Малотоксичные 1,3,4-оксадиазольные производные дезоксихолевой кислоты с простатопротекторным и противовоспалительным действием Российский патент 2024 года по МПК C07J43/00 A61K31/58 A61P13/08 A61P29/00 

Изобретение относится к фармацевтической химии, конкретно к соединениям, представляющим собой 1,3,4-оксадиазольные производные дезоксихолевой кислоты общей формулы I, в которой R представлен пиридин-4-ил (Iа) или 4-хлорфенильным (Iб) фрагментом. Технический результат заключается в расширении ряда простатопротекторных средств, уменьшающих гиперплазию железистого эпителия в предстательной железе (ПЖ), обладающих противовоспалительной активностью и низкой токсичностью. Указанные свойства позволяют применять заявленные соединения в качестве основы для разработки малотоксичного простатопротекторного препарата, направленного на коррекцию основных патогенетических синдромов доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ): нодулярной железистой гиперплазии и воспалительного процесса в ткани ПЖ.

I

где R = Py-4-ил, 4-Сl-C₆H₄-

ДГПЖ относится к одним из наиболее распространенных заболеваний у мужчин пожилого и старческого возраста [Paolone D., 2010]. Особенностью клинического течения болезни является последовательное развитие первичного патогенетического процесса, связанного с гиперплазией железистого и стромального отдела периуретральной зоны железы, и вторичной симптоматики - синдрома нижних мочевых путей (СНМП) с характерными уродинамическими нарушениями (повышение тонуса гладких мышц шейки мочевого пузыря и простаты, неполное опорожнение мочевого пузыря, ноктурия, недержание мочи, гематурия и др.) [Helfand B.T. et al., 2011]. Триггером гиперпластического процесса является воспаление, как предшествующее, так и вторично развивающееся в простате [Sciarra A. et al. 2007], что подтверждается результатами международного многоцентрового исследования MTOR [Roehrborn C.G., 2008]. Развитие СНМП существенно снижает качество жизни больных и, несмотря на продолжительную медикаментозную терапию, частым исходом является резекция ПЖ с высоким риском послеоперационных осложнений у пожилых пациентов [Roell D., 2011]. Очевидно, что применение простатопротекторных препаратов, эффективно подавляющих аденоматозную гиперплазию на ранней стадии ДГПЖ, способно существенно снизить тяжесть вторичных патологических симптомов и вероятность хирургического исхода. Одним из важных критериев при отборе таких препаратов являются, наряду с антипролиферативным действием, противовоспалительные свойства и низкая токсичность.

В настоящее время линейка простатопротекторных средств с клинически доказанной антипролиферативной активностью при ДГПЖ представлена двумя синтетическими азастероидами - финастеридом (препараты «Пенестер», «Проскар», «Финаст», «Финастерид» и др.) и дутастеридом (препараты «Аводарт», «Гардиум», «Дутастед Бактер»). Оба являются ингибиторами 5α-редуктазы, превращающей поступающий в простату тестостерон в более активный андроген - дигидротестостерон. Последний, связываясь с андрогеновым рецептором, вызывает экспрессию генов андроген-респонсивного элемента, что приводит к увеличению продукции ростовых факторов, стимулирующих рост железистого эпителия и стромы в периуретральном отделе простаты. Финастерид и его аналоги, ингибируя активность фермента, снижают объем железы до 30%, что опосредованно способствует ослаблению симптомов СНМП [Fang Q. et al., 2019].

Кроме синтетических азастероидных простатопротекторов в комплексном лечении ДГПЖ используются фитопрепараты и БАДы на основе растительных экстрактов. Их действие в основном направленно на облегчение вторичной симптоматики за счет противовоспалительной, противоотечной, антигипоксантной, спазмолитическй активности компонентов экстракта [Petrangelli et al, 2009]. Наиболее известными и популярными являются средства на основе экстракта плодов африканской сливы Prunus africana («Трианол») и карликовой африканской пальмы Serenoa repens (также известной как Saw Palmetto, Ju-Zhong, American Dwarf Palm Tree) («Пермиксон», «Простамол-Уно» и др.). Фитопрепараты и пищевые добавки на основе растительных экстрактов хорошо переносятся, однако они существенно уступают по эффективности ингибиторам 5α-редуктазы, особенно по антипролиферативной активности.

Считается, что азастероидные ингибиторы 5α-редуктазы обладают относительно хорошей общей переносимостью [Dörsam J., 2009]. Однако при длительной курсовой терапии они оказывают побочное действие на половую сферу мужчин в виде снижения либидо, эректильной дисфункции, импотенции, гинекомастии и других симптомов, вызывающих психологические проблемы и снижение фертильности у мужчин детородного возраста [Zhang, H. et al., 2020]. Кроме того, на основании клинических наблюдений около 12% пациентов являются нечувствительными к азастероидным ингибиторам 5α-редуктазы [Dörsam J., 2009]. Определенным недостатком финастерида и дутастерида можно считать также то, что они не обладают доказанными плейотропными эффектами на патологические процессы, сопутствующие ДГПЖ - воспаление, окислительный стресс, гипоксию.

Недавно новые соединения с простатопротекторным действием были выявлены среди производных дезоксихолевой кислоты (ДХК) III. В модели ДГПЖ, индуцированной тестостероном у крыс, показано, что сама ДХК III и два ее 1,2,4-оксадиазольных производных с метильным (соединение IVа) и фенильным (соединение IVб) заместителями при введении внутрь в дозе 50 мг/кг подавляют гиперплазию эпителия желез в простате подобно финастериду II в дозе 10 мг/кг и обладают противовоспалительным и гипохолестеринемическим действием [Патент № 2750488 С1 Ru].

Задачей изобретения является расширение структурного ряда простатопротекторных средств, обладающих наряду с антипролиферативной активностью в ПЖ дополнительно плейотропным противовоспалительным эффектом и низкой токсичностью. Наиболее близким по фармакологическому эффекту к заявленным соединениям является 4-азастероидный препарат из группы ингибиторов 5α-редуктазы - финастерид формулы II, обладающий выраженным антипролиферативным действием в железистом эпителии ПЖ [Aggarwal S., et al., 2010].

Поставленная техническая задача решается использованием соединений, представляющих 5-арил(гетарил)замещенные 1,3,4-оксадиазольные производные дезоксихолевой кислоты общей формулы I, которые обладают антипролиферативной активностью в ПЖ, а также противовоспалительными свойствами и низкой токсичностью.

Использование 5-арилзамещенных-1,3,4,-оксадиазольных производных дезоксихолевой кислоты Iа и Iб в качестве простатопротекторных средств с противовоспалительной активностью и низкой токсичностью в литературе не описано. Данные вещества синтезированы впервые и ранее не использовались.

Принципиально новым в предполагаемом изобретении является то, что в качестве простатопротекторных средств с антипролиферативным, противовоспалительным действием и низкой токсичностью используются 5-арилзамещенные 1,3,4-оксадиазольные производные дезоксихолевой кислоты. Их структурный аналог - дезоксихолевая кислота - известна как вещество, обладающее гепатопротекторной, противовоспалительной, гиполипидемической и простатопротекторной активностью, однако в качестве лекарственного средства не используется.

Соединения общей формулы I могут быть синтезированы в соответствии со следующей Фиг. 1, используя доступную желчную кислоту - дезоксихолевую кислоту III в качестве стартового материала.

На первом этапе осуществляется синтез гидразида дезоксихолевой кислоты V из дезоксихолевой кислоты III c суммарным выходом 98% выходом, для этого провели метилирование карбоксильной группы стартового соединения III диазометаном, и полученный метиловый эфир без дополнительной очистки ввели в реакцию с гидразин гидратом. Формирование 1,3,4-оксадиазольного цикла с образованием целевых соединений Iа,б провели в две стадии: 1) взаимодействие гидразида V с соответствующим альдегидом (изоникотинальдегидом, п-хлорбензальдегидом) с образованием соединений VIа,б; 2) замыкание 1,3,4-оксадиазольного цикла под действием I₂ в ДМСО в присутствии K₂CO₃ (соединения Iа,б). Очистку 5-арилзамещенных-1,3,4-оксадиазольных производных Iа,б осуществляли колоночной хроматографией на силикагеле с последующей кристаллизацией из этилацетата.

В экспериментах на лабораторных животных исследованы следующие свойства заявляемых соединений Iа и Iб:

- простатопротекторная активность;

- противовоспалительная активность;

- токсичность.

Исследование простатопротекторной активности соединений Iа и Iб проводили в экспериментах на самцах крыс Wistar массой 280-350 г на двух моделях ДГПЖ. В тестостероновой модели пролиферативный процесс в простате индуцировали путем 4-х недельного подкожного введения тестостерона пропионата (индуктор ДГПЖ) [Сорокина И. В. И др., 2022], в сульпиридной модели - 8-ми недельным внутрибрюшинным введением нейролептика сульпирида (индуктор ДГПЖ) [Миронов А. Н., 2013]. Изучаемые агенты Iа и Iб вводили внутрижелудочно в дозе 20 мг/кг через час после введения соответствующего индуктора. Референсный простатопротекторный препарат финастерид (II) («Пенестер», производитель «Зентива», Чешская Республика) вводили так же, как и изучаемые соединения, в эффективной дозе 10 мг/кг [Jeon W.Y. et al., 2017]. Контрольные животные получали перорально воду, интактные крысы (фон) не подвергались каким-либо воздействиям. В каждом опыте было 5 групп животных по 6 особей в группе:

1 - группа интактных животных;

2 - контрольная группа с введением индуктора ДГПЖ;

3 - референсная группа с введением финастерида II и индуктора ДГПЖ;

4 - опытная группа с введением Iа и индуктора ДГПЖ;

5 - опытная группа с введением Iб и индуктора ДГПЖ.

По окончании опытов всех животных выводили из эксперимента путем мгновенной декапитации. Образцы ПЖ подвергали стандартной гистологической обработке. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван Гизону и по-методу ШИК с оранжевым G и исследовали методом световой микроскопии. Морфометрическое исследование проводили в дорсолатеральной части предстательной железы в 25 полях зрения каждого препарата, по 5 фотографий на одно животное. Подсчитывали объемную плотность структурных компонентов: железистого эпителия, просвета желез и стромы. Объемную плотность каждого структурного компонента определяли по его доле [Автандилов Г.Г., 1990].

В тестостероновой модели ДГПЖ микроскопическое исследование ткани простаты выявило простатопротекторный эффект у агентов Ia и Iб, признаками которого являются: существенная регрессия гиперпластического процесса в железистом отделе (уменьшение митотической активности эпителиальных клеток, снижение количества папиллярных структур в просвете ацинусов); отсутствие дистрофических изменений в железистом эпителии и некоторое улучшение гемодинамических процессов в виде слабо выраженых отека стромы и венозного полнокровия. У части выводных протоков желез отмечено кистозное расширение с атрофичным эпителием. Степень папиллярной очаговой гиперплазии в железах простаты крыс снижается с III - IV стадии в контроле до I - II стадии в группах с введением агентов Iа и Iб.

По данным морфометрического анализа гистологических препаратов соединения Iа и Iб на фоне андрогена достоверно снижают объемную плотность эпителия соответственно в 1.7 и 1.3 раза относительно контрольной группы, в то время как у финастерида уменьшение данного показателя (в 1.1 раз против контроля) не было статистически значимым (Таблица 1). Под влиянием соединений Iа и Iб просвет желез восстанавливается до показателей интактной нормы, тогда как в референсной группе данный показатель незначимо отличается от контроля (Таблица 1). Кроме того, соединение Iб достоверно уменьшает объемную плотность стромы в 1.4 раза относительно контроля (Таблица 1).

Морфологическое исследование ткани ПЖ в сульпиридной модели ДГПЖ выявило регрессию патологических изменений у животных, получавших соединения Iа и Iб. Наиболее ярко положительная динамика наблюдалась под действием агента Iб, который заметно снизил пролиферативный процесс в секреторной части ПЖ по сравнению с референсной группой. В строме периуретральной зоны ПЖ в обеих опытных группах сохранялись умеренные гемодинамические нарушения, в виде венозного полнокровия и отека.

Морфометрический анализ ПЖ в сульпиридной модели подтвердил выраженный простатопротекторный эффект у соединения Iб, которое достоверно снизило объемную плотность железистого эпителия (в 1.7 раз) и стромы (в 1.6 раз) относительно контроля. При этом в железистом отделе ПЖ его антипролиферативное действие превзошло по выраженности эффект финастерида II в 1.4 раза (Таблица 2). Сам референсный препарат II значимо уменьшал объемную плотность железистого эпителия и стромы на фоне сульпирида (соответственно в 1.2 и 1.4 раз против контроля), а также увеличил в 1.3 раз просвет желез. Производное Iа оказывало эффект аналогичный по выраженности финастериду II. На фоне сульпирида Iа и Iб, аналогично референсному препарату, достоверно увеличили объемную плотность просвета желез (в 1.3 и 1.5 раз относительно контроля, соответственно) (Таблица 2).

Таким образом, на обеих гормонально индуцированных моделях ДГПЖ установлено, что по выраженности простатопротекторного действия соединение Iа не уступает, а соединение Iб превосходит референсный препарат финастерид II.

Исследование противовоспалительной активности соединений Iа и Iб проводили на мышах CD-1 и CBA массой 20-25 г на двух моделях острого воспаления лапы (острое экссудативное и псевдоаллергическое воспаление). В каждом опыте было 4 группы животных по 8 особей в группе. В первом случае воспаление индуцировали однократным субплантарным введением в заднюю лапу мыши 0.01% водного раствора гистамина, а во втором - двукратным введением конканавалина А концентрацией 5 мг/мл. Изучаемые агенты Iа и Iб, а также референсный препарат индометацин вводили внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг в виде водно-твиновой суспензии [Колла В.Э. и др., 1998]. Животные контрольной группы получали водно-твиновый раствор. По окончанию эксперимента животных умерщвляли путем цервикальной дислокации позвоночника, отсекали обе задние лапы, определяли массу каждой. Противовоспалительный эффект оценивали по величине индекса отека лапы мыши, который определяли как отношение разности масс воспаленной и интактной лап к массе интактной лапы, выраженное в процентах.

На модели гистаминового воспаления установлено, что при внутрибрюшинном введении в дозе 20 мг/кг соединения Iа и Iб оказывают достоверное противовоспалительное действие, которое выражается в снижении величины воспалительного отека в 1.9 раз относительно контроля. Указанный эффект не уступает эффекту индометацина (снижение отека в 2 раза) (Таблица 3). Внутрибрюшинное введение агентов Iа и Iб в дозе 20 мг/кг в условиях псевдоаллергического воспаления уменьшает величину отека соответственно в 2 и 1.6 раз относительно контрольной группы (Таблица 4). Референсный препарат индометацин снижает данный показатель в 2.4 раза (Таблица 4). Таким образом, соединения Iа и Iб оказывают выраженное противовоспалительное действие, сравнимое с действием референсного препарата в его эффективной дозе.

Определение острой токсичности соединений Iа и Iб проводили на мышах CD-1, массой 20-25 г в сравнении с финастеридом и ДХК. Вещества вводили внутрижелудочно через зонд в виде водно-твиновой суспензии в дозах 750 и 1500 мг/кг. На каждую дозу брали по 6 мышей. Наблюдения за животными проводили через 1 час, 4 часа и 24 часа в первые сутки, а затем раз в сутки в течение 14 дней с регистрацией количества летальных исходов. Величину среднесмертельной дозы определяли методом пробит-анализа по Литчвилду-Уилкоксону по логарифмической шкале «доза-эффект» [Саноцкий И.В.,1970].

Установлено, что расчетные величины LD₅₀ у финастерида и ДХК составляют соответственно 1060 и 1260 мг/кг, в то время как у соединений Iа и Iб LD₅₀ превышает 1500 мг/кг. Таким образом, исследуемые соединения Iа и Iб обладают меньшей токсичностью, по сравнению с исходной синтетической платформой и финастеридом.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Синтез гидразида 3α,12α-дигидрокси-5β-холан-24-овой кислоты (V)

К суспензии дезоксихолевой кислоты (III) (30.0 г, 76.5 ммоль) в метаноле (150 мл), охлажденной до 0°С при перемешивании порциями прибавляли эфирный раствор диазометана до тех пор, пока реакционная смесь не приобретала желтую окраску, свидетельствующую об избытке диазометана. Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре 24 часа до полного разложения диазометана, и удаляли растворитель на роторном испарителе, контроль реакции осуществляли методом ТСХ (CHCl₃-MeOH, v\v; 25:2)). Полученный остаток растворили в этаноле (110 мл), добавили NH₂NH₂*H₂O (30.0 мл, 618 ммоль) и кипятили 7 часов. По окончании реакции (ход реакции контролировали ТСХ (CHCl₃-MeOH, v\v; 25:2)) реакционную смесь охладждали до комнатной температуры, концентрировали в вакууме до объема ~70 мл и выливали в воду (1.5 л). Полученный осадок отфильтровывали, несколько раз промывали водой и высушивали на воздухе. Масса сырого продукта (V) в виде белого аморфного твердого вещества составила 30.5 г (выход 98%, чистота 97% (ВЭЖХ)). В дальнейшем продукт использовали без дополнительной очистки. Для получения аналитически-чистого образца 1 г гидразида (V) кристаллизовали из метанола. Т. пл 208-211°C (лит. 262-264°C [Siddiqui, A. U., et al., Journal of Heterocyclic Chemistry, 1993]). ¹H ЯМР (CDCl₃+CD₃OD, 500 МГц): δ = 3.87 (с, 1H, H-12), 3.48 (м, 1H, H-3), 3.00 (ш.с. 5H, 2ОН, СОNHNH₂), 2.1 (м, 1H, H-23), 1.99 (м, 1H, H-23′), 1.05 (д, 3H, J=6.3, CH₃-21), 0.95 (с, 3H, CH₃-19), 0.73 (с, 3H, CH₃-18), сигналы остальных протонов лежат в области 0.8-1.8 м.д. ¹³C ЯМР (CDCl₃+CD₃OD, 125 МГц): δ = 174.61 (с, C-24), 72.79 (д, C-12), 71.17 (д, C-3), 47.82 (д, C-14), 46.35 (д, C-17), 46.14 (с, C-13), 41.80 (д, C-5), 35.77 (т, C-4), 35.68 (д, C-8), 35.06 (д, C-20), 35.00 (с, C-1), 33.84 (с, C-10), 33.25 (д, C-9), 31.12 (т, C-23), 30.51 (т, C-2), 29.65 (т, C-22), 28.23 (т, C-11), 27.23 (т, C-16), 26.83 (т, C-6), 25.90 (т, C-7), 23.43 (т, C-15), 22.75 (к, C-19), 16.80 (к, C-21), 12.34 (к, C-18). HRMS: m/z вычислено (C₂₄H₄₂O₃N₂) 406.3190; найдено 406.3185.

Пример 2. Синтез (Z)- и (E)-N′-(Пиридин-4′-илметилен)гидразидов 3α,12α-дигидрокси-5β-холан-24-овой кислоты (VIа)

Гидразид дезоксихолевой кислоты (V) (6.0 г, 14.8 ммоль) и изоникотинбензальдегид (1.6 г (1.4 мл), 14.8 ммоль) растворяли в этаноле (50 мл), и реакционную смесь кипятили 3 часа. Ход реакции контролировали ТСХ (CHCl₃-MeOH, v\v; 25:2)). По окончании реакции растворитель удаляли при пониженном давлении, и полученный осадок хроматографировали на силикагеле, элюент хлороформ с градиентом метанола (0-8%). Масса полученной смеси (Z)- и (E)- стереоизомеров в соотношении 1.0:0.3 (VIa) (белое твердое вещество) составила 7.0 г (выход 95.5%).. Т. пл 129.6-134.1°C

(Z)-N′-(Пиридин-4′-илметилен)гидразид 3α,12α-дигидрокси-5β-холан-24-овой кислоты.

¹H ЯМР (CDCl₃+СD₃OD, 500 МГц): δ = 10.45 (с, 1H, NH), 7.75 (с, 1H, H-1′), 8.53 (д, 2H, J =6.1, H-4′, H-6′) и 7.48 (д, 2H, J=6.0, H-4′, H-6′) - AB-система, 3.89 (с, 1H, H-12), 3.48 (м, 1H, H-3), 3.32 (ш.с. 2Н, 2OH), 2.70 (м, 1H, H-23), 2.59 (м, 1H, H-23′), 1.0 (д, 3H, J=6.1, CH₃-21), 0.82 (с, 3H, CH₃-19), 0.60 (с, 3H, CH₃-18) сигналы остальных протонов лежат в области 0.80-2.00 м.д. ¹³C ЯМР (CDCl₃+СD₃OD, 125 МГц): δ = 177.31 (с, C-24), 149.64 (д, C-4′, С-6′), 141.68 (с, C-2′), 140.38 (д, C-1′), 120.91 (д, C-3′, С-5′), 72.87 (д, C-12), 71.20 (д, C-3), 48.01 (д, C-14), 46.90 (д, C-17), 46.27 (с, C-13), 41.85 (д, C-5), 35.78 (т, C-4), 35.71 (д, C-8) 35.50 (д, C-20), 35.06 (с, C-1), 33.88 (с, C-10), 33.20 (д, C-9), 30.65 (т, C-23), 29.78 (т, C-2), 29.55 (т, C-22), 28.28 (т, C-11), 27.45 (т, C-16), 26.86 (т, C-6), 25.93 (т, C-7), 23.48 (т, C-15), 22.79 (к, C-19), 17.17 (к, C-21), 12.48 (к, C-18).

(E)-N′-(Пиридин-4′-илметилен)гидразид 3α,12α-дигидрокси-5β-холан-24-овой кислоты.

Приведены только характеристичные сигналы, остальные совпадают с сигналами основного (Z)-изомера. ¹H ЯМР (CDCl₃+СD₃OD, 500 МГц): ¹H ЯМР (CDCl₃+СD₃OD, 500 МГц): δ = 11.08 (с, 1H, NH), 8.02 (с, 1H, H-1′), 8.50 (д, 2H, J =6.1, H-4′, H-6′) и 7.56 (д, 2H, J=6.0, H-4′, H-6′) - AB-система, 3.86 (с, 1H, H-12), 3.48 (м, 1H, H-3), 3.32 (ш.с. 2Н, 2OH), 2.26 (м, 1H, H-23), 2.14 (м, 1H, H-23′), 0.58 (с, 3H, CH₃-18) ¹³C ЯМР (CDCl₃+СD₃OD, 125 МГц): δ = 171.52 (с, C-24), 149.52 (д, C-4′, С-6′), 143.89 (д, C-1′), 141.82 (с, C-2′), 121.35 (д, C-3′, С-5′), 47.88 (д, C-14), 46.27 (с, C-13), 46.06 (д, C-17), 41.78 (д, C-5), 22.84 (т, C-15), 22.79 (к, C-19), 16.98 (к, C-21), 12.44 (к, C-18)

Пример 3. Синтез (Z)- и (E)-N′-(4′-хлоробензилиден)гидразидов 3α,12α-дигидрокси-5β-холан-24-овой кислоты (VIб)

Получали аналогично примеру 2, из гидразида дезоксихолевой кислоты (V) (7.0 г, 17.2 ммоль) и п-хлорбензальдегида (2.4 г, 17.2 ммоль), растворяя в этаноле (50 мл), с последующей хроматографией на силикагеле, элюент хлороформ с градиентом метанола (0-3%) выделили 8.4 г смеси (Z)- и (E)- стереоизомеров (VIб) в соотношении 1.0:0.15 (выход 92.5%). Т. пл 119.8°C (разложение, лит. 133-135°C [Siddiqui, A. U., et al., Journal of Heterocyclic Chemistry, 1993]).

(Z)-N′-(4′-Хлоробензилиден)гидразид 3α,12α-дигидрокси-5β-холан-24-овой кислоты.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ = 10.17 (с, 1H, NH), 7.74 (с, 1H, H-1′), 7.53 (д, 2H, J =8.5, H-3′, H-5′) и 7.31 (д, 2H, J=8.6, H-4′, H-6′) - AB-система, 3.95 (с, 1H, H-12), 3.60 (м, 1H, H-3), 2.68 (м, 2H, 2H-23), 2.63 (ш.с. 2Н, 2OH), 1.05 (д, 3H, J=6.1, CH₃-21), 0.87 (с, 3H, CH₃-19), 0.66 (с, 3H, CH₃-18) сигналы остальных протонов лежат в области 0.80-2.00 м.д. ¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ = 177.13 (с, C-24), 142.19 (д, C-1′), 135.59 (с, C-7′), 132.42 (с, C-2′), , 128.83 (д, C-3′, С-5′), 128.07 (д, C-4′, С-6′), 73.07 (д, C-12), 71.83 (д, C-3), 48.01 (д, C-14), 47.32 (д, C-17), 46.47 (с, C-13), 41.97 (д, C-5), 35.32 (т, C-4), 35.86 (д, C-8 и C-20), 35.21 (с, C-1), 34.00 (с, C-10), 33.16 (д, C-9), 30.74 (т, C-23), 30.19 (т, C-2), 30.08 (т, C-22), 28.43 (т, C-11), 27.63 (т, C-16), 27.01 (т, C-6), 26.03 (т, C-7), 28.37 (т, C-15), 22.86 (к, C-19), 17.39 (к, C-21), 12.57 (к, C-18).

(E)-N′-(4′-Хлоробензилиден)гидразид 3α,12α-дигидрокси-5β-холан-24-овой кислоты.

Приведены только характеристичные сигналы, остальные совпадают с сигналами основного (Z)-изомера. ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ = 10.41 (с. 1H, NH), 8.00 (с, 1H, H-1′), 0.62 (с, 3H, CH₃-18). ¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ = 170.88 (с, C-24), 145.80 (д, C-1′), 135.90 (с, C-7′), 130.78 (д, C-3′, С-5′), 129.32 (д, C-4′, С-6′)

Пример 4. Синтез 2′-(24-Нор-3α,12α-дигидрокси-5β-холан-23-ил)-5′-(пиридин-4′′-ил)-1′,3′,4′-оксадиазола (Iа)

Смесь изомеров (VIа) (соотношение (Z):(E)=1:0.3) (9.23 г, 18.64 ммоль) растворяли в ДМСО (70 мл), и к полученному раствору добавляли I₂ (9.47 г, 37.79 ммоль) и К₂СО₃ (12.86 г, 93 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при температуре 100°С в течение 8 часов (ход реакции контролировали ТСХ (CHCl₃-MeOH, v\v; 25:3)).). По окончании реакции смесь охлаждали до комнатной температуры, выливали в воду (500 мл) и экстраировали AcOEt (3 раза по 70 мл). Объединенные органические вытяжки промывали 0.1N раствором Na₂S₂O_3, H₂O, насыщенным раствором NaCl, и далее сушили MgSO4. Растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток хроматографировали на силикагеле (элюент хлороформ с градиентом метанола (0-6%)) с последующей кристаллизацией из этилацетата. Масса полученного целевого соединения Ia (белое твердое вещество) составила 7.95 г (выход 86%). Т. пл. 177.3-177.6 °С. Элементный анализ: Вычислено С, 72.99; H, 8.78; N, 8.51; O, 9.72. Найдено. С, 73.00; H, 8.87; N, 8.21. С₃₀H₄₁O₃N_3. ¹H ЯМР (CDCl₃+CD₃OD, 500 МГц): δ = 8.77 (д, 2H, J =1.6, H-4′, H-6′) и 7.86 (д, 2H, J=1.6, H-3′, H-5′) - AB-система, 3.93 (с, 1H, H-12), 3.58 (м, 1H, H-3), 2.98 (м, 1H, H-23), 2.86 (м, 1H, H-23′), 1.05 (д, 3H, J=6.5, CH₃-21), 0.87 (с, 3H, CH₃-19), 0.65 (с, 3H, CH₃-18) сигналы остальных протонов лежат в области 0.90-2.00 м.д. ¹³C ЯМР (CDCl₃+CD₃OD, 125 МГц): δ = 168.39 (с, C-1′), 162.76 (с, C-24), 150.67 (д, C-4′, С-6′), 131.03 (с, C-2′), 120.10 (д, C-3′, С-5′), 72.88 (д, C-12), 71.57 (д, C-3), 48.11 (д, C-14), 46.88 (д, C-17), 46.40 (с, C-13), 41.92 (д, C-5), 36.27 (т, C-4), 35.88 (д, C-8), 35.00 (д, C-20), 33.97 (с, C-10), 33.51 (д, C-9), 32.43 (т, C-22), 30.32 (т, C-2), 28.72 (т, C-11), 27.40 (т, C-16), 26.97 (т, C-6), 25.98 (т, C-7), 23.50 (т, C-15), 23.00 (к, C-19), 22.34 (т, C-23), 17.14 (к, C-21), 12.60 (к, C-18). HRMS: m/z вычислено (С₃₀H₄₁O₃N₃) 493.3299; найдено 493.3304.

Пример 5. Синтез 2′-(24-Нор-3α,12α-дигидрокси-5β-холан-23-ил)-5′-(4′′-хлорфенил)-1′,3′,4′-оксадиазола (Iб)

Аналогично примеру 4, из смеси изомеров (VIб) (соотношение (Z):(E)=1:0.15) (2.0 г, 3.8 ммоль), I₂ (1.2 г, 4.6 ммоль) и К₂СО₃ (1.6 г, 11.6 ммоль) в ДМСО (20 мл) получили 1.84 г сырого продукта (Iб). Очистку полученного соединения проводили колоночной хроматографией на силикагеле, элюент хлороформ с градиентом метанола (0-4%), с последующей кристаллизацией из этилацетата. Масса вещества (Va) (белое твердое вещество) составила 1.2 г (выход 57.6%). Т. пл. 163.8-164.7 °С. Элементный анализ: Вычислено С, 70.63; H, 8.22; Cl, 6.73; N, 5.31; O, 9.11. Найдено. С, 70.59; H, 8.36; Cl, 6.81; N, 5.10. С₃₁H₄₃ClO₃N_2. ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): δ = 7.93 (д, 2H, J =8.6, H-3′, H-5′) и 7.44 (д, 2H, J=8.6, H-4′, H-6′) - AB-система, 3.97 (с, 1H, H-12), 3.59 (м, 1H, H-3), 2.88 (м, 1H, H-23), 2.81 (м, 1H, H-23′), 2.04 (ш.с. 2Н, 2OH), 1.95 (м, 1H, H-5), 1.03 (д, 3H, J=6.4, CH₃-21), 0.86 (с, 3H, CH₃-19), 0.64 (с, 3H, CH₃-18) сигналы остальных протонов лежат в области 0.80-1.87 м.д. ¹³C ЯМР (CDCl₃, 100 МГц): δ = 167.48 (с, C-1′), 163.72 (с, C-24), 137.60 (с, C-7′), 129.24 (д, C-4′, С-6′), 127.86 (д, C-3′, С-5′), 122.33 (с, C-2′), 72.89 (д, C-12), 71.55 (д, C-3), 48.08 (д, C-14), 46.89 (д, C-17), 46.36 (с, C-13), 41.88 (д, C-5), 36.25 (т, C-4), 35.84 (д, C-8), 35.09 (д, C-20), 35.06 (с, C-1), 33.95 (с, C-10), 33.47 (д, C-9), 32.44 (т, C-22), 30.28 (т, C-2), 28.62 (т, C-11), 27.39 (т, C-16), 26.96 (т, C-6), 25.96 (т, C-7), 23.50 (т, C-15), 22.66 (к, C-19), 22.32 (т, C-23), 17.13 (к, C-21), 12.59 (к, C-18). HRMS: m/z вычислено (C₃₁H₄₃O₃N₂) 526.2957; найдено 526.2960.

Пример 6. Патоморфологическое исследование антипролиферативного эффекта Iа и Iб в ткани предстательной железы крыс в модели ДГПЖ, индуцированной тестостероном пропионатом

Эксперимент проводили на 5 группах крыс-самцов Wistar массой 320-400 г, полученных из лаборатории экспериментальных животных ФИЦ Института цитологии и генетики СО РАН. Животных содержали в пластиковых клетках с древесным автоклавированным подстилом, при обычном световом режиме, со свободным доступом к стандартному гранулированному корму и воде. В каждой группе было по 6 особей. Крысам контрольной, референсной и двух опытных групп вводили тестостерона пропионат («Дальхимфарм» Россия) в дозе 20 мг/кг подкожно в течение 4-х недель [Сорокина И. В. и др., 2022]. Крысам опытных групп через час после каждой инъекции тестостерона вводили внутрижелудочно (в/ж) 1,3,4-оксадиазольные производные Iа или Iб в дозе 20 мг/кг в виде водно-твиновой суспензии (1% раствор Твина-80), а животным референсной группы - препарат финастерид (Пенестер, «Zentiva» Чешская республика) в эффективной дозе 10 мг/кг [Jeon W.Y. et al., 2017]. Контрольная группа получала перорально водно-твиновый раствор. Интактные животные не подвергались воздействиям. Через 4 недели всех животных выводили из эксперимента декапитацией. Для гистологического исследования брали дорсолатеральную часть ПЖ, которую фиксировали в 10% нейтральном формалине и подвергали стандартной обработке на гистологическом комплексе «MICROM» с последующей заливкой в парафиновые блоки. На ротационном микротоме делали срезы толщиной 3 - 4 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван Гизону и по-методу ШИК с оранжевым G и исследовали с помощью световой микроскопии.

Срезы исследовали на микроскопе «Axioskop 40», микрофотографии сделаны на цифровой камере «AxioCam MRc 5» при помощи программы «AxioVision».

В ходе морфологического исследования дорсолатерального отдела ПЖ интактных животных установлено, что она имеет типичное строение (Фиг. 2. Предстательная железа интактной крысы, дорсолатеральный отдел. Окраска ШИК - гематоксилин - оранжевый G. Ув. 200). Секреторная часть представлена концевыми отделами и выводными протоками многочисленных желез, отличающихся размерами и локализацией. Просветы желез заполнены секретом, имеющим ШИК - положительную окраску (Фиг. 2А - Простатические конкреции в просвете желез). Простатические железы выстланы преимущественно однослойным кубическим или призматическим эпителием, а также многорядным призматическим эпителием (Фиг. 2Б - Однорядный, местами многорядный, железистый эпителий, соединительно тканая строма образует тонкие перегородки между железами). Воспалительных и дегенеративных изменений в ткани ПЖ интактных крыс не выявлено.

У животных контрольной группы («тестостерон») в результате 4-х недельного подкожного введения тестостерона пропионата в дозе 20 мг/кг в ПЖ выявлены признаки выраженного гиперпластического процесса (Фиг. 3. Дорсолатеральный отдел ПЖ контрольной крысы после введения тестостерона. Окраска ШИК - гематоксилин - оранжевый G. Ув. 200. ). Отмечено активное формирование новых очагов пролиферации с образованием разветвленных папиллярных структур в просвете ацинусов (Фиг. 3А - Формирование пролиферативных центров внутри ацинусов. Утолщение соединительнотканных прослоек). В отличие от интактных животных, существенно меняется состояние железистого эпителия ацинусов: он определяется как активно пролиферирующий, высокий призматический с гиперхромными ядрами, местами многорядный с большим количеством митозов (Фиг. 3Б). В нем выявляется вакуольная дистрофия. Во всех отделах ПЖ наблюдается выраженное венозное полнокровие и отек стромы. Прогрессирование пролиферативной активности ацинарных структур сопровождается нарушением оттока секрета из ацинусов, их кистозным расширением с атрофией эпителия. Просвет желез заполнен секретом в виде эозинофильной субстанции и слущенными эпителиальными клетками (Фиг. 3Б - Выраженная пролиферация железистого эпителия, слущенные клетки в просвете желез). Таким образом, выявленные патологические изменения в простате контрольных крыс соответствуют III - IV стадии гиперпластического процесса.

Введение животным финастерида на фоне тестостерона приводит к заметной регрессии гиперпластического процесса (Фиг. 4. Дорсолатеральный отдел предстательной железы крысы референсной группы после введения тестостерона и финастерида. Окраска ШИК - гематоксилин - оранжевый G. Ув. 200). Железистый эпителий в ацинусах определяется как призматический, без выраженных признаков пролиферации и атипии (Фиг. 4Б - Железистый эпителий призматический, местами многорядный, без видимой митотической активности). Визуально уменьшается количество митозов в эпителиоцитах. Тем не менее, на фоне введения финастерида сохраняется вакуольная дистрофия железистого эпителия, а также выраженные гемодинамические нарушения: венозное полнокровие, отек и лимфоцитарно-макрофагальная инфильтрация стромы. Наблюдаются признаки частичного нарушения оттока секрета из ацинусов с очаговым кистозным расширением и атрофией эпителия. Просвет желез заполнен секретом в виде эозинофильной субстанции и слущенными клетками (Фиг. 4А - Вакуольная дистрофия железистого эпителия. Кистозно расширенные выводные протоки желез, умеренный отек соединительно-тканных прослоек стромы). Таким образом, у крыс референсной группы морфологическая картина патологических изменений в простате соответствует папиллярной очаговой гиперплазии I - II стадии

Введение агентов Iа и Iб на фоне тестостерона приводит к положительным сдвигам в состоянии предстательной железы у опытных крыс аналогичным наблюдаемым в референсной группе (Фиг. 5. Дорсолатеральный отдел предстательной железы крысы после введения тестостерона и соединения 5-(пиридин-4′-ил)-1,3,4-оксадиазольного производного ДХК Iа. Окраска ШИК - гематоксилин - оранжевый G. Ув. 200 и Фиг. 6. Дорсолатеральный отдел предстательной железы крысы после введения тестостерона и 5-(4′-хлорфенил)-1,3,4-оксадиазольного производного ДХК Iб. Окраска ШИК - гематоксилин - оранжевый G. Ув. 200). Оба агента вызывают регрессию гиперпластических процессов, особенно в железистой части простаты (Фиг. 5А - Железистый эпителий без дистрофических изменений. Венозное полнокровие и отек стромы и Фиг. 6.А - Небольшое кистозное расширение желез). Железистый эпителий в ацинусах призматический как правило однорядный без повышенной митотической активности (Фиг. 5Б - Железистый эпителий призматический, местами многорядный, без видимой митотической активности и Фиг. 6.Б -Железистый эпителий без дистрофических изменений, незначительный отек стромы). Отличительной особенностью является незначительные дистрофические изменения в железистом эпителии и некоторое улучшение гемодинамических процессов в виде слабо выраженых отека стромы и венозного полнокровия. Выводные протоки желез частично кистозно расширены (Фиг. 5А и Фиг. 6А), с атрофичным эпителием, просвет желез заполнен секретом в виде эозинофильной субстанции. Морфологическая картина железы в целом соответствует папиллярной очаговой гиперплазии I - II стадии.

Пример 7. Морфометрические показатели антипролиферативного эффекта соединений Iа и Iб в ткани предстательной железы крыс с ДГПЖ, индуцированной тестостероном

Изменения объемных показателей структурных компонентов ткани ПЖ были количественно оценены методом морфометрического анализа. В контрольной группе на фоне 4-недельного введения тестостерона отмечено достоверное увеличение объемной плотности железистого эпителия (в 1.6 раз) и сужение просвета желез (в 1.4 раза) относительно интактных животных (Таблица1). Показано, что соединения Iа и Iб на фоне андрогена достоверно снижают объемную плотность эпителия соответственно в 1.7 и 1.3 раза относительно контрольной группы, в то время как у финастерида уменьшение данного показателя (в 1.1 раз против контроля) не было статистически значимым (Таблица 1). Под влиянием соединений Iа и Iб просвет желез восстанавливается до показателей интактной нормы. В референсной группе данный показатель незначимо отличается от контроля (Таблица 1). Показатели объемной плотности стромы во всех группах статистически не отличаются от интактных животных. Однако, на фоне введения соединения Iб отмечено достоверное уменьшение объемной плотности стромы относительно контрольной группы в 1,4 раза (Таблица 1).

Таким образом, в тестостероновой модели ДГПЖ у агентов Iа и Iб выявлен антипролиферативный эффект в виде достоверного уменьшения объема железистого эпителия, нормализации просвета желез и поддержания в норме размеров стромы. При внутрижелудочном введении в дозе 20 мг/кг соединение Iа не уступает, а соединение Iб превосходит финастерид в дозе 10 мг/кг по выраженности простатопротекторного действия.

Пример 8. Патоморфологическое исследование антипролиферативного эффекта соединений Iа и Iб в ткани предстательной железы крыс в модели ДГПЖ, индуцированной сульпиридом

Эксперимент проводили на 5 группах крыс-самцов Wistar массой 280-350 г, полученных из лаборатории экспериментальных животных ФИЦ Института цитологии и генетики СО РАН. Животных содержали в пластиковых клетках с древесным автоклавированным подстилом, при обычном световом режиме, со свободным доступом к стандартному гранулированному корму и воде. В каждой группе было по 6 особей. Крысам контрольной, референсной и опытных групп вводили внутрибрюшинно сульпирид (эглонил, «Санофи», Франция) в дозе 40 мг/кг в течение 60 суток [Van Coppenolle F. et al., 2001; Миронов А.Н., 2013]. Крысам опытных групп через час после каждой инъекции сульпирида вводили внутрижелудочно (в/ж) производное Iа или Iб в дозе 20 мг/кг в виде водно-твиновой смеси (1% раствор Твина-80), а животным референсной группы - препарат финастерид (Пенестер, «Zentiva» Чешская республика) в эффективной дозе 10 мг/кг [Jeon W.Y. et al., 2017], контрольной группе - воду с добавлением Тween-80. Группа интактных животных (фон) не подвергалась воздействиям. Через 2 месяца всех животных выводили из эксперимента декапитацией, извлекали ПЖ и фиксировали в 10 % нейтральном формалине. Гистологическую обработку ткани простаты, морфологическое исследование и морфометрический анализ проводили как указано выше в примерах 6 и 7.

В ходе морфологического исследования гистологических препаратов установлено, простата интактных животных соответствует норме, описанной выше в примере 6.

После 8-недельного введения сульпирида у контрольных животных наблюдалось развитие очаговой железистой гиперплазии ПЖ (Фиг. 7. Предстательная железа контрольной крысы после введения сульпирида. Окраска ШИК - гематоксилин - оранжевый G. Ув. 200). В секреторной части отмечалось формирование дополнительных очагов пролиферации с образованием папиллярных структур в просвете ацинусов (Фиг. 7А - Дополнительные очаги пролиферации с образованием папиллярных структур в просвете ацинусов). Железистый эпителий в ацинусах высокий призматический активно пролиферирующий с гиперхромными ядрами (Фиг. 7Б - Активно пролиферирующий эпителий в железистой части предстательной железы). Прогрессирование пролиферативной активности ацинарных структур сопровождалось нарушением оттока секрета из ацинусов и их кистозным расширением. Кистозно расширенные железы, выстланы кубическим эпителием, просвет этих желез заполнен секретом в виде эозинофильной и ШИК - позитивной субстанции (Фиг. 7В - Кистозно расширенные железы с атрофичным эпителием). Во всех отделах ПЖ выявляется выраженное венозное полнокровие, отек и коллагенизация стромы (Фиг. 7Г - Коллагенизация и отек стромы в периуретральной части предстательной железы). Таким образом, выявленные патологические изменения соответствуют II - III стадии гиперпластического процесса.

В группе животных, получавших сульпирид и II (финастерид) сохранялись признаки аденоматозных нарушений, подобных выявленным в контрольной группе (Фиг. 8. Предстательная железа крысы после введения сульпирида и II. Гиперплазия железистого эпителия предстательной железы. Окраска ШИК - гематоксилин - оранжевый G. Ув. 200). К ним относятся: очаговая гиперплазия железистого эпителия (Фиг. 8А - Гиперплазия железистого эпителия), выраженная коллагенизация стромы (Фиг. 8Б - Коллагенизация стромы предстательной железы), гемодинамические нарушения в виде полнокровия сосудов и плазматического отека межуточной ткани (Фиг. 8В - Гемодинамические нарушения: полнокровие сосудов и плазматический отек межуточной ткани).

У всех животных, получавших соединения Iа и Iб отмечалась регрессия патологических изменений. Железистый эпителий в ацинусах характеризовался как призматический однорядный, без признаков гетерогенности. В строме периуретральной зоны сохранялись гемодинамические нарушения, в виде умеренного венозного полнокровия и отека, и кистозное расширение желез. Стенки кровеносных сосудов были утолщены, просветы их сужены (Фиг. 9. Предстательная железа крысы после введения сульпирида и Iб. Окраска гематоксилин - эозин. Ув. 200 и Фиг. 10. Предстательная железа после введения сульпирида и Iа. Уменьшение гиперплазии эпителия и отека стромы. Окраска гематоксилин - эозин. Ув. 200). Наиболее ярко динамика положительных сдвигов в ПЖ наблюдалась у крыс, получавших производное Iб. В этой группе животных визуально снижалась выраженность гиперплазии в секреторной части ПЖ и признаки коллагенизации стромы по сравнению с животными референсной группы (Фиг. 9А - Существенная регрессия гиперпластических процессов). Сохранялись небольшой отек стромы и кистозное расширение желез (Фиг. 9Б - Небольшая отечность стромы, кистозное расширение желез). У крыс, получавших соединение Iа морфологическая картина простаты в большей степени соответствовала референсной группе (Фиг. 10).

Пример 9. Морфометрические показатели антипролиферативного эффекта соединений Iа и Iб в ткани предстательной железы крыс с ДГПЖ, индуцированной сульпиридом

По данным морфометрического анализа, 8-недельное введение сульпирида вызывало достоверное увеличение объемной плотности стромы (в 1.4 раз) и статистически незначимое увеличение объемной плотности железистого эпителия (в 1,1 раз) относительно интактных животных. При этом объемная плотность просвета желез в контрольной группе достоверно снижалась в (в 1,2 раз) (Таблица 2). На фоне сульпирида финастерид значимо уменьшил объемную плотность железистого эпителия и стромы (соответственно в 1,2 и 1,4 раз против контроля), а также увеличил в 1,3 раз просвет желез. Производное Iа оказало аналогичный по выраженности эффект, однако его действие в железистом эпителии и строме имело недостоверный характер. Наибольший по выраженности простатопротекторный эффект на фоне сульпирида выявлен у соединения Iб, которое достоверно снизило объемную плотность железистого эпителия (в 1,7 раз) и стромы (в 1,6 раз) относительно контроля. При этом в железистом отделе ПЖ его антипролиферативное действие превзошло по выраженности эффект финастерида в 1,4 раз (Таблица 2). На фоне сульпирида Iа и Iб, аналогично референсному препарату, достоверно увеличили объемную плотность просвета желез (соответственно. в 1,3 и 1,5 раз относительно контроля) (Таблица 2). В целом, в сульпиридной модели ДГПЖ простатопротекторное действие производные ДХК выражалось в поддержании в норме объемных показателей железистого эпителия, стромы и просвете желез, характерных для интактный животных.

Таким образом, исследуемые соединения в дозе 20 мг/кг на фоне сульпирида уменьшают пролиферативную активность железистого эпителия простаты, нормализуют объемные показатели стромы и просвета желез, улучшают отток секрета из ацинусов. Оксадиазольное производное Iа проявляет простатопротекторный эффект близкий по характеру и выраженности к финастериду в дозе 10 мг/кг, тогда как производное Iб превосходит референсный препарат по антипролиферативной активности в железистом эпителии и строме ПЖ.

Пример 10. Противовоспалительное действие соединений Iа и Iб в модели гистаминового отека лапы мышей

Противовоспалительные свойства соединений Iа и Iб изучали на стандартной модели гистаминового отека лапы мышей, рекомендованной для доклинических испытаний новых веществ [Миронов А.Н., 2013]

В эксперимент брали 32 самца мышей CD-1 массой 25-30 г, которых разделили на 4 группы по 8 особей. Мышам опытных групп вводили внутрибрюшинно водно-твиновую суспензию соединений Iа или Iб в дозе 20 мг/кг. Референсным препаратом являлся индометацин («Fluka»), который вводили внутрибрюшинно (в/б) в виде водно-твиновой суспензии в эффективной дозе 20 мг/кг [Колла В.Э.., 1998]. Контрольная группа получала воду с добавлением Твина-80. Через 1 час после введения соединений всем животным вводили в апоневроз задней лапы по 0.05 мл 0.01% водного раствора гистамина («Sigma Aldrich») [Миронов А.Н., 2013]. Через 5 часов после введения гистамина мышей забивали путем цервикальной дислокации позвоночника, отсекали обе задние лапы, определяли массу каждой. Противовоспалительный эффект оценивали по величине индекса отека лапы мыши, который определяли как отношение разности масс воспаленной и интактной лап к массе интактной лапы, выраженное в процентах.

Показано, что при внутрибрюшинном введении в дозе 20 мг/кг соединения Iа и Iб оказывают достоверное противовоспалительное действие, которое выражается в снижении величины воспалительного отека в 1,9 раз относительно контроля. Указанный эффект не уступает эффекту индометацина (снижение отека в 2 раза) (Таблица 3).

Таким образом, соединения Iа и Iб оказывают выраженное противовоспалительное действие, сравнимое с действием референсного препарата в его эффективной дозе.

Пример 11. Противовоспалительное действие соединений Iа и Iб в модели псевдоаллергического отека лапы мышей, вызванного лектином конканавалином А

Модель псевдоаллергического отека лапы мышей, индуцированного Конканавалином А, воспроизводили как описано в Руководстве по доклиническим испытаниям новых веществ [Миронов А.Н., 2013].

В эксперимент брали 32 самца мышей CBA массой 25-30 г, которых делили на 4 группы по 8 особей. Мышам опытных групп вводили внутрибрюшинно (в/б) водно-твиновую суспензию соединений Iа или Iб в дозе 20 мг/кг. Референсным препаратом являлся индометацин («Fluka»), который вводили внутрибрюшинно в виде водно-твиновой суспензии в эффективной дозе 20 мг/кг [Колла В.Э., 1998]. Контрольная группа получала воду с добавлением Твина-80. Через 1 час всем животным вводили в апоневроз задней лапы по 0.02 мл раствора конканавалина-А («Sigma Aldrich») концентрацией 5 мг/кг. Коллатеральная лапа оставалась интактной. Через сутки введение изучаемых агентов, референсного препарата, а также конканавалина-А повторяли по схеме, указанной выше. После чего через 1 час мышей забивали путем цервикальной дислокации позвоночника, отсекали обе задние лапы, определяли массу каждой и рассчитывали индекс отека лапы мыши аналогично предыдущей модели (пример 10).

Внутрибрюшинное введение агентов Iа и Iб в дозе 20 мг/кг на фоне псевдоаллергического воспаления показало, что оба соединения оказывают достоверное противовоспалительное действие. Под влиянием исследуемых соединений Iа и Iб средний индекс отека лапы мыши уменьшается соответственно в 2 и 1,6 раз относительно контрольной группы (Таблица 4). Референсный препарат индометацин снижает данный показатель в 2,4 раза (Таблица 4).

Таким образом на модели псевдоаллергического воспаления оба соединения проявили выраженное противовоспалительное действие соответствующее таковому у индометацина в его эффективной дозе.

Пример 12. Определение острой токсичности соединений Iа и Iб

Острую токсичность Iа и Iб определяли при внутрижелудочном введении мышам CD-1, массой 20-25 г, в сравнении с финастеридом II и ДХК с регистрацией количества летальных исходов в течение 14 дней. Вещества вводили внутрижелудочно через зонд в виде водной суспензии с Твином-80 (1%) в дозах 750 и 1500 мг/кг. На каждую дозу брали по 6 мышей. Наблюдения за животными проводили через 1, 4 и 24 часа в первые сутки, а затем раз в сутки в течение 14 дней с регистрацией количества летальных исходов. Величину среднесмертельной дозы определяли методом пробит-анализа по Литчвилду-Уилкоксону по логарифмической шкале «доза-эффект» [Саноцкий И.В.,1970].

Показано, что внутрижелудочное введение Iа и Iб, ДХК, а также препарата финастерида II в дозе 750 мг/кг не вызывает гибели животных (Таблица 5). При повышении дозы до 1500 мг/кг наблюдалась гибель животных в группе с введением финастерида II, ДХК и Iб (Таблица 5). В результате пробит-анализа установлено, что у соединений Iа и Iб LD₅₀, превышает 1500 мг/кг, в то время как у ДХК она соответствует 1260 мг/кг. У финастерида LD₅₀, соответствует 1060 мг/кг, а доза 1500 мг/кг является абсолютно смертельной.

Таким образом, исследуемые соединения Iа и Iб обладают меньшей токсичностью, по сравнению с исходной синтетической платформой - дезоксихолевой кислотой III и финастеридом II.

Таблица 1. Влияние соединений Iа и Iб на показатели объемной плотности (Vv) структурных компонентов предстательной железы крыс в тестостероновой модели ДГПЖ

Группа Доза, мг/кг
в/ж Показатели объемной плотности (Vv), у.е. Желез.эпителий Строма Просвет желез Интактные - 0.27±0.04 0.16±0.13 0.46±0.19 Контроль - 0.42±0.08
^Ир=0.0369 0.26±0.02 0.34±0.05
^Ир=0.0369 Финастерид II 10 0.38±0.02 0.27±0.10 0.36±0.08 Соединение Iа 20 0.25±0.11
^Кр=0.0369 0.19±0.07 0.47±0.11
^Кр=0.0121
^Фр=0.0367 Соединение Iб 20 0.32±0.05
^Кр=0.0120
^Фр=0.0373 0.19±0.10
^Кр=0.0367 0.47±0.12
^Кр=0.0122

Значения представлены в виде медианы ± квартильный размах.

р<0.05 - различия достоверны относительно: И - интактной группы; К - контрольной групы; Ф - финастерида.

Таблица 2. Изменение показателей объемной плотности (Vv) структурных компонентов предстательной железы крыс под влиянием соединений Iа и Iб в сульпиридной модели ДГПЖ

Группа Доза, мг/кг
в/ж Показатели объемной плотности (Vv), у.е. Желез.эпителий Строма Просвет желез Интактные - 0.35±0.01 0.14±0.03 0.51±0.06 Контроль - 0.38±0.06 0.19±0.08
^Ир=0.0369 0.42±0.08
^Ир=0.0120 Финастерид II 10 0.32±0.01
^Кр=0.0283 0.14±0.01
^Кр=0.0122 0.54±0.01
^Кр=0.0122 Соединение Iа 20 0.31±0.11 0.14±0.04 0.53±0.09
^Кр=0.0283 Соединение Iб 20 0.23±0.01
^Кр=0.0122
^Фр=0.0283 0.12±0.04
^Кр=0.0122 0.65±0.04
^Кр=0.0122
^Фр=0.0283

Значения представлены в виде медианы ± квартильный размах.

р<0.05 - различия достоверны относительно: И - интактной группы; К - контрольной групы; Ф - финастерида.

Таблица 3. Влияние соединений Iа и Iб на величину отека лапы мышей, вызванного гистамином

Группа Доза, мг/кг
в/б Индекс отека, % Индекс отека в % относительно контроля Противовоспалительная активность, % Контроль - 45.54±25.67 100 - Соединение Iа 20 23.50±8.81
^Кр=0.0026 51.6 48.4 Соединение Iб 20 24.54±10.82
^Кр=0.0012 53.9 46.1 Индометацин 20 22.32±6.74
^Кр=0.0012 49.0 51.0

Значения представлены в виде медианы ± квартильный размах.

р<0.05 - различия достоверны относительно контрольной группы.

Таблица 4. Влияние агентов Iа и Iб на величину отека лапы мышей, вызванного конканавалином-А

Группа Доза, мг/кг
в/б Индекс отека, % Индекс отека в % относительно контроля Противовоспалительная активность, % Контроль - 33.33±15.51 100 - Соединение Iа 20 16.32±6.25
^Кр=0.0065 49.0 51.0 Соединение Iб 20 20.63±5.61
^Кр=0.0046 61.9 38.1 Индометацин 20 14.08±7.37
^Кр=0.0032 42.2 57.8

Медиана±КР; ^Кр<0.05 - достоверное отличие от контрольной группы.

Таблица 5. Острая токсичность исследуемых соединений у мышей CD-1 при внутрижелудочном введении соединений Iа и Iб в сравнении с ДХК и финастеридом.

Группа 750 мг/кг 1500 мг/кг LD₅₀, мг/кг Число погибших мышей/число мышей в группе Процент погибших животных Число погибших мышей/число мышей в группе Процент погибших животных ДХК III 0/6 0 4/6 66.7 1260 Соединение Iа 0/6 0 0/6 0 >1500 Соединение Iб 0/6 0 1/6 16.7 >1500 Финастерид II 0/6 0 6/6 100 1060

Литературные источники

Aggarwal S. An overview on 5α-reductase inhibitors / Aggarwal S., Thareja S., Verma A., Bhardwaj T. R., Kumara M. // Steroids. - 2010. - V. 75. - P.109-153.

Do¨rsam, J. 5α-Reductase inhibitor treatment of prostatic diseases: background and practical implications / J. Do¨rsam, J. Altwein // Prostate Cancer and Prostatic Diseases. - 2009. V. 12 (2). - P. 130-36.

Fang, Q. Analysis of Data From Breast Diseases Treated With 5-Alpha Reductase Inhibitors for Benign Prostatic Hyperplasia // Q. Fang, P. Chen, N. Du, K. S. Nandakumar // Clinical Breast Cancer. - 2019. - V. 19 (5). - P. 624-636.

Helfand, B.T. The relationship between lower urinary tract symptom severity and sleep disturbance in the CAMUS trial / Helfand B.T., McVary K.T., Meleth S., Sharp V., Foster H., Nusland M., Williams O.D. // Urology. - 2011. - V.170 (6). - P. 2223-2228.

Jeon, W. Y. Inhibitory Effects of Ponciri Fructus on Testosterone-Induced Benign Prostatic Hyperplasia in Rats / W. Y. Jeon, O. S. Kim, C. S. Seo, S. E. Jin, J. A. Kim, H. K. Shin, Y. Kim, M. Y. Lee // BMC Complementary and Alternative Medicine. - 2017. - V. 17 (1).

Paolone, D. R. Benign Prostatic Hyperplasia / D. R. Paolone // Clinics in Geriatric Medicine. - 2010. - V. 26 (2). - P. 223-239.

Petrangelli E. Lipido-sterolic extract of Serenoa repens (LSESr, Permixon) treatment affects human prostate cancer cell membrane organization / Petrangelli E., Lenti L., Buchetti B., Chinzari P., Sale P., Salvatori L., Ravenna L., Lococo E., Morgante E., Russo A., Frati L., Di Silverio F., Russo M.A. // J. Cell. Physiol. - 2009. - V.219. - P. 69-76.

Roehrborn C.G. Current medical therapies from men with lower urinary tract symptoms and benign prostatic hyperplasia: achievements and limitations / C.G. Roehrborn // Rev. Urol. - 2008. - V.10. - P.14-25.

Roell D. The natural compounds atraric acid and N-butylbensene-sulfonamide as antagonists of human androgen receptor and inhybitors of prostate cancer growth / Roell D., Baniahmad A. // Mol. Cell. Endoctinol. - 2011. - V.332 (1-2). - P. 1-8.

Sciarra, A. Inflammation and chronic prostatic diseases: evidence for link? / Sciarra A., Di Silverio F., Salciccia S., Autran Gomez A.M., Centile V. // European Urology. - 2007. - V.52 (4). - P. 964-972.

Siddiqui, A. U. Synthesis of C-24 β-lactams of bile acids / Siddiqui, A. U., Siddiqui, A. H., Sundara Ramaiah, T. // Journal of Heterocyclic Chemistry - 1993 - V. 30(1). - P. 61-64.

Van Coppenolle, F. Effects of Hyperprolactinemia on Rat Prostate Growth: Evidence of Androgeno-Dependence / F. Van Coppenolle, C. Slomianny, F. Carpentier, X. Le Bourhis, A. Ahidouch, D.Croix, G. Legrand, et al. // American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. - 2001. - V. 280. - P. 120-29.

Zhang, H. High Real-World Medication Adherence and Durable Clinical Benefit in Medicare Patients Treated with 5-Alpha Reductase Inhibitors for Benign Prostatic Hyperplasia / H. Zhang, D. M. Frendl, Z. Wang, A. F. Olumi // The Journal of Urology. - 2020. - V. 204 (2). - P. 325-330.

Автандилов, Г.Г. Медицинская Морфометрия: Руководство / Г. Г. Автандилов. - М.: Медицина. - 1990. - 384 с.

Колла, В. Э. Дозы лекарственных средств и химических соединений для лабораторных животных / В. Э. Колла, Б. Я. Сыропятов. - М.:Медицина. - 1998. - 263 с.

Миронов, А. Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / А. Н. Миронов - М.: Гриф и К. - 2013. - 944 с.

Патент № 2750488 С1 Ru. 1,2,4-Оксадиазольные производные дезоксихолевой кислоты, обладающие простатопротекторным действием, гипохолестеринемической и противовоспалительной активностью: заявл. 03.06.2020. опубл. 28.06.2021 / Сорокина И.В., Попадюк И.И., Жукова Н.А., Низомов С.А., Мешкова Ю.В., Баев Д.С., Борисов С.А., Саломатина О.В., Толстикова Т.Г., Салахутдинов Н.Ф. - 26 с.

Саноцкий И.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия) / под ред. Саноцкого И.В. - М.: Медицинаю - 1970. - 99 с.

Сорокина, И. В. Моделирование доброкачественной гиперплазии предстательной железы у крыс высокой дозой тестостерона / И. В. Сорокина, Н. А. Жукова, Ю. В. Мешкова, Д. С. Баев, Т. Г. Толстикова, М. А. Бакарев, Е. Л Лушникова // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины. - 2022. - Т. 173. - №5. - С. 656-663.

Изобретение относится к фармацевтической химии, а именно к 1,3,4-оксадиазольным производным дезоксихолевой кислоты общей формулы I, где R=Py-4-ил, 4-Сl-C₆H₄. Указанные соединения обладают малой токсичностью, простатопротекторным и противовоспалительным действием. Технический результат заключается в получении альтернативных соединений, уменьшающих гиперплазию железистого эпителия в предстательной железе, обладающих противовоспалительной активностью и низкой токсичностью, которые могут найти применение в медицине. 10 ил., 5 табл., 12 пр.

I

1,3,4-оксадиазольные производные дезоксихолевой кислоты общей формулы I

I,

где R=Py-4-ил, 4-Сl-C₆H₄,

обладающие малой токсичностью, простатопротекторным и противовоспалительным действием.