M2-ДЕФЕКТНЫЙ ПОКСВИРУС Российский патент 2024 года по МПК C12N15/863 A61K39/275 C12N7/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области онколитических вирусов. Согласно изобретению предложены новые поксвирусы, которые сконструированы дефектными в отношении функции, кодируемой локусом M2L (а именно, функции m2 ). Такие поксвирусы не обладают функциональной активностью связывания m2 с по меньшей мере одним или обоими костимулирующими антигенами CD80 и CD86. Указанные онколитические поксвирусы предпочтительно представляют собой вирус осповакцины, имеющий полную или частичную делецию локуса M2L. Настоящее изобретение также относится к клеткам и композициям, содержащим такие поксвирусы, и их применению для лечения пролиферативных заболеваний, таких как раковые заболевания, и для предупреждения заболеваний (вакцинация, особенно в области ветеринарии). Более точно, согласно изобретению предложена альтернатива существующим онколитическим вирусам, которые широко используются в виротерапии. М2-дефектные поксвирусы особенно полезны для экспрессии иммуномодулирующих полипептидов, таких как антитела против CTLA-4, с целью стимуляции или улучшения иммунного ответа.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Каждый год рак диагностируется у более чем 12 миллионов субъектов по всему миру. В промышленно развитых странах приблизительно один человек из пяти умрет от рака. Несмотря на то, что существует огромное количество химиотерапевтических средств, они часто являются неэффективными, особенно против злокачественных и метастатических опухолей, которые образуются на очень ранней стадии заболевания.

Онколитическая виротерапия является перспективной на протяжении двух десятилетий, в основе которой лежит разрушение раковых клеток репликационно-компетентными вирусами (Russell et al., 2012, Nat. Biotechnol. 30 (7): 658-70). Bo множестве доклинических и клинических исследований в настоящее время продолжают оценивать в разных типах раковых заболеваний терапевтический потенциал онколитических вирусов, вооруженных целым рядом терапевтических генов.

Терапевтические гены обычно вставляют в геном вируса в неосновные гены для сохранения онколитического фенотипа. Вставка в локус J2R (tk) широко используется в данной области, поскольку она также облегчает идентификацию рекомбинантного вируса в присутствии BUdR (Mackett et al., 1984 J. of Virol., 49: 857-64; Boyle et al., 1985, Gene 35, 169-177). Однако, также предложены другие локусы, например, во фрагмент Hind F, в локус M2L (Smith et al., 1993, Vaccine 11 (1): 43-53; Guo et al., 1990, J. Virol. 64: 2399-2406; Bloom et al., 1991, J. Virol. 65 (3): 1530-42; Hodge et al., 1994, Cancer Res. 54: 5552-5; McLaughlin et al., 1996, Cancer Res. 56: 2361-67) и локус A56R (кодирующий гемагглютинин (НА)).

Поксвирусы и особенно вирусы осповакцины (VV - от англ. Vaccinia viruse) предложили несколько перспективных онколитических кандидатов (De Graaf et al., 2018, doi.org/10.1016/j.cytogfr.2018.03.006), таких как JX594 (Sillajen/Transgene), GL-ONC1 (Genelux), TG6002 (Transgene) и vvDD-CDSR (Университет Питсбурга). Данные онколитические VV происходят из разных штаммов VV с разными модификациями генома и экспрессией разных терапевтических генов. JX-594 (штамм Wyeth), ослабленный из-за делеции вирусного гена J2R (который кодирует тимидинкиназу (tk)) и дополнительно вооруженный GM-CSF (от англ. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), в настоящее время проходит клиническую оценку в рандомизированном испытании, фаза III, при гепатоцеллюлярной карциноме (Parato et al., 2012, Molecular Therapy 20(4): 749-58). GL-ONC1 получали посредством вставки трех экспрессионных кассет соответственно вместо локусов F14.5L, J2R и A56R исходного генома вируса штамма Lister. В то же время TG6002, J2R (tk) и I4L (локус I4L кодирует рибонуклеотидредуктаза(rr-))-дефектный VV (штамм Copenhagen), кодирующий фермент FCU1, который превращает нетоксичный 5-фторцитозин (5-FC (от англ. fluorocytosine)) в цитотоксичный 5-фторурацил (5-FU (от англ. fluorouracile)), оценивается в некоторых клинических испытаниях. Двойная делеция tk и rr ограничивает репликацию вируса клетками, содержащими высокий пул нуклеотидов, делая TG6002, неспособным к репликации в покоящихся клетках (Foloppe et al., 2008, Gene Ther. 15: 1361-71; WO 2009/065546). vvDD-CDSR в настоящее время анализируют у пациентов с трудно поддающимися лечению кожными и подкожными опухолями. Он был сконструирован посредством двойной делеции tk (локус J2R) и генов, кодирующих фактор роста осповакцины (vgf - от англ. vaccinia growth factor), и вооружен как геном цитозиндезаминазы (CD - от англ. cytosine deaminase) для превращения 5-FC в 5-FU, так и геном рецептора соматостатина (SR - от англ. somatostatin receptor) для визуализации in vivo.

Исходно, считается, что непосредственный онколизис является единственным механизмом, посредством которого онколитические вирусы оказывают свое противоопухолевое действие. Только лишь недавно признали, что иммунная система играет крайне важную роль в успехе виротерапии (Chaurasiya et al., 2018, Current Opinion in Immunology 51: 83-90). Однако, большинство вирусов развили самозащитные механизмы за счет репертуара белков, участвующих в уклонении от надзора иммунной системы и иммуномодуляции, нацеленных на блокирование многих стратегий, используемых хозяином для противостояния вирусным инфекциям (Smith and Kotwal, 2002, Crit. Rev. Microbiol. 28 (3): 149-85). Кроме того, опухолевые клетки также развили механизм истощения Т-клеток для избегания иммунной системы хозяина, который характеризуется повышающей регуляцией ингибиторных рецепторов; причем CTLA-4 (в случае белка, ассоциированного с цитотоксическим Т-лимфоцитом,-4; также известен как CD152) и PD-1 (в случае белка запрограммированной гибели клеток 1) и его лиганды PD-L1 и PD-L2 являются наиболее документально подтвержденными. Данные иммунодепрессивные рецепторы служат в качестве иммунных контрольных точек, действующих на разных уровнях Т-клеточного иммунитета. CTLA-4 ингибирует ранние стадии активации Т-клеток в лимфатическом узле и также стимулирует нежелательные Treg, в то время как PD-1 действует на более поздней стадии.

Более конкретно, активация Т-клеток включает взаимодействие костимулирующих лигандов, таких как CD80 (также обозначаемый В7-1) и CD86 (также обозначаемый В7.2), присутствующих на поверхности АРС (от англ. Antigen Presenting Cell - антигенпрезентирующая клетка), с рецепторами, находящимися на поверхности Т-клеток, такими как CD28, CTLA-4 и PDL-1. CD80 представляет собой лиганд для данных 3 рецепторов клеточной поверхности, тогда как CD86 связывает CD28 и CTLA-4. Рецептор CD28 конститутивно экспрессируется на покоящихся Т-клетках, и лигирование CD28 с костимулирующими лигандами CD80 и CD86 доставляет положительный стимулирующий сигнал к Т-клеткам, индуцирует их пролиферацию и секрецию IL-2 и ингибирует апоптоз через повышенный уровень экспрессии Bcl-XL (Chen, 2004, Nat. Rev. Immunol. 4: 336-347). Напротив, CTLA-4 или PD-L1 играют роль в негативной регуляции Т-клеток или после исходной активации Т-клеток (в случае CTLA-4) или на более поздней стадии (в случае PD-L1). Конкретно, при лигировании с костимулирующими лигандами CD80 и CD86 CTLA-4 действует in cis на активированные Т-клетки, препятствуя костимулирующему сигналу, обеспеченному взаимодействиями CD28 с CD80 и CD86, и участвует в продукции IL-10. Кроме того, CTLA-4 конститутивно экспрессируется на субпопуляции иммунодепрессивных регуляторных Т-клеток (Treg). С другой стороны, показали, что лигирование CD80 с PD-L1 на поверхности регуляторных Т-клеток увеличивает пролиферацию данных иммунодепрессивных клеток (Yi, 2011, J Immunol. 186:2739-2749). CTLA4 идентифицировали в 1987 году (Brunet et al., 1987, Nature 328: 267-70), и он кодируется геном CTLA4 (Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18: 1901-5). Полную последовательность нуклеиновой кислоты CTLA-4 можно найти под номером доступа в GenBank LI 5006.

Растет интерес в блокировании таких иммунодепрессивных контрольных точек как в средстве спасения истощенных противоопухолевых Т-клеток. Огромное число антител-антагонистов разработано за последнее десятилетие (Kahn et al., 2015, J. Oncol. Doi: 10.1155/2015/847383), и несколько одобрено FDA (от англ. Food and Drug Administration - Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов), из которых первые были против CTLA4 (например, ипилимумаб / Yervoy, Bristol-Myers Squibb) и PD-1 (пембролизумаб / Keytruda, разработанный Merck, и ниволумаб / Optivo, разработанный BMS). В то время, как общепринятые способы лечения основаны на введении антител пациентам, в настоящее время считается, что векторизация посредством вирусных или плазмидных векторов доставляет данные антитела непосредственно к опухолевым клеткам (см., например, WO 2016/008976). Например, было показано, что tk- и rr- VV, вооруженный антителом против PD-1, индуцирует контроль роста опухоли в мышиной модели МСА-205 (Kleinpetter et al., 2016, Oncolmmunology 5 (10): e1220467).

Однако, из-за сложной природы данных молекул, взаимодействующих с иммунитетом, и вирусных векторов и риска запуска каскадных событий, доклинические и даже более того клинические исследования может быть сложно осуществить.

Таким образом, все еще существует необходимость в дальнейшей разработке онколитических вирусов, композиций и способов доставки терапевтических полипептидов, таких как антитела-антагонисты, направленные на контрольные точки, для усиления противоопухолевых адаптивных иммунных ответов у раковых пациентов.

Техническая проблема и предложенное решение

Неожиданно, авторы изобретения идентифицировали, что супернатанты клеток, инфицированных вирусом осповакцины (W), взаимодействуют с костимулирующими лигандами CD80 и CD86, тогда как супернатанты клеток, инфицированных ослабленным модифицированным вирусом осповакцины Ankara (MVA - от англ. Modified Vaccinia virus Ankara), не обладают данным свойством. Авторы изобретения приписали свойства связывания CD80 и CD86 белку М2, кодируемому локусом M2L VV. До данного изобретения о М2 сообщалось как о белке, сохраняющемся в эндоплазматическом ретикулуме, действующем как ингибитор NfKb-пути (Hinthong et al., 2008, Virology 373(2): 248-62) и участвующем в «раздевании» вируса (Baoming Liu et al., 2018, J. Virol. 92 (7) e02152-17). Помимо VV, авторы изобретения идентифицировали существование ортологов М2 у целого ряда репликативных поксвирусов.

В настоящем изобретении проиллюстрирована способность белка М2 к связыванию с CD80 и CD86 и воздействию на три иммунодепрессивных пути; соответственно, i) он блокирует взаимодействие CD80 и CD86 с CD28; ii) он стимулирует взаимодействие CD80 с PD-L1; и iii) он стимулирует обратную передачу сигнала к CD80/CD86 позитивным клеткам.

В контексте настоящего изобретения авторы изобретения получили вирус осповакцины, который является дефектным в отношении функции m2. При оснащении иммуномодулирующим полипептидом, таким как антитело против CTLA-4, его экспрессия ингибирует CTLA-4-опосредованные иммунодепрессивные сигналы, и ожидают, что отсутствие m2 позволяет перенаправлять Т-клеточный ответ к CD28-опосредованным иммуностимулирующим сигналам, тогда как M2L-позитивный вирус осповакцины будет негативно препятствовать таким CD28-опосредованными позитивным сигналам из-за связывания m2 с костимулирующими лигандами CD80 и CD86.

Важно и неожиданно, поксвирусы, описанные в данном документе, как ожидают, стимулируют или улучшают иммунный ответ, особенно ответ, опосредованный лимфоцитами, на антиген за счет отсутствия синтеза функционального белка m2 в инфицированных клетках, тогда как в традиционном поксвирусе (M2L-позитивном), продуцируемый вирусный белок m2 будет связывать костимулирующие лиганды CD80 и CD86 и, таким образом, предотвращать CD28-опосредованные позитивные пути. Кроме того, поксвирусы, описанные в данном документе, демонстрируют повышенную склонность к тому, чтобы быть принятыми иммунной системой хозяина, поскольку они не обладают белком, участвующим в уклонении вируса от иммунного надзора; признак, который обеспечивает конкурентное преимущество над М2-позитивными поксвирусами. Согласно настоящему изобретению предложен уникальный продукт, объединяющий онколизис для уничтожения делящихся клеток и иммуностимулирующие активности, например, для прекращения истощения иммунной системы, ассоциированного с раком, таким образом, улучшая терапевтические возможности онколитического вируса.

Данная техническая проблема решается, благодаря предложению воплощений, как определено в формуле изобретения. Другие и дополнительные аспекты, признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего описания предпочтительных в настоящее время воплощений изобретения. Данные воплощения приведены с целью раскрытия.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Раскрытие относится к поксвирусам, главным образом онколитическим поксвирусам, которые сконструированы дефектными в отношении белка m2, кодируемого локусом M2L, и способам получения и использования таких вирусов. Как раскрыто в данном документе, получали и выделяли поксвирусы, дефектные в отношении функции m2, кодируемой локусом M2L, возможно в комбинации с другой(ими) функциональной(ыми) инактивацией(ями) tk-кодирующего локуса и/или rr-кодирующего локуса. Также рассматриваются m2 - дефектный вирус осповакцины, сконструированный экспрессирующим антитело против CTLA4.

Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен модифицированный поксвирус, геном которого содержит в нативном контексте (дикий тип) локус M2L, кодирующий функциональный поксвирусный белок m2, и который модифицирован таким образом, что является дефектным в отношении указанной функции m2 ; где указанный функциональный поксвирусный белок m2 способен связывать костимулирующие лиганды CD80 или CD86 или оба костимулирующих лиганда CD80 и CD86, и где указанная дефектная функция m2 не может связывать указанные костимулирующие лиганды CD80 и CD86.

В одном воплощении модифицированный поксвирус образован или получен из Chordopoxvirinae, предпочтительно выбранных из группы рода, состоящего из Avipoxvirus, Capripoxvirus, Leporipoxvirus, Molluscipoxvirus, Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Suipoxvirus, Cervidpoxvirus и Yatapoxvirus. В одном предпочтительном воплощении указанный модифицированный поксвирус представляет собой член рода Orthopoxvirus, предпочтительно выбран из группы, состоящей из вируса осповакцины (VV), вируса коровьей оспы (CPXV - от англ. cowpox virus), вируса оспы енота (RCN - от англ. raccoonpox virus), вируса оспы кроликов, вируса оспы обезьян, вируса оспы лошадей, вируса оспы полевок, вируса оспы скунсов, вируса натуральной оспы (или черной оспы) и вируса оспы верблюдов; с конкретным предпочтением в отношении модифицированного вируса осповакцины.

В одном воплощении неспособность связывать указанные костимулирующие лиганды CD80 и CD86 происходит в результате генетического повреждения в пределах локуса M2L или в результате ненормального взаимодействия, нарушающего функцию m2, или прямо или опосредованно. Указанное(ые) генетическое(ие) повреждение(я) включает(ют) частичную или полную делецию и/или одну или более немолчащих мутаций (которые трансформируются в изменение аминокислотного(ых) остатка(ов)) или в пределах m2 -кодирующей последовательности или в регуляторных элементах, контролирующих экспрессию M2L, что предпочтительно приводит к синтезу дефектного белка m2 или к отсутствию синтеза m2 . Указанное генетическое повреждение предпочтительно представляет собой частичную или полную делецию локуса M2L.

В одном воплощении модифицированный поксвирус дополнительно модифицирован в области, отличной от локуса M2L; в частности, в локусе J2R (что приводит к получению модифицированного поксвируса, дефектного как в отношении функции m2, так и в отношении функции tk) или в локусе/локусах I4L/F4L (что приводит к получению модифицированного поксвируса, дефектного в отношении и функции m2 и функции rr). Предпочтительно, модифицированный поксвирус дополнительно модифицирован в локусах J2R и I4L/F4L, что приводит к получению модифицированного поксвируса, дефектного в отношении активностей m2, tk и rr.

В одном воплощении модифицированный поксвирус является онколитическим.

В одном воплощении указанный модифицированный поксвирус является рекомбинантным. Указанный модифицированный поксвирус предпочтительно сконструирован таким образом, чтобы экспрессировать по меньшей мере один полипептид, выбранный из группы, состоящей из антигенных полипептидов, полипептидов, обладающих функцией модулирования пула нуклеозидов/нуклеотидов, и иммуномодулирующих полипептидов. Указанный иммуномодулирующий полипептид желательно выбран из группы, состоящей из цитокинов, хемокинов, лигандов и антител или их любой комбинации. В одном предпочтительном воплощении указанный модифицированный поксвирус является дефектным в отношении активностей m2, tk и rr и кодирует антитело против CTLA-4. В еще одном предпочтительном воплощении указанный модифицированный поксвирус является дефектным в отношении активностей m2, tk и rr и кодирует антитело против PD-L1.

Согласно еще одному аспекту предложен способ получения модифицированного поксвируса, включающий следующие стадии: а) получение линии клеток-продуцентов, b) осуществление трансфекции или инфицирования полученной линии клеток-продуцентов модифицированным поксвирусом, с) культивирование линии трансфицированных или инфицированных клеток в подходящих условиях таким образом, чтобы обеспечить получение вируса, d) выделение полученного вируса из культуры указанной линии клеток-продуцентов и возможно е) очистка указанного выделенного вируса.

Согласно еще одному аспекту предложена композиция, содержащая терапевтически эффективное количество модифицированного поксвируса и фармацевтически приемлемый носитель. Композиция желательно содержит от приблизительно 10³ до приблизительно 10¹² БОЕ (Бляшкообразующая единица), преимущественно от приблизительно 10⁴ БОЕ до приблизительно 10¹¹ БОЕ, предпочтительно от приблизительно 10⁵ БОЕ до приблизительно 10¹⁰ БОЕ; и более предпочтительно от приблизительно 10⁶ БОЕ до приблизительно 10⁹ БОЕ модифицированного поксвируса. Композиция предпочтительно приготовлена для внутривенного или внутриопухолевого введения.

В еще одном аспекте композиция предназначена для применения для лечения или предупреждения пролиферативного заболевания, выбранного из группы, состоящей из раковых заболеваний, а также заболеваний, ассоциированных с повышенной активностью остеокластов, таких как ревматоидный артрит и остеопороз, и сердечнососудистых заболеваний, таких как рестеноз. Рак, предназначенный для лечения или предупреждения, предпочтительно выбран из группы, состоящей из рака почки, рака предстательной железы, рака молочной железы, рака толстой и прямой кишки, рака легкого, рака печени, рака желудка, карциномы желчного протока, рака эндометрия, рака поджелудочной железы и рака яичника. Модифицированный поксвирус и композиция предназначены для применения в качестве самостоятельной терапии или в совокупности с одной или более дополнительными терапиями, предпочтительно выбранными из группы, состоящей из оперативного вмешательства, лучевой терапии, химиотерапии, криотерапии, гормональной терапии, терапии на основе токсинов, иммунотерапии, терапии цитокинами, таргетной терапии рака, генной терапии, фотодинамической терапии и трансплантации.

В еще одном аспекте модифицированный поксвирус или композиция предназначены для применения для стимуляции или улучшения иммунного ответа.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 проиллюстрированы конкурентные анализы ELISA (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay - твердофазный иммуноферментный анализ) CD80/CTLA4 (1А) и CD86/CTLA4 (1В), провидимые с супернатантами, собранными из клеток DF1 птиц, или неинфицированных (пунктирная линия) или инфицированных VV дикого типа (ромб) или Yervoy (перевернутый треугольник). Связывание His-меченых белков B7-Fc с иммобилизованным CTLA4-Fc проводили, используя конъюгированное антитело против His-метки-HRP (от англ. horseradish peroxidase - пероксидаза хрена).

На Фиг. 2 проиллюстрирован конкурентный ELISA CD80/CTLA4,проводимый с супернатантами, собранными из клеток HeLa, инфицированных MVA (MVA), вирусом осповакцины штамма Copenhagen (Сор VV), штамма Western Reserve (WR VV), штамма Weyth (Wyeth VV), вирусом оспы енота (RCN), вирусом оспы кролика (RPX), вирусом коровьей оспы (СРХ), вирусом оспы кур (FPV) и вирусом псевдооспы коров (PCPV), и супернатантом неинфицированных клеток HeLa (отрицательный контроль).

На Фиг. 3 проиллюстрирован вестерн-блоттинг, проводимый в SDS-PAGE (от англ. sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) в невосстанавливающих условиях с супернатантами клеток CEF (от англ. chicken embryo fibroblast - фибробласт куриного эмбриона), или неинфицированных (Sup.cells), или инфицированных MVA (Sup.MVA) или вирусом осповакцины Copenhagen (Sup.VV), непосредственно собранными или концентрированными в 20 раз (х20), и исследовали с продуктами слияния человеческого CD86 с фрагментом Fc (hCD86-Fc), человеческого CD80 с фрагментом Fc (hCD80-Fc) и человеческого CTLA4 с фрагментом Fc (hCTLA4-Fc). Выявление проводили посредством конъюгированного антитела против Fc.

На Фиг. 4 проиллюстрирован конкурентный ELISA, анализирующий взаимодействие биотинилированного-CD80 и биотинилированного-CD86 с их когнатными рецепторами, CD28/CD86, CD28/CD80, CTLA4/CD80 и PDL1/CD80, соответственно. Супернатанты, собранные из клеток CEF, инфицированных MVA (MVA) и вирусом осповакцины штамма Copenhagen (VV), сравнивают с супернатантом неинфицированных клеток CEF (CEF) (отрицательный контроль) и антитела Yervoy (10 мкг/мл). Реактивность рекомбинантного человеческого PD1 (hPD1), человеческого CD80 (hCD80) и человеческого CTLA4 (hCTLA4), все в количестве 10 мкг/мл, использовали в качестве положительного контроля для конкуренции с взаимодействием PDL1/CD80. Выявление связанных биотинилированных белков В7 проводили, используя HRP-конъюгированный стрептавидин.

На Фиг. 5А проиллюстрирован экспериментальный подход, используемый для идентификации «фактора интерференции» (IF - от англ. interference factor) посредством аффинной хроматографии с иммобилизованным слитым белком CD86-Fc, и на Фиг. 5В предложена последовательность IF, захваченного в W-инфицированных клетках CEF.

На Фиг. 6 проиллюстрирован конкурентный ELISA CD80/CTLA4, проводимый с супернатантами, собранными из неинфицированных клеток HeLa или DF1 (HeLa или DF1) в качестве отрицательных контролей или инфицированных вирусом осповакцины Copenhagen с двойной делецией (tk- rr-) (WTG18277) или вирусом осповакцины Copenhagen с тройной делецией (tk- rr- m2-) (COPTG19289). Связывание his-меченых белков CD80-Fc с иммобилизованным CTLA4-Fc контролировали, используя конъюгированное антитело против His-метки-HRP.

На Фиг. 7 проиллюстрирована онколитическая активность tk- rr- m2 -вируса осповакцины (COPTG19289) и его tk- rr- аналога (WTG18277) через четверо суток после инфицирования клеток LOVO (А) и НСТ116 (В) при разной MOI (от англ. multiplicity of infection - множественность заражения) (от 10^-1 до 10^-4). Клетки, обработанные имитатором, используют в качестве отрицательного контроля.

На Фиг. 8 проиллюстрирована экспрессия люциферазы у мышей C57BL/6, которым подкожно имплантировали опухоли B16F10. Вирус WTG18277 и COPTG19289 (10⁷ БОЕ) инъецировали внутриопухолевым образом в сутки 0, 3, 6, 10 и 14, и образцы опухолей собирали в сутки 1, 2, 6, 9, 13 и 16 для оценки активности люциферазы на грамм опухоли (RLU (от англ. Relative luminescence unit - относительная единица люминесценции)/г опухоли). Трех мышей включали к моменту времени.

На Фиг. 9 проиллюстрирована противоопухолевая активность у мышей Balb/c, которым подкожно имплантировали опухоли СТ26. 10⁷ БОЕ WTG18277 (квадрат), COPTG19289 (треугольник) или имитатор (кружок) инъецировали внутриопухолевым способом в сутки D0, D3, D6, D10 и D14 (10 мышей/группа). За ростом опухоли следили два раза в неделю (мышей умерщвляли, когда объем опухоли достигал 2000 мм³).

На Фиг. 10 проиллюстрирована противоопухолевая активность у швейцарских голых мышей, которым подкожно имплантировали опухоли НТ116. Мыши (10 мышей/группа) получали одну внутривенную инъекцию в D10, когда опухоль достигала 100-200 мм³, или 10⁵ (А) или 10⁷ (В) БОЕ WTG18277 (кружок), COPTG 19289 (квадрат) или имитатора (ромб). За ростом опухоли следили два раза в неделю.

На Фиг. 11 проиллюстрировано действие супернатанта клеток, инфицированных М2-дефектным поксвирусом, на реакцию смешанных лимфоцитов (MLR - от англ. mixed lymphocyte reaction). РВМС (от англ. peripheral blood mononuclear cell - мононуклеарная клетка периферической крови) очищали у двух разных доноров и культивировали в присутствии супернатантов, полученных из CEF, инфицированных (MOI 0,05) COPTG19289 (tk-, rr- и m2-), WTG18058 (tk- rr-) или MVAN33 (дикий тип). Супернатанты культуры собирали через 48 ч после инфицирования и концентрировали примерно в 20 раз. Данные концентрированные супернатанты добавляли к культуре РВМС (20 мкл в 200 мкл), или неразведенными или разведенными в 10 или 100 раз с получением конечной «концентрации супернатанта» 2, 0,2 и 0,02-кратной, соответственно. Количество IL-2, секретируемое в культуральную среду РВМС, измеряли посредством ELISA. Измерение IL-2 делали в трехкратной повторности для каждого анализируемого образца. Измерения нормировали посредством деления среднего значения концентрации IL-2 трех повторностей данного образца на среднее значение концентрации IL-2 трех повторностей РВМС, инкубируемых со средой.

На Фиг. 12 проиллюстрировано воздействие на объем опухоли, обеспечиваемое М2-дефектным COPTG19289 в модели гуманизированной мыши. NOD/Shi-scid/IL-2RYnull иммунодефицитных мышей (NCG) гуманизировали посредством CD34+ стволовых клеток человека, и им прививали клетки карциномы толстой и прямой кишки человека НСТ-116 (5×10⁶ клеток инъецировали п. к. (подкожно) в одну боковую поверхность мыши; представляя D0). Через двенадцать суток после имплантации (D12) мыши получали одну в.в. (внутривенную) инъекцию или COPTG 19289 (TD) или m2+ аналога WTG18058 (DD) в дозах 10⁶ БОЕ (А) или 10⁵ БОЕ (В). Мышей, обработанных носителем, использовали в качестве отрицательных контролей. Рост опухоли отслеживали на протяжении 60 суток после имплантации клеток. Средний рост опухоли в мм³ представлен для каждой группы в зависимости от числа суток после инъекции клеток.

На Фиг. 13 проиллюстрировано воздействие на выживаемость, обеспечиваемое М2-дефектным COPTG19289, в модели гуманизированной NCG-CD34+ мыши, описанной выше. Через двенадцать суток после имплантации опухоли (D12) мыши получали одну в.в. инъекцию или COPTG 19289 (TD) или m2+ аналога WTG18058 (DD) в дозах 10⁶ БОЕ (А) или 10⁵ БОЕ (В). Мышей, обработанных носителем, использовали в качестве отрицательных контролей. Выживаемость мышей контролировали на протяжении 90 суток после имплантации клеток.

Выживаемость (процент) приведена для каждой группы в виде функции количества суток после инъекции клеток.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Общие определения

В данном документе предложен целый ряд определений, которые помогут в понимании данного изобретения. Однако, если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, как и обычно подразумеваемое средним специалистом в области, к которой принадлежит данное изобретение. Все ссылки, процитированные в данном документе, включены посредством ссылки во всей своей полноте.

В том виде, в котором они используются на протяжении всей заявки, термины в единственном числе используются в том смысле, что они означают «по меньшей мере один», «по меньшей мере первый», «один или более» или «множество» компонентов или стадий, на которые ссылаются, если контекстом явным образом не продиктовано иное. Например, термин «клетка» включает множество клеток, включая их смеси.

Термин «один или более» относится или к одному или к числу более одного (например, 2, 3, 4, 5 и т.д.).

Термин «и/или», где бы он не использовался в данном документе, включает значение «и», «или» и «все или любая другая комбинация элементов, соединенных указанным термином».

Термин «примерно» или «приблизительно», в том виде, в котором он используется в данном документе, означает в пределах 20%, предпочтительно в пределах 10% и более предпочтительно в пределах 5% данного значения или интервала.

В том виде, в котором он используется в данном документе, при использовании для определения продуктов, композиций и способов, термин «содержащий» (и любая форма слова содержащий, как например, «содержат» и «содержит»), «имеющий» (и любая форма слова имеющий, как например, «имеют» и «имеет»), «включающий» (и любая форма слова включающий, как например, «включает» и «включают») или «содержащий» (и любая форма слова содержащий, такая как «содержит и «содержат»), являются открытыми и не исключают дополнительных, непроцитированных элементов или стадий способа. Таким образом, полипептид «содержит» аминокислотную последовательность, когда данная аминокислотная последовательность могла бы быть частью конечной аминокислотной последовательности полипептида. Термин «состоящий из» означает исключение других компонентов или стадий любой существенной значимости. Таким образом, композиция, состоящая из процитированных компонентов, не будет исключать микропримесей и фармацевтически приемлемых носителей. Полипептид «состоящий из» аминокислотной последовательности относится к наличию такой аминокислотной последовательности с возможно только несколькими дополнительными и заменимыми аминокислотными остатками. Тем не менее, предпочтительно, чтобы полипептид не содержал никаких аминокислот, кроме перечисленной аминокислотной последовательности. В настоящем описании термин «содержащий» (особенно при ссылке на конкретную последовательность) можно заменить термином «состоящий из», при необходимости.

В контексте настоящего изобретения термины «нуклеиновая кислота», молекула нуклеиновой кислоты», «полинуклеотид» и «нуклеотидная последовательность» используются взаимозаменяемо и определяют полимер любой длины или из полидезоксирибонуклеотидов (ДНК) (например, кДНК, геномная ДНК, плазмиды, векторы, вирусные геномы, выделенная ДНК, зонды, праймеры и их любая смесь) или из полирибонуклеотидов (РНК) (например, мРНК, антисмысловая РНК, миРНК (малые интерферирующие РНК)) или из смешанных полирибополидезоксирибонуклеотидов. Они охватывают одно- или двухцепочечные, линейные или кольцевые, природные или синтетические, модифицированные или немодифицированные полинуклеотиды.

Нужно понимать, что термин «полипептид» представляет собой полимер из по меньшей мере девяти аминокислотных остатков, связанных пептидными связями, независимо от его размера и присутствия или отсутствия посттрансляционных компонентов (например, гликозилирование). Никакого ограничения не накладывается на максимальное число аминокислот, содержащихся в полипептиде. Как общий показатель, термин относится к обоим коротким полимерам (обычно обозначаемым в данной области как пептид) и к более длинным полимерам (обычно обозначаемым в данной области как полипептид или белок). Данный термин охватывает нативные полипептиды, модифицированные полипептиды (также обозначаемые производными, аналогами, вариантами или мутантами), фрагменты полипептида, мультимеры полипептида (например, димеры), слитые полипептиды, среди прочего. Термин также относится к рекомбинантному полипептиду, экспрессируемому с полинуклеотидной последовательности, которая кодирует указанный полипептид. Обычно, данный термин включает трансляцию кодирующей нуклеиновой кислоты в последовательность мРНК и ее трансляцию посредством рибосомного механизма клетки, к которой доставляется полинуклеотидная последовательность.

Термин «идентичность» относится к соответствию аминокислоты аминокислоте или нуклеотида нуклеотиду между двумя полипептидными или нуклеотидными последовательностями. Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных положений, являющихся общими у данных последовательностей, принимая во внимание число гэпов, которые должны быть введены для оптимального выравнивания, и длину каждого гэпа. Разные компьютерные программы и математические алгоритмы доступны в данной области для определения процента идентичности между аминокислотными последовательностями, такие как, например, программа Blast, доступная на NCBI или ALIGN в Atlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoffed, 1981, Suppl., 3: 482-9), или алгоритм Needleman и Wunsh (J. Mol. Biol. 48,443-453, 1970). Программы для определения идентичности между нуклеотидными последовательностями также доступны в специализированной базе данных (например, программы Genbank, Wisconsin Sequence Analysis Package, BESTFIT, FAS ТА и GAP). Специалисты в данной области могут определять соответствующие параметры оценки выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. В иллюстративных целях фраза «по меньшей мере 70%» означает 70% или больше (включая 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, тогда как фраза «по меньшей мере 80%-ная идентичность» означает 80% или выше (включая 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% и по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%).

В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «выделенный» относится к компоненту (например, полипептиду, молекуле нуклеиновой кислоты, вирусу, вектору и т.д.), который удаляют из его природной среды (а именно, отделяют от по меньшей мере одного другого компонента(ов), с которым(и) он в природе ассоциирован или обнаружен в природе). Например, нуклеотидную последовательность выделяют, когда ее отделяют от последовательностей, обычно ассоциированных с ней в природе (например, отделяют от генома), но она может быть ассоциирована с гетерологичными последовательностями.

Термин «полученный из», «происходящий» или «происходят» и любой его эквивалент используют для идентификации исходного источника компонента (например, полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты, вируса, вектора и т.д.), но он не предназначен для ограничения способа, посредством которого получают компонент, который может быть получен, например, посредством химического синтеза или рекомбинантными средствами.

В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «клетка-хозяин» нужно понимать в широком смысле без какого-либо ограничения, касающегося конкретной организации в ткани, органе или выделенных клетках. Такие клетки могут принадлежать к одному типу клеток или группе разных типов клеток, как например, культивируемые линии клеток, первичные клетки и делящиеся клетки. В контексте изобретения термин «клетки-хозяева» предпочтительно относится к эукариотическим клеткам, таким как клетки млекопитающего (например, человека или млекопитающего, не являющегося человеком), а также клетки, способные продуцировать поксвирус, описанный в данном документе. Данный термин также включает клетки, которые могут быть или возможно были реципиентом поксвируса, а также потомство таких клеток.

Термин «субъект» обычно относится к организму, для которого необходимы или могут быть полезны любой поксвирус, композиция и способ, описанные в данном документе. Обычно, организм представляет собой млекопитающее, в частности млекопитающее, выбранное из группы, состоящей из домашних животных, сельскохозяйственных животных, спортивных животных и приматов. Предпочтительно, субъект представляет собой человека, у которого диагностировано или который находится в группе риска заболевания пролиферативным заболеванием, таким как рак. Термины «субъект» и «пациенты» могут использоваться взаимозаменяемо при ссылке не человеческий организм и охватывает мужчину и женщину. Субъект, подлежащий лечению, может быть новорожденным, ребенком грудного возраста, молодым человеком, взрослым или пожилым человеком.

Термин «лечение» (и любая форма слова лечение, такая как «осуществление лечения», «лечат»), в том виде, в котором он используется в данном документе, охватывает профилактику (например, превентивная мера у субъекта, находящегося в группе риска наличия патологического состояния, подлежащего лечению) и/или терапию (например, у субъекта, у которого диагностировано наличие патологического состояния), впоследствии в сочетании с общепринятыми терапевтическими способами. Результат лечения заключается в замедлении, излечении, улучшении состояния или контроле над прогрессированием патологического состояния, являющегося мишенью. Например, субъекта успешно лечат от рака, если после введения поксвируса, как описано в данном документе, субъект демонстрирует наблюдаемое улучшение своего клинического статуса.

Термин «введение» (или любая форма слова введение, такая как «вводимый»), в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к доставке субъекту терапевтического средства, такого как поксвирус, описанный в данном документе.

Термин «комбинация» или «ассоциация», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к любой организации, возможной для разных компонентов (например, поксвирус и одно или более веществ, эффективных в противораковой терапии). Такая организация включает смесь указанных компонентов, а также отдельные комбинации для одновременных или последовательных введений. Настоящее изобретение охватывает комбинации, содержащие равные молярные концентрации каждого компонента, а также комбинации с очень разными концентрациями. Следует принимать во внимание, что оптимальная концентрация каждого компонента комбинации может быть определена квалифицированным специалистом в данной области.

М2-дефектный поксвирус

В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен модифицированный поксвирус, геном которого содержит в нативном (дикий тип) контексте локус M2L, кодирующий функциональный проксвирусный белок m2, и который модифицирован для того, чтобы быть дефектным в отношении указанной функции пл2; где указанный функциональный поксвирусный белок m2 может связывать костимулирующие лиганды CD80 или CD86 или оба костимулирующих лиганда CD80 и CD86, и где указанная дефектная функция m2 неспособна связывать указанные костимулирующие лиганды CD80 и CD86.

В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «поксвирус» или «поксвирусный» относится к любому вирусу Poxviridae, идентифицированному в настоящее время или который будет идентифицирован позже, который является инфекционным в отношении одной или более клеток млекопитающего (например, клеток человека), и геном которого содержит в нативном (то есть дикий тип) контексте локус M2L, кодирующий функциональный так называемый белок М2. Термин «вирус», в том виде, в котором он используется в контексте поксвируса или любого другого вируса, упоминаемого в данном документе, охватывает геном вируса, а также вирусную частицу (в капсиде и/или геном, покрытый оболочкой).

Поксвирусы представляют собой большое семейство ДНК-вирусов, содержащих двухцепочечный геном. Подобно большинству вирусов, поксвирусы разработали механизмы самозащиты за счет репертуара белков, участвующих в уклонении от иммунного надзора и иммуномодуляции, которые нацелены на блокирование многих стратегий, используемых хозяином для борьбы с вирусными инфекциями (Smith and Kotwal, 2002, Crit. Rev. Microbiol. 28 (3): 149-85). Обычно, поксвирусный геном кодирует более чем 20 модификаторов ответа хозяина, которые позволяют вирусу управлять иммунными ответами хозяина и, таким образом, облегчают репликацию, распространение и передачу вируса. Данные модификаторы включают факторы роста, антиапоптотические белки, ингибиторы NFκB-пути и сигнализации с участием интерферона, и понижающие регуляторы главного комплекса гистосовместимости (МНС - от англ. major histocompatibility complex).

Для базового руководства геном вируса осповакцины (W) дикого типа содержит локус M2L, кодирующая последовательность которого кодирует белок, называемый m2, продуцируемый на ранней стадии жизненного цикла вируса. Он или секретируется или локализуется в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) и с большой вероятностью гликозилируется (Hinthong et al., 2008, Virology 373: 248-262). Несмотря на то, что его функция все еще исследуется, он участвует в «раздевании» вируса и репликации вирусной ДНК (Liu et al., 2018, J. Virol., doi/10.1128/JVI.02152-17), но он является несущественным для репликации вируса in vitro (Smith, 1993, Vaccine 11: 43-53). Кроме того, его функция понижающей регуляции клеточного транскрипционного фактора NF-κВ посредством ингибирования фосфорилирования Erk1 в настоящее время хорошо установлена (Gedey et al., 2006, J. Virol. 80: 8676-85), что указывает на то, что m2 участвует, таким образом, в противовирусном ответе хозяина во время инфицирования поксвирусом. Локус VV «M2L» находится в 5' третьем участке генома VV дикого типа; конкретно, кодирующая последовательность расположена между положением 27324 и положением 27986 генома VV Copenhagen (Сор). M2L Cop-кодируемый продукт гена представляет собой белок из 220 аминокислот (имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1; также раскрытую в Uniprot под номером доступа Р21092), и состоит из зрелого полипептида, длиной 203 аминокислотных остатка, включая 8 остатков Cys, и N-концевого сигнального пептида, длиной 17 аминокислотных остатков, также имеющего один остаток Cys.

Геном поксвируса в нативном контексте представляет собой двухцепочечную ДНК приблизительно из 200 т.п.н. и потенциально способен кодировать почти 200 белков с разными функциями, включая локус M2L. Геномная последовательность и кодируемые открытые рамки считывания (ORF - от англ. open reading frame) хорошо известны. Модифицированный поксвирус по изобретению содержит геном, который модифицирован человеком таким образом, чтобы быть дефектным по меньшей мере в отношении функции m2, кодируемой нативным локусом M2L, и может дополнительно содержать одну или более дополнительных модификаций, таких как модификации, описанные в данном документе.

Идентификация наличия локуса M2L в пределах поксвирусного генома

Определение того, содержит ли данный поксвирус или нет в нативном контексте локус M2L, кодирующий функциональный белок m2, доступно для специалиста, использующего информацию, данную в данном документе, и общее знание в данной области. Конкретный выбор технологии анализа не является крайне важным, и специалистам в данной области доступна адаптация любой из данных общепринятых методологий для определения того, содержит ли поксвирус - кандидат локус M2L, кодирующий функциональный белок m2.

В одном воплощении локус M2L может быть идентифицирован в данном поксвирусе посредством методик гибридизации или ПЦР (полимеразная цепная реакция), используя информацию, приведенную в данном документе, и конструируя соответствующие зонды или праймеры для скрининга последовательности генома поксвируса. Для общего руководства, анализы гибридизации обычно основаны на олигонуклеотидных зондах, полученных на основе информации об известной нуклеотидной (nt) последовательности, изложенной в данном документе, для локуса M2L, подлежащего выявлению, причем нуклеиновые кислоты выделяют из клеток, инфицированных или содержащих такой поксвирус-кандидат, в условиях, подходящих для гибридизации. Олигонуклеотидный зонд представляет собой коротки участок одноцепочечной РНК или ДНК (обычно длиной 10-30 нуклеотидов), который конструируют комплементарным (а именно, по меньшей мере с 80%-ной идентичностью) целевой последовательности M2L. Зонды предпочтительно метят для обеспечения выявления (например, радиоактивно, флуоресцентно или ферментативно-меченые зонды). Гибридизацию обычно проводят в жестких условиях, делающих возможным образование только специфичных гибридов.

В еще одном или альтернативном воплощении наличие локуса M2L в геноме данного поксвируса можно идентифицировать на основе аминокислотной последовательности кодируемого продукта гена. Например, наличие локуса M2L можно идентифицировать посредством анализа трансляции геномной последовательности и проведения исследования в BLAST аминокислотных последовательностей кодируемых открытых рамок считывания (ORF) в доступных базах данных против известных поксвирусных белков m2, таких как m2 VV Сор (SEQ ID NO: 1), или gp-120-подобного белка вируса миксомы (SEQ ID NO: 2) для исследования на наличие кодируемой ORF, демонстрирующей по меньшей мере 40%-ную, желательно по меньшей мере 50%-ную, предпочтительно по меньшей мере 70%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную и, как абсолютное предпочтение, по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1 или в SEQ ID NO: 2.

В качестве альтернативы или кроме того, аминокислотные последовательности ORF, кодируемые геномом поксвируса, могут быть выровнены против доступных баз данных. Считается, что поксвирус-кандидат содержит локус M2L, если он кодирует так называемое семейство полипептидов m2, которое дает результат после поиска в базах данных доменов (например, Gene3D, PANTHER, Pfam, PIRSF, PRINTS, ProDom, PROSITE, SMART, SUPERFAMILY или TIGRFAM), который является таким же, как результат белка VV m2 (на который дается ссылка в Uniprot под номером доступа Р21092; также раскрыт в данном документе, как SEQ ID NO: 1). Таким образом, поксвирус-кандидат идентифицируют как содержащий локус M2L, если он кодирует полипептид, которому, при внесении в анализ Blast с использованием приведенных выше баз данных, в Uniprot приписан опознавательный мотив PFAM №PF04887 или мотив Interpro №IPR006971.

Функциональность кодируемого белка m2

Функциональный белок m2, в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к способности указанного белка связывать костимулирующие лиганды CD80 и/или CD86 или in vitro или in vivo. Способность поксвируса кодировать функциональный полипептид m2 может быть оценена рутинными методиками. Стандартные анализы для оценки способности белка к связыванию со своей мишенью хорошо известны в данной области, включая, например, Biacore™, калориметрию, флуорометрию, биослойную интерферометрию, иммуноблоттинг (например, вестерн-блоттинг), RIA (от англ. radioimmune analysis - радиоиммунный анализ), проточную цитометрию и ELISA. Конкретный выбор технологии анализа не является крайне важным, и специалистам в данной области доступна адаптация любого и данных общепринятых методологий для определения того, связывается ли белок m2 - кандидат с костимулирующими лигандами CD80 и/или CD86.

Например, супернатанты клеток, инфицированных поксвирусом-кандидатом, можно использовать для исследования CD80 или CD86, или иммобилизованного на планшете (ELISA), или экспонированного на поверхности клетки (FACS - от англ. fluorescence-activated cell sorting - сортировка клеток с активированной флуоресценцией). «Сэндвич»-конкурентные анализы ELISA (см. раздел Примеры) являются особенно подходящими ввиду того факта, что отсутствует необходимость в получении меченого рекомбинантного белка для получения результата. Например, планшеты для ELISA могут быть покрыты лигандом, представляющим интерес, (например, CD86-Fc) перед добавлением образца, подлежащего анализу (например, супернатант клеток, инфицированных поксвирусом). Если образец содержит полипептид М2, он будет связываться с лигандом покрытия. Затем, добавляют лиганд для выявления, который обычно метят для выявления, например, под действием фермента, который превращает вещество для мечения в окрашенный продукт, который можно оценивать, используя планшет-ридер (например, CTLA4-Fc с His-меткой, распознаваемой антителами против His-метки, связанными с HRP (для пероксидазы хрена). Восстановление хромогенного выявления в присутствии образца кандидата, по сравнению с отсутствием образца или образцом отрицательного контроля, является признаком того, что образец содержит полипептид М2, конкурирующий с лигандом для выявления за связывание с лигандом покрытия. Также можно продолжать наоборот, например, посредством использования CTLA-4-Fc в качестве лигнанда покрытия и CD80-Fc-His-метка в качестве лиганда выявления.

Фраза «дефектный в отношении функции m2», в том виде, в котором она используется в данном документе, предназначена для обозначения неспособности белка m2 связывать костимулирующие лиганды CD80 и/или CD86 или in vitro или in vivo. Данная неспособность может быть обусловлена повреждением гена в пределах нативного локуса M2L, которое препятствует нормальной активности связывания кодируемого белка m2. Таким образом, функциональная инактивация могла происходить в результате одной или более мутаций в локусе M2L. Такая мутация предпочтительно выбрана из группы, состоящей из вставок, делеций и изменений оснований или в кодирующей последовательности или в регуляторных последовательностях, контролирующих экспрессию белка m2. В качестве альтернативы, функциональная инактивация может происходить в результате ненормального взаимодействия белка m2 с одним или более другими продуктами гена, которые связываются с или иным образом предотвращают функциональную активность указанного белка m2.

Для общего руководства авторы изобретения в действительности идентифицировали локус M2L (кодирующий функциональный белок m2 или его ортолог) в огромном разнообразии поксвирусов, как описано ниже в данном документе; более конкретно в семи штаммах вируса осповакцины, в семи штаммах вируса миксомы, в 4 штаммах вируса оспы обезьян, в множестве штаммов вируса коровьей оспы, в восьми штаммах вируса натуральной оспы, а также во множестве других поксвирусов, включая вирус оспы лошади, вирус оспы гололапых песчанок, вирус оспы верблюда, вирус оспы енота, вирус оспы скунса, вирус Yokapox, вирус фибромы кролика, вирус мурманской оспы, вирус Eptesipox, вирус оспы оленя, вирус оспы Тана, вирус Cotia и вирус оспы полевок, но, не ограничиваясь ими. В иллюстративных целях кодируемые ортологи белка М2 вируса оспы лошади, вируса натуральной оспы, вируса оспы обезьяны, вируса оспы верблюда, вируса коровьей оспы демонстрируют более чем 90%-ную идентичность с референсным белком m2 Сор (как представлено SEQ ID NO: 1), кодируемые ортологи белка М2 вирусов миксомы, оспы скунса, Cotia и оспы полевок демонстрируют соответственно 50%-ную, 74%-ную, 70%-ную и 72%-ную идентичность последовательностей с белком m2 CopVV, как проиллюстрировано в Таблице 1.

В Таблице 1 представлен обзор номеров доступа в Genbank для геномных последовательностей разных поксвирусов, содержащих локус M2L в нативном контексте и показатель идентичности аминокислот их белка m2 относительно белка m2 Сор (номер доступа в Uniprot Р21092 и SEQ ID NO: 1).

Для ясности, номенклатура генов, используемая в данном документе для обозначения локуса M2L поксвируса и кодируемого белка m2, соответствует вирусу осповакцины (и более конкретно соответствует штамму Copenhagen). Она также используется в данном документе для других поксвирусов, содержащих функционально эквивалентные гены M2L и белки m2, на которые ссылаются в данном документе, если особым образом не указано иное. В действительности, номенклатура гена и соответствующего продукта гена может быть разной в зависимости от семейств, родов и штаммов поксвируса, но соответствия между вирусом осповакцины и другими поксвирусами обычно имеются в литературе. В иллюстративных целях эквивалент гена M2L VV обозначается M154L в геноме миксомы, CPXV040 или P2L в геноме коровьей оспы, O2L в геноме оспы обезьяны, RPXV023 в геноме оспы кролика и O2L или Q2L в геноме вируса натуральной оспы.

Однако, геном нескольких поксвирусов, таких как ослабленный вирус осповакцины MVA (модифицированный вирус осповакцины Ankara) и вирус псевдооспы коров (PCPV - от англ. pseudocowpox virus), в нативном контексте не имеет локуса M2L (Antoine et al., 1998, Virology 244 (2) 365-96) из-за больших геномных делеций, случающихся во время процесса ослабления. В контексте изобретения термин «поксвирус» не включает поксвирусы, которые в нативном контексте имеют геномную(ые) делецию(и) или мутацию(и), охватывая локус M2L (или эквивалент), у которых, таким образом, отсутствует полипепид m2, или которые кодируют нефункциональный белок m2, такие как вирус псевдооспы коров (PCPV), вирус MVA и NYVAC.

В одном воплощении модифицированный поксвирус по настоящему изобретению образован или получен из Chordopoxvirinae, предпочтительно выбран из группы рода, состоящей из Avipoxvirus, Capripoxvirus, Leporipoxvirus, Molluscipoxvirus, Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Suipoxvirus, Cervidpoxvirus и Yatapoxvirus. Геномные последовательности данных поксвирусов доступны в данной области, а именно в специализированных базах данных, таких как Genbank или Refseq.

В одном предпочтительном воплощении модифицированный поксвирус образован или получен из Orthopoxvirus. Несмотря на то, что можно использовать любой ортопоксвирус, он предпочтительно выбран из группы, состоящей из вируса осповакцины (W), коровьей оспы (CPXV), оспы енота (RCN), оспы кролика, оспы обезьяны, оспы лошади, оспы полевок, оспы скунса, вируса натуральной оспы (или вируса черной оспы) и вируса оспы верблюда. Особенно предпочтительным является вирус осповакцины. Любой штамм вируса осповакцины является подходящим в контексте настоящего изобретения (за исключением MVA), включая, без ограничения, следующие штаммы: Western Reserve (WR), Copenhagen (Cop), Lister, LIVP, Wyeth, Tashkent, Tian Tan, Brighton, Ankara, LC16M8, LC16M0 и т.д., с особым предпочтением в отношении штаммов Lister, WR, Copenhagen и Wyeth. Их геномные последовательности имеются в литературе и Genbank (например, под номерами доступа AY678276 (Lister), М35027 (Сор), AF095689 1 (Tian Tan) и AY243312.1 (WR). Данные вирусы могут также быть получены из коллекций вирусов (например, АТСС VR-1354 для WR, АТСС VR-1536 для Wyeth и АТСС VR-1549 для Lister).

В еще одном воплощении модифицированный поксвирус образован или получен из рода Leporipoxvirus с предпочтением в отношении вируса миксомы (чьи геномные последовательности раскрыты в Genbank под номером доступа NP_051868.1). Локус ортолога M2L в вирусе миксомы обозначен локусом M154L и кодирует так называемый др120-подобный белок, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, и демонстрирующий 50%-ную идентичность с Cop-кодируемым белком m2 (SEQ ID NO: 1).

Дефектная функция m2

Как описано выше, неспособность белка m2 связывать костимулирующие лиганды CD80 и/или CD86 может происходить в результате повреждения гена в локусе M2L или в результате ненормального взаимодействия, нарушающего функцию m2 или прямо, или опосредовано. Конкретно, «дефектная функция m2» относится к пониженной способности, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или даже абсолютной неспособности связывать CD80 (например, человеческий) и CD86 (например, человеческий), по сравнению с нативным белком m2 (например, как обнаружено в супернатантах клеток, инфицированных m2 - позитивным поксвирусом), как измерено посредством общепринятого анализа, такого как конкурентный анализ ELISA.

Модифицированный поксвирус может быть сконструирован таким образом, чтобы являться дефектным в отношении функции m2, посредством целого ряда способов, известных специалистам в данной области, используя общепринятые молекулярные методики. В одном предпочтительном воплощении модифицированный поксвирус содержит по меньшей мере одно генетическое повреждение в нативном локусе M2L, которое приводит к подавленной экспрессии вирусом белка m2 . Такое(ие) генетическое(ие) повреждение(я) включает(ют) частичную или полную делецию и/или одну или более немолчащих мутаций (что преобразуется в изменение аминокислотного(ых) остатка(ов) или в пределах пл2-кодирующей последовательности, или в регуляторных элементах, контролирующих экспрессию M2L. Указанное(ые) генетическое(ие) повреждение(я) приводит(ят) к синтезу дефектного белка m2 (неспособного обеспечивать активность нативного белка, как описано выше) или отсутствию синтеза m2 (вовсе отсутствие белка). Например, указанное генетическое нарушение представляет собой частичную или полную делецию локуса M2L, например, частичную делецию, простирающуюся, начиная выше последовательностей, кодирующих m2, до по меньшей мере 100 кодонов последовательности, кодирующей m2. В качестве альтернативы или совместно, локус M2L может быть модифицирован посредством точечной мутации (например, введение стоп-кодона в пределах кодирующей последовательности), мутации со сдвигом рамки считывания (таким образом, чтобы модифицировать рамку считывания), инсерционной мутации (посредством вставки одного или более нуклеотидов, которые нарушают кодирующую последовательность) или посредством делеции или замены одного или более остатков, участвующих в или ответственных за функцию связывания CD80 и/или CD86, или их любой комбинации. Кроме того, чужеродная нуклеиновая кислота может быть введена в кодирующую последовательность с нарушением открытой рамки считывания m2. Кроме того, промотор гена может быть удален или мутирован, таким образом, ингибируя экспрессию M2L. Специалист в данной области на основе настоящего раскрытия легко бы определил, инактивирует ли функционально конкретная модификация m2, посредством сравнения белка m2 дикого типа и мутантного белка m2 в отношении их способности связывать CD80 и/или CD86, как проиллюстрировано в разделе

Примеры.

Другие модификации поксвирусов

В одном воплощении модифицированный поксвирус по настоящему изобретению дополнительно модифицируют в области, отличной от локуса M2L. Разные дополнительные модификации могут быть рассмотрены в контексте данного изобретения.

Одна или более дополнительных модификаций, охваченных настоящим изобретением, воздействуют, например, на онколитическую активность (например, улучшенная репликация в делящихся клетках), безопасность (например, опухолевая селективность) и/или иммунитет, индуцируемый вирусом, по сравнению с поксвирусом без таких модификаций. Типичные модификации предпочтительно касаются генов вируса, участвующих в метаболизме ДНК, вирулентности в отношении хозяина или IFN (от англ. interferon - интерферон)-пути (см., например, Guse et al., 2011, Expert Opinion Biol. Ther. 11 (5):595-608).

Особенно подходящим геном, подлежащим повреждению, является локус, кодирующий тимидинкиназу (tk) (J2R; номер доступа в Genbank ААА48082). Фермент tk участвует в синтезе дезоксирибонуклеотидов. Tk необходима для репликации вируса в нормальных клетках, поскольку данные клетки обычно имеют низкую концентрацию нуклеотидов, тогда как она является необязательной в делящихся клетках, которые содержат высокую концентрацию нуклеотидов. Кроме того, известно, что tk-дефектные вирусы обладают повышенной селективностью в отношении опухолевых клеток. В одном воплощении модифицированный поксвирус дополнительно модифицирован в локусе J2R (предпочтительность в отношении модификации, приводящей к подавленной экспрессии вирусного белка tk), что приводит к получению модифицированного поксвируса, дефектного в отношении обеих функций m2 и tk (m2- tk- поксвирус). Частичная или полная делеция указанного локуса J2R, а также вставка чужеродной нуклеиновой кислоты в локус J2R рассматриваются в контексте настоящего изобретения для инактивации функции tk. Такой модифицированный m2- tk- поксвирус желательно является онколитическим.

В качестве альтернативы или совместно, модифицированный поксвирус может быть дополнительно модифицирован в I4L и/или F4L локусе/локусах (предпочтение в отношении модификации, приводящей к подавленной экспрессии вирусного белка рибонуклеотидредуктаза (rr)), что приводит к получению модифицированного поксвируса, дефектного в отношении обеих функций m2 и rr (m2 и rr-дефектный поксвирус). В природном контексте данный фермент катализирует восстановление рибонуклетидов до дезоксирибонуклеотидов, которое представляет важнейшую стадию в биосинтезе ДНК. Фермент вируса похож по структуре субъединицы на фермент млекопитающего, состоя из двух гетерологичных субъединиц, обозначаемых R1 и R2, кодируемых, соответственно, локусом I4L и F4L. Последовательности для генов I4L и F4L и их расположение в геноме разных поксвирусов доступны в общедоступных базах данных (см., например, WO 2009/065546). В контексте изобретения поксвирус может быть модифицирован или в гене I4L (кодирующем большую субъединицу г1) или в гене F4L (кодирующем малую субъединицу г2) или в обоих генах с получением rr-дефектного поксвируса, например, посредством частичной или полной делеции указанного(ых) I4L и/или F4L локуса/локусов. Такой модифицированный m2 - rr-поксвирус желательно является онколитическим.

Также предложен модифицированный поксвирус, дополнительно модифицированный в локусах J2R и I4L/F4L (трижды дефектный вирус с модификациями в локусах M2L, J2R и I4L; локусах M2L, J2R и F4L или M2L, локусах J2R, I4L и F4L), что приводит к получению модифицированного поксвируса, дефектного в отношении активностей m2, tk и rr (m2-, tk- rr- поксвирус). Такой модифицированный tk- rr- и m2 - поксвирус желательно является онколитическим.

В одном предпочтительном воплощении такие двойные и тройные дефектные поксвирусы предпочтительно происходят из Orthpoxvirus или Leporipoxvirus, как описано выше, совместно с m2 - дефектным поксвирусом. Особенно предпочтителен онколитический вирус осповакцины, отличный от MVA, с особым предпочтением в отношении штаммов Lister, WR, Copenhagen, Wyeth. VV, дефектные в отношении активностей tk и m2 и в отношении активностей tk, rr и m2, особенно предпочтительны, особенно для применения для стимуляции или улучшения иммунного ответа (например, ответ, опосредованный лимфоцитами, на антиген или его эпитоп) или для применения для лечения пролиферативного заболевания, как описано в данном документе.

Другие подходящие дополнительные модификации включают модификации, приводящие к подавленной экспрессии одного или более вирусных продуктов генов, выбранных из группы, состоящей из вирусного гемагглютинина (A56R); ингибитора сериновой протеазы (B13R/B14R), белка, связывающего комплемент 4b (C3L), VGF-кодирующего гена и интерферон-модулирующего(их) гена(ов) (B8R или B18R). Еще одна подходящая модификация включает инактивацию локуса F2L, приводящую к подавленной экспрессии вирусной dUТРазы (дезоксиуридинтрифосфатазы), участвующей и в сохранении четкости воспроизведения репликации ДНК и в предоставлении предшественника для продукции ТМР (от англ. Thymidine monophosphate - тимидинмонофосфат) посредством тимидилатсинтазы (WO 2009/065547).

Что касается M2L, номенклатура генов, используемая в данном документе, соответствует штамму VV Сор. Она также используется в данном документе для гомологичных генов других poxviridae, если не указано иное, и соответствие между Copenhagen и другими поксвирусами доступно специалисту.

В еще одном воплощении модифицированный поксвирус по настоящему изобретению является онколитическим. В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «онколитический» относится к способности поксвируса селективно реплицироваться в делящихся клетках (например, пролиферативная клетка, такая как раковая клетка) с целью замедления роста и/или лизиса указанной делящейся клетки, или in vitro или in vivo, одновременно демонстрируя отсутствие или минимальную репликацию в неделящихся (например, нормальных или здоровых) клетках. «Репликация» (или любая форма слова репликация, такая как «реплицируются» и «реплицирующийся» и т.д.) означает размножение вируса, которое может происходить на уровне нуклеиновой кислоты или предпочтительно на уровне инфекционной вирусной частицы. Термин «инфекционный» (или любая форма слова инфекционный, такая как инфицируют, инфицирование и т.д.) обозначает способность вируса инфицировать и поступать в клетку-хозяина или субъект. Обычно, онколитический поксвирус содержит вирусный геном, упакованный в вирусную частицу (геном, заключенный в капсид и/или оболочку), несмотря на то, что данный термин, в контексте изобретения, может также охватывать геном вируса (например, геномную ДНК) или его часть.

Рекомбинантный m2-дефектный поксвирус

В одном воплощении модифицированные поксвирусы по настоящему изобретению являются рекомбинантными.

Термин «рекомбинантный», в том виде, в котором он используется в данном документе, указывает на то, что поксвирус сконструирован для экспрессии по меньшей мере одной чужеродной нуклеиновой кислоты (так называемого рекомбинантного гена, трансгена или нуклеиновой кислоты). В контексте изобретения «чужеродная нуклеиновая кислота», которая вставляется в геном поксвируса, не обнаружена в или не экспрессируется геномом поксвируса, встречающегося в природе. Тем не менее, чужеродная нуклеиновая кислота может быть гомологичной или гетерологичной в отношении субъекта, в который вводится рекомбинантный поксвирус.Более конкретно, она может происходить из человека или нет (например, бактериального, дрожжевого, вирусного происхождения, за исключением поксвирусного). Преимущественно, указанная рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид или представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, способную связываться, по меньшей мере частично (посредством гибридизации), с комплементарной нуклеиновой кислотой клетки (Например, ДНК, РНК, миРНК), находящейся в пораженной болезнью клетке, с целью ингибирования гена, участвующего в указанном заболевании. Такая рекомбинантная нуклеиновая кислота может представлять собой нативный ген или его фрагмент(ы) (например, кДНК) или его любой вариант, полученный в результате мутации, делеции, замены и/или присоединения одного или более нуклеотидов.

В одном воплощении рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который представляет терапевтический или профилактический интерес (а именно, полипептид, представляющий терапевтический интерес), при введении соответствующим образом субъекту, приводя к благоприятному действию на протекание или симптом патологического состояния, подлежащего лечению. Может быть рассмотрено огромное количество полипептидов, представляющих терапевтический интерес. В одном предпочтительном воплощении модифицированный поксвирус, описанный в данном документе, сконструирован таким образом, чтобы экспрессировать по меньшей мере один полипептид, выбранный из группы, состоящей из антигенных полипептидов (например, опухолеассоциированный антиген или антиген вакцины), полипептидов, имеющих функцию модуляции пула нуклеозидов/нуклеотидов, и иммуномодулирующих полипептидов. Рекомбинантный модифицированный поксвирус, кодирующий выявляемый продукт гена, может быть также полезным в контексте изобретения. Термин «сконструированный», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к вставке одной или более чужеродных нуклеиновых кислот в геном вируса в подходящий локус (например, вместо локуса J2R) под контролем соответствующих регуляторных элементов для обеспечения экспрессии указанной чужеродной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине или организме.

Иммуномодулирующие полипептиды

В одном воплощении модифицированный поксвирус, описанный в данном документе, сконструирован для экспрессии по меньшей мере одного иммуномодулирующего полипептида. Термин «иммуномодулирующий полипептид» относится к полипептиду, нацеленному на компонент сигнального пути, который может участвовать в модулировании иммунного ответа или прямо или опосредовано. «Модулирование» иммунного ответа относится к любому изменению в клетке иммунной системы или в активности такой клетки (например, Т-клетки). Такая модуляция включает стимуляцию или подавление иммунной системы, которые могут быть выражены увеличением или уменьшением в числе разных типов клеток, увеличением или уменьшением в активности данных клеток или любыми другими изменениями, которые могут происходить в пределах иммунной системы. Предпочтительно, такой полипептид способен к понижающей регуляции по меньшей мере частично пути ингибирования (антагонист) и/или к повышающей регуляции по меньшей мере частично пути стимуляции (агонист); в частности, иммунного пути, существующего между антигенпрезентирующей клеткой (АРС) или раковой клеткой и эффекторной Т-клеткой.

Иммуномодулирующий полипептид для экспрессии модифицированным поксвирусом, описанным в данном документе, может действовать на любой стадии Т-клеточного иммунитета, включая клональную селекцию антиген-специфичных клеток, активацию Т-клеток, пролиферацию, миграцию к сайтам антигена и воспаления, выполнение прямой эффекторной функции и сигнализацию посредством цитокинов и мембранных лигандов. Каждая из данных стадий регулируется уравновешиванием стимулирующих и ингибирующих сигналов, которые тонко регулируют ответ.

Подходящие иммуномодулирующие полипептиды и способы их использования описаны в литературе. Типичные иммуномодулирующие полипептиды включают, без ограничения, цитокины, хемокины, лиганды и антитела или любую их комбинацию. Настоящее изобретение охватывает модифицированный и предпочтительно онколитический поксвирус, кодирующий более чем один иммуномодулирующий полипептид (например, цитокин и антитело; цитокин и лиганд; два цитокина; два антитела иммунной контрольной точки; цитокин, лиганд и антитело; антитело и два цитокина; и т.д.).

В одном воплощении иммуномодулирующий полипептид, подлежащий экспрессии модифицированным поксвирусом, описанным в данном документе, представляет собой цитокин, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL- 14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-36, IFNα (от англ. Interferon alfa - интерферон альфа), IFNγ (от англ. Interferon gamma - интерферон гамма) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF).

В еще одном воплощении иммуномодулирующий полипептид, подлежащий экспрессии модифицированным поксвирусом, описанным в данном документе, представляет собой хемокин, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из MlPlα, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19 и CCL21.

В еще одном воплощении иммуномодулирующий полипептид, подлежащий экспрессии модифицированным поксвирусом, описанным в данном документе, может быть независимо выбран из группы, состоящей из пептидов (например, пептидных лигандов), растворимых доменов природных рецепторов и антител. Особенно соответствующими в контексте изобретения являются антитела, которые специфично связывают белок иммунной системы контрольной точки, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из CD3, 4-1ВВ, GITR, ОХ40, CD27, CD40, PD1, PDL1, CTLA4, Tim- 3, BTLA, Lag-3 и Tigit.

Термин «специфично связывает» относится к способности специфичного и аффинного связывания в отношении конкретной мишени или эпитопа даже в присутствии гетерогенной популяции других белков и биологических препаратов. Таким образом, в заданных условиях анализа, антитело связывается предпочтительно со своей мишенью и не связывается в значимом количестве с другими компонентами, находящимися в анализируемом образце или субъекте. Предпочтительно, такое антитело демонстрирует высокую аффинность связывания со своей мишенью с равновесной константой диссоциации, равной или ниже 1×10^-6 М (например, по меньшей мере 0,5×10^-6, 1×10^-7, 1×10^-8, 1×10^-9, 1×10^-10 и т.д.). Стандартные анализы для оценки способности связывания антитела со своей мишенью хорошо известны в данной области, включая, например, ELISA, вестерн-блоттинги, RIA и проточную цитометрию.

В контексте изобретения термин «антитело» («Ab») используется в самом широком смысле и охватывает встречающиеся в природе антитела и антитела, сконструированные человеком; включая синтетические, моноклональные, поликлональные антитела, а также полноразмерные антитела и их фрагменты, варианты или слитые белки, при условии, что такие фрагменты, варианты или слитые белки сохраняют свойства связывания с белком-мишенью. Такие антитела могут быть любого происхождения; человеческие или не являющиеся человеческими (например, антитело грызуна или камелид) или химерные. Антитело, не являющееся человеческим, может быть гуманизировано методами генной инженерии для уменьшения его иммуногенности у человека. Антитело может происходить из любого из хорошо известных изотипов (например, IgA, IgG и IgM) и любых подклассов IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). Кроме того, оно может быть гликозилировано, частично гликозилировано или негликозилировано. Если контекст не указывает иное, термин «антитело» также включает антигенсвязывающий фрагмент любого из упомянутых выше антител и включает одновалентный и двухвалентный фрагмент и одноцепочечные антитела. Термин «антитело» также включает мультиспецифичное (например, биспецифичное) антитело, при условии, что оно демонстрирует такую же специфичность связывания, что и исходное антитело. Скрининг свойств связывания антитела-кандидата находится в пределах квалификации специалиста.

В иллюстративных целях полноразмерные антитела представляют собой гликопротеины, содержащие по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и константную область тяжелой цепи, которая состоит из трех доменов СН1, СН2 и СН3 (в конечном итоге, с шарнирной областью между СН1 и СН2). Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (VL) и константную область легкой цепи, которая содержит один домен CL. Области VH и VL содержат три гипервариабельные области, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR - от англ. complementarity determining region), перемежающиеся с четырьмя консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR - от англ. framework region) в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Области CDR тяжелой и легкой цепей определяют специфичность связывания. В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «гуманизированное антитело» относится к антителу, не являющемуся человеческим (например, мышиному, верблюжьему, крысиному и т.д.), чья белковая последовательность модифицирована для увеличения его сходства с человеческим антителом (а именно, продуцируемым в природе у человека). Способ гуманизации хорошо известен в данной области и обычно осуществляется посредством замены одного или более остатков областей FR для того, чтобы оно было похожим на последовательность человеческого иммуноглобулина, тогда как подавляющее большинство остатков вариабельных областей (особенно CDR) не модифицировано и соответствует остаткам иммуноглобулина, не являющегося человеческим. «Химерное антитело» содержит один или более элементов одного вида и один или более элементов другого вида, например, антитело, не являющееся человеческим, содержащее по меньшей мере часть константной области (Fc) человеческого иммуноглобулина.

Типичные примеры антигенсвязывающих фрагментов известны в данной области, включая Fab, Fab', F(ab')2, dAb, Fd, Fv, scFv, ds-scFv и диатело. Особенно полезный фрагмент антитела представляет собой одноцепочечное антитело (scFv), содержащее данные два домена фрагмента Fv, VL и VH, которые слиты вместе, в конечном итоге с помощью линкера, с получением одной цепи белка.

В одном воплощении антитело, подлежащее экспрессии модифицированным поксвирусом, описанным в данном документе, представляет собой моноклональное антитело или одноцепочечное антитело, которое специфично связывается с молекулой на поверхности Т-клетки и предпочтительно с иммунодепрессивным рецептором, участвующим в регуляции активации Т-клеток. Помимо активности связывания, такое антитело дополнительно способно ингибировать биологическую активность указанного иммунодепрессивного рецептора.

Особенно предпочтительные воплощения направлены на модифицированный и предпочтительно онколитический поксвирус, экспрессирующий антитело-антагонист, которое специфично связывается с PD-L1 или CTLA4 и предпочтительно ингибирует биологическую активность такого рецептора, в особенности в результате ингибирования взаимодействия с костимулирующим(и) лигандом(ами) CD80 и/или CD86.

В одном предпочтительном воплощении антитело-антагонист, подлежащее экспрессии рекомбинантным модифицированным поксвирусом, описанным в данном документе, представляет собой антитело против CTLA-4, которое специфично связывается с CTLA-4 млекопитающего (например, человеческим CTLA-4) и ингибирует его способность доставлять иммунодепрессивный сигнал (например, посредством блокирования связывания CTLA-4 с лигандами CD80 и CD86).

В случает традиционного поксвируса, несущего локус M2L в своем геноме, экспрессируемое антитело против CTLA-4 будет действовать, ингибируя CTLA-4-опосредуемый иммунодепрессивный сигнал, но in situ продуцируемый белок М2 будет взаимодействовать с лигандами CD80 и CD86, таким образом, ослабляя или ингибируя CD28-опосредованный костимулирующий сигнал. Напротив, модифицированный (то есть m2 - дефектный) поксвирус, экспрессирующий антитело против CTLA-4, описанный в данном документе, у которого отсутствует функция m2, будет способен как ингибировать CTLA-4-опсредованный иммунодепрессивный сигнал, так и перенаправлять иммунный ответ в направлении CD28-опосредованных костимулирующих сигналов.

Целый ряд антител против CTLA-4 доступен в данной области (см., например, антитела, описанные в US 8491895, WO 2000/037504, WO 2007/113648, WO 2012/122444 и WO 2016/196237, среди прочих), и горстка из них одобрена FDA за последнее десятилетие или находится на продвинутом этапе клинической разработки. Типичные примеры антител против CTLA-4, используемых в настоящем раскрытии, представляют собой, например, ипилимумаб, продаваемый на рынке Bristol Myer Squibb как Yervoy® (см., например, US 6984720; US 8017114), МK-1308 (Merck), AGEN-1884 (Agenus Inc.; WO 2016/196237), и тремелимумаб (AstraZeneca; US 7109003 и US 8143379) и одноцепочечные антитела против CTLA4 (см., например, WO 97/20574 и WO 2007/123737).

Предпочтительные воплощения направлены на (i) модифицированный (и предпочтительно онколитический) поксвирус с предпочтением в отношении онколитического вируса осповакцины, дефектного в отношении как функции m2, так и tk (полученного в результате инактивирующих мутаций в обоих локусах M2L и J2R), кодирующего антитело против CTLA-4; (ii) модифицированный (и предпочтительно онколитический) поксвирус с предпочтением в отношении онколитического вируса осповакцины, дефектного в отношении активностей m2 и rr (полученного в результате инактивирующих мутаций и в локусе M2L и гене(ах) I4L и/или F4L), кодирующего антитело против CTLA-4, и (iii) модифицированный (и предпочтительно онколитический) поксвирус с предпочтением в отношении онколитического вируса осповакцины, дефектного в отношении активностей m2, tk и rr (полученного в результате инактивирующих мутаций в локусах M2L, J2R и I4L/F4L), кодирующего антитело против CTLA-4.

В некоторых воплощениях антитело против CTLA-4 представляет собой ипилимумаб.

В некоторых воплощениях антитело против CTLA-4 представляет собой тремелимумаб.

Еще один предпочтительный пример иммуномодулирующих полипептидов, подходящих для экспрессии модифицированным поксвирусом, описанным в данном документе, представлен антителом, специфично связывающим PDL-1 (лиганд запрограммированной гибели клеток-1) и ингибирующим его биологическую активность. Образование комплекса рецептор/лиганд PD-1/PD-L1 приводит к ингибированию CD8+ Т-клеток, и, вследствие этого, ингибированию иммунного ответа. PD-L1 представляет собой один из двух гликопротеиновых лигандов поверхности клетки для PD-1 (другой представляет собой PD-L2), который осуществляет понижающую регуляцию активации Т-клеток и секреции цитокинов при связывании с PD-1. Полная последовательность человеческого PD-L1 может быть найдена под номером доступа в GenBank Q9NZQ7.

Антитела-антагонисты против PD-L1 доступны в данной области от разных поставщиков, таких как Merck, sigma Aldrich и Abeam, и некоторые одобрены FDA или находятся на продвинутом этапе клинической разработки. Типичные примеры антител против PD-L1, используемых в настоящем раскрытии, представляют собой, например, BMS-936559 (в разработке Bristol Myer Squibb, также известно как MDX-1105; WO 2013/173223), атезолизумаб (в разработке Roche; также известно как TECENTRIQ®; US 8217149), дурвалумаб (AstraZeneca; также известно как EVIFINZI™; WO 2011/066389), MPDL3280A (в разработке Genentech/Roche), а также авелумаб (в разработке Merck и Pfizer под торговым названием Bavencio; WO 2013/079174), STI-1014 (Sorrento; WO 2013/181634) и СХ-072 (Cytomx; WO 2016/149201). Соответствующие нуклеотидные последовательности могут быть клонированы или выделены в соответствии со стандартными методиками на основе информации, раскрытой в имеющейся литературе.

Предпочтительные воплощения направлены на (i) модифицированный (и предпочтительно онколитический) поксвирус с предпочтением в отношении онколитического вируса осповакцины, дефектного в отношении как функции m2, так и функции tk (полученного в результате инактивирующих мутаций в обоих локусах M2L и J2R), кодирующего антитело против PD-L1; (ii) модифицированный (и предпочтительно онколитический) поксвирус с предпочтением в отношении онколитического вируса осповакцины, дефектного в отношении активностей m2 и rr (полученного в результате инактивирующих мутаций как в локусе M2L, так и гене(ах) I4L и/или F4L), кодирующего антитело против PD-L1, и (iii) модифицированный (и предпочтительно онколитический) поксвирус с предпочтением в отношении онколитического вируса осповакцины, дефектного в отношении активностей m2, tk и rr (полученного в результате инактивирующих мутаций в локусах M2L, J2R и I4L/F4L), кодирующего антитело против PD-L1.

В некоторых воплощениях антитело против PD-L1 представляет собой атезолизумаб.

В некоторых воплощениях антитело против PD-L1 представляет собой дурвалумаб.

В некоторых воплощениях антитело против PD-L1 представляет собой авелумаб.

Другие воплощения направлены на (i) модифицированный и предпочтительно онколитический поксвирус с предпочтением в отношении онколитического вируса осповакцины, дефектного в отношении как функции m2, так и функции tk (полученного в результате инактивирующих мутаций в обоих локусах M2L и J2R), кодирующего антитело против CTLA-4 и антитело против PD-L1; (ii) модифицированный и предпочтительно онколитический поксвирус с предпочтением в отношении онколитического вируса осповакцины, дефектного в отношении активностей m2 и rr (полученного в результате инактивирующих мутаций как в локусе M2L, так и гене(ах) I4L и/или F4L), кодирующего антитело против CTLA-4 и антитело против PD-L1, и (iii) модифицированный и предпочтительно онколитический поксвирус с предпочтением в отношении онколитического вируса осповакцины, дефектного в отношении активностей m2, tk и rr (полученного в результате инактивирующих мутаций в локусах M2L, J2R и I4L/F4L), кодирующего антитело против CTLA-4 и антитело против PD-L1.

В некоторых воплощениях антитело против CTLA-4 представляет собой ипилимумаб и антитело против PD-L1 представляет собой авелумаб.

Антигенные полипептиды

Термин «антигенный» относится к способности вызывать или стимулировать измеряемый иммунный ответ у субъекта, которому введен рекомбинантный поксвирус, описанный в данном документе, кодирующий полипептид, относящийся к антигенному. Стимулируемый или индуцируемый иммунный ответ на антигенный пептид, экспрессируемый указанным рекомбинантный поксвирусом, может быть гуморальным и/или клеточным (например, продукция антител, цитокинов и/или хемокинов, участвующих в активации эффекторных иммунных клеток). Стимулируемый или индуцируемый иммунный ответ обычно способствует защитному действию у субъекта, которому осуществляют введение. В данной области имеется огромное количество прямых и непрямых биологических анализов для оценки антигенной природы полипептида или in vivo (субъекты, являющиеся животным или человеком), или in vitro (например, в биологическом образце). Например, способность конкретного антигена стимулировать врожденный иммунитет может быть определена, например, посредством измерения NK/NKT-клеток (например, репрезентативность и уровень активации), а также IFN-связанных цитокин- и/или хемокин-продуцирующих каскадов, активации TLR (от англ. Toll-like receptor - Толл-подобный рецептор) и других маркеров врожденного иммунитета (Scott-Algara et al., 2010 PLOS One 5 (1), e8761; Zhou et al., 2006, Blood 107, 2461-2469; Chan, 2008, Eur. J. Immunol. 38, 2964-2968). Способность конкретного антигена стимулировать клеточный иммунный ответ можно определять, например, посредством количественной оценки цитокина(ов), продуцируемого(ых) активированными Т-клетками, включая цитокины, полученные из CD4+ и CD8+ Т-клеток с использованием рутинных биологических анализов (например, характеристика и/или количественная оценка Т-клеток посредством ELISpot, посредством многопараметрической проточной цитометрии, ICS (от англ. intracellular cytokine staining - внутриклеточное окрашивание цитокинов), посредством анализа профиля цитокинов с использованием мультиплексных технологий или ELISA), посредством определения пролиферативной способности Т-клеток (например, анализы пролиферации Т-клеток посредством анализа включения [³Н] тимидина), посредством анализа цитотоксической способности для антиген-специфичных Т-лимфоцитов в сенсибилизированном субъекте или посредством идентификации субпопуляций лимфоцитов посредством проточной цитометрии и посредством иммунизации соответствующих животных моделей, как описано в данном документе.

Считается, что термин «антигенный полипептид» охватывает нативный антиген, а также его фрагмент (например, эпитопы, иммуногенные домены и т.д.) и вариант, при условии, что такой фрагмент или вариант способен являться мишенью иммунного ответа. Предпочтительные антигенные полипептиды для применения в данном документе представляют собой опухолеассоциированные антигены. Выбор одного или более антигенных полипептидов, которые подходят для лечения конкретного патологического состояния, находится в пределах квалификации специалиста.

В одном воплощении антигенный(ые) полипептид(ы), кодируем ый(ые) рекомбинантным модифицированным поксвирусом, представляет(ют) собой раковый(ые) антиген(ы) (также называемые опухолеассоциированными антигенами или ТАА (от англ. tumor-associated antigen)), который(ые) ассоциирован(ы) с и/или служит(ат) в качестве маркеров для раковых заболеваний. Раковые антигены охватывают разные категории полипептидов, например, полипептиды, которые обычно «молчат» (то есть не экспрессируются) в здоровых клетках, полипептиды, которые экспрессируются только на низких уровнях или на определенных стадиях дифференцировки, и полипептиды, которые временно экспрессируются, такие как эмбриональные и фетальные антигены, а также антигены, полученные в результате мутации клеточных генов, как например, онкогены (например, активированный онкоген ras), протоонкогены (например, семейство ErbB), или белки, полученные в результате хромосомных транслокаций.

Многочисленные опухолеассоциированные антигены известны в данной области. Типичные опухолевые антигены включают, без ограничения, антиген, ассоциированный с раком толстой и прямой кишки (CRC - от англ. colorectal cancer), раково-эмбриональный антиген (СЕА - от англ. carcinoembryonic antigen), простатический специфический антиген (PSA - от англ. prostate specific antigen), BAGE, GAGE или семейство антигенов MAGE, р53, муциновые антигены (например, MUC1), HER2/neu, p21ras, hTERT, Hsp70, iNOS, тирозинкиназу, мезотелин, c-erbB-2, альфа фетопротеин, АМ-1, среди многих других, и их любой иммуногенный эпитоп или вариант.

Опухолеассоциированные антигены могут также охватывать неоэпитопы/антигены, которые появились во время процесса канцерогенеза в раковой клетке, и включающие одну или более мутаций аминокислотного(ых) остатка(ов) относительно соответствующего антигена дикого типа. Обычно, он обнаруживается в раковых клетках или тканях, полученных от пациента, но не обнаруживается в образце нормальных клеток или тканей, полученных у пациента или здорового индивида.

Опухолеассоциированные антигены могут также охватывать антигены, кодируемые патогенными организмами, которые могут вызывать злокачественное состояние у субъекта (особенно хронически инфицированного субъекта), такие как РНК- и ДНК-содержащие онкогенные вирусы (например, папилломавирус человека (HPV - от англ. human papillomavirus), вирус гепатита С (HCV - от англ. hepatitis С virus), вирус гепатита В (HBV - от англ. hepatitis В virus), вирус Эпштейна - Барр (EBV - от англ. Epstein Barr virus) и т.д.) и бактерии (например, Helicobacterpilori).

В еще одном воплощении антигенный(ые) полипептид(ы), кодируемый(ые) рекомбинантным модифицированным поксвирусом, представляет(ют) собой вакцинный(ые) антиген(ы), который(ые), при доставке субъекту, являющемуся человеком или животными, нацелен(ы) на защиту терапевтически или профилактически против инфекционных заболеваний. Многочисленные вакцинные антигены известны в данной области. Типичные вакцинные антигены включают клеточные антигены, вирусные, бактериальные антигены или антигены паразитов, но не ограничиваются ими. Клеточные антигены включают гликопротеин муцин 1 (MUC1). Вирусные антигены включают, например, антигены из вирусов гепатита А, В, С, D и Е, вирусов иммунодефицита (например, HIV (от англ. human immunodeficiency virus - вирус иммунодефицита человека)), вирусов герпеса, цитомегаловируса, вируса ветряной оспы, вирусов папилломы, вируса Эпштейна -Барр, вирусов гриппа, вирусов парагриппа, вирусов Коксаки, пикорнавирусов, ротавирусов, респираторных синцитиальных вирусов, риновирусов, вируса краснухи, паповируса, вируса эпидемического паротита, вируса кори и рабби вируса. Некоторые неограничивающие примеры антигенов HIV включают др120 др40, др160, р24, gag, pol, env, vif, vpr, vpu, tat, rev, nef tat, nef. Некоторые неограничивающие примеры антигенов вируса герпеса человека включают gH, gL gM gB gC gK gE или gD или предранний белок, такой как ICP27, ICP47, ICP4, ICP36 из HSV1 или HSV2. Некоторые неограничивающие примеры антигенов цитомегаловируса включают дВ. Некоторые неограничивающие примеры антигенов, происходящих из вируса Эпштейна - Барр (EBV), включают др350. Некоторые неограничивающие примеры антигенов вируса ветряной оспы включают gp1, 11, 111 и IE63. Некоторые неограничивающие примеры антигенов вируса гепатита С включают белок env Е1 или Е2 protein, коровый белок, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, p7. Некоторые неограничивающие примеры антигенов вирусов папилломы человека (HPV) включают L1, L2, Е1, Е2, ЕЗ, Е4, Е5, Е6, Е7. Антигены, происходящие из других вирусных патогенов, таких как респираторный синцитиальный вирус (например, белки F и G), вирус парагриппа, вирус кори, вирус эпидемического паротита, флавивирусы (например, вирус желтой лихорадки, вирус Денге, вирус клещевого энцефалита, вирус японского энцефалита) и клетки вируса гриппа (например, белки НА, NP, NA или М), могут также использоваться согласно настоящему изобретению. Бактериальные антигены включают, например, антигены из микобактерий, вызывающих ТВ, лепру, пневмококков, аэробных грамотрицательных бацилл, микоплазмы, стафилококка, стрептококка, сальмонелл, хламидий, бактерий рода Neisseriae и тому подобное. Полипептиды - антигены паразитов включают, например, антигены из малярии, лейшманиоза, трипанозомоза, токсоплазмоза, шистосомоза и филяриатоза.

Модуляторы пула нуклеозидов

В одном воплощении модифицированный поксвирус, описанный в данном документе, несет в своем геноме один или более рекомбинантных генов, имеющих функцию модулятора пула нуклеозидов. Репрезентативные примеры включают, без ограничения, цитидиндезаминазу и в особенности дрожжевую цитидиндезаминазу (CDD1 - от англ. cytidine deaminase) или человеческую цитидиндезаминазу (hCD) (см. WO 2018/122088); полипептиды, действующие на метаболические и иммунные пути (например, аденозиндезаминаза и в особенности человеческая аденозиндезаминаза huADAI или huADA2; см. ЕР17306012.0); полипептиды, действующие на путь апоптоза; эндонуклеазы (подобно эндонуклеазам рестрикции, CRISPR/Cas9) и мишень-специфичные РНК (например, микроРНК, короткие РНК, образующие шпильки, миРНК).

Выявляемые продукты гена

Обычно каждый полипептид выявляют посредством спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических, химических или других физических средств, и, таким образом, могут позволить идентифицировать рекомбинантный поксвирус в клетке-хозяине или субъекте. Неограничивающие примеры подходящих выявляемых продуктов генов включают mCherry, Emerald, люциферазу светлячка и зеленые флуоресцентные белки (GFP - от англ. green fluorescent protein и его усиленная версия e-GFP), выявляемые посредством флуоресцентных средств, а также бета-галактозидазу, выявляемую посредством калориметрических средств.

Экспрессия рекомбинантного гена

Нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, представляющий терапевтический интерес, такой как приведен выше, можно легко получать стандартными методиками молекулярной биологии (например, ПЦР-амплификация, клонирование кДНК, химический синтез) с использованием данных о последовательностях, доступных в данной области, и информации, предоставленной в данном документе. Например, способы клонирования антител, их фрагментов и аналогов известны в данной области (см., например, Harlow and Lane, 1988, Antibodies - A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY). Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело, может быть выделена из продуцирующей гибридомы (например, Cole et al. in Monoclonal antibodies and Cancer Therapy; Alan Liss pp77-96), библиотек генов иммуноглобулина и из любого доступного источника, или нуклеотидная последовательность может быть получена посредством химического синтеза.

Кроме того, рекомбинантная нуклеиновая кислота может быть оптимизирована для обеспечения высокого уровня экспрессии в конкретной клетке-хозяине или субъекте. В действительности, наблюдалось, что картины частоты использования кодона организмов являются в высшей степени неслучайными, и использование кодонов может сильно различаться среди разных хозяев. Например, терапевтический ген может происходить из бактерии, вируса или низшего эукариота и, таким образом, имеет картину частоты использования кодона, неподходящую для эффективной экспрессии в клетках высших эукариот (например, человека). Обычно, оптимизацию кодонов проводят посредством замены одного или более «нативных» (например, бактериальных, вирусных или дрожжевых) кодонов, соответствующих кодону, нечасто используемому в организме-хозяине, одним или более кодонами, кодирующими ту же аминокислоту, которая чаще используется. Необязательно заменять все нативные кодоны, соответствующие нечасто используемым кодонам, поскольку повышенный уровень экспрессии может быть достигнут даже частичной заменой.

Помимо оптимизации частоты использования кодона, экспрессия в клетке-хозяине или субъекте может быть дополнительно улучшена посредством дополнительных модификаций рекомбинантной(ых) нуклеиновой (ых) последовательности(ей). Например, разные модификации можно предусматривать таким образом, чтобы предупредить скопление редких, неоптимальных кодонов, находящихся в концентрированных областях, и/или подавить или модифицировать «негативные» элементы последовательности, которые, как ожидается, негативно влияют на уровни экспрессии. Такие негативные элементы последовательности включают, без ограничения, области, имеющие очень высокое (больше 80%) или очень низкое (меньше 30%) содержание GC; АТ-богатые или GC-богатые участки последовательности; нестабильные прямые или обратные последовательности повтора; RA вторичные структуры; и/или внутренние криптические регуляторные элементы, такие как внутренние ТАТА-боксы, chi-сайты, участки посадки рибосом и/или донорные/акцепторные сайты сплайсинга.

Согласно настоящему изобретению каждая из одной или более молекул рекомбинантных нуклеиновых кислот функционально связана с подходящими регуляторными элементами для ее экспрессии в клетке-хозяине или субъекте. В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «регуляторные элементы» или «регуляторная последовательность» относится к любому элементу, который обеспечивает, способствует или модулирует экспрессию кодирующей(их) нуклеиновой(ых) кислоты(от) в данной клетке-хозяине или субъекте, включая репликацию, дупликацию, транскрипцию, сплайсинг, трансляцию, стабильность и/или транспорт нуклеиновой(ых) кислоты(от) или ее(их) производного (а именно, мРНК). В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «функционально связанный» означает, что связанные элементы расположены таким образом, что они функционируют согласовано для их предполагаемого назначения. Например, промотор функционально связан с молекулой нуклеиновой кислоты, если промотор воздействует на транскрипцию от инициации транскрипции до терминатора указанной молекулы нуклеиновой кислоты в пермиссивной клетке-хозяине.

Специалисты в данной области будут принимать во внимание, что выбор регуляторных последовательностей может зависеть от таких факторов, как непосредственно нуклеиновая кислота, вирус, в который ее вставляют, клетка-хозяин или субъект, желательный уровень экспрессии и т.д. Промотор имеет особое значение. В контексте изобретения он может быть конститутивным, направляя экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты во многих типах клеток-хозяев, или специфичным в отношении определенных клеток-хозяев (например, регуляторные последовательности, специфичные в отношении печени), или регулироваться в ответ на конкретные события или внешние факторы (например, под действием температуры, пищевой добавки, гормона и т.д.) или в соответствии с фазой цикла вируса (например, поздней или ранней). Также можно применять промоторы, которые подавляются во время стадии продукции в ответ на конкретные события или внешние факторы, для оптимизации продукции вируса и избегания потенциальной токсичности экспрессируемого(ых) полипептида(ов).

Промоторы поксвируса особым образом адаптированы для экспрессии рекомбинантного гена модифицированным поксвирусом, описанным в данном документе. Репрезентативные примеры включают, без ограничения, промоторы вируса осповакцины 7.5K, H5R, 11K7.5 (Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15 (1): 18-28), TK, p28, p11, pB2R, pA35R и K1L, а также синтетические промоторы, такие как промоторы, описанные в Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23: 1094-7; Hammond et al., 1997, J. Virol Methods 66: 135-8; and Kumar and Boyle, 1990, Virology 179: 151-8), а также ранние/поздние химерные промоторы.

Специалистам в данной области будет понятно, что регуляторные элементы, контролирующие экспрессию молекулы(ул) нуклеиновой кислоты, вставленной(ых) в геном поксвируса, могут дополнительно содержать дополнительные элементы для соответствующей инициации, регуляции и/или терминации транскрипции (например, поли(А)-последовательности терминации транскрипции), транспорта мРНК (например, сигнальные последовательности ядерной локализации), процессинга (например, сигналы сплайсинга) и стабильности (например, интроны и некодирующие 5'- и 3'- последовательности), трансляции (например, инициатор Met, трехкомпонентные лидерные последовательности, участки связывания рибосом IRES (от англ. Internal Ribosome Entry Site - участок внутренней посадки рибосомы), сигнальные пептиды и т.д.).

При необходимости, может быть преимущественным, чтобы рекомбинантный полипептид включал дополнительные регуляторные элементы для облегчения его экспрессии, миграции и биологической активности. Например, сигнальный пептид может быть включен для облегчения секреции из инфицированной клетки. Сигнальный пептид обычно вставлен на N-конце белка, сразу после инициатора Met. Выбор сигнальных пептидов является широким и доступным специалистам в данной области. Также можно рассматривать добавление транс-мембранного домена для облегчения заякоривания кодируемого(ых) пептида(ов) в подходящей мембране (например, плазматической мембране) инфицированных клеток. Трансмембранный домен обычно вставлен на С-конце белка, сразу перед или в непосредственной близости к стоп-кодону. Огромное многообразие трансмембранных доменов доступно в данной области (см., например, WO 99/03885).

В качестве дополнительного примера, пептидная метка (обычно, короткая пептидная последовательность, которая может распознаваться доступными антисыворотками или соединениями), может быть также добавлена для отслеживания экспрессии, миграции или очистки кодируемого продукта гена. Огромное разнообразие пептидов метки можно использовать в контексте изобретения, включая, без ограничения, метку РК, октапептид FLAG, метку МУС, метку HIS (обычно, участок из 4-10 остатков гистидина) и е-метку (US 6686152). Пептид(ы) метки могут независимо располагаться на N-конце белка или в качестве альтернативы на его С-конце или в качестве альтернативы внутри или в любом из данных положений, когда используются несколько меток. Пептиды Tag можно выявлять посредством иммунологических анализов с использованием антител против tag.

В качестве еще одного примера, гликозилирование можно менять таким образом, чтобы повышать биологическую активность кодируемого продукта гена. Такие модификации можно выполнять, например, посредством мутирования одного или более остатков в пределах сайта(ов) гликозилирования. Измененные профили гликозилирования могут повышать способность ADCC (от англ. antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity - антителозависимая клеточная цитотоксичность) антител и/или их аффинность в отношении их мишени.

Еще один подход, который можно рассматривать в контексте настоящего изобретения, заключается в связывании рекомбинантного продукта гена, кодируемого модифицированным поксвирусом, описанным в данном документе, с внешним агентом, таким как цитотоксическое средство и/или средство мечения. В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «цитотоксическое средство» относится к соединению, которое является непосредственно токсичным для клеток (например, препятствующее их делению или росту), такому как токсины (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, или его фрагменты). В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «средство мечения» относится к выявляемому соединению. Средство мечения может быть выявлено само по себе (например, метки-радиоактивные изотопы или флуоресцентные метки) или, в случае ферментативной метки, может катализировать химическую модификацию соединения-субстрата, которое является выявляемым. Связывание можно осуществлять посредством слияния генов между терапевтическим полипептидом и внешним средством.

Вставка рекомбинантной(ых) нуклеиновой(ых) кислоты(от) (оснащенной(ых) соответствующими регуляторными элементами) в геноме поксвируса осуществляется традиционными средствами, или с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции, или предпочтительно посредством гомологичной рекомбинации.

В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ получения модифицированного поксвируса, описанного в данном документе, и в частности рекомбинантного и онколитического поксвируса, посредством гомологичной рекомбинации между плазмидой для переноса, содержащей рекомбинантную нуклеиновую кислоту (с ее регуляторными элементами), ланкированную на 5' и 3' вирусными последовательностями, соответственно находящимися выше и ниже сайта встраивания, и вирусным геномом. В одном воплощении указанный способ включает стадию получения указанной плазмиды для переноса (например, общепринятыми способами молекулярной биологии) и стадию введения указанной плазмиды для переноса в подходящую клетку-хозяина, а именно вместе с геномом поксвируса (например, M2L-инактивированный вирус), включая фланкирующую последовательность, находящуюся в плазмиде для переноса. Предпочтительно, плазмиду для переноса вводят в клетку-хозяина посредством трансфекции и вирус - посредством инфицирования.

Размер каждой фланкирующей вирусной последовательности может варьировать. Обычно он составляет по меньшей мере 100 п.н. и максимум 1500 п.н. с предпочтением в отношении приблизительно 150-800 п.н. на каждой стороне рекомбинантной нуклеиновой кислоты, предпочтительно от 180 до 600 п.н., предпочтительно от 200 до 550 п.н. и более предпочтительно от 250 до 500 п.н.

Молекула(ы) рекомбинантной нуклеиновой кислоты может(гут) независимо быть вставлена(ы) в любое положение генома поксвируса, и вставку можно осуществлять рутинным методом молекулярной биологии, известным в данной области. Разные сайты вставки можно рассматривать, например, во второстепенном гене вируса, в межгенной области или в некодирующей области генома поксвируса. Локус J2R является особенно подходящим в контексте изобретения. Как описано выше, при вставке чужеродной (ых) нуклеиновой(ых) кислоты(от) в геном поксвируса, локус вируса в участке вставки может быть удален по меньшей мере частично, что, например, приводит к подавленной экспрессии продукта гена вируса, кодируемого полностью или частично удаленным локусом, и дефектным вирусом в отношении указанной функции вируса.

В некоторых воплощениях идентификация модифицированного поксвируса может быть облегчена посредством применения селективного и/или выявляемого гена. В предпочтительных воплощениях плазмида для переноса дополнительно содержит селективный маркер с конкретным предпочтением в отношении гена GPT (кодирующего гуанинфосфорибозилтрансферазу), что делает возможным рост в селективной среде (например, в присутствии микофеноловой кислоты, ксантина и гипоксантина), или выявляемого гена, кодирующего выявляемый продукт гена, такой как GFP, e-GFP или mCherry. Кроме того, может также рассматриваться применение эндонуклеазы, способной обеспечивать разрыв двойной цепи, в указанном селективном или выявляемом гене. Указанная эндонуклеаза может быть в форме белка или экспрессироваться экспрессионным вектором.

Гомологичную рекомбинацию, позволяющую получать модифицированный поксвирус, предпочтительно проводят в соответствующих клетках-хозяевах (например, клетках HeLa или CEF).

Получение поксвируса

Обычно модифицированный поксвирус по изобретению получают в подходящей линии клеток-хозяев с использованием традиционных методик, включающих культивирование трансфицированной или инфицированной клетки-хозяина в подходящих условиях таким образом, чтобы обеспечить продукцию и выделение инфекционных частиц поксвируса.

Таким образом, в другом аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения модифицированного поксвируса, описанного в данном документе. Предпочтительно указанный способ включает следующие стадии: а) получение линии клеток-продуцентов, b) трансфекция или инфицирование полученной линии клеток-продуцентов модифицированным поксвирусом, с) культивирование линии трасфицированных или инфицированных клеток-продуцентов в подходящих условиях таким образом, чтобы обеспечить продукцию данного вируса (например, инфекционных поксвирусных частиц), d) выделение продуцированного вируса из культуры указанной линии клеток-продуцентов и возможно е) очистка указанного выделенного вируса.

В одном воплощении клетка-продуцент представляет собой клетку млекопитающего (например, человеческую или не являющеюся человеческой), выбранную из группы, состоящей из клеток HeLa (например, ATCC-CRM-CCL-2™ или ATCC-CCL-2.2™), HER96, PER-C6 (Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-17) и линий клеток хомяка, таких как ВНК-21 (АТСС CCL-10), или клетки птицы, такой как клетка из клеток, описанных в WO 2005/042728, WO 2006/108846, WO 2008/129058, WO 2010/130756, WO 2012/001075 и т.д.), а также первичного фибробласта куриного эмбриона (CEF - от англ. chicken embryo fibroblast), полученного из куриных эмбрионов, полученных из оплодотворенных яиц.

Клетки-продуценты предпочтительно культивируют в соответствующей среде, которая может, при необходимости, быть дополнена сывороткой и/или подходящим(и) фактором(и) роста или не дополнена (например, химически определяемая среда, предпочтительно не содержащая продуктов животного или человеческого происхождения). Соответствующая среда может быть легко выбрана специалистами в данной области в зависимости от клеток-продуцентов. Такие среды имеются в продаже. Клетки-продуценты предпочтительно культивируют при температуре, составляющей от +30°С до +38°С (более предпочтительно при приблизительно 37°С), на протяжении 1-8 суток перед инфицированием. При необходимости, несколько пассажей от 1 до 8 суток можно проводить для увеличения общего числа клеток.

На стадии Ь) клетки-продуценты инфицируют модифицированным поксвирусом в соответствующих условиях с использованием соответствующей множественности заражения (MOI - от англ. multiplicity of infection) для обеспечения продуктивного инфицирования клеток-продуцентов. В иллюстративных целях соответствующая MOI находится в интервале от 10^-3 до 20, с конкретным предпочтением в отношении MOI составляет от 0,01 до 5 и более предпочтительно от 0,03 до 1. Стадию инфицирования проводят в среде, которая может быть такой же, как или отличной от среды, используемой для культивирования клеток-продуцентов.

На стадии с) инфицируемые клетки-продуценты затем культивируют в соответствующих условиях, хорошо известных специалистам в данной области, до получения потомства поксвируса (например, инфекционных вирусных частиц). Культивирование инфицированных клеток-продуцентов также предпочтительно проводят в среде, которая может быть такой же или отличной от среды/сред, используемой(ых) для культивирования клеток-продуцентов и/или для стадии инфицирования, при температуре от +32°С до +37°С, в течение 1-5 суток.

На стадии d) поксвирус, полученный на стадии с), собирают из супернатанта культуры и/или клеток-продуцентов. Выделение из клеток-продуцентов может требовать стадии, делающей возможным разрушение мембраны клеток-продуцентов с обеспечением высвобождения вируса. Разрушение мембраны клетки-продуцента может быть вызвано разными методиками, хорошо известными специалистам в данной области, включая замораживание/оттаивание, гипотонический лизис, обработку ультразвуком, микрофлюидизацию, гомогенизацию с большим усилием сдвига (также называемую высокоскоростной) или гомогенизацию высокого давления, но, не ограничиваясь ими.

Выделенный поксвирус может быть затем по меньшей мере частично очищен перед распределением на дозы и использованием в соответствии настоящим изобретением. Огромное число стадий и способов очистки доступно в данной области, включая, например, осветление, ферментативную обработку (например, эндонуклеазой, протеазой и т.д.), хроматографические стадии и стадии фильтрации. Соответствующие способы описаны в данной области (см., например, WO 2007/147528; WO 2008/138533, WO 2009/100521, WO 2010/130753, WO 2013/022764).

В одном воплощении согласно настоящему изобретению также предложена клетка, инфицированная модифицированным поксвирусом, описанным в данном документе.

Композиция

Согласно настоящему изобретению также предложена композиция, содержащая терапевтически эффективное количество модифицированного поксвируса, описанного в данном документе (действующее вещество), и фармацевтически приемлемый носитель. Такая композиция может быть введена один раз или несколько раз и посредством одного и того же или разных способов.

Термин «терапевтически эффективное количество» соответствует количеству модифицированного поксвируса, которое достаточно для получения одного или более полезных результатов. Такое терапевтически эффективное количество может варьировать в зависимости от разных параметров, в частности способа введения; состояния при заболевании; возраста и массы субъекта; способности субъекта отвечать на лечение; типа сопутствующего лечения; частоты лечения; и/или необходимости в профилактике или терапии. Когда рассматривается профилактическое применение, композицию по изобретению вводят в дозе, достаточной для предотвращения или задержки начала и/или становления и/или рецидива пролиферативного заболевания (такого как рак), особенно у субъекта, находящегося в зоне риска. Для «терапевтического» применения композицию вводят субъекту, у которого диагностировано пролиферативное заболевание (такое как рак), с целью лечения заболевания, в конечном итоге в совокупности с одним или более общепринятыми терапевтическими средствами. В частности, терапевтически эффективное количество могло представлять собой количество, необходимое для того, чтобы вызывать наблюдаемое улучшение клинического статуса, по сравнению с исходным статусом или по сравнению с ожидаемым статусом при отсутствии лечения, например, уменьшение количества опухолей; уменьшение размера опухоли, уменьшение числа или распространения метастаза, увеличение продолжительности ремиссии, стабилизацию (а именно отсутствие ухудшения) состояния заболевания, отложение или замедление прогрессирования или тяжести заболевания, улучшение или временное облегчение состояния при заболевании, пролонгированное выживание, лучший ответ на стандартное лечение, улучшение качества жизни, пониженный уровень смертности и т.д. Например, методики, рутинно используемые в лабораториях (например, проточную цитометрию, гистологию, медицинскую визуализацию), можно использовать для осуществления надзора за опухолью.

Терапевтически эффективное количество может также представлять собой количество, необходимое для того, чтобы вызывать развитие эффективного неспецифичного (врожденного) и/или специфичного (адаптивного) иммунного ответа. Обычно, развитие иммунного ответа, в частности, Т-клеточного ответа, может быть оценено in vitro, в подходящих животных моделях или используя биологические образцы, собираемые у субъекта (ELISA, проточная цитометрия, гистология и т.д.). Также можно использовать разные доступные антитела, таким образом, чтобы идентифицировать разные популяции иммунных клеток, участвующие в противоопухолевом ответе, которые находятся в субъектах, подлежащих лечению, такие как цитотоксические Т-клетки, активированные цитотоксические Т-клетки, естественные клетки-киллеры и активированные естественные клетки-киллеры. Улучшение клинического статуса можно легко оценивать посредством любого релевантного клинического измерения, обычно используемого лечащими врачами или другим квалифицированным медицинским персоналом.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» предназначен для включения всех возможных носителей, растворителей, разбавителей, вспомогательных веществ, адъювантов, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых средств, поглощающих веществ и т.п., совместимых с введением млекопитающим и в частности субъектам, являющимся человеком. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых носителей включают воду, NaCl, физиологические растворы, рингер лактат, раствор сахарида (например, глюкозы, трегалозы, сахарозы, декстрозы и т.д.), спирты, масла, желатины, углеводы, такие как лактоза, амилоза или крахмал, сложные эфиры жирных кислот, гидроксиметилцеллюлозу и тому подобное, а также можно использовать другие водные физиологически сбалансированные солевые растворы (см., например, наиболее текущее издание Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins).

В одном воплощении композиция приготовлена соответствующим образом для обеспечения стабильности действующего вещества модифицированного поксвируса в условиях изготовления и длительного хранения (а именно, на протяжении по меньшей мере 6 месяцев, с предпочтением в отношении по меньшей мере двух лет) при замораживании (например, от -70°С до -10°С), при хранении в холодильнике (например, при 4°С) или температуре окружающей среды (например, 20-25°С). Такие композиции обычно включают жидкий носитель, такой как водные растворы.

Преимущественно, композиция подходящим образом буферизована для медицинского применения, предпочтительно при физиологическом или немного основном рН (например, от приблизительно рН 7 до приблизительно рН 9 с особым предпочтением в отношении рН, составляющего от 7 до 8, и более конкретно близкого к 7,5). Подходящие буферы включают без ограничения TRIS (трис(гидроксиметил)метиламин), TRIS-HCl (трис(гидроксиметил)метиламин-HCl), HEPES (4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), фосфатный буфер (например, PBS (от англ. phosphate-buffered saline - фосфатно-солевой буферный раствор), ACES (N-(2-ацетамидо)-аминоэтансульфоновая кислота), PIPES (пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновая кислота)), MOPSO (3-(N-морфолино)-2-гидроксипропансульфоновая кислота), MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота), TES (2-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновая кислота), DIPSO (3-[бис(2-гидроксиэтил)амино]-2-гидроксипропан-1-сульфоновая кислота), MOBS (4-(N-морфолино)бутансульфоновая кислота), TAPSO (3-[N-трис(гидроксиметил)метиламино]-2-гидроксипропансульфоновая кислота), HEPPSO (4-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-1-(2-гидрокси)-пропансульфоновая кислота), POPSO (2-гидрокси-3-[4-(2-гидрокси-3-сульфопропил)пиперазин-1-ил]пропан-1-сульфоновая кислота), TEA (триэтаноламин), EPPS (N-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-N'-3-пропансульфоновая кислота) и TRICINE (N-[трис(гидроксиметил)-метил]-глицин). Предпочтительно, указанный буфер выбран из TRIS-HCl, TRIS, трицина, HEPES и фосфатного буфера, содержащего смесь Na₂HPO₄ и KH₂PO₄ или смесь Na₂HPO₄ и NaH₂PO₄. Указанный буфер (в частности, буферы, упомянутые выше, и главным образом TRIS-HCl) предпочтительно представлен в концентрации 10-50 мМ.

Также может быть полезным включать в композицию одновалентную соль, таким образом, чтобы обеспечивать соответствующее осмотическое давление. Указанная одновалентная моль может быть главным образом выбрана из NaCl и KCl, предпочтительно указанная одновалентная соль представляет собой NaCl, предпочтительно в концентрации 10-500 мМ.

Композиция может быть приготовлена таким образом, чтобы она включала криопротектор для защиты модифицированного поксвируса при низкой температуре хранения. Подходящие криопротекторы включают без ограничения сахарозу (или тростниковый сахар), трегалозу, мальтозу, лактозу, маннит, сорбит и глицерин, предпочтительно в концентрации от 0,5 до 20% (масса в г/объем в л, обозначаемая как масс./об.). Например, сахароза предпочтительно присутствует в концентрации от 5 до 15% (масс./об.).

Композиция модифицированного поксвируса и особенно его жидкая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый хелатирующий агент для улучшения стабильности. Фармацевтически приемлемый хелатирующий агент может главным образом быть выбран из этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 1,2-бис(о-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (ВАРТА - от англ. 1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid), этиленгликоль-тетрауксусной кислоты (EGTA - от англ. ethylene glycol tetraacetic acid), димеркаптоянтарной кислоты (DMSA - от англ. dimercaptosuccinic acid), диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA - от англ. diethylene triamine pentaacetic acid) и 2,3-димеркопто-1-пропансульфоновой кислоты (DMPS - от англ. 2,3-Dimercapto-1-propanesulfonic acid). Фармацевтически приемлемый хелатирующий агент предпочтительно находится в концентрации по меньшей мере 50 мкМс конкретным предпочтением в отношении концентрации 50-1000 мкМ. Предпочтительно, указанный фармацевтически приемлемый хелатирующий агент представляет собой ЭДТА, находящийся в концентрации, близкой к 150 мкМ.

Дополнительные соединения могут дополнительно присутствовать для повышения стабильности композиции модифицированного поксвируса. Такие дополнительные соединения включают, без ограничения, С₂-С₃ спирт (желательно в концентрации от 0,05 до 5% (объем/объем или об./об.)), глутамат натрия (желательно в концентрации ниже чем 10 мМ), неионное поверхностно-активное вещество (US 7456009, US 2007-0161085), такое как Tween 80 (также известное как полисорбат 80) в низкой концентрации ниже 0,1%. Обнаружили, что двухвалентные соли, такие как MgCl₂ или CaCl₂, индуцируют стабилизацию разных биологических продуктов в жидком состоянии (см. Evans et al. 2004, J Pharm Sci. 93:2458-75 и US7456009). Обнаружили, что аминокислоты, в частности гистидин, аргинин и/или метионин, вызывают стабилизацию разных вирусов в жидком состоянии (см. WO 2016/087457).

Наличие высокомолекулярных полимеров, таких как декстран или поливинилпирролидон (PVP - от англ. polyvinylpyrrolidone), особенно подходит для лиофилизированных композиций, полученных способом, включая вакуумную сушку и лиофилизацию, и наличие данных полимеров помогают в образовании осадка во время лиофилизации (см., например, WO 03/053463; WO 2006/085082; WO 2007/056847; WO 2008/114021 и WO 2014/053571).

В соответствии с настоящим изобретением приготовление композиции может быть адаптировано под способ введения для обеспечения надлежащего распределения или замедленного высвобождения in vivo. Могут быть использованы биодеградируемые и биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры, полимолочная кислота и полиэтиленгликоль (см., например, J. R. Robinson in «Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems», ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978; WO 01/23001; WO 2006/93924; W O2009/53937).

В иллюстративных целях Tris-буферизованные препараты (Tris-HCl, рН8), содержащие сахарозу 5% (масс./об.), глутамат натрия 10 мМ и NaCl 50 мМ, адаптированы для сохранения композиции, описанной в данном документе, от -20°С до 5°С.

Дозировка

В одном предпочтительном воплощении композиция приготовлена в индивидуальных дозах, причем каждая доза содержит от примерно 10³ до 10¹² vp (от англ. viral particle - вирусная частица), iu (от англ. infectious unit - инфекционная единица) или БОЕ (от англ. plaque-forming unit - бляшкообразующая единица) модифицированного поксвируса в зависимости от используемой количественной методики. Количество вируса, находящееся в образце, можно определять рутинными методиками титрования, например, посредством подсчета числа бляшек после инфицирования пермиссивных клеток (например, клетки HeLa) с получением титра бляшкообразующих единиц (БОЕ), посредством измерения поглощения А260 (титры vp) или еще посредством количественной иммунофлуоресценции, например, используя антитела к вирусу (титры iu). Дополнительное уточнение расчетов, необходимое для адаптации соответствующей дозировки для субъекта или группы субъектов, может осуществлять рутинным образом практикующий специалист, исходя из релевантных обстоятельств. В качестве общего руководства, индивидуальные дозы, которые подходят для композиции поксвируса, содержат от приблизительно 10³ до приблизительно 10¹² БОЕ, от преимущественно 10⁴ БОЕ до приблизительно 10¹¹ БОЕ, предпочтительно от приблизительно 10⁵ БОЕ до приблизительно 10¹⁰ БОЕ; и более предпочтительно от приблизительно 10⁶ БОЕ до приблизительно 10⁹ БОЕ, и главным образом особенно предпочтительны индивидуальные дозы приблизительно 10⁶, 5×10⁶, 10⁷, 5×10⁷, 10⁸ или 5×10⁸ БОЕ.

Введение

Любой из общепринятых способов введения применим в контексте изобретения, включая парентеральный, местный способ или способ введения через слизистые оболочки. Парентеральные способы предназначены для введения в виде инъекции или инфузии и охватывают системные, а также местные способы. Типы парентеральных инъекций, которые можно использовать для введения композиции поксвируса, включают внутривенный (в вену), внутрисосудистый (в кровеносный сосуд), внутриартериальный (в артерию, такую как печеночная артерия), внутрикожный (в дерму), подкожный (под кожу), внутримышечный (в мышцу), внутрибрюшинно (в брюшную полость) и внутриопухолевый (в опухоль или ее ближайшее окружающее пространство) типы и также скарификацию. Введение может быть в виде однократной болюсной дозы, или может, например, осуществляться посредством насоса для непрерывной перфузии. Введения через слизистые оболочки включают, без ограничения, пероральный/алиментарный, внутриносовой, внутритрахеальный, внутрилегочный, внутривагинальный или ректальный способ. Местное введение можно также осуществлять, используя чрескожные средства (например, пластырь и т.д.). Предпочтительно, композиция модифицированного поксвируса приготовлена для внутривенного или внутриопухолевого введения в опухоль или в ее близкое окружение).

В способах введения можно использовать традиционные шприцы и иглы (например, инъекционные иглы Quadrafuse) или любое соединение или устройство, доступное в данной области, способное облегчать или улучшать доставку модифицированного поксвируса в субъекте (например, электропорация для облегчения внутримышечного введения). Альтернативой является применение безыгольного устройства для инъекций (например, устройства Biojector ТМ). Также могут рассматриваться трансдермальные пластыри.

Композиция, описанная в данном документе, подходит для однократного введения или серии введений. Также возможно продолжать посредством последовательных циклов введений, которые повторяются после периода «отдыха». Интервалы между каждым введением могут составлять от трех суток до примерно шести месяцев (например, 24 ч, 48 ч, 72 ч, еженедельно, каждые две недели, ежемесячно или ежеквартально и. т.д.). Интервалы могут также быть нерегулярными. Дозы могут варьировать для каждого введения в пределах интервала, описанного выше. Предпочтительная терапевтическая схема включает от 2 до 10 еженедельных введений, за которыми возможно следуют 2-15 введений с более длительными интервалами (например, 3 недели) композиции поксвируса.

Способы использования m2 -дефектного поксвируса и композиции по изобретению

В еще одном аспекте композиция, описанная в данном документе, предназначена для применения для лечения или предупреждения пролиферативного заболевания в соответствии с условиями, описанными в данном документе. Соответственно, согласно изобретению также предложен способ лечения, включающий введение указанной композиции субъекту, нуждающемуся в этом (предпочтительно, субъекту, пораженному раком), в количестве, достаточном для лечения или предупреждения такого заболевания, а также способ ингибирования роста опухолевых клеток, включающий введение композиции субъекту. В контексте изобретения способы и применение, описанные в данном документе, нацелены на замедление, излечение, улучшение состояния или контроль над возникновением или прогрессированием пролиферативного заболевания.

В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «пролиферативное заболевание» охватывает широкую группу разных заболеваний, являющихся результатом неконтролируемого роста и разрастания клеток, включая раковые заболевания, а также заболевания, ассоциированные с повышенной активностью остеокластов (например, ревматоидный артрит, остеопороз и т.д.), и сердечнососудистые заболевания (например, рестеноз, который происходит в результате пролиферации гладкомышечных клеток стенки кровеносных сосудов). Нерегулируемое деление и рост клеток может приводить к образованию злокачественных опухолей, которые прорастают в соседние ткани и могут также давать метастазы в удаленных частях тела посредством лимфатической системы или кровотока. Термин «рак» может быть использован взаимозаменяемо с любым из терминов «опухоль», «злокачественное образование», «новообразование» и т.д., и подразумевается, что включает любой тип ткани, органа или клетки, любую стадию злокачественного образования (например, от предварительного поражения до стадии IV) и охватывает солидные опухоли и гемоконтактные опухоли, а также первичные и метастатические раковые заболевания.

Репрезентативные примеры раковых заболеваний, которые можно лечить, используя композицию и способы по изобретению, включают, без ограничения, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз и более конкретно рак кости, рак желудочно-кишечного тракта, рак печени, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак толстой и прямой кишки, рак пищевода, рак ротоглотки, рак гортани, карциному слюнной железы, рак щитовидной железы, рак легкого, рак головы и шеи, рак кожи, плоскоклеточный рак, меланому, рак матки, рак шейки матки, рак эндометрия, рак вульвы, рак яичника, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак эндокринной системы, саркому мягкой ткани, рак мочевого пузыря, рак почки, глиобластому и разные типы центральной нервной системы (ЦНС) и т.д. В одном воплощении способы и применение согласно настоящему изобретению предназначены для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из рака почки (например, светлоклеточный рак), рака предстательной железы (например, гормонорезистентная аденокарцинома предстательной железы), рака молочной железы (например, метастатический рак молочной железы), рака толстой и прямой кишки, рака легкого (например, немелкоклеточный рак легкого), рака печени (например, гепатокарцинома), рака желудка, карциномы желчного протока, рака эндометрия, рака поджелудочной железы и рака яичника.

Обычно, введение композиции, описанной в данном документе, обеспечивает терапевтический эффект в отношении субъекта, подвергающегося лечению, который может быть доказан наблюдаемым улучшением клинического статуса, по сравнению с исходным статусом или по сравнению с ожидаемым статусом при отсутствии лечения. Улучшение клинического статуса может быть легко оценено любым релевантным киническим измерением, обычно используемым лечащими врачами или другим квалифицированным медицинским персоналом. В контексте изобретения терапевтический эффект может быть временным (на протяжении одного или пары месяцев после прекращения введения) или длительным (на протяжении нескольких месяцев или лет). Ввиду естественного развития клинического статуса, которое может варьировать значительно от одного субъекта к другому субъекту, не требуется, чтобы терапевтический эффект наблюдался у каждого субъекта, получающего лечение, а у значимого числа субъектов (например, статистически значимые различия между двумя группами можно определять посредством любого статистического критерия, известного в данной области, такого как параметрический критерий Тьюки, критерий Краскела-Уоллиса, U-критерий Манна-Уитни, t-критерий Стьюдента, t-критерий Вилкоксона и т.д.).

Например, терапевтический эффект у субъекта, пораженного раком, может быть подтвержден, например, уменьшением числа опухолей, уменьшением размера опухоли, уменьшением числа или распространения метастазов, увеличением продолжительности ремиссии, стабилизацией (а именно отсутствием ухудшения) состояния при заболевании, уменьшением скорости прогрессирования заболевания или его тяжести, пролонгированным выживанием, лучшим ответом на стандартное лечение, улучшением состояния суррогатных маркеров заболевания, улучшением качества жизни, уменьшенной смертностью и/или предупреждением рецидива заболевания и т.д.

Соответствующие измерения, такие как анализы крови, анализ биологических жидкостей и биопсий, а также медицинские методики визуализации, можно использовать для оценки клинической пользы. Они могут быть выполнены перед введением (исходная линия) и в разные моменты времени на протяжении лечения и после прекращения лечения. Такие измерения оцениваются рутинным образом в медицинских лабораториях и больницах, и в продаже имеется большое количество наборов (например, иммунологические анализы, анализы на основе количественной ПЦР).

Предпочтительное воплощение относится к композиции, содержащей модифицированный поксвирус, желательно онколитический модифицированный поксвирус и предпочтительно онколитический вирус осповакцины (например, штамм Copenhagen) с конкретным предпочтением в отношении онколитического вируса осповакцины, кодирующего антитело против CTLA-4, как описано в данном документе, для применения для лечения субъекта с раком, и предпочтительно раком почки, раком толстой и прямой кишки, раком легкого (например, немелкоклеточным раком легкого), меланомой и раком яичника.

В еще одном воплощении модифицированный поксвирус или композиция, описанные в данном документе, предназначены для применения для усиления противоопухолевого адаптивного иммунного ответа или для усиления или продления противоопухолевого ответа.

В еще одном аспекте модифицированный поксвирус или его композицию используют или вводят для стимуляции или улучшения иммунного ответа у субъекта, получающего лечение. Соответственно, настоящее изобретение также охватывает способ стимуляции или улучшения иммунного ответа, включающий введение композиции субъекту, нуждающемуся в этом, в количестве, достаточном в соответствии с условиями, описанными в данном документе, таким образом, чтобы стимулировать или улучшать иммунитет субъекта. Стимулированный или улучшенный иммунный ответ может быть специфичным (а именно, направленным на эпитопы/антигены) и/или неспецифичным (врожденным), гуморальным и/или клеточным, главным образом, CD4+ или CD8+ - опосредованным Т-клеточным ответом. Способность композиции, описанной в данном документе, для стимуляции или улучшения иммунного ответа, может быть оценена или in vitro (например, используя биологоческие образцы, собранные у субъекта) или in vivo, используя многообразие прямых или непрямых анализов, которые являются стандартными в данной области (см., например, Coligan et al., 1992 and 1994, Current Protocols in Immunology; ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health или последующие редакции). Также подходят анализы, приведенные выше, в связи с антигенной природой полипептида.

В частности и по сравнению с общепринятым (m2 - позитивным) поксвирусом, модифицированный поксвирус или композиция, описанная в данном документе, также полезны для любой из следующих целей или их любой комбинации:

для стимуляции или улучшения иммунного ответа, опосредованного лимфоцитами (особенно против антигенного полипептида);

для стимуляции или улучшения активности АРС;

для стимуляции или улучшения противоопухолевого ответа;

для стимуляции или улучшения CD28-сигнального пути;

для улучшения терапевтической эффективности, обеспечиваемого модифицированным поксвирусом, описанным в данном документе, у субъекта, получающего лечение, или группы субъектов, получающих лечение; и/или

для уменьшения токсичности, обеспечиваемого модифицированным поксвирусом, описанным в данном документе, у субъекта, получающего лечение, или группы субъектов, получающих лечение.

Комбинированная терапия

В одном воплощении модифицированный поксвирус, композиция или способы по изобретению используются в качестве отдельной терапии. В еще одном воплощении они могут быть использованы или проведены совместно с одной или более дополнительными терапиями, в частности, стандартной(ыми) терапией(ями), которые подходят для типа рака, поражающего субъект, получающий лечение. Стандартные терапии для разных типов рака хорошо известны специалисту в данной области и обычно раскрыты в Cancer Network и клинических практических руководствах. Такая одна или более дополнительных терапий выбраны из группы, состоящей из оперативного вмешательства, лучевой терапии, химиотерапии, криотерапии, гормональной терапии, терапии на основе токсинов, иммунотерапии, терапии цитокинами, таргетной противораковой терапии, генной терапии, фотодинамической терапии и трансплантации и т.д.

Такую(ие) дополнительную(ые) противораковую(ые) терапию/ии вводят субъекту в соответствии со стандартной практикой до, после, одновременно или вперемежку с модифицированным поксвирусом или композицией, описанными в данном документе. Одновременное введение двух или более терапий не требует того, чтобы средства вводились в одно и то же время или одним и тем же способом, при условии, что существует перекрывание во временном периоде, на протяжении которого композиция и дополнительная противораковая терапия оказывают свое терапевтическое действие. Сопутствующее введение включает введение композиции модифицированного поксвируса в пределах одних и тех же суток (например, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 часов) в качестве еще одного терапевтического средства. Несмотря на то, что настоящим изобретением рассматривается любой порядок, предпочтительно, чтобы композиция модифицированного поксвируса вводилась субъекту до другого терапевтического средства.

В конкретных воплощениях модифицированный поксвирус или композицию, описанные в данном документе, можно использовать совместно с оперативным вмешательством. Например, композиция может быть введена после частичной или полной хирургической резекции опухоли (например, посредством местного применения в пределах удаленной зоны, например).

В других воплощениях модифицированный поксвирус или композицию, описанные в данном документе, можно использовать совместно с лучевой терапией. Специалисты в данной области могут легко приготовить соответствующие протоколы и параметры лучевой терапии (см., например, Perez and Brady, 1992, Principles and Practice of Radiation Oncology, 2nd Ed. J В Lippincott Co; с использованием соответствующих адаптаций и модификаций, как будет сразу очевидно специалистам в данной области). Типы облучения, которые можно использовать главным образом в лечении рака, хорошо известны в данной области и включают электронные пучки, высокоэнергетические фотоны из линейного ускорителя или из радиоактивных источников, таких как кобальт или цезий, протоны и нейтроны. Диапазоны дозировки для радиоизотопов широко варьируют и зависят от периода полураспада изотопа, силы и типа испускаемого излучения, и поглощения опухолевыми клетками. Регулярные дозы рентгеновского облучения для продолжительных периодов времени (3-6 недель) или высокие однократные дозы рассматриваются настоящим изобретением.

В некоторых воплощениях модифицированный поксвирус или композиция, описанные в данном документе, могут быть использованы совместно с химиотерапией. Репрезентативные примеры подходящих химиотерапевтических средств, в настоящее время доступных для лечения рака, включают, без ограничения, алкилирующие агенты, ингибиторы топоизомеразы I, ингибиторы топоизомеразы II, производные платины, ингибиторы рецепторов тирозинкиназы, циклофосфамиды, антиметаболиты, ДНК-повреждающие средства и антимитотические средства. Репрезентативные примеры подходящих химиотерапевтических средств, доступных в настоящее время для лечения инфекционных заболеваний, включают, среди прочих, антибиотики, антиметаболиты, антимитотические и противовирусные лекарственные средства (например, интерферон альфа).

В других воплощениях модифицированный поксвирус или композиция, описанные в данном документе, могут быть использованы совместно с иммунотерапевтическими средствами, такими как противоопухолевые антитела, а также ми РНК и антисмысловые полинуклеотиды.

В еще одних воплощениях модифицированный поксвирус или композицию, описанные в данном документе, можно использовать совместно с адъювантом. Репрезентативные примеры подходящих адъювантов включают, без ограничения, лиганды TLR3 (Claudepierre et al., 2014, J. Virol. 88 (10): 5242-55), лиганды TLR9 (например, Fend et al., 2014, Cancer Immunol. Res. 2, 1163-74; Carpentier et al., 2003, Frontiers in Bioscience 8, e115-127; Carpentier et al., 2006, Neuro-Oncology 8 (1): 60-6; EP 1162982; US 7700569 и US 7108844) и ингибиторы PDE5, такие как силденафил (US 5250534, US 6469012 и ЕР 463 756).

В дополнительных воплощениях модифицированный поксвирус или композиция, описанные в данном документе, могут быть использованы в соответствии с подходом первичной повторной иммунизации, который включает последовательные введения примирующей(их) композиции(ий) и композиции(ий) для повторной иммунизации. Обычно, в композициях для примирования и повторной иммунизации применяют разные векторы, которые кодируют по меньшей мере один антигенный домен, подобно по меньшей мере одному, являющемуся модифицированным поксвирусом, описанным в данном документе. Кроме того, композиции для примирования и повторной иммунизации могут быть введены в один и тот же участок или в альтернативные участки одним и тем же способом или разными способами введения.

Другие признаки, объекты и преимущества изобретения будут с очевидностью вытекать из описания и графических материалов и из формулы изобретения. Следующие примеры включены для иллюстрации предпочтительных воплощений изобретения. Однако, в соответствии с настоящим раскрытием, специалисты в данной области должны понимать, что изменения могут быть внесены в конкретные воплощения, которые раскрыты, без отклонения от сущности и объема изобретения.

Примеры

Материалы и методы Белки и вирусы

Рекомбинантные слитые белки Fc (человеческие и мышиные) с или без His-метки на их С-конце заказывали в R&D Systems. Человеческие CD80-Fc и CD86-Fc биотинилировали самостоятельно с использованием сложного N-гидроксисукцинимидного эфира биотинамидогексаноил-6-аминогексановой кислоты (Sigma).

Использовали разные вирусы осповакцины:

- вирус осповакцины дикого типа (штаммы Copenhagen, Wyeth и Western Reserve);

- вирусы осповакцины с двойной делецией (штамм Copenhagen), дефектные в отношении обеих активностей тимидинкиназы и рибонуклеотидредуктазы (tk-; rr-; описанные в WO 2009/065546).

- вирусы осповакцины с тройной делецией (штамм Copenhagen), дефектные в отношении tk, rr- и m2 - активностей. Вирус с тройной делецией получали из вируса с двойной делецией tk- rr- посредством конкретной гомологичной рекомбинации в открытой рамке считывания локуса M2L, как описано далее в данном документе.

Помимо вируса осповакцины все анализируемые поксвирусы, если не указано иное, представляли собой штаммы дикого типа.

Делеция M2L в rr-, tk- вирусе осповакцины

Для исследований in vivo вирусы осповакцины с двойной (tk- rr-) и тройной (tk-rr- m2-) делециями конструировали для кодирования люциферазы светлячка в локусе J2R под промотором p11K7.5.

Делеция гена M2L, вводимая в геном VV, охватывает 64 нуклеотида выше ORF m2 и первые 169 кодонов ORF m2 . Делецию осуществляли посредством гомологичной рекомбинации, используя плазмиду для переноса из источника PUC18. Данная плазмида для переноса содержала левое (nt26980 - 27479 генома VV, номер доступа М35027) и правое (nt28051 - 28550) плечо, разделенные экспрессионной кассетой, кодирующей продукт слияния селективных маркеров усиленного зеленого флуоресцентного белка/ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (EGFP/GPT) под контролем промотора pH5R вируса осповакцины. Полученной плазмидой, посредством электропорации, трансфицировали фибробласты куриных эмбрионов (CEF), инфицированные вирусом осповакцины, кодирующим люциферазу (rr-; r/с-/люцифераза) с использование Amaxa Nucleofactor. Рекомбинантный вирус выделяли посредством EGFP/GPT селекции. Делецию M2L и вставку кассеты EGFP/GPT подтверждали посредством ПЦР-анализа. Селективную кассету EGFP/GPT удаляли посредством переноса рекомбинантного вируса на CEF без селекции. Маточный раствор первичного исследования получали на CEF. Делецию гена M2L проверяли посредством ПЦР и секвенирования.

Вирус получали на CEF после инфицирования при MOI 0,05 и трех суток инкубации. Спустя трое суток после инфицирований, неочищенный материал, содержащий инфицированные клетки и супернатант культуры, выделяли и хранили при -20°С до применения. Перед очисткой данную суспензию гомогенизировали для высвобождения вирусных частиц. Большие клеточные обломки затем исключали посредством глубокой фильтрации. Очищенную вирусную суспензию впоследствии концентрировали и подвергали диафильтрации с помощью буфера композиции посредством использования фильтров для тангенциальной проточной фильтрации и половолоконных фильтров для микрофильтрации. Наконец, очищенный вирус дополнительно концентрировали, используя ту же систему тангенциальной проточной фильтрации, делили на аликвоты и хранили при -80°С до применения.

ELISA анализ связывания В7

96-Луночные планшеты (иммунологический планшет Nunc Medisorp) покрывали в течение ночи при 4°С, 100 мкл 0,5 мкг/мл белков В7, CTLA4 или CD28 в покрывающем буфере (50 мМ карбонат Na, рН 9,6). Микропланшеты промывали PBS/0,05% Tween20 и насыщали 200 мкл блокирующего раствора (PBS; 0,05% Tween20; 5%-ное обезжиренное сухое молоко (Biorad)). Все препараты и разведения антител делали в блокирующем растворе. Сто мкл образцов добавляли в каждую лунку в трехкратной повторности и в двухкратных серийных разведениях для некоторых экспериментов (кривые связывания). Затем микропланшеты инкубировали с 100 мкл антитела против Flag-HRP (Sigma), разведенного в 10000 раз. Затем микропланшеты инкубировали с 100 мкл/лунка 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ - от англ. tetramethylbenzidine, Sigma), и реакцию останавливали 100 мкл 2 М H₂SO₄. Поглощение измеряли при 450 нм посредством планшет-ридера (TECAN Infinite M200PRO). Значения поглощения переносили в программное обеспечение GraphPadPrism для анализа и графического представления.

Конкурентный ELISA

Экспериментальные условия и решение, если не указано иное, идентичны экспериментальным условиям и решению, описанным выше. Для конкурентных анализов CTLA4/CD80, CD28/CD80 и PDL1/CD80 100 мкл CTLA4, CD28 и PDL1 покрывали в количестве 0,25 (CTLA4) или 1 мкг/мл (CD28 и PD-L1). Образцы добавляли и разводили (двухкратное серийное разведение) в блокирующем растворе, содержащем постоянную концентрацию CD80 (или 50, 250 или 500 нг/мл для CTLA4, CD28 и PD-L1, соответственно). Для конкурентных анализов CD86/CTLA4 и CD28/CD86 100 мкл CD86 или CD28 покрывали в количестве 0,25 (CD86) или 2 мкг/мл (CD28). Образцы добавляли и разводили (двухкратное серийное разведение) в блокирующем растворе, содержащем постоянную концентрацию или CTLA4 (100 нг/мл) или CD86 (500 нг/мл), соответственно. Или антитело против His-метки-HRP (Qiagen) при 1/2000 или стрептавидин HRP (Southern Biotech) при 1/1000 использовали в качестве конъюгированных реагентов. Планшеты дополнительно обрабатывали, и результаты анализировали, как описано выше.

Вестерн -блоттинг

Двадцать пять микролитров образцов получали в буфере Лэммли, содержащем 5% (3-меркаптоэтанол (ВМЕ - от англ. p-mercaptoethanol) (восстанавливающие условия) или нет (невосстанавливающие условия). После электрофореза на неокрашенном геле Criterion TGX 4-15% (Biorad) белки переносили на мембрану PVDF (от англ. polyvinylidene difluoride поливинилиденфторид) (Transblot Turbo System). Систему вестерн-блоттинга I Bind Flex (Invitrogen) использовали для инкубаций и промывок белков/антител. Блоты метели с помощью 2,5 мкг/мл CD80-Fc, CD86-Fc, CTLA4-Fc или антитела против Flag-HRP при 1/1000. Для CD80-Fc, CD86-Fc и CTLA4-Fc меченое HRP антитело против человеческого Fc (Bethyl) при 1/3000 использовали в качестве конъюгированного антитела. Раствор 1Х iBind Flex использовали для блокирования, разведения антител, промывки и увлажнения iBind Flex Card. Иммунные комплексы выявляли, используя реагенты для вестерн-блоттинга Amersham ECL Prime. Хемилюминесценцию регистрировали посредством устройства для визуализации молекул ChemiDOC XRS (Biorad).

Аффинная хроматография

Супернатанты CEF, инфицированных (MOI 0,05) или MVA или вирусом осповакцины, штамм Copenhagen, собирали через 72 часа после инфицирования. Супернатанты центрифугировали и фильтровали на 0,2 мкм фильтрах для удаления большей части клеточных обломков и вируса осповакцины. Затем обработанные супернатанты, дополненные 0,05% Tween 20, концентрировали примерно в 20 раз с использованием концентратора на основе порога отсечения по молекулярной массе MWCO (от англ. molecular weight cut-off) 30000 vivaspin20 (Sartorius). Магнитные шарики со стрептавидином (GE healthcare) покрывали или нерелевантным моноклональным биотинилированным антителом (chCXIIG6), CTLA4-Fc-Biot или CD86-Fc-Biot. Четыре мл концентрированных супернатантов (MVA и вирус осповакцины Copenhagen) инкубировали с 24 мкл шариков с chCXIIG6-стрептавидином для удаления неспецифичного связывания. Непрерывные потоки данной первой инкубации разбивали на 2 равные части и инкубировали или с шариками с CTLA4-Fc-Biot-стрептовидином или шариками с CD86-Fc-Biot-стрептавидином с получением четырех следующих групп: супернатант MVA + шарики CTLA4 (MVA А4); супернатант MVA + шарики CD86 (MVA CD); вирус осповакцины + супернатант шариков CTLA4 (VV А4) и вирус осповакцины + шарики CD86 (VV CD86). Шарики активно промывали PBS, 0,05% Tween 20 с последующей промывкой PBS, и связанные белки два раза элюировали 50 мкл 0,1 М уксусной кислоты, сразу же нейтрализовали добавлением 4 мкл 2М трис-основания. Затем два элюирования объединяли перед МС (масс-спректрометрия)-анализом.

Препарат белка для расщепления

Десять или 20 мкл образца выпаривали и подвергали восстановлению посредством солюбилизации в 10 мкл 10 мМ ДТТ (Дитиотреитол) в 25 мМ NH₄HCO₃ (1Н при 57°С). Восстановленные остатки цистеина алкилировали 10 мкл 55 мМ йодацетамида в 25 мМ NH₄HCO₃ 30 мин при комнатной температуре в темноте. Трипсин (12,5 нг/мкл; Promega V5111), свежеразведенный в 25 мМ NH₄HCO₃, добавляли к образцу в соотношении 1:100 (фермент/белок) до конечного объема 30 мкл и инкубировали 5 часов при 37°С. Активность трипсина ингибировали посредством подкисления 5 мкл H₂O/ТФУ (трифторуксусная кислота) 5%.

Анализ МС/МС

Образцы анализировали в наносистеме для СВЭЖХ (сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография) (nanoAcquity, Waters), соединенной с гибридным квадрупольным масс-спектрометром Orbitrap (Q-Exactive plus, Thermo Scientific, San Jose, CA). Система СВЭЖХ была оборудована предколонкой Symmetry С18 (20 × 0,18 мм, размер частиц 5 мкм, Waters, Milford, США) и разделительной колонкой ACQUITY UPLC® ВЕН130 С18 (75 мкм × 200 мм, размер частиц 1,7 мкм, Waters). Система растворителей состояла из 0,1% муравьиной кислоты в воде (растворитель А) и 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (растворитель В). Инъецировали два мкл каждого образца. Пептиды захватывали на протяжении 3 мин при 5 мкп/мин с помощью 99% А и 1% В. Элюирование проводили при 60°С при скорости потока 400 нл/мин, используя 79 минутный линейный градиент 1-35% В. Для минимизации переноса промывку колонки (50% ACN (от англ. acetonitrile - ацетонитрил) на протяжении 20 мин) включали между каждым образцом помимо инъекции холостого растворителя, которую проводили после каждого образца.

Q-Exactive Plus работал в режиме выявления положительно заряженных ионов с установлением температуры источника на уровне 250°С и напряжении при электростатическом напылении на уровне 1,8 кВ. Полное сканирование МС-спектров (300-1800 m/z) получали при разрешении 140000 при m/z 200, максимальном времени инъецирования 50 мс и заданном значении AGC 3×106 зарядов с доступным вариантом фиксированной массы (445,12002 m/z). Вплоть до 10 наиболее интенсивных предшественников на полный скан выделяли, используя окно 2 m/z, и фрагментировали, используя более высокоэнергетическую диссоциацию, вызванную столкновениями (HCD - от англ. high energy collisional dissociation, нормированная энергия столкновений 27eV) и динамическое исключение уже фрагментированных предшественников устанавливали на уровне 60 с. МС/МС-спектры получали с разрешением 17500 при m/z 200, максимальном времени инъецирования 100 мс и заданном значении AGC 1 × 105. Систему полностью контролировали посредством программного обеспечения XCalibur (v3.0.63; Thermo Fisher Scientific).

Интерпретация данных по МС/МС

Данные по МС/МС исследовали в сравнении с объединенной базой данных на основе подхода «целевой-ложный», полученной из базы данных Uniprot Gallus gallus и вируса осповакцины (01-04-2018, содержащей 33939 целевых последовательностей плюс то же количество обратных ложных последовательностей), используя Mascot (version 2.5.1, Matrix science, Лондон, Англия). Целевые белки hCTLA4, hCD86 и hCXIIG6 и «целевые-ложные» вручную добавляли в базу данных. Базу данных, включающую обычные загрязняющие вещества (человеческие кератины и свиной трипсин) и создавали, используя внутренний инструментарий базы данных (http://msda.u-strasbg.fr). Применяли следующие параметры: рассматривали одно недорасщепление трипсином и вариабельные модификации (окисление метионина (+16 Да), карбамидометилирование цистеина (+57 Да). Окно исследования устанавливали на уровне 25 млн^-1 для ионов-предшественников и 0,07 Да для фрагментных ионов. Файлы с результатами Mascot (.dat) импортировали в программное обеспечение Proline (http://proline.profiproteomics.fr/), и белки проверяли на хороший ранг, равный 1, 1% FDR на совпадениях спектра пептидов на основе отрегулированного е-значения, по меньшей мере 1 специфичный пептид на белок, 1% FDR на наборах белков и модифицированное оценивание в баллах Mudpit Mascot.

Реакция смешанных лимфоцитов (MLR)

Способность m2 -вируса активировать лимфоциты оценивали в анализах MLR. Клетки CEF инфицировали (MOI 0,05) или COPTG19289 или WTG18058, или MVAN33, и супернатанты культуры собирали через 48 ч после инфицирования и концентрировали приблизительно в 20 раз, используя концентратор на основе порога отсечения по молекулярной массе MWCO 30000 vivaspin 20 (Sartorius). В Концентрированные супернатанты добавляли (20 мкл в 200 мкл) или неразведенными или разведенными в 10 и 100 раз с получением 2, 0,2 и 0,02-кратной конечной «концентрации супернатанта», соответственно.

Кровь от разных здоровых доноров приобретали в Etablissement Francais du sang (EFS Grand Est, 67065 Strasbourg). РВМС очищали способом на основе Ficoll-Paque (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare) и ресуспендировали при примерно 1×10⁷ клеток/мл в среде RPMI с добавлением 20% FBS (от англ. Fetal bovine serum -фетальная телячья сыворотка) и 10% ДМСО (диметилсульфоксид) и хранили при -150°С до применения. РВМС подвергали оттаиванию при 37°С, ресуспендировали в среде RMPI с 10% FBS и центрифугировали 5 минут при 300 д. Собранные клетки ресуспендировали в среде RMPI плюс 10% FBS, и концентрацию клеток доводили до 3×10⁶ клеток/мл. Сто мкл РВМС от двух разных доноров смешивали в лунке 96-луночного микропланшета в трехкратной повторности. Двадцать мкл супернатантов инфицированных клеток, описанных выше, добавляли в каждую лунку, и микропланшеты инкубировали 72 ч при 37°С в атмосфере 5% CO₂.

Затем супернатанты культуры MLR собирали, и человеческий интерлейкин-2 (IL-2 - от англ. lnterleukin-2) измеряли посредством ELISA с использованием набора Human IL-2*-2ELISA MAX™ deluxe Set (BioLegend). Измерения нормировали посредством деления среднего значения концентрации IL-2 трех повторностей данного образца на среднее значение концентрации IL-2 трех повторностей РВМС, инкубируемых со средой.

Эксперименты in vivo на гуманизированных NCG-34+ мышах Гуманизация мышей

Линия мышей с иммунодефицитом NOD/Shi-scid/IL-2RYnull (NCG) была предоставлена Taconic. Животных в возрасте четырех недель внутрибрюшинно обрабатывали бусульфаном (химиоабляция), и им на следующие сутки внутривенно (в.в.) инъецировали CD34+ стволовые клетки человека (50000 клеток на мышь). Спустя четырнадцать недель после инъекции клеток отслеживали уровень приживления посредством анализа человеческих CD45+ клеток среди общего числа лейкоцитов крови посредством проточной цитометрии. Степень гуманизации определяли как отношение циркулирующих hCD45 к общему числу CD45 (mCD45+hCD45).

Иммунный фенотип Т-лимфоцитов

Осуществляли забор крови (100 мкл) из ретроорбитального синуса за 2 суток до прививания опухоли. Популяции CD45+, CD3+, CD3+CD4+и CD3+CD8+ лимфоцитов человека оценивали посредством проточной цитометрии (Attune NxT, Lifetechnologies), используя антитела, направленные против hCD45 (Ref 563879; BD), CD4 (Ref 130-092-373; Miltenyi), CD3 (Ref 130-109-462; Miltenyi) и CD8 (Ref 130-096-561; Miltenyi), а также желтый маркер живых/мертвых клеток (Ref L34968; Thermofisher). Кратко, образцы крови инкубировали с разными антителами в течение 30 мин при 4°С. Затем, эритроциты лизировали, используя лизирующий буфер с высоким выходом (HYL250; Thermo Fischer Scientific) при комнатной температуре (RT) в течение 15 мин, непосредственно с последующим анализом -проточной цитометрией (Attune NxT, Life technologies).

Обработка онколитическими вирусами

Человеческие клетки карциномы толстой и прямой кишки НСТ-116 приобретали у АТСС (CCL-247™), выращивали в среде McCoy's 5А с добавлением 10% FBS плюс пенициллин/стрептомицин и разъединяли трипсином при 37°С в течение 10 мин. После промывки клетки ресуспендировали в стерильном PBS в количестве 5×10⁷ клеток/мл, и 100 мкл клеточной суспензии (5×10⁶ клеток) подкожно инъецировали в один бок мышей. Когда средний объем опухоли почти достигал 70 мм³, мышей случайным образом распределяли по пяти группам (5 мышей/группа) в зависимости от их степени гуманизации и размера опухоли:

- Группа 1 получала носитель

- Группа 2 получала 10⁵ БОЕ WTG18058

- Группа 3 получала 10^е БОЕ WTG18058

- Группа 4 получала 10⁵ БОЕ COPTG 19289

- Группа 5 получала 10^е БОЕ COPTG 19289

Для каждой группы одну внутривенную (в.в.) инъекцию 100 мкл препарата вируса проводили в сутки распределения случайным образом по группам, обозначаемые как D0. За мышами ежесуточно следили в отношении неожиданных признаков дистресса. Массу тела и объем опухоли контролировали 3 раза в неделю. Диаметры опухоли измеряли, используя штангенциркуль. Объемы опухоли (в мм³) рассчитывали в соответствии со следующей формулой: Объем = 1/2 (длина × ширина²). Животных умерщвляли, когда объем опухоли превышал 1500 мм³ или когда потеря массы тела составляет более 25%.

Пример 1: Идентификация способности белка m2 вируса осповакцины препятствовать В7-опосредуемому костимулирующему пути и характеристика его свойств связывания

Супернатанты клеток, инфицированных вирусом осповакцины,

ингибируют взаимодействие CTLA4 с CD80 или CD86

Два анализа устанавливали для количественного контроля блокирующих активностей CD80/CTLA4 и CD86/CTLA4, обеспечиваемых разными кандидатами-вирусами. В данных анализах человеческий CTLA4 (hCTLA4) иммобилизировали на ELISA-планшете, и добавляли растворимые меченые hCD80 или hCD86. В данной установке любая конкурентная молекула, которая связывается или с иммобилизованным или с растворимым партнером, будет вызывать ослабление сигнала (конкурентный анализ). Антитело против hCTLA4 Ипилимумаб (Yervoy) и супернатант неинфицированных DF1 (имеющаяся линия клеток цыпленка; например, из АТСС® CRL-12208™ использовали в качестве положительного и отрицательного контролей, соответственно. Неожиданно, как и Yervoy, которое взаимодействует с hCTLA-4 покрытия, все супернатанты клеток, инфицированных вирусом осповакцины (штаммы Copenhagen, Wyeth и Western Reserve), как было обнаружено, конкурируют дозозависимым образом как с пробой CD80/CTLA4, так и с пробой CD86/CTLA4 (Фиг. 1А и 1В), тогда как супернатант неинфицированных клеток DF1 не оказывал никакого действия. Интересно, супернатанты DF1, инфицированных модифицированным вирусом осповакцины Ankara (MVA), не вызывали никакого ингибирования взаимодействий hCTLA4/hCD80 и hCTLA4/hCD86, указывая на то, что данная способность противодействия не сохраняется в данном вирусе, который потерял шесть геномных фрагментов (делеции I-VI) во время процесса его ослабления (данные не показаны). Данные результаты указывают на то, что что-то в супернатантах VV препятствовало связыванию CTLA-4 с CD80 и CD86.

Для исключения какого-либо артефакта, включая компоненты клетки или среды, тестировали разные клеточные линии из разных источников (птичьи первичные и человеческие опухолевые клеточные линии), и также анализировали способ конкуренции FACS (от англ. сортировка клеток с активированной флуоресценцией).

Конкурентный FACS-анализ проводили, используя человеческую клеточную линию (а именно, KМ-Н2, Лимфома Ходжкина), экспонирующую в природе hCD80 и hCD86 на своей поверхности. Связывание растворимого рекомбинантного CTLA4-Fc с клетками KМ-Н2 было показано с использованием конъюгированного с флуорохромом антитела против Fc. При совместной инкубации с CTLA4-Fc, супернатанты клеток, инфицированных вирусом осповакцины, конкурировали за связывание CTLA4-Fc с клетками KМ-Н2, в отличие от MVA-инфицированных клеток, которые ведут себя, как отрицательный контроль (данные не показаны).

Конкурентный ELISA проводили, используя супернатанты клеток HeLa (вместо DF1), инфицированных разными поксвирусами, для оценки их способности препятствовать связыванию CTLA4 с CD80 или CD86. Тестировали разные штаммы вируса осповакцины (Wyeth, WR и Copenhagen), а также другие ортопоксвирусы (например, вирус оспы енота, вирус оспы кролика, вирус коровьей оспы, MVA), авипоксвирусы (вирус оспы кур) и парапоксвирусов (вирус псевдооспы коров). Неинфицированные клетки HeLa используют в качестве отрицательного контроля. В данном эксперименте по скринингу клетки HeLa инфицировали разными поксвирусами при высокой MOI (MOI 1) для обеспечения оптимального инфицирования, и полученные супернатанты собирали и тестировали посредством оценивания их способности ингибировать связывание CTLA4-Fc с CD80 (представлено как OD450hm). Как проиллюстрировано на Фиг. 2, все супернатанты клеток, инфицированных или тремя штаммами вируса осповакцины, или вирусом оспы енота (RCN), вирусом оспы кролика (RPX) и вирусом коровьей оспы (СРХ), могли препятствовать связыванию hCTLA4 с hCD80. Данные результаты указывают на то, что фактор, секретируемый во время инфицирования данными поксвирусами, препятствовал CTLA4-В7-пути. Новый неизвестный фактор, участвующий в данной ингибирующей активности, называли «фактор интерференции» (IF - от англ. interference factor). Снова, супернатанты клеток, инфицированных MVA и некоторыми другими поксвирусами, подобно вирусу псевдооспы коров (PCPV) и вирусу оспы кур and (FPV), не демонстрировали никакого ингибирования взаимодействий CTLA4/CD80-CD86, как неинфицированные клетки HeLa (HeLa).

«Фактор интерференции» присутствует в супернатантах вируса осповакцины, но отсутствует в супернатантах MVA

Для понимания того, с какой молекулой, находящейся в W-инфицированных супернатантах, взаимодействовал IF, вестерн-блоттинг супернатантов CEF (также обозначаемых СЕР), неинфицированных или инфицированных или MVA или вирусом осповакцины, исследовали с помощью трех компонентов ELISA-анализа, описанных выше (а именно, hCD80, hCD86 и hCTLA4). CEF выбирали, поскольку они являются пермиссивными как в отношении вируса осповакцины, так и в отношении MVA, которые продуцируют или не продуцируют IF, соответственно. Каждый белок, используемый для мечения вестерн-блота, представлял собой слитый белок с фрагментом Fc, который делает возможными, среди прочих вещей, их димеризацию и их выявление с помощью одного и того же конъюгированного антитела против Fc. Каждый супернатант использовали или в таком виде или концентрированным в 20 раз (×20). Блоты, представленные на Фиг. 3, однозначно демонстрировали, что большая молекула примерно 200 кДа присутствовала только в супернатантах, инфицированных вирусом осповакцины, и отмечена как в случае hCD80, так и hCD86, но не в случае hCTLA4 (по меньшей мере в данных условиях иммуноблота). Данная полоса легко выявляется даже в неконцентрированных супернатантах. Реактивность с обоими hCD80-Fc и hCD86-Fc была утеряна в восстанавливающих условиях (отсутствие выявления какой-либо полосы), что указывало на то, что внутри- и/или междисульфидные связи необходимы для сохранения структуры IF и взаимодействия с CD80 и CD86 (данные не показаны). С заметным отличием, в супернатантах MVA не была отмечена полоса.

Характеристика свойств связывания: «фактор интерференции», присутствующий в супернатанте вируса осповакцины, ингибирует связывание CD80 и CD86 с CTLA4 и CD28, но делает возможным связывание CD80 с PD-L1

Как обсуждается выше, CD80 и CD86 являются важными костимулирующими антигенами, участвующими в регуляции адаптивного Т-клеточного ответа. Поскольку CD80 и CD86 участвуют в нескольких молекулярных взаимодействиях с отрицательными (CTLA4 в случае обоих антигенов, и PD-L1 только в случае CD80) и положительными (CD28) результатами с точки зрения иммунного ответа, разные ELISA налаживали для расшифровки эффекта IF, оказываемого на каждый из данных 5 специфичных взаимодействий. Неразведенные супернатанты из CEF, неинфицированных нерекомбинантным вирусом осповакцины (W), тестировали в данных разных анализах и сравнивали с супернатантом MVA-инфицированных CEF, и антителом против hCTLA4 Yervoy (10 мкг/мл). Супернатанты неинфицированных клеток CEF используют в качестве отрицательного контроля. Как проиллюстрировано на Фиг. 4, супернатант VV ингибировал взаимодействие CD80 и CD86 с CTLA4 (как подтверждено впечатляющим уменьшение поглощения при OD450hm), аналогично Yervoy (как ожидалось из-за связывания Yervoy с его мишенью CTLA-4, что препятствует доступу к CD80 и, таким образом, лигированию CTLA4/CD80). С заметным отличием, супернатанты MVA-инфицированных клеток не оказывали действия (такое же поглощение, как и в случае отрицательного контроля CEF). Кроме того, супернатанты VV также были способны прекращать положительное взаимодействие CD80 или CD86 с CD28 (сильное уменьшение поглощения при OD450hm относительно поглощения, измеряемого с супернатантом неинфицированных клеток CEF). Напротив, супернатанты MVA-инфицированных клеток и Yervoy (как ожидается в случае антитела, которое нацелено только на рецептор CTLA4) не оказывали действия (такое же поглощение, как в случае отрицательного контроля). Данные результаты подтверждают наличие «IF» в супернатантах клеток, инфицированных VV, тогда как геном MVA не продуцирует такой фактор.

Неожиданно, взаимодействие PD-L1/CD80 усиливалось в результате наличия супернатантов вируса осповакцины (сильное увеличение поглощения при OD450hm относительно отрицательного контроля), с усилением PDL1-опосредованной иммунодепрессивной сигнализации. Напротив, Yervoy и супернатанты MVA-инфицированных CEF не оказывали воздействия на PDL1/CD80 (то же поглощение, как в случае неинфицированного контроля). Как и ожидалось, рекомбинантные hCD80, hCTLA4 и hPD1 прекращали данное взаимодействие. Данный результат указывает на то, что IF и CTLA4-связывающие участки на CD80 не полностью перекрываются. Следует отметить, что недавно было определено участие взаимодействия CD80/PD-L1 в выживании Treg.

Данные результаты подчеркивают улучшенные иммунодепрессивные свойства, демонстрируемые полипептидом m2 поксвируса. Действительно, m2 «подталкивает» иммунодепрессивные пути посредством блокирования CD80/CD28, CD86/CD28 и посредством усиления PDL1-CD80-путей, тогда как CTLA4-Fc ингибирует данные три пути, включая иммунодепрессивное взаимодействие PDL1-CD80.

Идентификация поксвирусного белка m2 как фактора интерференции

На основе кажущейся молекулярной массы приблизительно 200 кДа и того факта, что IF отсутствовал в MVA-инфицированных суперантантах, 37 генов, которые различаются у штамма вируса осповакцины Copenhagen и MVA, исследовали в отношении возможного кандидата без нахождения какого-либо очевидного кандидата. Никакого белка, массой примерно 200 кДа, не смогли идентифицировать. Наибольший кодируемый белок, среди данных 37 генов-кандидатов, представляет собой субъединицу ДНК-зависимой РНК-полимеразы rpo147 (J6R) с теоретической массой 147 кДа, таким образом, ниже, чем наблюдаемая масса 200 кДа. На основе первичной структуры не было очевидного вирусного белка-кандидата, который мог бы связываться с IF.

Таким образом, экспериментальный подход для идентификации IF пробовали, используя аффинную хроматографию (см. схему Фиг. 5А) для захвата IF. Концентрированный в 20 раз супернатант CEF, инфицированных вирусом осповакцины (инфицированных W), загружали на данную колонку для аффинной хроматографии. Концентрированный в 20 раз супернатант MVA-инфицированных клеток (MVA-инфицированных) параллельно обрабатывали. W- и MVA-супернатанты вносили или к иммобилизованному CTLA4 (отрицательные контроли) или иммобилизованному слитому белку CD86-Fc перед элюированием кислотой. Разные элюирования групп аффинной хроматографии анализировали посредством МС/МС (масс-спектрометрия) после расщепления трипсином. Полученные данные по m/z использовали для исследования банков данных курицы (Gallus gallus) и вируса осповакцины. Одно попадание получали только из супернатанта CEF, инфицированных вирусом осповакцины, инкубируемых с CD86-покрытыми шариками с покрытием 75% (включая пептидный сигнал) или 82% (без пептидного сигнала) белка m2 вируса осповакцины, кодируемого локусом M2L (Фиг. 5В, где последовательность, покрытая выявляемыми пептидами, указана жирным шрифтом). Данный результат полностью согласуется с отсутствием локуса M2L в геноме MVA и с тем фактом, что m2 имеет предсказанный сигнальный пептид, делающий его предполагаемым секретируемым белком.

Однако, белок m2 имеет расчетную молекулярную массу лишь 25 кДа и, как сообщалось, мигрирует на SDS-PAGE в восстанавливающих условиях, как белок 35 кДа (Hinthong et al. 2008), что далеко от массы 200 кДа IF, наблюдаемой на SDS-PAGE. Тем не менее, к сведению авторов изобретения, поведение белка m2 на SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях не было задокументировано. Таким образом, авторы изобретения предполагают, что IF мог бы представлять собой гомо- или гетеромультимерный комплекс, включающий белок m2 VV с межсубъединичными дисульфидными связями, приводя к получению кажущейся массы на SDS-PAGE приблизительно 200 кДа.

Пример 2: m2 -дефектный поксвирус больше не продуцирует IF

Конструирование поксвирусов с делецией M2L

Участие m2 в IF дополнительно исследовали посредством удаления гена M2L в геноме вируса осповакцины. Конкретно, локус M2L был нарушен в вирусе осповакцины с двойной делецией (DD), экспрессирующем люциферазу (а именно, tk', rr-', описанном в WO 2009/065546 и обозначаемом WTG18277), с получением рекомбинантного вируса с тройной делецией (TD) (а именно, tk' rr, mZ), экспрессирующего люциферазу (COPTG 19289), как описано выше. Частичная делеция M2L, которая простирается от 64 нуклеотидов выше ORF m2 до 169 первых кодонов, приводила к подавленной экспрессии белка m2 (m2-) и не оказывала никакого значимого воздействия на репликацию вируса на CEF, по сравнению с исходным геном (данные не показаны).

Вирус с делецией M2L больше не продуцирует IF

Супернатанты, полученные при инфицировании человеческих HeLa и клеток DF1 птиц вирусами DD и TD, исследовали посредством конкурентного анализа ELISA, как раньше. Как показано на Фиг. 6, супернатант, собранный при инфицировании вирусом осповакцины с делецией M2L COPTG19289, больше не мог ингибировать взаимодействия CTLA4/CD80 (о чем свидетельствует такое же поглощение, как и поглощение, измеренное в неинфицированных клетках HeLa или DF1), в отличие от исходного вируса DD (WTG18277), который демонстрировал сильное уменьшение в измерении поглощения, по сравнению с отрицательными контролями.

Кроме того, при подвергании вестерн-блоттингу, как указано выше, большой комплекс, мигрирующий с массой 200 кДа, выявляемый с использованием зондов CD80-Fc или CD86-Fc, больше не выявляли с супернатантом вируса с делецией M2L (данные не показаны). Данные результаты подтвердили, что m2 представляет собой по меньшей мере часть IF.

Пример 3: m2-дефектный рекомбинантный поксвирус Конструирование tk-rr-m2-онколитического вируса осповакцины, экспрессирующего люциферазу (ген, вставляемый в локус J2R), описано выше.

Онколитическая активность

Клетки карциномы толстой кишки LOVO (АТСС® CCL-229) и НТ116 (АТСС®CCL-247™) высевали в 96-луночные планшеты при плотности клеток 8,10⁵ клеток/лунка. Планшеты инкубировали в течение 4 ч, при 37°С, 5% CO₂, перед инфицированием. Клетки инфицировали или tk- rr- m2- вирусом COPTG19289, или tk-rr- вирусом WTG18277, причем оба экспрессировали люциферазу при интервале MOI от 10^-1 до 10^-4 частиц на клетку. Жизнеспособность клеток определяли посредством вытеснения трипанового синего с использованием устройства для подсчета клеток (Vi-Cell, Beckman coulter) через 96 ч после инфицирования (D4). Количественная оценка % выживаемости клеток для LOVO (Фиг. 7А) и НСТ116 (Фиг. 7В) показала, что онколитическая сила, обеспечиваемая m2 - дефектным вирусом COPTG19289, была сопоставима с онколитической силой, полученной с m2 -позитивным WTG18277 как в клетках LOVO, так и клетках НСТ116. Конкретно, клетки LOVO лизировали при инфицировании WTG18277 и COPTG19289 при MOI 10^-1 и 10^-2, тогда как 80%-ную жизнеспособность клеток наблюдали при низкой MOI 10³, и она полностью сохранялась при MOI 10^-4. Вирусная онколитическая активность была даже выше в клетках НСТ116, поскольку никакая жизнеспособность клеток (0%) не могла быть выявлена при MOI 10^-1, 10^-2 и 10^-3, и менее чем 50% клеток были жизнеспособны при MOI 10^-4. Обработка имитатором не оказывала действия на клетки и использовалась для определения 100% жизнеспособности клеток LOVO и НСТ116.

Данное отсутствие противоречия между вирусами с двойной и тройной делециями подтверждали в других линиях опухолевых клеток, включая клетки меланомы B16F10 (АТСС® CCL-6475™), карциномы толстой кишки мыши CT26WT (АТСС® CRL-2638™ и аденокарциномы толстой кишки мыши MC38WT (имеющиеся у Kerafast и Cellosaurus CVCL_B288). Оба вируса осповакцины являлись онколитическими в данных трех клеточных линиях при MOI 10^-1 и в B16F10 и MC38WT при MOI 10^-2, одновременно являясь частично онколитическими в CT26WT.

В заключение, рекомбинантный m2 -дефектный вирус демонстрировал сопоставимую онколитическую активность с его m2 - позитивным аналогом, что указывает на тот факт, что повреждение локуса M2L негативно не влияло на онколитическую активность в линиях опухолевых клеток.

Экспрессия трансгена in vivo

Экспрессию люциферазы, полученную от tk-rr-m2-онколитического вируса осповакцины (COPTG19289), оценивали в мышах C57BL/6, которым имплантировали опухоли B16F10 после подкожной инъекции, и сравнивали с экспрессией люциферазы, полученной с tk-rr- вирусом WTG18277. Каждый вирус (10⁷ БОЕ) инъецировали внутриопухолевым способом в сутки 0, 3, 6, 10 и 14, образцы опухоли собирали с сутки 1, 2, 6, 9, 13 и 16 для оценки активности люциферазы на грамм опухоли (RLU (от англ. Relative luminescence unit -относительная единица люминесценции)/г опухоли). Как проиллюстрировано на Фиг. 8, для обоих вирусов, сильную активность люциферазы выявляли в первые сутки (D1 и D2) после инъецирования вируса, и затем она снижалась. Однако, экспрессия люциферазы достигала фонового уровня через 13 суток после инфицирования WTG18277, тогда как слабый, но устойчивый уровень экспрессии измеряли при инфицировании COPTG19289, который сохранялся со временем (D9, D13 и D16).

Противоопухолевая активность

Противоопухолевую активность, предоставляемую tk-rr-m2- онколитическим вирусом осповакцины (COPTG19289), оценивали в трех моделях опухоли, B16F10, СТ26 и НТ116, соответственно.

В первой установке мышам C57BL/6 (10 мышей/группа) имплантировали опухоли B16F10 посредством подкожной инъекции. Когда опухоли достигали объема 25-100 мм³, опухоль каждого животного измеряли, и мышей случайным образом разделяли на группы, и им инъецировали внутриопухолевым способом 10⁷ БОЕ COPTG 19289, WTG 18277 или имитирующий носитель (отрицательный контроль) в DO, D3, D6, D10 и D14. Выживаемость животных и рост опухоли отслеживали два раза в неделю (мышей убивают, когда объем опухоли достигал 2000 мм³ или больше). Отсутствуют сильные различия между двумя W-обработанными группами. Примечательно, несколько животных демонстрировали замедленный рост опухоли в обеих группах. Напротив, рост опухоли был очень быстрым у животных, обработанных имитатором, достигая 2000 мм³ через 24 суток, приводя к смерти всех мышей в D24. Выживаемость мышей улучшалась в результате обработки вирусом осповакцины. Конкретно, в данном эксперименте 50%-ную выживаемость получали в D23 для мышей, обработанных tk- rr-WTG18277 и в D28 для мышей, обработанных tk- rr- m2- COPTG19289. Для ясности, кривые выживаемости совпадали у данных двух групп VV, за исключением того, что 2 из 10 мышей, получающих инъекцию, умерли несколько суток спустя (данные не показаны).

Противоопухолевую активность также оценивали у мышей Balb/c, которым имплантировали опухоли СТ26 посредством подкожной инъекции. Когда опухоли достигали объема 25-100 мм³, опухоли по отдельности измеряли, и мышей случайным образом распределяли по группам (D0) перед внутриопухолевым инъецированием tk-rr-m2 -онколитического вируса осповакцины (COPTG19289) или tk-rr- вируса WTG18277 или имитирующего носителя (10 мышей/группа). Пятьдесят мкл, соответствующих 10⁷ БОЕ каждого препарата вируса осповакцины (или имитации), инъецировали в опухоль в D0, D3, D6, D10 и D14. Рост опухоли отслеживали два раза в неделю, и мышей умерщвляли, когда объем опухоли достигал 2000 мм³ или больше. Как проиллюстрировано на Фиг. 9, объем опухоли у животных, обрабатываемых имитатором, быстро увеличивался до достижения 2000 мм³ в D28, тогда как рост опухоли замедлялся в группах, обрабатываемых VV, с объемом опухоли меньше 1000 мм³ только в tk- rr- m2- вирусе осповакцины.

Противоопухолевую активность также оценивали у швейцарских голых мышей (10 мышей/группа), которым имплантировали опухоли НТ116 посредством подкожной инъекции. Две разные дозы вирусов осповакцины инъецировали внутривенно через 10 суток после имплантации опухоли, соответственно, 10⁵ и 10⁷ БОЕ.

Рост опухоли отслеживали два раза в неделю, и мышей умерщвляли, когда объем опухоли достигал 2000 мм³ или больше. Как ожидалось, объем опухоли у животных, обрабатываемых имитатором, быстро увеличивался до достижения 2000 мм³ или больше через 45 суток после имплантации опухоли, тогда как рост опухоли замедлялся в группах, обрабатываемых 10⁵ БОЕ VV. Примечательно, рост опухоли полностью ингибировался в двух группах, которым инъецировали 10⁷ БОЕ вируса осповакцины, как проиллюстрировано на Фиг. 10.

В заключение, модификация локуса M2L VV, делающая вирус осповакцины неспособным продуцировать иммунодепрессивный белок М2, не влияет на онколитическую активность, противоопухолевое действие и экспрессию трансгена.

Пример 4: Анализы реакции смешанных лимфоцитов (MLR)

Супернатанты, полученные из клеток CEF, инфицированных COPTG19289 (tk-, rr- и m2) или WTG18058 (tk- rr-) или MVAN33, оценивали в MLR в отношении их способности активировать лимфоциты. Супернатанты культуры собирали через 48 ч после инфицирования (MOI 0,05) и концентрировали примерно в 20 раз.

РВМС очищали посредством Ficoll-Paque PLUS (GE healthcare) из крови, собранной у здоровых доноров. Более конкретно, 3×10⁵ РВМС от 2 разных доноров смешивали в 96-луночном микропланшете. Концентрированные супернатанты добавляли к культуре РВМС (20 мкл в 200 мкл), или неразведенными или разведенными в 10 или 100 раз с получением 2, 0,2 и 0,02-кратной конечной «концентрации суперантанта», соответственно, и культивировали в течение 72 ч при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Добавление среды RPMI использовали в качестве отрицательного контроля. Секрецию IL-2 количественно оценивали в супернатантах культуры посредством ELISA (Набор IL-2*-2ELISA MAX™ deluxe Set из BioLegend) в качестве маркера активации лимфоцитов. Измерения нормировали посредством деления среднего значения концентрации IL-2 трех повторностей данного образца на среднее значение концентрации IL-2 трех повторностей РВМС, инкубируемых со средой.

Отрицательный контроль представляет нормированный статус активации лимфоцитов 1. Как проиллюстрировано на Фиг. 11, РВМС, инкубируемые в присутствии супернатантов клеток, инфицированных и MVA и COPTG19289 (tk- rr-m2-; TD), вызывали активацию лимфоцитов, достигая значения, близкого значению при разведении в 10 или 100 раз, и больше 1 при тестировании неразведенных. С заметным отличием, WTG18058 (tk- rr-; DD)-инфицированные супернатанты демонстрировали явное ингибирование активации лимфоцитов при всех анализируемых разведениях, подтверждая иммунодепрессивную активность М2-кодирующего вируса.

Пример 5: Противоопухолевая активность у гуманизированных NCG-CD34+мышей

Противоопухолевую активность, обеспечиваемую вирусом m2-COPTG19289, оценивали у линии иммунодефицитных мышей NOD/Shi-scid/1L-2Rynull (NCG), гуманизированных человеческими CD34+ стволовыми клетками и с прививкой клеток карциномы толстой и прямой кишки человека НСТ-116 (5×10⁶ клеток инъецировали п.к. (подкожно) в одну боковую поверхность мыши, что представляло D0). Через двенадцать суток после имплантации (D12) мыши получали одну единственную в.в. инъекцию или COPTG19289 (tk- rr- m2-; TD) или его m2+ аналога WTG 18058 (tk- rr-; DD) в дозах 10⁵ БОЕ или 10⁶ БОЕ. Мышей, обработанных носителем, использовали в качестве отрицательных контролей. Рост опухоли и выживаемость мышей контролировали на протяжении по меньшей мере 60 суток после имплантации клеток.

Как проиллюстрировано на Фиг. 12А и В, объемы опухоли увеличивались очень быстро в группе мышей, обработанных носителем. С заметным отличием, рост опухоли явно ингибировался у мышей, обработанных m2-COPTG19289 (TD) или m2+ WTG18058 (DD), независимо от инъецируемой дозы, но в случае некоторых животных возникали дозозависимые проблемы токсичности; таким образом, предотвращение роста опухоли наблюдалось на протяжении периода 60 суток. При дозе 10⁶, оба вируса замедляли рост опухоли с приблизительно одинаковой эффективностью (Фиг. 12А), но более низкая токсичность наблюдалась в случае вируса TD COPTG 19289, по сравнению с вирусом DD WTG18058. Следует отметить, что одно животное, обработанное TD, не имело опухоли на 55-ые сутки после имплантации клеток, и безопухолевый статус сохранялся на протяжении более чем 85 суток. При дозе 10⁵, вирус TD COPTG19289 демонстрировал улучшенное противоопухолевое действие, по сравнению с вирусом DD WTG18058 (Фиг. 12В). Более конкретно, рост опухоли явно ингибировался у 5 из 5 животных в группе TD, в сравнении с 2 из 5 в группе DD. Кроме того, уменьшенную токсичность наблюдали в группе TD, по сравнению с группой DD.

Сравнение выживаемости мышей подтвердило улучшенное противоопухолевое действие, обеспечиваемое m2-COPTG19289 (TD), по сравнению с m2 + WTG18058 (DD), после одной в.в. инъекции 10⁶ БОЕ (Фиг. 13А) или 10⁵ БОЕ (Фиг. 13В). Более конкретно, 100% животных, обработанных носителем, мертвы через 52 суток, тогда как выживаемость явно увеличивается в результате обработки WTG18058 (DD) и даже еще больше в результате обработки COPTG 19289 (TD). Например, 50%-ную выживаемость (Фиг. 13А) определяли в сутки 52 в случае отрицательного контроля, в сутки 54 в случае группы, обработанной DD-10⁶ БОЕ, и в сутки 70 в случае группы, обработанной TD-10⁶ БОЕ.

Кроме того, при дозах 10⁵ БОЕ, 50%-ная выживаемость составляла 52 и 80 суток в случае вирусов DD и TD, соответственно.

Данные результаты иллюстрируют улучшенный терапевтический интерес, обеспечиваемый m2 - дефектными поксвирусами, для лечения патологии, такой как раковые заболевания.

Ссылки

Antoine et al., 1998, Virology 244 (2) 365-96

Baoming Liu et al., 2018, J. Virol. 92 (7) e02152-17

Bloom et al., 1991, J. Virol. 65 (3): 1530-42

Boyle et al., 1985, Gene 35, 169-177

Brunet et al., 1987, Nature 328: 267-70

Carpentier et al., 2003, Frontiers in Bioscience 8, e115-127

Carpentier et al., 2006, Neuro-Oncology 8 (1): 60-6

Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23: 1094-7

Chan, 2008, Eur. J. Immunol. 38, 2964-2968

Chaurasiya et al., 2018, Current Opinion in Immunology 51: 83-90

Chen, 2004, Nat. Rev. Immunol. 4: 336-347

Claudepierre et al., 2014, J. Virol. 88 (10): 5242-55

Cole et al. in Monoclonal antibodies and Cancer Therapy;

Alan Liss pp77-96 Coligan et al., 1992 and 1994, Current Protocols in Immunology; ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health

Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18: 1901-5

De Graaf et al., 2018, doi.org/10.1016/j.cytogfr.2018.03.006

Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15 (1): 18-28

Evans et al. 2004, J Pharm Sci. 93:2458-75

Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-17

Fend et al., 2014, Cancer Immunol. Res. 2, 1163-74

Foloppe et al., 2008, Gene Ther. 15: 1361-71

Gedey et al., 2006, J. Virol. 80: 8676-85

Guo et al., 1990, J. Virol. 64: 2399-2406

Guse et al., 2011, Expert Opinion Biol. Ther. 11 (5):595-608

Hammond et al, 1997, J. Virol Methods 66: 135-8

Harlow and Lane, 1988, Antibodies - A laboratory manual; Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor NY

Hinthong et al., 2008, Virology 373 (2): 248-62

Hodge et al., 1994, Cancer Res. 54: 5552-5

Kahn et al., 2015, J. Oncol. Doi: 10.1155/2015/847383

Kleinpetter et al., 2016, Oncolmmunology 5 (10): e1220467

Kumar and Boyle, 1990, Virology 179: 151-8

Liu et al., 2018, J. Virol., doi/10.1128/JVI.02152-17

Mackett et al., 1984 J. of Virol., 49: 857-64

McLaughlin et al., 1996, Cancer Res. 56: 2361-67

Needleman andWunsh. J.Mol. Biol. 48,443-453, 1970

Parato et al., 2012, Molecular Therapy 20 (4): 749-58

J. R. Robinson in "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Syst ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978

Russell et al., 2012, Nat. Biotechnol. 30 (7): 658-70

Scott-Algara et al., 2010 PLOS One 5 (1), e8761

Smith et al., 1993, Vaccine 11(1): 43-53

Smith and Kotwal, 2002, Crit. Rev. Microbiol. 28(3): 149-85

Yi, 2011, J Immunol. 186:2739-2749

Zhou et al., 2006, Blood 107, 2461-2469

WO 97/20574

WO 99/03885

WO 00/037504

WO 01/23001

WO 03/053463

WO 2005/042728

WO 2006/085082

WO 2006/93924

WO 2006/108846

WO 2007/056847

WO 2007/113648

WO 2007/123737

WO 2007/147528

WO 2008/114021

WO 2008/129058

WO 2008/138533

WO 2009/53937

WO 2009/065546

WO 2009/065547

WO 2009/100521

WO 2010/130753

WO 2010/130756

WO 2011/066389

WO 2012/001075

WO 2012/122444

WO 2013/022764

WO 2013/079174

WO 2013/173223

WO 2013/181634

WO 2014/053571

WO 2016/008976

WO 2016/149201

WO 2016/196237

WO 2018/122088

ЕР 17306012.0

ЕР 463756

ЕР 1162982

US 5250534

US 6469012

US 6686152

US 6984720

US 7108844

US 7109003

US 7456009

US 7700,569

US 8017114

US 8143379

US 8217149

US 8491895

US 2007-016108

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ТРАНСГЕН СА

<120> M2-дефектный поксвирус

<130> B377256PCT-D39862

<150> EP 18306874.1

<151> 2018-12-28

<150> EP 19306022.5

<151> 2019-08-21

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 220

<212> ПРТ

<213> вирус осповакцины

<400> 1

Met Val Tyr Lys Leu Val Leu Leu Phe Cys Ile Ala Ser Leu Gly Tyr

1 5 10 15

Ser Val Glu Tyr Lys Asn Thr Ile Cys Pro Pro Arg Gln Asp Tyr Arg

20 25 30

Tyr Trp Tyr Phe Ala Ala Glu Leu Thr Ile Gly Val Asn Tyr Asp Ile

35 40 45

Asn Ser Thr Ile Ile Gly Glu Cys His Met Ser Glu Ser Tyr Ile Asp

50 55 60

Arg Asn Ala Asn Ile Val Leu Thr Gly Tyr Gly Leu Glu Ile Asn Met

65 70 75 80

Thr Ile Met Asp Thr Asp Gln Arg Phe Val Ala Ala Ala Glu Gly Val

85 90 95

Gly Lys Asp Asn Lys Leu Ser Val Leu Leu Phe Thr Thr Gln Arg Leu

100 105 110

Asp Lys Val His His Asn Ile Ser Val Thr Ile Thr Cys Met Glu Met

115 120 125

Asn Cys Gly Thr Thr Lys Tyr Asp Ser Asp Leu Pro Glu Ser Ile His

130 135 140

Lys Ser Ser Ser Cys Asp Ile Thr Ile Asn Gly Ser Cys Val Thr Cys

145 150 155 160

Val Asn Leu Glu Thr Asp Pro Thr Lys Ile Asn Pro His Tyr Leu His

165 170 175

Pro Lys Asp Lys Tyr Leu Tyr His Asn Ser Glu Tyr Gly Met Arg Gly

180 185 190

Ser Tyr Gly Val Thr Phe Ile Asp Glu Leu Asn Gln Cys Leu Leu Asp

195 200 205

Ile Lys Glu Leu Ser Tyr Asp Ile Cys Tyr Arg Glu

210 215 220

<210> 2

<211> 214

<212> ПРТ

<213> вирус миксомы

<400> 2

Met Ala Arg Tyr Ile Ile Ile Val Leu Ala Cys Leu Val Ala Thr Ser

1 5 10 15

Thr Cys Ala Thr Tyr Pro Lys Lys Tyr Trp His Leu Ala Ala Glu Leu

20 25 30

Thr Ile Gly Leu Asn Arg Tyr Val Glu Thr Val Met Gly Glu Cys His

35 40 45

Met Lys Glu Arg Cys Asp His Lys Thr Ser Thr Leu Ile Leu Thr Gly

50 55 60

Tyr Gly Leu Met Ile Asn Ile Thr Ile Thr Asn Val Val Gln Arg Phe

65 70 75 80

Val Ala Ala Ser Ala Gly Ala Gly Asp Gly Asn Lys Leu Ser Ile Met

85 90 95

Leu Phe Thr Thr His Pro Leu Thr Lys Tyr Ser Asp Ile Tyr Leu Thr

100 105 110

Ile Thr Cys Leu Glu Pro Glu Gly Asp Val Gly Asn Tyr Gly Asn Gln

115 120 125

Leu Pro Asp Ser Leu His His Asn Lys Asp Val Ser Ile Thr Ile Leu

130 135 140

Gly Ser Cys Val Thr Cys Val Asn Leu Glu Thr Asn Pro Ile Lys Val

145 150 155 160

Asn Pro His Phe Thr His Pro Ile Ser Met Phe Val Tyr Asp Asn Lys

165 170 175

Glu Asp Val Arg Gly Ser Tyr Gly Val Thr Phe Glu Asp Glu Leu Asn

180 185 190

Val Cys Phe Leu Asp Ile Lys Lys Val Ser Tyr Asp Leu Cys Tyr Arg

195 200 205

Gln Thr Arg Tyr Leu Ile

210

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описан модифицированный поксвирус для стимуляции или улучшения иммунного ответа. Геном модифицированного поксвируса содержит в нативном (дикий тип) контексте локус M2L, кодирующий функциональный поксвирусный белок m2, и который модифицирован таким образом, чтобы быть дефектным в отношении указанной функции m2; где указанный функциональный поксвирусный белок M2 может связывать костимулирующие лиганды CD80 или CD86 или оба костимулирующих лиганда CD80 и CD86, и где указанная дефектная функция m2 не может связывать указанные костимулирующие лиганды CD80 и CD86. Также описан способ получения модифицированного поксвируса, включающий следующие стадии: a) получение линии клеток-продуцентов, b) осуществление трансфекции или инфицирования полученной линии клеток-продуцентов модифицированным поксвирусом, c) культивирование линии трансфицированных или инфицированных клеток-продуцентов в подходящих условиях таким образом, чтобы обеспечить продукцию вируса, d) выделение полученного вируса из культуры указанной линии клеток-продуцентов и, возможно, e) очистка указанного выделенного вируса. Раскрыта композиция для стимуляции или улучшения иммунного ответа, содержащая терапевтически эффективное количество модифицированного поксвируса и фармацевтически приемлемый носитель. Раскрыто применение композиции для лечения или предупреждения пролиферативного заболевания, выбранного из группы, состоящей из раковых заболеваний. М2-дефектные поксвирусы особенно полезны для экспрессии иммуномодулирующих полипептидов, таких как антитела против CTLA-4, с целью стимуляции или улучшения иммунного ответа. 6 н. и 32 з.п. ф-лы, 13 ил., 1 табл., 5 пр.

1. Модифицированный поксвирус для стимуляции или улучшения иммунного ответа, где геном указанного модифицированного поксвируса содержит в нативном (дикий тип) контексте локус M2L, кодирующий функциональный поксвирусный белок m2, и который модифицирован таким образом, чтобы быть дефектным в отношении указанной функции m2; где указанный функциональный поксвирусный белок M2 может связывать костимулирующие лиганды CD80 или CD86 или оба костимулирующих лиганда CD80 и CD86, и где указанная дефектная функция m2 не может связывать указанные костимулирующие лиганды CD80 и CD86.

2. Модифицированный поксвирус по п. 1, где указанный модифицированный поксвирус образован или получен из Chordopoxvirinae, предпочтительно выбран из группы родов, состоящей из Avipoxvirus, Capripoxvirus, Leporipoxvirus, Molluscipoxvirus, Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Suipoxvirus, Cervidpoxvirus и Yatapoxvirus.

3. Модифицированный поксвирус по п. 2, где указанный модифицированный поксвирус представляет собой член Orthopoxvirus, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из вируса осповакцины (VV), коровьей оспы (CPXV), оспы енотов (RCN), оспы кроликов, оспы обезьян, оспы лошадей, оспы полевок, оспы скунсов, вируса натуральной оспы (или черной оспы) и оспы верблюдов.

4. Модифицированный поксвирус по п. 3, где указанный модифицированный поксвирус представляет собой вирус осповакцины, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из штаммов Western Reserve (WR), Copenhagen (Cop), Lister, LIVP, Wyeth, Tashkent, Tian Tan, Brighton, Ankara, LC16M8, LC16M0 и т.п., особо предпочтительно из штаммов WR, Copenhagen и Wyeth.

5. Модифицированный поксвирус по п. 2, где указанный модифицированный поксвирус представляет собой член рода Leporipoxvirus, предпочтительно вирус миксомы.

6. Модифицированный поксвирус по любому из пп. 1-5, в котором неспособность связывать указанные костимулирующие лиганды CD80 и CD86 возникает в результате генетического повреждения в пределах локуса M2L или в результате ненормального взаимодействия, нарушающего функцию m2 напрямую или опосредованно.

7. Модифицированный поксвирус по п. 6, в котором указанное(ые) генетическое(ие) повреждение(ия) включает(ют) частичную или полную делецию и/или одну или более немолчащих мутаций или в пределах m2-кодирующей последовательности или в регуляторных элементах, контролирующих экспрессию M2L, которые предпочтительно приводят к синтезу дефектного m2-белка или к отсутствию синтеза m2.

8. Модифицированный поксвирус по п. 7, в котором указанное повреждение гена представляет собой частичную или полную делецию локуса M2L.

9. Модифицированный поксвирус по любому из пп. 1-8, где указанный модифицированный поксвирус дополнительно модифицирован в области, отличной от локуса M2L.

10. Модифицированный поксвирус по п. 9, где указанный модифицированный поксвирус дополнительно модифицирован в локусе J2R, что приводит к получению модифицированного поксвируса, дефектного в отношении функций m2 и tk.

11. Модифицированный поксвирус по п. 9 или 10, где указанный модифицированный поксвирус дополнительно модифицирован в локусе/локусах I4L и/или F4L, что приводит к получению модифицированного поксвируса, дефектного в отношении функций m2 и rr.

12. Модифицированный поксвирус по любому из пп. 9-11, где указанный модифицированный поксвирус дополнительно модифицирован в локусах J2R и I4L/F4L, что приводит к получению модифицированного поксвируса, дефектного в отношении активностей m2, tk и rr.

13. Модифицированный поксвирус по любому из пп. 1-12, где указанный модифицированный поксвирус является онколитическим.

14. Модифицированный поксвирус по любому из пп. 1-13, где указанный модифицированный поксвирус является рекомбинантным.

15. Модифицированный поксвирус по п. 14, где модифицированный поксвирус сконструирован для экспрессии по меньшей мере одного полипептида, выбранного из группы, состоящей из антигенных полипептидов, полипептидов, имеющих функцию модуляции пула нуклеозидов/нуклеотидов, и иммуномодулирующих полипептидов.

16. Модифицированный поксвирус по п. 15, где указанный иммуномодулирующий полипептид выбран из группы, состоящей из цитокинов, хемокинов, лигандов и антител или любой их комбинации.

17. Модифицированный поксвирус по п. 16, где указанное антитело специфично связывает белок иммунной контрольной точки, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из CD3, 4-1BB, GITR, OX40, CD27, CD40, PD1, PDL1, CTLA4, Tim- 3, BTLA, Lag-3 и Tigit.

18. Модифицированный поксвирус по п. 17, где указанный модифицированный поксвирус экспрессирует антитело-антагонист, которое специфично связывается с PD-L1 или CTLA4.

19. Модифицированный поксвирус по п. 18, где указаный модифицированный поксвирус является дефектным в отношении активностей m2, tk и rr и кодирует антитело против CTLA-4, предпочтительно ипилимумаб или тремелимумаб.

20. Модифицированный поксвирус по п. 18, где указанный модифицированный поксвирус является дефектным в отношении активностей m2, tk и rr и кодирует антитело против PD-L1, предпочтительно атезолизумаб, дурвалумаб или авелумаб.

21. Способ получения модифицированного поксвируса по любому из пп. 1-20, включающий следующие стадии:

a) получение линии клеток-продуцентов,

b) осуществление трансфекции или инфицирования полученной линии клеток-продуцентов модифицированным поксвирусом по любому из пп. 1-20,

c) культивирование линии трансфицированных или инфицированных клеток-продуцентов в подходящих условиях таким образом, чтобы обеспечить продукцию вируса,

d) выделение полученного вируса из культуры указанной линии клеток-продуцентов и, возможно,

e) очистка указанного выделенного вируса.

22. Композиция для стимуляции или улучшения иммунного ответа, содержащая терапевтически эффективное количество модифицированного поксвируса по любому из пп. 1-20 и фармацевтически приемлемый носитель.

23. Композиция по п. 22, содержащая от приблизительно 10³ до приблизительно 10¹² БОЕ, преимущественно от приблизительно 10⁴ БОЕ до приблизительно 10¹¹ БОЕ, предпочтительно от приблизительно 10⁵ БОЕ до приблизительно 10¹⁰ БОЕ; и более предпочтительно от приблизительно 10⁶ БОЕ до приблизительно 10⁹ БОЕ модифицированного поксвируса, и при этом индивидуальные дозы составляют приблизительно 10⁶, 5×10⁶, 10⁷, 5×10⁷, 10⁸ или 5×10⁸ БОЕ.

24. Композиция по п. 22 или 23, которая приготовлена для внутривенного или внутриопухолевого введения.

25. Применение композиции по любому из пп. 22-24 для лечения или предупреждения пролиферативного заболевания, выбранного из группы, состоящей из раковых заболеваний.

26. Применение композиции по любому из пп. 22-24 для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения пролиферативного заболевания, выбранного из группы, состоящей из раковых заболеваний.

27. Способ лечения или предупреждения пролиферативного заболевания, выбранного из группы, состоящей из раковых заболеваний, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, композиции по любому из пп. 22-24.

28. Применение по п. 25 или 26 или способ по п. 27, где указанный рак выбран из группы, состоящей из рака почки, рака предстательной железы, рака молочной железы, рака толстой и прямой кишки, рака легкого, рака печени, рака желудка, карциномы желчного протока, рака эндометрия, рака поджелудочной железы и рака яичника.

29. Применение композиции по любому из пп. 22-24 для стимуляции или улучшения иммунного ответа.

30. Применение по п. 29 для:

- стимуляции или улучшения иммунного ответа, опосредованного лимфоцитами;

- стимуляции или улучшения активности APC;

- стимуляции или улучшения противоопухолевого ответа;

- стимуляции или улучшения CD28-сигнального пути;

- улучшения терапевтической эффективности, обеспечиваемого модифицированным поксвирусом, описанным в данном документе, у субъекта, получающего лечение, или группы субъектов, получающих лечение; и/или

- уменьшения токсичности, обеспечиваемого модифицированным поксвирусом, у субъекта, получающего лечение, или группы субъектов, получающих лечение.

31. Применение по п. 30 для стимуляции или улучшения иммунного ответа, опосредованного лимфоцитами, против антигенного полипептида.

32. Применение композиции по любому из пп. 22-24 для получения лекарственного средства для стимуляции или улучшения иммунного ответа.

33. Применение по п. 32 для:

- стимуляции или улучшения иммунного ответа, опосредованного лимфоцитами;

- стимуляции или улучшения активности APC;

- стимуляции или улучшения противоопухолевого ответа;

- стимуляции или улучшения CD28-сигнального пути;

- улучшения терапевтической эффективности, обеспечиваемого модифицированным поксвирусом, описанным в данном документе, у субъекта, получающего лечение, или группы субъектов, получающих лечение; и/или

- уменьшения токсичности, обеспечиваемого модифицированным поксвирусом, у субъекта, получающего лечение, или группы субъектов, получающих лечение.

34. Применение по п. 32 для стимуляции или улучшения иммунного ответа, опосредованного лимфоцитами, против антигенного полипептида.

35. Способ стимуляции или улучшения иммунного ответа, включающий введение композиции по любому из пп. 22-24.

36. Способ по п. 35 для:

- стимуляции или улучшения иммунного ответа, опосредованного лимфоцитами;

- стимуляции или улучшения активности APC;

- стимуляции или улучшения противоопухолевого ответа;

- стимуляции или улучшения CD28-сигнального пути;

- улучшения терапевтической эффективности, обеспечиваемого модифицированным поксвирусом, описанным в данном документе, у субъекта, получающего лечение, или группы субъектов, получающих лечение; и/или

- уменьшения токсичности, обеспечиваемого модифицированным поксвирусом, у субъекта, получающего лечение, или группы субъектов, получающих лечение.

37. Способ по п. 36 для стимуляции или улучшения иммунного ответа, опосредованного лимфоцитами, против антигенного полипептида.

38. Композиция по любому из пп. 22-24, применение по любому из пп. 25, 26, 28-34, или способ по любому из пп. 27, 35-37, предназначенные для самостоятельной терапии или в совокупности с одной или более дополнительными терапиями, предпочтительно выбранными из группы, состоящей из оперативного вмешательства, лучевой терапии, химиотерапии, криотерапии, гормональной терапии, терапии на основе токсинов, иммунотерапии, терапии цитокинами, таргетной терапии рака, генной терапии, фотодинамической терапии и трансплантации.