях антител к тиреоидной пироскидазе (АТ-ТПО), антител к тиреоидной пироскидазе (АТ-ТТГ) и величине индекса Z более 2,8 рекомендуют гемитиреоидэктомию с ревизией региональных лимфоузлов.

При подозрении на метастатическое поражение по данным КТ, МРТ - рекомендуют регионарную лимфодиссекцию с тиреоидэктомией.

В случаях изоэхогенных ультразвуковых характеристик узла, наличии биохимических показателей аутоимунного тиреоидита АТ-ТПО, АТ-ТТГ и величине индекса Z более 2,8 рекомендуют проведение жидкостной цитологии для исключения папиллярной карциномы.

Если величина индекса Z составляет 1,1 - 2,8, то судят о среднем риске злокачественного роста опухоли. Рекомендуют при этом повторную ТАПБ с исследованием на наличие мутации V600E гена BRAF в опухолевых клетках, и в случае подтверждения опухолевой трансформации клеток - оперативное вмешательство, гемитиреоидэктомию.

Использование заявляемого способа дает возможность исключить риск врачебной ошибки в диагностике природы узловых образований щитовидной железы и выборе тактики ведения пациентов в сомнительных случаях.

Заявляемый способ дифференциальной диагностики был применен у 61 пациента (как мужчины, так и женщины) возрастом от 30 до 75 лет, которые обратились в клинику эндокринной хирургии для тиреоидэктомии. Все пациенты, участвовавшие в исследовании, дали на это письменное добровольное информированное согласие. Во время предоперационного УЗИ-исследования отбиралась ТАПБ по стандартной методике, при заполнении направления на цитологическое исследование указывали описание локализации и ультразвуковых характеристик узла. Материал биопсии доставлялся в лабораторию в шприце в течение 30 минут после взятия, и сразу же после поступления содержимое шприца выдавливали в пробирку-эппендорф, содержащую 0,5 мл сыворотки, и добавляли 50 мкл хлорида кальция, после чего помещали в термостат на 30 минут. Полученный сгусток, содержащий биопсийный материал, фиксировали в 10% забуференном формалине в течение двух часов и подвергали гистологической проводке по стандартной методике из инструкции и руководств пользователя приборов для гистолаборатории фирмы Leica (Австрия) и Millestone (Италия) - вырезная станция Leec LTD, гистологический процессор Logos, заливочная станция, автоматический микротом и микроскоп Leica. Из парафинового блока изготавливали тонкие срезы, окрашивали их гематоксилином и эозином в ручном стандартном протоколе согласно инструкции к реагентам (Биовитрум, Россия). Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования использовали срезы с тех же блоков, уложенные на высокоадгезивные стекла. Протокол ИГХ соответствовал рекомендациям, указанным производителями антител и иммуностейнеру Bond Max (Leica, Австрия). Использовали антитела Ki-67 (клон ММ1, RTU; Novocastra, Великобритания) и Fas-R (ab82419, концентрат, разведение 1:200; Abcam, США). Окрашенные препараты просматривали под микроскопом DM 2000 (Leica, Германия) с объективами Plan10x, Plan 40х. Расчет индекса соотношения уровней экспрессии маркеров проводили по формуле Z=Fas-R / (Ki-67+1), где Z - индекс злокачественности, Fas-R и Ki-67 - среднее количество позитивных клеток, окрашенных соответствующим маркером, по 10 полям зрения в препарате. Операционный материал, поступивший от этих же больных, фиксировали в формалине и подвергали тем же процедурам, что и материал ТАПБ.

При подозрении на наличие мутации BRAF в гене V600E делали парафиновую стружку из материала клеточного блока, выполняли экстракцию ДНК, используя набор для выделения ДНК из тканей, заключенных в парафин «ДНК-Ткань-Ф-100» по ТУ 21.20.23-009-97638376-2016 и методом ГЩР-РВ на приборе Амплификатор LightCycler®96 System (Roche) в пробе геномной ДНК, используя набор реагентов для определения статуса мутаций гена BRAF, определяли искомую мутацию.

Исследование было выполнено в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (ред. 2013 г).

В 97% случаев результаты реакции по заявляемому способу на предоперационном этапе показали соответствие с послеоперационным диагнозом. Наиболее высокие значения маркера Ki-67 (15-20 клеток в поле зрения) наблюдали у пациентов с токсическим зобом или аутоиммунным тиреоидитом. То есть, данный маркер в изолированном применении не специфичен для онкологической патологии щитовидной железы, а в сочетании с маркером апоптоза FAS-R и вычислении их соотношения он чувствителен и специфичен.

На основании анализа количества достоверно положительных, ложно - и достоверно отрицательных диагнозов по четырем нозологическим группам (Папиллярная карцинома (n=29), Токсический зоб (n=13), Аутоиммунный тиреоидит (n=5), Аденоматозный зоб (n=12) чувствительность заявляемого способа показала 96,80%, и специфичность - 96,17%. При этом у 38% пациентов с папиллярной микрокарциномой выявлена мутация BRAF в гене V600E. Применение предложенного способа дополнительно к стандартным методам исследования, таким как УЗИ и цитологическое исследование позволяет улучшить дооперационную диагностику и осуществить дальнейший выбор адекватного метода лечения.

Использование способа позволяет исследовать на внегоспитальном этапе узловые образования ЩЖ с большей точностью и информативностью по сравнению со способом-прототипом, а также выявить генетически обусловленную злокачественную микрокарциному, следовательно, дает возможность не только верифицировать диагноз, но и выбрать оптимальный способ терапии, определить адекватный объем оперативного вмешательства, особенно при многоузловом поражении щитовидной железы.

Способ подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1.

Пациентка И., 47 лет.во время планового УЗИ исследования щитовидной железы обнаружен узел 27×20 мм, с четкими контурами, гипоэхогенный. ТЗ - 2,2 нмоль/л, Т4 - 20,6 пмоль/л, ТТГ - 3,1 МЕ/мл, АТ-ТТГ - 40 мкМЕ/мл, АТ-ТПО - 12 мкМЕ/мл.

Проведена ТАПБ. В цитологических препаратах: аспират высокой клеточности. Форменные элементы крови, солидные пласты и микро-нормофолликулярные структуры из тироцитов. Ядра укрупнены, подчеркнуто округлой формы, нагромождаются. Феномен «голоядерности». Заключение: Подозрение на фолликулярную неоплазию. Категория по системе Bethesda 2017 - IV.

Проведена дифференциальная диагностика по заявляемому способу.

При проведении ИЦХ реакции индекс Z составил 0,92. Заключение: Вероятно, фолликулярная аденома. Низкий риск злокачественности. Не выявлена Мутация V600E гена BRAF в опухолевых клетках.

Проведена гемитиреоидэктомия. При гистологическом исследовании верифицирован диагноз: Фолликулярная аденома левой доли щитовидной железы (диаметр 2,7 см) без признаков инвазивного роста в собственную капсулу опухоли.

При использовании данного способа диагностики был определен характер патологического процесса и верно выбрана щадящая оперативная тактика ведения пациента.

Пример 2.

Пациентка А., 29 лет. во время планового УЗИ исследования щитовидной железы обнаружен узел 12×15 мм, с четкими контурами, гипоэхогенный. ТЗ - 2,1 нмоль/л, Т4 - 20,5 пмоль/л, ТТГ - 3,0 МЕ/мл, АТ-ТТГ - 38 мкМЕ/мл, АТ-ТПО - 11 мкМЕ/мл.

Проведена ТАПБ. В цитологических препаратах: на фоне эритроцитов и малых лимфоцитов, умеренно плотного коллоида определяются микро-нормофолликулярные и папиллярные скопления тироцитов со слабо полиморфными, укрупненными ядрами округлой и округло-овальной формы и наличием внутриядерных борозд, признаки нагромождения ядер. Заключение: Атипия неясного значения. Категория по системе Bethesda 2017 - III.

Проведена дифференциальная диагностика по заявляемому способу.

При проведении ИЦХ реакции индекс Z составил 1,04. Выявлена Мутация V600E гена BRAF в опухолевых клетках. Заключение: высокий риск злокачественности.

Проведена тиреоидэктомия. При гистологическом исследовании верифицирован диагноз: Папиллярная карцинома левой доли щитовидной железы (диаметр 1,2 см) без признаков инвазивного роста в собственную капсулу опухоли. pT1 L0 V0 Pn0.

При использовании данного способа диагностики был определен характер патологического процесса и верно выбрана оперативная тактика ведения пациента.

Пример 3.

Пациентка И., 36 лет во время планового УЗИ исследования щитовидной железы обнаружен узел 16×10 мм, с нечеткими контурами, гипоэхогенный. Т3 - 2,6 нмоль/л, Т4 - 13,4 пмоль/л, ТТГ - 4,0 МЕ/мл, АТ-ТТГ - 0,4 МЕ/мл, АТ-ТПО - 30 мкМЕ/мл.

Проведена ТАПБ. В цитологических препаратах: на фоне форменных элементов крови с умеренно плотным коллоидом определяются микро-нормофолликулярные и папиллярные скопления из тироцитов со слабо полиморфными, укрупненными и очагово нагромождающимися ядрами округлой и округло-овальной формы и наличием внутриядерных борозд. В фоновом материале - примесь умеренного количества малых лимфоцитов. Заключение: Атипия неясного значения. Категория по системе Bethesda 2017 - III.

Проведена дифференциальная диагностика по заявляемому способу.

При проведении ИЦХ реакции величина индекса Z составила 2,7. Заключение: Подозрение на папиллярную карциному. Средний риск злокачественности - ближе к высокому. Выявлена мутация V600E гена BRAF в опухолевых клетках.

Была проведена повторная ТАПБ: Подозрение на папиллярную карциному. Категория по системе Bethesda 2017 - VI. Планировалось проведение гемитиреоидэктомии. Выполнена тотальная резекция. При гистологическом исследовании верифицирован диагноз: Папиллярная карцинома правой доли щитовидной железы, ассоциированная с мутацией V600E гена BRAF, диаметр 1,6 см, без признаков прорастания капсулы щитовидной железы. pT1 L0 V0 Pn0.

При использовании данного способа удалось определить характер патологического процесса, верно определить тактику ведения пациентки и объем операции.

Пример 4.

Пациентка И., 58 лет во время УЗИ исследования щитовидной железы обнаружен узел 32×10 мм, с нечеткими контурами, изоэхогенный. Т3 - 1,8 нмоль/л, Т4 - 10,5 пмоль/л, ТТГ - 6,8 мкМЕ/мл, АТ-ТТГ - 1,5 мкМЕ/мл, АТ-ТПО - 56 мкМЕ/мл.

Проведена ТАПБ. В цитологических препаратах: на фоне форменных элементов крови со скудным комковатым коллоидом определяются кластеры, солидно-шаровидные скопления из тироцитов с признаками В-клеточной трансформации и дистрофическим ядерным полиморфизмом. Определяется наличие единичных трабекулярных и папиллярных структур с нагромождающимися овальными ядрами с неровными ядерными контурами и наличием внутриядерных борозд. Очаговая плоскоклеточная метаплазия. В фоновом материале - примесь макрофагов и единичных эпителиоидных многоядерных клеток, обилие лимфоидных клеток: малых лимфоцитов, клеток герминативных центров, единичных плазмоцитов. Заключение: Атипия неясного значения на фоне аутоимунного тиреоидита. Категория по системе Bethesda 2017 - III.

Пациентке проведена дифференциальная диагностика по заявляемому способу.

При проведении ИЦХ реакции индекс Z составил 3,3. Заключение: вероятно, папиллярная карцинома. Высокий риск злокачественности. Не выявлена мутация V600E гена BRAF в опухолевых клетках

Была проведена повторная ТАПБ: Папиллярная карцинома на фоне аутоимунного тиреоидита. Категория по системе Bethesda 2017 - VI. Проведена тиреоидэктомия. При гистологическом исследовании верифицирован диагноз: Папиллярная карцинома левой доли щитовидной железы, диаметр 3,1 см, без признаков прорастания капсулы щитовидной железы. рТ2 L0 V0 Pn0.

Применение заявляемого способа диагностики позволило определить характер патологического процесса, выполнена радикальная операция.

Пример 5.

Пациентка О., 60 лет во время УЗИ исследования щитовидной железы обнаружен узел 15×12 мм, с нечеткими контурами, изоэхогенный. Т3 - 1,7 нмоль/л, Т4 - 10,6 пмоль/л, ТТГ - 6,9 мкМЕ/мл, АТ-ТТГ - 1,5 мкМЕ/мл, АТ-ТПО - 54 мкМЕ/мл.

Проведена ТАПБ. В цитологических препаратах: эритроциты, комковатый коллоид, на их фоне определяются солидные шаровидные скопления тироцитов с признаками В-клеточной трансформации и ядерным полиморфизмом, наличие единичных трабекулярных и папиллярных структур с нагромождающимися овальными ядрами с неровными ядерными контурами и наличием внутриядерных борозд и инвагинатов. Очаговая плоскоклеточная метаплазия. В фоновом материале - примесь макрофагов и единичных эпителиоидных многоядерных клеток, обилие лимфоидных клеток: малых лимфоцитов, клеток герминативных центров, единичных плазмоцитов. Заключение: Атипия неясного значения на фоне аутоимунного тиреоидита. Категория по системе Bethesda 2017 - VI.

Пациентке проведена дифференциальная диагностика по заявляемому способу.

При проведении ИЦХ реакции индекс Z составил 2,9. Заключение: вероятно, папиллярная карцинома. Высокий риск злокачественности. Выявлена мутация V600E гена BRAF в опухолевых клетках

Была проведена повторная ТАПБ: Папиллярная карцинома на фоне аутоимунного тиреоидита. Категория по системе Bethesda 2017 - VI. Проведена тиреоидэктомия. При гистологическом исследовании верифицирован диагноз: Папиллярная карцинома левой доли щитовидной железы, диаметр 1,5 см, без признаков прорастания капсулы щитовидной железы. pT1 L0 V0 Pn0.

Применение заявляемого способа диагностики позволило определить характер патологического процесса, была выполнена радикальная операция.

Заявляемый способ обеспечивает повышение достоверности верификации опухолевых поражений щитовидной железы и может быть эффективно использован для диагностики опухолей в дооперационном периоде у больных с узловыми заболеваниями ЩЖ для выбора адекватного метода лечения.

Изобретение относится к области медицины, а именно к молекулярно-генетической диагностике в онкологии, и может быть использовано в комплексной предоперационной дифференциальной диагностике доброкачественной или злокачественной природы узловых образований щитовидной железы, определяющей выбор тактики лечения пациентов. Способ включает следующие стадии: выполняют тонкоигольную аспирационную биопсию узловых образований щитовидной железы под контролем ультразвукового исследования; приготавливают классический цитологический препарат и гистологический препарат из цитологического материала методом клеточного блока; проводят иммуноцитохимическую реакцию с маркером пролиферации Ki-67 и с апоптотическим маркером Fas-R на клеточном блоке. Затем измеряют уровни экспрессии маркеров Ki-67 и Fas-R и вычисляют индекс злокачественности Z по формуле. При величине индекса Z менее 1,1 судят о низком риске злокачественного роста узлового образования щитовидной железы. При величине индекса Z более 2,8 делают заключение о высоком риске злокачественности узлового образования щитовидной железы. При величине индекса Z в пределах 1,1 - 2,8 судят о среднем риске злокачественного роста опухоли и рекомендуют повторную тонкоигольную аспирационную биопсию с исследованием на наличие мутации V600E гена BRAF в опухолевых клетках, где при наличии мутации делают заключение о высоком риске злокачественности узлового образования. Способ обеспечивает повышение информативности и точности дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы на предоперационном этапе и позволяет выбрать адекватный метод лечения в алгоритме ведения пациентов. 4 пр.

Способ комплексной предоперационной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных узловых образований щитовидной железы, который включает выполнение тонкоигольной аспирационной биопсии узлов под контролем ультразвукового исследования, приготовление цитологического препарата, изготовление клеточного блока и проведение иммуноцитохимического анализа экспрессии маркера пролиферации Ki-67 и апоптоза Fas-R, отличающийся тем, что дополнительно на материале клеточного блока вычисляют индекс злокачественности Z по формуле Z=Fas-R/(Ki-67+1), где Fas-R - среднее количество позитивных клеток, окрашенных маркером апоптоза, a Ki-67 - среднее количество позитивных клеток, окрашенных маркером пролиферации, по 10 полям зрения в препарате; далее при величине индекса Z менее 1,1 судят о низком риске злокачественного роста узлового образования щитовидной железы, при величине индекса Z более 2,8 делают заключение о высоком риске злокачественности узлового образования щитовидной железы, при величине индекса Z в пределах 1,1-2,8 судят о среднем риске злокачественного роста опухоли и рекомендуют проведение дополнительного молекулярно-генетического исследования на наличие мутации V600E гена BRAF в опухолевых клетках, при наличии мутации делают заключение о высоком риске злокачественности узлового образования.