1,2,4-Оксадиазольные производные дезоксихолевой кислоты, обладающие простатопротекторным действием, гипохолестеринемической и противовоспалительной активностями Российский патент 2021 года по МПК C07J43/00 A61K31/58 A61P13/08 A61P3/00 A61P29/00 

1,2,4-Оксадиазольные производные дезоксихолевой кислоты общей формулы I,

I

где, R = -Me, -Ph;

обладающие простатопротекторным действием, а также гипохолестеринемической и противовоспалительной активностями. Указанные свойства позволяют применять заявленные соединения в качестве основы для разработки простатопротекторного медицинского препарата с широким спектром фармакологических свойств, направленных на коррекцию основных патогенетических синдромов доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ), сопутствующих нарушений в липидном обмене и воспалительных процессов в тканях.

ДГПЖ является одним из наиболее распространенных в мире социально значимых заболеваний, существенно снижающих работоспособность и качество жизни мужчин старше 50 лет. Болезнь характеризуется разрастанием ткани предстательной железы (ПЖ), железистого эпителия и стромы, прежде всего в периуретальной зоне, что со временем нарушает мочеиспускание и вызывает другие негативные изменения в урогенитальной сфере. Патогенез ДГПЖ тесно связан с системными возрастными изменениями в организме, в том числе с гормональной дисфункцией, острыми и хроническими воспалительными процессами, нарушением липидного обмена (гиперхолестеринемией, ожирением, метаболическим синдромом) [Тюзиков И.А. и др., 2016; Briganti A. et al., 2009; La Vignera S. et al., 2016]. В работе [La Vignera et al., 2016] показано, что развитие ДГПЖ тесно связано с воспалительными процессами в микроокружении: активация, рекрутирование и пролиферация иммунокомпетентных клеток является существенным компонентом патогенеза. Также, в международном эпидемиологическом исследовании МТОР [Roehrborn C.G., 2008] установлена тесная ассоциация роста доброкачественной гиперплазии и риска острой задержки мочи с увеличением воспалительных инфильтратов в ткани простаты. Гиперхолестеринемия и дислипидемия, патогенетически связанные с метаболическим синдромом, в настоящее время считаются доказанными факторами риска ДГПЖ. Тесная связь гиперплазии ПЖ с гиперлипидемией выявлена как в экспериментальных работах [Vikram A. et al., 2010], так и в эпидемиологических исследованиях [Nandeesha H. et al., 2006]. Связь ДГПЖ и ожирения также достаточно широко представлена в литературе - показано, что увеличение массы абдоминального жира напрямую коррелирует с объемом простаты, уровнем простатспецифического антигена (PSA) в крови и показателем IPSS (International Prostate Symptoms Score) отражающим патологическую симптоматику ПЖ [Parikesit D. et al., 2016]. Результаты многоцентровых исследований, проведенных в последнее время, подтверждают связь ожирения с факторами, которые являются индукторами гиперплазии ПЖ, а именно с гормональными изменениями (повышенное соотношение эстроген/тестостерон) и с активацией симпатической нервной системы [Lee S.H. et al., 2009]. В связи с этим, особенно актуально наличие препаратов, которые обладают как целевой простатотропной активностью, так и дополнительными ценными эффектами (противовоспалительными, гипохолестеринемическими и т.д.).

На сегодняшний день, препараты для лечения и профилактики ДГПЖ, находящиеся на фармацевтическом рынке, представлены в основном двумя типами лекарственных средств - фитопрепараты (экстракты некоторых растений) и синтетические препараты (ингибиторы фермента 5α-редуктазы).

К официальным простатопротекторам, входящими в фармакопеи Европы, США и Российской Федерации относятся фитопрепараты на основе африканской сливы Prunus africana («Трианол») [Jena A.K. et al., 2016] и карликовой африканской пальмы Serenoa repens (Со Пальметто) («Пермиксон», «Простамол-Уно» и др.) [Tacklind J. et al., 2012]. Данные простатопротекторные препараты содержат экстрактивные вещества с антиандрогенной и фитоэстрогенной активностью, а также компоненты с противовоспалительным, противоотечным и антипролиферативным действием, избирательно проявляющимся на уровне ПЖ [Cabeza M. et al., 2016; Petrangelli E. et al., 2009]. Наиболее изученным из растительных простатопротекторов является «Пермиксон», имеющий в составе длинноцепочечные жирные кислоты (лауриновая, линолевая, линоленовая и миристиновая) и некоторые фитостеролы (β-ситостерол, кампестерол, стигмастерол и т.д.), которые дополнительно обеспечивают противовоспалительное, антигипоксическое и антифибротическое действие [Petrangelli E. et al., 2009]. Фитопрепараты и пищевые добавки на основе растительных экстрактов хорошо переносятся и обладают полезными плейотропными свойствами (противовоспалительными, антиоксидантными), однако эффективность данных препаратов невысока, поэтому, в основном, их применение показано только на ранних стадиях ДГПЖ или для ее профилактики [Olta Allkanjari et al., 2015].

Синтетические препараты, ингибиторы фермента 5α-редуктазы, в настоящее время считаются наиболее эффективными средствами лечения ДГПЖ. В ткани простаты 5α-редуктаза превращает поступающий из циркуляции тестостерон в более активный дигидротестостерон, который, связываясь с андрогеновым рецептором, повышает экспрессию генов, что в дальнейшем вызывают пролиферацию клеток простаты [La Vignera S. et al., 2016; Aggarwal S. et al., 2010; Nicolson T.M. et al., 2013]. Представителями группы ингибиторов 5α-редуктазы являются 4-азастероидные производные - финастерид (является действующим веществом таких препаратов как «Пенестер», «Проскар», «Финаст», «Финастерид» и др.), а также дутастерид (препараты «Аводарт», «Гардиум», «Дутастерид Бактэр»). Недостатком стероидных препаратов являются побочные эффекты, возникающие при длительном применении - импотенция, эректильная дисфункция, снижение либидо и проблемы эякуляции [Roehrborn C.G., et al., 2011; Do¨rsam J. et al., 2009; «Клиническая фармакология по Гудману и Гилману», 2006].

Исходя из вышеуказанного, наиболее близким к заявленным соединениям - прототипом - является финастерид формулы II, ингибитор 5α-редуктазы 4-азастероидного ряда, обладающий выраженным антипролиферативным эффектом в железистом эпителии предстательной железы [Aggarwal S., et al., 2010].

Задачей изобретения является расширение структурного ряда простатопротекторных средств, обладающих наряду с антипролиферативной активностью в ПЖ дополнительными плейотропными эффектами - противовоспалительным и гипохолестеринемическим.

Поставленная техническая задача решается использованием соединений, представляющих 3-замещенные 1,2,4-оксадиазольные производные дезоксихолевой кислоты общей формулы I, которые обладают антипролиферативной активностью в ПЖ, а также гипохолестеринемическими и противовоспалительными свойствами. Соединения Ia и Iб синтезированы впервые. Использование соединений Ia и Iб в качестве простатопротекторных средств с гипохолестеринемической и противовоспалительной активностью в литературе не представлено.

Соединения общей формулы I могут быть синтезированы, используя доступную желчную кислоту - дезоксихолевую кислоту III в качестве стартового материала в соответствии со схемой (фиг. 2).

На первом этапе осуществляется защита гидроксильных групп стероидного остова взаимодействием с уксусным ангидридом в уксусной кислоте с образованием диацетоксипроизводного IV. Далее формируется 1,2,4-оксадиазольный цикл на базе карбоксильной группы: 1) взаимодействием активированной карбоксильной группы с соответствующим N'-гидроксиимидамидом (соединения Va,б) с образованием соединений VIа,б; активация карбоксильной группы проводится карбонилдиимидазолом (CDI); 2) замыкание 1,2,4-оксадиазольного цикла под действием фторида тетрабутиламмония (соединения VIIа,б). Последующая обработка гидроксидом калия в метаноле приводит к снятию ацетатных групп в стероидном остове, и, соответственно, к получению целевых соединений Iа,б.

Были исследованы следующие свойства заявляемых средств Iа,б

• простатопротекторная активность;

• гипохолестеринемическая активность;

• противовоспалительное действие.

Простатопротекторные свойства агентов Ia и Iб обнаружены в экспериментах на крысах-самцах Вистар массой 270-320 г на тестостероновой модели ДГПЖ [Kato T. et al., 1965; Li J. et al., 2018, Kumar A., et al., 2016]. Индукция пролиферативных процессов в ПЖ достигалась ежедневным подкожным введением тестостерона пропионата (ОАО «Дальхимфарм», Россия) в дозе 20 мг/кг в течение 4-х недель. Изучаемые агенты Ia и Iб, а также стартовое соединение - дезоксихолевую кислоту III вводили внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг в виде водно-твиновой смеси (1%-ный раствор Твина-80) через 1 час после тестостерона. Референсный простатопротекторный препарат финастерид (II) («Пенестер», производитель «Зентива», Чешская Республика) вводился в том же режиме, что и изучаемые соединения, в эффективной дозе 10 мг/кг [Lee M.-Y, et al., 2012]. Контрольной группе животных вводили воду, интактные крысы (фон) не подвергались каким-либо воздействиям. В каждой группе было по 6 особей. Через 4 недели всех животных выводили из эксперимента мгновенной декапитацией. Образцы ПЖ подвергали стандартной гистологической обработке. Препараты, окрашенные гематоксилином и эозином по методу ШИК с оранжевым G и по Ван Гизону, исследовали с помощью световой микроскопии.

В результате микроскопического исследования ткани простаты крыс, у агентов Ia и Iб выявлено простатопротекторное действие, которое выражается: в снижении степени гиперпластических изменений в железистом отделе простаты (уменьшение количества дочерних пролиферативных центров, митозов в эпителиальных клетках); в снижении выраженности воспалительных и дегенеративных процессов (макрофагальной инфильтрации, вакуольной дистрофии и атрофии эпителия); уменьшении кистоза желез и увеличение их просвета. Степень папиллярной очаговой гиперплазии в железах простаты крыс снижается с III - IV стадии в контроле до I - II стадии в группах с введением агентов Ia и Iб. Выявленная морфологическая картина соответствует таковой у животных с введением финастерида II.

Морфометрическое исследование проводили у 5 животных из каждой группы на 25 участках дорсолатеральной части предстательной железы. Подсчитывали объемную плотность структурных компонентов: железистого эпителия, просвета желез и стромы. Объемную плотность каждого структурного компонента определяли по его доле [Автандилов Г.Г. 1990. 380 с.]. По данным морфометрического анализа гистологических препаратов соединения Ia и Iб уменьшают объемную плотность железистого эпителия в 1.6 и 1.4 раз по сравнению с контролем, что соответствует эффекту финастерида (1.5-кратное снижение). При этом объемные показатели эпителия в группах с введением соединений Ia, Iб и референсного препарата снижаются до уровня интактной группы (табл. 1). Дезоксихолевая кислота III уступает своим производным Ia и Iб по антипролиферативному эффекту в эпителии простаты (уменьшение объемной плотности в 1.3 раза относительно контроля) и значительно уменьшает объемную плотность стромы (в 1.7 раз относительно интактной группы) (табл. 1), что может быть связано с более заметным дегенеративным действием дезоксихолевой кислоты III, выявленном в ходе микроскопического исследования ткани ПЖ (фиг. 1Е: Простата крысы в группе с введением дезоксихолевой кислоты (III) и тестостерона. Папиллярная гиперплазия эпителия I степени, вакуольная дистрофия; фиг. 1Ж: Простата крысы в группе с введением дезоксихолевой кислоты (III) и тестостерона. Фрагмент Е, ув. 400. Папиллярная гиперплазия эпителия I степени, вакуольная дистрофия, полнокровие сосудов).

Таким образом, в условиях индуцированного тестостероном доброкачественного пролиферативного процесса в ПЖ крыс, простатопротекторное действие производных Ia и Iб выражается в поддержании в норме объемных показателей эпителия и стромы, характерных для интактных животных, а также в уменьшении дегенеративных и воспалительных процессов в ткани простаты. Простатопротекторный эффект агентов Ia и Iб при внутрижелудочном введении в дозе 50 мг/кг по характеру и выраженности соответствует таковому у финастерида II в дозе 10 мг/кг при том же способе введения.

Влияние агентов Ia и Iб на обмен холестерина оценивали в модели гепатита, индуцированного α-нафтилизотиоционатом, который вызывает у экспериментальных животных нарушение липидного обмена и гиперхолестеринемию. Причиной данных метаболических процессов является нарушение конверсии холестерина в желчные кислоты в результате инактивации белков-транспортеров в мембранах гепатоцитов [Клишевич М.С. и др., 2008; Wang H. et al., 2017]. Опыты проводили на беспородных мышах-самцах, которым вводили внутрибрюшинно α-нафтилизотиоцианат (“Aldrich”) в дозе 200 мг/кг. Изучаемые агенты Ia и Iб вводили внутрижелудочно в дозе 20 мг/кг за 1 час до воспроизведения гепатита. Дезоксихолевую кислоту III и референсный препарат α-липоевую кислоту (“Fisher Chemical”) вводили соответствующим группам животных в том же режиме и дозе. Выбор референсного агента определялся исходя из свойств α-липоевой кислоты, как препарата, регулирующего липидный обмен, обладающего липотропным и гипохолестеринемическим действием [Машковский М.Д., 1996]. Контрольные крысы получали воду в эквивалентном объеме. Интактные животные манипуляциям не подвергались. Через сутки животных забивали мгновенной декапитацией, отделяли сыворотку крови и с помощью стандартных наборов реактивов (“Analyticon”, Германия) определяли показатели обмена холестерина: общий холестерин (ХС), липопротеины высокой и низкой плотности (ДПВП и ЛПНП). Установлено, что производные дезоксихолевой кислоты Ia и Iб достоверно снижают концентрацию общего холестерина в крови соответственно в 2.5 и 1.5 раза относительно контроля (табл. 2). При этом у соединения Ia гипохлестеринемический эффект достоверно выше, чем у α-липоевой кислоты, которая уменьшает уровень холестерина в 1.9 раз. Сама дезоксихолевая кислота III в дозе 20 мг/кг гипохолестеринемического действия не оказывает. Показано, что соединения Ia и Iб, так же как структурный аналог III, значимо понижают в крови концентрацию ЛПНП, уступая по выраженности эффекта α-липоевой кислоте, однако лучше, чем последняя, поддерживают в норме уровень ЛПВП (табл. 2).

Противовоспалительные свойства производных Ia и Iб, а также дезоксихолевой кислоты III изучали на модели гистаминового отека лапы мышей, рекомендованной для доклинических испытаний новых веществ [«Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ». Под ред. Р.У. Хабриева Москва, изд-во ОАО Медицина, 2005, 832 с.].

В эксперимент брали самцов неинбредных мышей массой 25-30 г. Соединения Iа, Iб и III в виде водно-твиновой смеси (1%-ный раствор Твина-80) вводили в двух режимах: (1) внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг и (2) внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг. Референсный препарат индометацин (Fluka) вводили в эффективной дозе 20 мг/кг [Колла В.Э. и др., 1998] внутрибрюшинно или внутрижелудочно. Контролю вводили 1%-ный водный раствор Твина-80.

Через 1 час после введения соединений и референсного препарата всем животным вводили в апоневроз задней лапы по 0.05 мл 0.01% водного раствора гистамина. Через 5 часов после этого мышей забивали путем цервикальной дислокации позвоночника, отсекали обе задние лапы, определяли массу каждой. Противовоспалительный эффект оценивали по величине индекса воспаления, который определяли как отношение разности масс воспаленной (m_в) и интактной (m_и) лапой к массе интактной, выраженное в процентах. Установлено, что при внутрибрюшином введении дезоксихолевая кислота III и ее производные Ia и Iб оказывают достоверное противовоспалительное действие. При этом соединение Ia проявляет выраженный эффект, сравнимый с референсным препаратом, (снижение отека соответственно в 1.7 и 2.4 раз), а Iб и III - умеренную активность (снижение отека в 1.4 и 1.5 раз) (табл. 4).

При внутрижелудочном введении в дозе 50 мг/кг соединение Ia оказывает достоверный противовоспалительный эффект, который в 2.7 раз превосходит эффект структурного референса III. У производного Iб аналогичная разница составляет 1.4 раз, (табл. 5).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Авторы выражают благодарность Химическому исследовательскому центру коллективного пользования СО РАН за проведение спектральных и аналитических измерений. Элементный состав полученного соединения определяли из масс-спектров высокого разрешения, записанных на приборе DFS (Double Focusing Sector) фирмы Thermo Electron Corporation. Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С регистрировали на спектрометрах АМ-400 (рабочие частоты 400.13 MHz для 1Н и 100.61 MHz для ¹³С) и DRX-500 (500.13 MHz и 125.76 MHz соответственно) фирмы Bruker для растворов вещества в CDCl₃. В качестве внутреннего стандарта использовали сигналы растворителя (δ_Н 7.24 и δ_С 76.9 м.д.). Строение полученного соединения устанавливали на основании анализа спектров ЯМР ¹Н с привлечением спектров двойного резонанса ¹Н-¹Н, и двумерных спектров гомоядерной ¹Н-¹Н корреляции, а также анализа спектров ЯМР ¹³С записанных в режиме J-модуляции (JMOD), с внерезонансным подавлением протонов и двумерных спектров гетероядерной ¹³С-¹Н корреляции на прямых и на дальних константах спин-спинового взаимодействия (С-Н COSY, ¹J_C,H 135 Гц и COLOC, ^2,3J_C,H 10 Гц, соответственно).

Пример 1. Синтез 3α,12α-диацетокси-5β-холан-24-овой кислоты (IV)

Дезоксихолевую кислоту III (25.0 г, 63.8 ммоль) кипятили в AcOH (200 мл) несколько дней (до полной этерификации 3-OH-группы и 90% этерификации 12-OH-группы; ход реакции контролировали ¹H ЯМР). Добавили в реакционную смесь бензол (80 мл) и отогнали азеотроп бензол-вода с использованием насадки Дина-Старка. Затем добавили в реакционную смесь Ac₂O (4 мл) и перемешивали при комнатной температуре до полной конверсии. Реакционную смесь разбавили водой (70 мл) и выдержали 8 часов при 50°C (для разложения смешанного ангидрида уксусной и дезоксихолевой кислот), охладили до комнатной температуры и вылили в воду, далее экстрагировали смесью CH₂Cl₂-t-BuOMe. Органическую фазу промыли насыщенными водными растворами NaHCO₃ и NaCl, сушили над безводным MgSO₄. Удалили растворитель на роторном испарителе, получили сырой продукт в виде желтой аморфной массы (33.3 г); очистили его колоночной хроматографией (SiO₂, элюент CHCl₃), получили соединение IV (28.7 г, выход 95%) в виде белого твердого вещества. Тпл 71.1°C [разложение; лит. 92-93°C [Patiño Cano L.P. et al., 2013].

¹H ЯМР (CDCl₃): δ= 10.92 (ш.с., 1H, OH), 5.03 (с, 1H, H-12), 4.65 (м, 1H, H-3), 2.33 (м, 1H, H-23), 2.20 (м, 1H, H-23'), 2.05 (с, 3H, CH₃-29), 1.99 (с, 3H, CH₃-27), 0.86 (с, 3H, CH₃-19), 0.77 (д, 3H, J=6.2, CH₃-21), 0.68 (с, 3H, CH₃-18). ¹³C ЯМР (CDCl₃): δ = 179.96 (с, C-24), 170.52 (с, C-26), 170.39 (с, C-28), 75.74 (д, C-12), 74.07 (д, C-3), 49.25 (д, C-14), 47.38 (д, C-17), 44.83 (с, C-13), 41.63 (д, C-5), 35.48 (д, C-8), 34.52 (т, C-1), 34.46 (д, C-20), 34.21 (д, C-9). 33.84 (с, C-10), 32.06 (т, C-4), 30.79 (т, C-23), 30.41 (т, C-22), 27.15 (т, C-16), 26.70 (т, C-6), 26.44 (т, C-2), 25.68 (т, C-7), 25.46 (т, C-11), 23.24 (т, C-15), 22.89 (к, C-19), 21.29 (к, C-27), 21.20 (к, C-29), 17.31 (к, C-21), 12.23 (к, C-18).

Пример 2. Синтез N'-гидроксиацетимидамида (Va)

Соединение получали согласно литературной методике [Bacchi A., et al., 2011]. К холодному раствору NH₂OH·HCl (20.3 г, 293 ммоль), в MeOH (80 мл) прибавили холодный раствор KOH (18.3 г, 327 ммоль) в MeOH (80 мл), перемешивали сутки. Образовавшийся осадок KCl отфильтровали и промыли MeOH (20 мл). Охладили полученный раствор NH₂OH в MeOH и прибавили к нему охлажденный MeCN (18.3 г, 327 ммоль). Перемешивали реакционную смесь двое суток (ход реакции контролировали ТСХ, CHCl₃ : MeOH, 20:3). Удалили растворитель на роторном испарителе получили сырой продукт; очистку проводили методом колоночной хроматографией (SiO₂, элюент CHCl₃ с градиентом MeOH 0÷15%) с последующей кристаллизацией из MeOH (белые игольчатые кристаллы). Масса полученного соединения Va 8.70 г (выход 48%). ¹H ЯМР (DMSO-d₆): δ = 8.70 (с, 1H, OH), 5.34 (с, 2H, NH₂), 1.61 (с, 3H, CH₃). ¹³C ЯМР (DMSO-d₆): δ = 149.93 (с, C-2), 16.74 (к, С-1).

Пример 3. Синтез N'-гидроксибензимидамида Vб

Аналогично примеру 2 из NH₂OH·HCl (8.1 г, 116 ммоль), KOH (7.3 г, 130 ммоль) в MeOH (75 мл) и PhCN (10 г, 97 ммоль) получили сырой продукт (13.5 г); очистили его колоночной хроматографией (SiO₂, элюент CHCl₃ с градиентом MeOH 0÷10%), получили соединение Vб (12 г, выход 91%) в виде желтоватого твердого вещества. ¹H ЯМР (DMSO-d₆): δ = 9.67 (с, 1H, OH), 7.67 (м, 2H, H-2, H-6), 7.36 (м, 3H, H-3, H-4, H-5), 5.80 (с, 2H, NH₂). ¹³C ЯМР (DMSO-d₆): δ = 151.13 (с, C-7), 133.44 (д, C-4), 129.12 (с, C-1), 128.31 (д, C-3, C-5), 125.57 (д, C-2, C-6).

Пример 4. Синтез N'-(3α,12α-диацетокси-5β-холан-24-оил)ацетимидамида VIa

К диацетату ДХК IV (2.5 г, 5.25 ммоль) в сухом CH₂Cl₂ (20 мл) прибавили N,N'-карбонилдиимидазола (1.0 г, 6.30 ммоль) и перемешивали 3 часа при комнатной температуре; затем добавили N''-гидроксиацетимидамид (0.58 г, 7.88 ммоль) и премешивали ночь при комнатной температуре. Ход реакции контролировали ТСХ, AcOEt : CHCl₃ = 5 : 20. Удалили растворитель на роторном испарителе. Сырой продукт очистили колоночной хроматографией (SiO₂, элюент CHCl₃ с градиентом AcOEt 0÷5%), получили соединение VIa (2.5 г, выход 89%) в виде белого аморфного вещества. HRMS: m/z вычислено для C₃₀H₄₈O₆N₂⁺ 532.3507; найдено 514.3393; вычислено для [M-H₂O]⁺ (C₃₀H₄₆O₅N₂⁺) 514.3401. ¹H ЯМР (CDCl₃): δ = 5.03 (м, 1H, H-12), 4.78 (ш.с., 2H, NH₂), 4.65 (м, 1H, H-3), 2.38 (м, 1H, H-23), 2.23 (м, 1H, H-23'), 2.05 (с, 3H, CH₃-29), 1.99 (с, 3H, CH₃-27), 1.92 (с, 3H, CH₃-1''), 1.88-1.72 (м: 4H, [1.83]-H-16, [1.81]-H-22, [1.78]-H-6, [1.76]-H-4), 1.69-1.46 (м: 8H, [1.66]-H-1, [1.62]-H-9, [1.59]-H-2, [1.59]-H-11, [1.58]-H-17, [1.56]-H-14, [1.56]-H-15, [1.50]-H-4'), 1.45-1.12 (м: 9H, [1.42]-H-5, [1.41]-H-11', [1.39]-H-7, [1.38]-H-8, [1.35]-H-20, [1.30]-H-22', [1.26]-H-16', [1.21]-H-6', [1.17]-H-2'), 1.12-0.92 (м: 3H, [1.07]-H-7', [1.03]-H-15', [0.96]-H-1'), 0.85 (с, 3H, CH₃-19), 0.77 (д, 3H, J=6.4, CH₃-21), 0.67 (с, 3H, CH₃-18). ¹³C ЯМР (CDCl₃): δ = 171.20 (с, C-24), 170.42 (с, C-26), 170.34 (с, C-28), 154.81 (с, C-3'), 75.73 (д, C-12), 74.02 (д, C-3), 49.22 (д, C-14), 47.50 (д, C-17), 44.83 (с, C-13), 41.62 (д, C-5), 35.46 (д, C-8), 34.58 (д, C-20), 34.52 (т, C-1), 34.19 (д, C-9). 33.84 (с, C-10), 32.05 (т, C-4), 30.80 (т, C-22), 29.94 (т, C-23), 27.15 (т, C-16), 26.68 (т, C-6), 26.43 (т, C-2), 25.66 (т, C-7), 25.45 (т, C-11), 23.23 (т, C-15), 22.88 (к, C-19), 21.30 (к, C-27), 21.23 (к, C-29), 17.34 (к, C-21), 16.86 (к, C-1''), 12.26 (к, C-18).

Пример 5. Синтез N'-(3α,12α-диацетокси-5β-холан-24-оил)бензимидамида VIб

Аналогично примеру 4 из диацетата ДХК III (2.5 г, 5.25 ммоль), N,N''-карбонилдиимидазола (1.0 г, 6.30 ммоль), сухого CH₂Cl₂ (20 мл) и N''-гидроксибензимидамида (1.07 г, 7.88 ммоль) получили сырой продукт; очистили его колоночной хроматографией (SiO₂, элюент CHCl₃ с градиентом AcOEt 0÷5%), получили соединение VIб (2.55 г, выход 82%) в виде белого аморфного вещества. HRMS: m/z вычислено для C₃₅H₅₀O₆N₂⁺ 594.3663; найдено 576.3559; вычислено для [M-H₂O]⁺ (C₃₅H₄₈O₅N₂⁺) 576.3558. ¹H ЯМР (CDCl₃): δ = 7.67 (м, 2H, H-2'', H-6''), 7.45 (м, 1H, H-4''), 7.38 (м, 2H, H-3'', H-5''), 5.08 (ш.с., 1H, NH₂), 5.06 (м, 1H, H-12), 4.67 (м, 1H, H-3), 2.50 (м, 1H, H-23), 2.36 (м, 1H, H-23'), 2.08 (с, 3H, CH₃-29), 2.00 (с, 3H, CH₃-27), 1.92-1.73 (м: 4H, [1.89]-H-22, [1.88]-H-16, [1.81]-H-6, [1.79]-H-4), 1.73-1.55 (м: 7H, [1.68]-H-1, [1.65]-H-9, [1.62]-H-2, [1.62]-H-11, [1.62]-H-17, [1.59]-H-14, [1.59]-H-15), 1.50 (м, 1H, H-4'), 1.47-1.14 (м: 9H, [1.44]-H-5, [1.43]-H-11', [1.42]-H-7, [1.41]-H-8, [1.40]-H-20, [1.37]-H-22', [1.30]-H-16', [1.23]-H-6', [1.20]-H-2'), 1.14-1.02 (м: 2H, [1.10]-H-7', [1.08]-H-15'), 0.99 (м, 1H, H-1'), 0.88 (с, 3H, CH₃-19), 0.82 (д, 3H, J=6.3, CH₃-21), 0.70 (с, 3H, CH₃-18). ¹³C ЯМР (CDCl₃): δ = 171.60 (с, C-24), 170.45 (с, C-26), 170.38 (с, C-28), 155.95 (с, C-3'), 131.03 (с, C-1''), 130.87 (д, C-4''), 128.57 (д, C-3'', C-5''), 126.55 (д, C-2'', C-6''), 75.79 (д, C-12), 74.07 (д, C-3), 49.29 (д, C-14), 47.56 (д, C-17), 44.91 (с, C-13), 41.68 (д, C-5), 35.52 (д, C-8), 34.63 (д, C-20), 34.57 (т, C-1), 34.26 (д, C-9), 33.90 (с, C-10), 32.11 (т, C-4), 30.79 (т, C-22), 29.99 (т, C-23), 27.22 (т, C-16), 26.74 (т, C-6), 26.49 (т, C-2), 25.72 (т, C-7), 25.51 (т, C-11), 23.30 (т, C-15), 22.94 (к, C-19), 21.34 (к, C-27), 21.27 (к, C-29), 17.44 (к, C-21), 12.32 (к, C-18).

Пример 6. Синтез 24-нор-3α,12α-диацетокси-5β-холан-23-(3'-метил-1',2',4'-оксадиазол-5'-ила) VIIa

Смесь соединения VIa (2.4 г, 4.4 ммоль, 1.0 экв.) и 2.8 мл 1M раствора фторида тетрабутиламмония (2.8 ммоль, 0.64 экв.) в сухом ТГФ (25 мл) кипятили несколько часов. Ход реакции контролировали ТСХ, AcOEt : CHCl₃ = 10 : 20. Реакционную смесь упарили на роторном испарителе, растворили в смеси CH₂Cl₂-Et₂O, промыли насыщенным водным раствором NaCl, сушили безводным MgSO₄. Растворитель удалили на роторном испарителе. Сырой продукт очистили колоночной хроматографией (SiO₂, элюент CH₂Cl₂ с градиентом AcOEt 0÷10%), получили соединение VIIa (2.5 г, количественный выход) в виде бесцветной прозрачной аморфной массы. HRMS: m/z вычислено для C₃₀H₄₆O₅N₂⁺ 514.3401; найдено 514.3408. ¹H ЯМР (CDCl₃): δ = 5.03 (м, 1H, H-12), 4.65 (м, 1H, H-3), 2.83 (м, 1H, H-23), 2.68 (м, 1H, H-23'), 2.32 (с, 3H, CH₃-1''), 2.05 (с, 3H, CH₃-29), 1.98 (с, 3H, CH₃-27), 0.85 (с, 3H, CH₃-19), 0.82 (д, 3H, J=6.3, CH₃-21), 0.68 (с, 3H, CH₃-18). ¹³C ЯМР (CDCl₃): δ = 179.82 (с, C-5'), 170.37 (с, C-26), 170.26 (с, C-28), 166.81 (с, C-3'), 75.62 (д, C-12), 73.97 (д, C-3), 49.22 (д, C-14), 47.23 (д, C-17), 44.84 (с, C-13), 41.60 (д, C-5), 35.46 (д, C-8), 34.60 (д, C-20), 34.51 (т, C-1), 34.18 (д, C-9). 33.83 (с, C-10), 32.38 (т, C-22), 32.04 (т, С-4), 27.20 (т, C-16), 26.67 (т, C-6), 26.43 (т, C-2), 25.65 (т, C-7), 25.45 (т, C-11), 23.22 (т, C-15), 23.22 (т, C-23), 22.88 (к, C-19), 21.29 (к, C-27), 21.20 (к, C-29), 17.27 (к, C-21), 12.21 (к, C-18), 11.39 (к, C-1'').

Пример 7. Синтез 24-нор-3α,12α-диацетокси-5β-холан-23-(3'-фенил-1',2',4'-оксадиазол-5'-ила) VIIб

Аналогично примеру 6 из соединения VIб (2.4 г, 4.1 ммоль, 1.0 экв.) и фторида тетрабутиламмония (1.0 мл, 1.0 ммоль, 0.25 экв.) в сухом ТГФ (25 мл) получили сырой продукт; очистку проводили колоночной хроматографией (SiO₂, элюэнт хлористый метилен с градиентом AcOEt 0÷3%), получили соединение VIIб (2.1 г, выход 92%) в виде белого аморфного вещества. HRMS: m/z вычислено для C₃₅H₄₈O₅N₂⁺ 576.3558; найдено 576.3552. ¹H ЯМР (CDCl₃): δ = 8.04 (м, 2H, H-2'', H-6''), 7.45 (м, 3H, H-3'', H-4'', H-5''), 5.08 (м, 1H, H-12), 4.68 (м, 1H, H-3), 2.95 (м, 1H, H-23), 2.81 (м, 1H, H-23'), 2.09 (с, 3H, CH₃-29), 2.00 (с, 3H, CH₃-27), 0.89 (д, 3H, J=6.2, CH₃-21), 0.88 (с, 3H, CH₃-19), 0.71 (с, 3H, CH₃-18). ¹³C ЯМР (CDCl₃): δ = 180.15 (с, C-5'), 170.38 (с, C-26), 170.26 (с, C-28), 168.14 (с, C-3'), 130.93 (д, C-4''), 128.69 (д, C-3'', C-5''), 127.27 (д, C-2'', C-6''), 126.86 (с, C-1''), 75.74 (д, C-12), 74.05 (д, C-3), 49.34 (д, C-14), 47.41 (д, C-17), 44.98 (с, C-13), 41.72 (д, C-5), 35.58 (д, C-8), 34.70 (д, C-20), 34.62 (т, C-1), 34.30 (д, C-9), 33.93 (с, C-10), 32.54 (т, C-22), 32.17 (т, C-4), 27.28 (т, C-16), 26.77 (т, C-6), 26.53 (т, C-2), 25.75 (т, C-7), 25.54 (т, C-11), 23.52 (т, C-23), 23.31 (т, C-15), 22.94 (к, C-19), 21.31 (к, C-27), 21.24 (к, C-29), 17.40 (к, C-21), 12.31 (к, C-18).

Пример 8. Синтез 24-нор-3α,12α-дигидрокси-5β-холан-23-(3'-метил-1',2',4'-оксадиазол-5'-ила) Ia

К раствору соединения VIIa (2.25 г, 4.4 ммоль, 1 экв.) в MeOH (20 мл) добавили раствор KOH (2.0 г, 35 ммоль, 8 экв.) в MeOH (20 мл), затем аккуратно нагрели до кипения и выдержали при этой температуре до окончания реакции (ход реакции контролировали ТСХ, AcOEt : CHCl₃ = 3 : 20). Реакционную смесь охладили до комнатной температуры, концентрировали при пониженном давлении добавили 5%-ный водный раствор HCl до pH~7. Экстрагировали смесью CH₂Cl₂-AcOEt (v/v: 3:1, 3х100 мл), объединенные органические вытяжки промыли раствором NaHCO_3, затем NaCl(насыщ), сушили безводным MgSO₄. Растворитель удалили на роторном испарителе. Сырой продукт массой 1.25 г очистили колоночной хроматографией на силикагеле (SiO₂, элюент CHCl₃ с градиентом AcOEt 0÷15% в), получили соединение Ia (1.1 г, выход 82%) в виде белого твердого вещества. Тпл 89.8°C [разложение]. HRMS: m/z вычислено для C₂₆H₄₂O₃N₂⁺ 430.3190; найдено 430.3186. ¹H ЯМР (CDCl₃): δ = 3.95 (м, 1H, H-12), 3.58 (м, 1H, H-3), 2.87 (м, 1H, H-23), 2.73 (м, 1H, H-23'), 2.34 (с, 3H, CH₃-1''), 1.94-1.66 (м: 9H, [1.90]-H-22, [1.83]-H-16, [1.80]-H-6, [1.77]-H-9, [1.75]-H-4, [1.73]-H-17, [1.70]-H-1, OH-12, OH-3), 1.66-1.28 (м: 12H, [1.63]-H-2, [1.58]-H-15, [1.53]-H-14, [1.52]-H-22', [1.48]-H-11, [1.48]-H-11, [1.48]-H-4', [1.42]-H-20, [1.38]-H-7, [1.38]-H-8, [1.37]-H-5, [1.33]-H-2'), 1.26-1.17 (м: 2H, [1.23]-H-6', [1.20]-H-16',), 1.14-1.01 (м: 2H, [1.09]-H-7', [1.04]-H-15'), 0.94 (м, 1H, H-1'), 1.00 (д, 3H, J=6.5, CH₃-21), 0.87 (с, 3H, CH₃-19), 0.64 (с, 3H, CH₃-18). ¹³C ЯМР (CDCl₃): δ = 180.02 (с, C-5'), 166.85 (с, C-3'), 72.90 (д, C-12), 71.58 (д, C-3), 48.08 (д, C-14), 46.86 (д, C-17), 46.35 (с, C-13), 41.89 (д, C-5), 36.26 (т, C-4), 35.86 (д, C-8), 35.05 (т, C-1), 35.04 (д, C-20), 33.96 (с, C-10), 33.49 (д, C-9). 32.49 (т, C-22), 30.30 (т, C-2), 28.62 (т, C-11), 27.33 (т, C-16), 26.96 (т, C-6), 25.96 (т, C-7), 23.48 (т, C-15), 23.30 (т, C-23), 23.01 (к, C-19), 17.09 (к, C-21), 12.59 (к, C-18), 11.43 (к, C-1'').

Пример 9. Синтез 24-нор-3α,12α-дигидрокси-5β-холан-23-(3'-фенил-1',2',4'-оксадиазол-5'-ила) Iб

Аналогично примеру 8 из соединения VIIб (2.0 г, 3.5 ммоль) и KOH (1.2 г, 21 ммоль) в MeOH (40 мл) получили сырой продукт массой 1.55 г; очистку проводили колоночной хроматографией (SiO₂, элюент хлороформ с градиентом AcOEt 0÷15%), получили соединение Iб (1.45 г, выход 85%) в виде белого твердого вещества. Тпл 151.1-151.8°C. HRMS: m/z вычислено для C₃₁H₄₄O₃N₂⁺ 492.3347; найдено 492.3350. ¹H ЯМР (CDCl₃): δ = 8.04 (м, 2H, H-2'', H-6''), 7.45 (м, 3H, H-3'', H-4'', H-5''), 3.97 (м, 1H, H-12), 3.58 (м, 1H, H-3), 2.97 (м, 1H, H-23), 2.85 (м, 1H, H-23'), 2.00 (м, 1H, H-22), 1.03 (д, 3H, J=6.4, CH₃-21), 0.95 (м, 1H, H-1'), 0.88 (с, 3H, CH₃-19), 0.65 (с, 3H, CH₃-18). ¹³C ЯМР (CDCl₃): δ = 180.29 (с, C-5'), 168.07 (с, C-3'), 130.92 (д, C-4''), 128.67 (д, C-3'', C-5''), 127.24 (д, C-2'', C-6''), 126.79 (с, C-1''), 72.92 (д, C-12), 71.59 (д, C-3), 48.10 (д, C-14), 46.97 (д, C-17), 46.37 (с, C-13), 41.90 (д, C-5), 36.27 (т, C-4), 35.86 (д, C-8), 35.09 (д, C-20), 35.06 (т, C-1), 33.96 (с, C-10), 33.49 (д, C-9), 32.56 (т, C-22), 30.31 (т, C-2), 28.62 (т, C-11), 27.36 (т, C-16), 26.97 (т, C-6), 25.96 (т, C-7), 23.54 (т, C-15), 23.50 (т, C-23), 23.01 (к, C-19), 17.12 (к, C-21), 12.60 (к, C-18).

Пример 10. Патоморфологическое исследование антипролиферативного эффекта Ia и Iб в ткани предстательной железы крыс с ДГПЖ, индуцированной тестостероном

Эксперимент проводили на крысах-самцах массой 270-320 г, которые содержались на стандартном гранулированном корме со свободным доступом к воде. Для индукции пролиферативных процессов в предстательной железе крысам контрольной, референсной и опытных групп вводили ежедневно подкожно тестостерон пропионат в дозе 20 мг/кг в течение 4-х недель [Kato T. et al., 1965; Li J. et al., 2018, Jena A.K.]. Изучаемые агенты Ia и Iб, а также стартовое соединение - дезоксихолевую кислоту III вводили соответствующим опытным группам внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг в виде водно-твиновой смеси (1%-ный раствор Твина-80) через час после тестостерона. Референсный простатопротекторный препарат финастерид II («Пенестер», производитель «Зентива», Чешская Республика) вводился в том же режиме, что и изучаемые соединения, в эффективной дозе 10 мг/кг [Lee M.-Y. et al., 2012]. Контрольные животные получали воду, интактные крысы (фон) не подвергались каким-либо воздействиям. В каждой группе было по 6 особей. Через 4 недели всех животных взвешивали и далее выводили из эксперимента мгновенной декапитацией. После вскрытия животных предстательную железу извлекали и фиксировали в 10% нейтральном формалине. После фиксации готовили гистологические препараты, которые окрашивали гематоксилином и эозином, по методу ШИК с оранжевым G и по Ван Гизону. Морфологическое исследование проводили с помощью световой микроскопии.

В результате установлено, что у интактных животных дорсолатеральная часть предстательной железы имеет типичное строение. Секреторная часть представлена концевыми отделами и выводными протоками многочисленных желез, отличающихся размерами и локализацией. Предстательные железы выстланы преимущественно однослойным кубическим или призматическим эпителием, а также многорядным призматическим эпителием (фиг. 1А: Предстательная железа интактной крысы). Воспалительных и дегенеративных изменений в ткани предстательной железы у интактных животных не выявлено.

У животных контрольной группы («тестостерон») после 4 недельного введения тестостерона пропионата в предстательной железе отмечено развитие очаговой железистой гиперплазии с формированием дополнительных очагов пролиферации. Последние визуализируются в виде дочерних пролиферативных центров с образованием папиллярных структур в просвете ацинусов. Усиление пролиферативной активности ацинарных структур сопровождается нарушением оттока секрета из ацинусов предстательной железы, что вызывает их кистозное расширение. Железистый эпителий в ацинусах активно пролиферирующий, высокий призматический с гиперхромными ядрами, местами многорядный с большим количеством митозов без признаков атипии (фиг. 1Б: Простата крысы контрольной группы с доброкачественной гиперплазией на фоне 4-недельного введения тестостерона пропионата. Папиллярная форма гиперплазии центральной части предстательной железы). Во всех отделах предстательной железы контрольных крыс выявляется умеренно выраженное венозное полнокровие, отек и коллагенизация стромы. В центральной части большинство желез выстлано однослойным призматическим эпителием. Наблюдаются и кистозно расширенные железы, выстланные кубическим эпителием. Просвет этих желез заполнен секретом в виде эозинофильной субстанции. Таким образом, выявленные признаки пролиферации в простате контрольных животных соответствуют III - IV стадии гиперпластического процесса.

Введение финастерида II на фоне тестостерона животным референсной группы приводит к положительным сдвигам в динамике патологического процесса. Это прежде всего выражается в снижении тяжести папиллярной очаговой гиперплазии в железах, которая у всех животных соответствует I и II стадии (фиг. 1В: Простата крысы референсной группы с введением финастерида II и тестостерона. Умеренная пролиферация эпителия ацинусов. Высокий призматический эпителий без признаков атипии и полнокровие сосудов). Железистый эпителий в ацинусах отмечен как призматический, без выраженных признаков пролиферации и атипии. Визуально уменьшается количество митозов в эпителиоцитах.

Введение на фоне тестостерона агентов Iа, Iб и исходной дезоксихолевой кислоты III вызывает снижение тяжести патологического процесса в простате подобно действию финастерида II. В секреторной части железы животных этих групп выявляется сходная с референсной группой картина папиллярной формы очаговой гиперплазии по типу аденоза I-II стадии. Железистый эпителий в ацинусах высокий призматический, с гиперхромными ядрами (фиг. 1Г: Простата крысы в группе с введением соединения Ia и тестостерона. Уменьшение степени гиперпластических изменений в эпителии, незначительное полнокровие сосудов. Уменьшение высоты железистого эпителия и митозов в клетках; 1Д: Простата крысы в группе с введением соединения Iб и тестостерона. Уменьшение степени гиперпластических изменений в эпителии). У всех животных опытных групп наблюдается умеренное кистозное расширение желез с атрофией эпителия и слущиванием эпителиальных клеток в просвет желез. В стромальной части встречается венозное полнокровие и отечность, степень лимфо-макрофагальной инфильтрации - незначительная, при этом визуально отмечается уменьшение численности тучных клеток. Однако, в отличие от агентов Ia и Iб, при введении дезоксихолевой кислоты III наблюдаются более выраженные признаки воспалительных и дегенеративных процессов (вакуольная дистрофия и атрофия эпителия, слущивание эпителия в просвет желез) (фиг. 1Е: Простата крысы в группе с введением дезоксихолевой кислоты (III) и тестостерона. Папиллярная гиперплазия эпителия I степени, вакуольная дистрофия; фиг. 1Ж: Простата крысы в группе с введением дезоксихолевой кислоты (III) и тестостерона. Фрагмент Е, ув. 400. Папиллярная гиперплазия эпителия I степени, вакуольная дистрофия, полнокровие сосудов).

В периуретральной зоне простаты также сохраняются умеренные пролиферативные изменения эпителия с формированием папиллярных выростов. При окраске по Ван Гизону выраженной пролиферации соединительной ткани не выявлено. Тонкие нити рыхлой волокнистой соединительной ткани локализуются преимущественно периацинарно.

Таким образом, в результате морфологического исследования ткани простаты крыс в модели ДГПЖ у агентов Ia и Iб выявлено простатопротекторное действие, которое выражается: в снижении степени гиперпластических изменений в железистом отделе простаты (уменьшении количества пролиферативных центров, митозов в эпителиальных клетках), снижении выраженности воспалительных и дегенеративных процессов (макрофагальной инфильтрации, вакуольной дистрофии и атрофии эпителия) и повышении просвета желез. Степень папиллярной очаговой гиперплазии в железах простаты крыс снижается с III-IV стадии в контроле до I-II стадии в группах с введением агентов Ia и Iб. Установлено, что простатопротекторный эффект агентов Ia и Iб, вводимых внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг в модели ДГПЖ по выраженности соответствует таковому у финастерида в дозе 50 мг/кг при том же способе введения.

Пример 11. Морфометрические показатели антипролиферативного эффекта соединений Ia и Iб в ткани предстательной железы крыс с ДГПЖ, индуцированной тестостероном

Морфометрическое исследование проводили у 5 животных из каждой группы на 25 участках дорсолатеральной части предстательной железы. Подсчитывали объемную плотность структурных компонентов: железистого эпителия, просвета желез и стромы. Объемную плотность каждого структурного компонента определяли по его доле [Автандилов Г.Г. 1990].

В результате морфометрического анализа гистологического материала, полученного в эксперименте, описанном в примере 10, установлены количественные соотношения объемных показателей (V/v) структурных элементов ткани предстательной железы у животных различных групп.

В контрольной группе на фоне 4-недельного введения тестостерона пропионата наблюдается увеличение в 1.8 раз объемной плотности железистого эпителия по сравнению с интактной группой (р≤0.05) (табл. 1).

Введение крысам соединений Ia и Iб на фоне тестостерона оказывает антипролиферативный эффект, который выражается в статистически достоверном снижении объемной плотности эпителия простаты соответственно в 1.6 и 1.4 раз против контроля. У финастерида II аналогичный антипролиферативный эффект отмечен в виде 1.5-кратного снижения данного показателя. При этом у обоих производных Ia и Iб, так же, как и у референсного препарата, объемная плотность железистого эпителия и стромы не выходит за пределы статистической разницы с интактными животными (табл. 1).

Дезоксихолевая кислота III значительно (в 1.7 раз) снижает объемную плотность стромы относительно интактной группы, но уступает своим производным Ia и Iб по антипролиферативному действию в эпителии (уменьшение объемной плотности в 1.3 раза относительно контроля), так как в последнем случае данный показатель не достигает уровня, наблюдаемого у интактных животных (табл. 1). Последний эффект может быть связан с более выраженным местным дегенеративным действием дезоксихолевой кислоты III, признаки которого были выявлены в ходе микроскопического исследования ткани ПЖ (фиг. 1Е: Простата крысы в группе с введением дезоксихолевой кислоты (III) и тестостерона. Папиллярная гиперплазия эпителия I степени, вакуольная дистрофия; фиг. 1Ж: Простата крысы в группе с введением дезоксихолевой кислоты (III) и тестостерона. Фрагмент Е, ув. 400. Папиллярная гиперплазия эпителия I степени, вакуольная дистрофия, полнокровие сосудов).

Под влиянием соединений Ia и Iб достоверно, относительно контроля, повысилась объемная плотность просвета канальцев (табл. 1). При этом данный показатель в опытных и референсных группах не имел значимых отличий от показателей интактной группы.

Таблица 1. Влияние агентов Ia и Iб на показатели объемной плотности (Vv) структурных компонентов предстательной железы крыс в модели ДГПЖ, индуцированной тестостероном

Группа Объемная плотность, V/v Эпителий Строма Просвет желез Интактная 0.34±003 0.20±0.02 0.45±0.04 Контрольная 0.62±0.02
^И)р=0.00005 0.17±0.01 0.23±0.01
^И)р=0.00076 Финастерид II 0.41±0.03
^K)р=0.00032 0.15±0.01 0.44±0.03
^K)р=0.00009 Дезоксихолевая кислота III 0.46±0.04
^И)р=0.051
^К)р=0.0095 0.12±0.01
^И)р=0.018
^К)р=0.037
^Ф)р=0.021 0.42±0.05
^К)р=0.0035 Соединение Iа 0.39±0.05
^К)р=0.0032 0.21±0.04 0.40±0.02
^К)р=0.000079 Соединение Iб 0.43±0.05
^К)р=0.0074 0.20±0.02 ^Ф)р=0.050 ^III)р=0.011 0.37±0.03
^К)р=0.0040

р≤0.05 различия достоверны относительно: И - интактной, К - контрольной, Ф - финастерида, III - дезоксихолевой кислоты.

Таким образом, в модели ДГПЖ, индуцированной тестостероном, у соединений Ia и Iб выявлен существенный простатопротекторный эффект, который выражается в достоверном (в 1.6 и 1.4 раз) уменьшении объемной плотности эпителия железы по сравнению с контролем. При этом показатели в группах с введением соединений Ia и Iб снижались до уровня интактной группы. Уменьшение пролиферативной активности железистого эпителия сопровождается увеличением просвета канальцев, что способствует улучшению оттока секрета из ткани простаты. Показано, что данные эффекты изучаемых агентов не уступают референсному препарату финастериду II.

Таким образом, в условиях индуцированного тестостероном доброкачественного пролиферативного процесса в ПЖ крыс, простатопротекторное действия производных Ia и Iб выражается в поддержании в норме объемных показателей эпителия и стромы, характерных для интактных животных, а также за счет уменьшения дегенеративных и воспалительных процессов в ткани простаты. Установленный эффект не уступает по выраженности финастериду.

Пример 12. Гипохолестеринемическое действие соединений Ia и Iб в модели АНИТ-гепатита

Влияние агентов на обмен холестерина оценивали в модели гепатита, индуцированного α-нафтилизотиоционатом (АНИТ), который вызывает у экспериментальных животных холестаз и гиперхолестеринемию [Клишевич М.С. и др. 2008; Wang H. et al., 2017]. В опыт брали беспородных мышей-самцов с массой тела 25-30 г, которым вводили внутрибрюшинно α-нафтилизотиоцианат (“Aldrich”) в дозе 200 мг/кг. Изучаемые агенты Ia и Iб вводили внутрижелудочно в дозе 20 мг/кг за 1 час до воспроизведения гепатита. Дезоксихолевую кислоту III и референсный препарат α-липоевую кислоту (“Fisher Chemical”) вводили соответствующим группам животных в том же режиме и дозе. Выбор референсного агента определялся исходя из свойств α-липоевой кислоты, как препарата, регулирующего липидный обмен, обладающего липотропным и гипохолестеринемическим действием [Машковский М.Д., 1996]. Контрольные крысы получали воду в эквивалентном объеме. Интактные животные манипуляциям не подвергались В каждой группе было по 10 мышей. Через сутки животных забивали мгновенной декапитацией, отделяли сыворотку крови и с помощью стандартных наборов реактивов (“Analyticon”, Германия) определяли показатели обмена холестерина: общий холестерин (ХС), липопротеины высокой и низкой плотности (ДПВП и ЛПНП, соответственно).

В результате биохимического анализа сыворотки крови установлено, что производные дезоксихолевой кислоты Ia и Iб достоверно снижают концентрацию общего холестерина в крови соответственно в 2.5 и 1.5 раза относительно контроля (табл. 2). При этом у соединения Ia гипохлестеринемический эффект достоверно выше, чем у α-липоевой кислоты, которая уменьшает уровень холестерина в 1.9 раз. Сама дезоксихолевая кислота III в дозе 20 мг/кг гипохолестеринемического действия не оказывает.

Показано, что соединения Ia и Iб, так же как дезоксихолевая кислота III, значимо понижают в крови концентрацию ЛПНП, уступая по выраженности эффекта α-липоевой кислоте, однако лучше, чем последняя, поддерживают в норме уровень ЛПВП (табл. 2).

Таблица 2. Влияние агентов Ia и Iб на показатели обмена холестерина в сыворотке крови мышей в модели гепатита, индуцированного альфа-нафтилизотиоцианатом

Группа Показатели обмена холестерина в сыворотке крови, ммоль/л Общий холестерин ЛПВП ЛПНП Контроль 4.10±1.00 5.16±1.32 2.38±0.04 Дезоксихолевая кислота III 4.91±0.93 ^## 5.85±1.51 ^# 2.21±0.03*** ^# Соединение Iа 1.61±0.24***^##&& 5.28±0.28 ^## 2.19±0.04 ***^# Соединение Iб 2.68±0.74 **^&&& 5.50±0.98 ^# 2.23±0.03*** ^## α-Липоевая кислота 2.11±1.27 * 4.51±1.62 2.13±0.06 ***

*р<0.05, **р<0.01, ***р<0.001 - достоверные различия относительно контроля.

#р<0.05, ##р<0.01, ### р<0.001 - достоверные различия относительно α-липоевой кислоты,

^&&&p=0.0001 - достоверные различия относительно дезоксихолевой кислоты III.

Таким образом, производные дезоксихолевой кислоты Ia и Iб в дозе 20 мг/кг проявляют выраженный гипохолестеринемический эффект, не уступающий таковому у α-липоевой кислоты, а также оказывают умеренное гиполипидемическое действие в отношении ЛПНП. Сама дезоксихолевая кислота III в изученной дозе проявляет лишь гиполипидемическую активность.

Дополнительно определяли влияние соединений Iа, Iб и III на показатели обмена холестерина в сыворотке крови крыс-самцов в модели доброкачественной гиперплазии предстательной железы, индуцированной тестостероном. Условия воспроизведения модели и режим введения изучаемых соединений описан выше в примере 10. При выполнении биохимического анализа использовали методы, описанные выше в примере 11.

Показано, что на фоне тестостерона концентрация свободного холестерина у крыс контрольной группы тенденционно повышается (табл. 3). В этих условиях введение животным соединений Ia и Iб достоверно уменьшает уровень общего холестерина, соответственно в 1.3 и 1.4 раза относительно контрольной группы (табл. 3). Этот эффект аналогичен таковому у финастерида II и дезоксихолевой кислоты III, которые снижают этот показатель в 1.3 и 1.4 раза, соответственно.

В данной модели под действием тестостерона уровни ЛПВП и ЛПНП достоверно не изменяются (табл. 3). В этих условиях соединения Ia и Iб, а также референсные агенты, не оказывают существенного влияния на данные показатели.

Таблица 3. Влияние агентов Ia и Iб на показатели обмена холестерина в сыворотке крови крыс-самцов в модели доброкачественной гиперплазии предстательной железы, индуцированной тестостероном

Группа Показатели обмена холестерина в сыворотке крови, ммоль/л Общий холестерин ЛПВП ЛПНП Интактные 1.74±0.18 2.25±0.22 0.79±0.09 Контроль 2.30±0.08 2.25±0.21 0.44±0.13 Дезоксихолевая кислота III 1.69±0.05 ^*** 2.35±0.17 0.38±0.06 ^## Соединение Iа 1.83±0.09 ^** 2.21±0.15 0.33±0.19 ^## Соединение Iб 1.69±0.07 ^*** 2.04±0.18 0.44±0.15 Финастерид II 1.72±0.07 ^*** 2.18±0.26 0.50±0.11

*р<0.05, **р<0.01, ***р<0.001 - достоверные различия относительно контроля

^##)р<0.01 - достоверные различия относительно интактной группы.

Таким образом, в условиях модели доброкачественной гиперплазии предстательной железы, вызванной тестостероном, у соединений Ia и Iб отмечен умеренный гипохолестеринемический эффект, аналогичный таковому у финастерида II и дезоксихолевой кислоты III.

Пример 13. Противовоспалительное действие соединений Ia и Iб в модели гистаминового отека лапы мышей

Противовоспалительные свойства соединений Iа, Iб и дезоксихолевой кислоты III изучали на стандартной модели гистаминового отека лапы мышей, рекомендованной для доклинических испытаний новых веществ [«Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ». Москва, изд-во ОАО Медицина, 2005, 832 с.].

В эксперимент брали самцов неинбредных мышей массой 25-30 г, которых делили на группы по 8 особей. Соединения Iа, Iб и III в виде водно-твиновой смеси (1%-ный раствор Твин-80) вводили в двух режимах: (1) внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг и (2) внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг. Референсный препарат индометацин (Fluka) вводили в эффективной дозе 20 мг/кг [Колла В.Э. и др., 1998] внутрибрюшинно или внутрижелудочно. Контролю вводили 1%-ный водный раствор Твин-80.

Через 1 час после введения соединений и референсного препарата всем животным вводили в апоневроз задней лапы по 0.05 мл 0.01%-ного водного раствора гистамина. Через 5 часов после этого мышей забивали путем цервикальной дислокации позвоночника, отсекали обе задние лапы, определяли массу каждой. Противовоспалительный эффект оценивали по величине индекса воспаления, который определяли как отношение разности масс воспаленной (m_в) и интактной (m_u) лапой к массе интактной, выраженное в процентах (формула 1):

(1)

В результате установлено, что при внутрибрюшином введении дезоксихолевая кислота III и ее производные Ia и Iб оказывают достоверное противовоспалительное действие. При этом соединение Ia проявляет выраженный эффект, сравнимый с референсным препаратом индометацином (снижение отека соответственно в 1.7 и 2.4 раз); а Iб и дезоксихолевая кислота III - умеренную активность (снижение отека в 1.4 и 1.5 раз, соответственно) (табл. 4)

Таблица 4. Влияние агентов Ia и Iб на величину отека лапы мышей, вызванного гистамином (внутрибрюшинное введения, 20 мг/кг)

Группа Доза, мг/кг Индекс отека Индекс отека в % относительно контроля Противовос-палительная активность, % Контроль - 37.3±3.6 100 0 Дезоксихолевая кислота III 20 24.3±1.8 ** ## 65.1 34.9 Соединение Iа 20 22.2±3.8 * 56.5 43.5 Соединение Iб 20 27.1±1.5 * ### 72.7 27.3 Индометацин 20 15.8±1.1 *** 42.4 57.6

*р<0.05, **р<0.01, ***р<0.001 - достоверные различия относительно контроля;

##р<0.01, ### р<0.001 - достоверные различия относительно индометацина.

При внутрижелудочном введении в дозе 50 мг/кг соединение Ia оказывает достоверный противовоспалительный эффект, который в 2.7 раз превосходит эффект исходной дезоксихолевой кислоты III. У производного Iб аналогичная разница составляет 1.4 раза, однако в последнем случае действие обоих соединений носит лишь тенденционный характер (табл. 5).

Таблица 5. Влияние агентов Ia и Iб на величину отека лапы мышей, вызванного гистамином (внутрижелудочное введение, 50 мг/кг)

Группа Доза, мг/кг Индекс отека Индекс отека в % относительно контроля Противовос-палительная активность, % Контроль - 43.7±4.2 100 0 Дезоксихолевая кислота III 50 37.2±2.9 ### 85.1 14.9 Соединение Iа 50 26.3±2.6 *^& 60.2 39.8 Соединение Iб 50 34.8±2.9 ### 79.6 20.4 Индометацин 20 25.4±2.1 *** 58.1 41.9

*р<0.05, **р<0.01, ***р<0.001 - достоверные различия относительно контроля;

^&р<0.05 - достоверные различия относительно группы I;

##р<0.01, ### р<0.001 - достоверные различия относительно индометацина.

Поскольку активность Ia в дозе 50 мг/кг соответствует таковой у индометацина в дозе 20 мг/кг, то противовоспалительный эффект производных дезоксихолевой кислоты Ia и Iб при пероральном введении можно оценить как, соответственно, умеренный и слабый.

Литературные источники

• Aggarwal S., Thareja S., Verma A., Bhardwaj T. R., Kumara M. An overview on 5α-reductase inhibitors // Steroids, 2010, 75, 109-153.

• Allkanjari O., Vitalone A. What do we know about phytotherapy of benign prostatic hyperplasia?// Life Sciences, 2015, 126, 42-56.

• Bacchi A., Carcelli M., Compari C., Fisicaro E., Pala N., Rispoli G., Rogolino D., Sanchez T.W., Sechi M., Sinisi V., Neamati N. Investigating the Role of Metal Chelation in HIV-1 Integrase Strand Transfer Inhibitors // J. Med. Chem., 2011, 54, 8407-8420.

• Briganti A., Capitanio U., Suardi N., et al. Benign Prostatic Hyperplasia and Its Aetiologies // European Urology Suppl, 2009, 8, 865-871.

• Cabeza M., Sanchez-Marquez A., Garrido M., Silva A., Bratoeff E. Recent advances in drug design and drug discovery for androgen-dependent diseases // Current medical chemistry, 2016, 23, 792-815.

• Do¨rsam J., Altwein J. 5α-Reductase inhibitor treatment of prostatic diseases: background and practical implications // Prostate Cancer and Prostatic Diseases, 2009, 12, 130-136.

• Kumar J. A., Vasisht K., Sharma N., Kaur R., Dhingra M. S., Karan M. Amelioration of testosterone induced benign prostatic hyperplasia by Prunus species // Journal of Ethnopharmacology, 2016, 190, 33-45.

• La Vignera S., Condorelly R.A., Russo G.I., et al. Endocrine control of benign prostatic hyperplasia // Andrology, 2016, 4, 404-411.

• Lee M.-Y., Shin I.-S., Seo C.-S., Lee N.-H., Ha H.-K., Sonand J.-K., Shin H.-K. Effects of Melandrium firmum methanolic extract on testosterone-induced benign prostatic hyperplasia in Wistar rats // Asian Journal of Andrology, 2012, 14, 320-324.

• Lee S.H., Kim J.C., Lee J.Y., Kim J.H., Oh C.Y., Lee S.W., Yoo S.J., Chung B.H. Effects of obesity on lower urinary tract symptoms in Korean BPH patients// Asian J. Androl., 2009, 11, 663-668.

• Li J., Tian Y., Guo S., Gu H., Yuan Q., Xie X. Testosterone-induced benign prostatic hyperplasia rat and dog as facile models to assess drugs targeting lower urinary tract symptoms // PLOS ONE, 2018, January 19, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191469.

• Nandeesha, H., Koner, B.C., Dorairajan, L.N., Sen, S.K. Hyperinsulinemia and dyslipidemia in non-diabetic benign prostatic hyperplasia// Clin. Chim. Acta, 2006, 370, 89-93.

• Nicholson T.M., Sehgal P.D., Drew S.A., Huang W., Ricke W. A.. Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment // Differentiation, 2013, 85, 140-149.

• Parikesit D., Mochtar Ch. A., Umbas R., Rizal A., Hamid A.H.. The impact of obesity towards prostate disease // Prostate International. 2016, 4,1-6.

• Patiño Cano L.P., Bartolotta S.A., Casanova N.A., Siless G.E., Portmann E., Schejter L., Palermo J.A., Carballo M.A. Isolation of acetylated bile acids from the sponge Siphonochalina fortis and DNA damage evaluation by the comet assay // Steroids, 2013, 78, 982-986.

• Petrangelli E., Lenti L., Buchetti B., Chinzari P., Sale P., Salvatori L., Ravenna L., Lococo E., Morgante E., Russo A., Frati L., Di Silverio F., and Russo M.A. Lipido-sterolic extract of Serenoa repens (LSESr, Permixon) treatment affects human prostate cancer cell membrane organization // J. Cell. Physiol, 2009, 219, 69-76.

• Roehrborn, C.G. Male lower urinary tract symptoms (LUTS) and benign prostatic hyperplasia (BPH)// Med. Clin. North Am, 2011, 95, 87-100.

• Roehrborn, C.G. Сurrent medical therapies from men with lower urinary tract symptoms and benign prostatic hyperplasia: achievements and limitations // Rev. Urol. 2008, 10, 14-25.

• Tacklind J., Macdonald R., Rutks I., Stanke J.U., Wilt T.J. Serenoa repens for benign prostatic hyperplasia. // Cochrane Database Syst. Rev., 2009 Apr. 15; (2), CD 001423.

• Vikram A., Jena G.B., Ramarao P., Increased cell proliferation and contractility of prostate in insulin resistant rats: linking hyperinsulinemia with benign prostate hyperplasia // Prostate, 2010, 70, 79-89.

• Wang H., Fang Z.-Z., Meng R., Cao Y.-F., Tanaka N., Krausz K. W., Gonsalez F. J.. Glycyrrhizin and glycyrrhetinic acid inhibits alpha-naphthyl isothiocyanate-induced liver injury and bile acid cycle disruption// Toxicology, 2017, 386, 133-142.

• Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. М., Медицина. 1990. 380 с.

• Машковский М.Д. Лекарственные средства. 12-е издание. Т. 2- М.: Новая волна, 1996. 46.

• «Клиническая фармакология по Гудману и Гилману».: ИД «Практика», 2006, 1394-1395.

• Клишевич М.С., Черканова М.С., Гончарова И.А., Юзько Ю.В., Филюшина Е.Е., Савченко Н.Г., Короленко Т.А. Характеристика развития холестаза у мышей приведении тритона и АНИТ // Бюллетень СО РАМН. 2008, 130 (2), 39-45.

• Колла В.Э., Сыропятов Б.Я.. Дозы лекарственных средств и химических соединений для лабораторных животных. М. Медицина, 1998. С. 55.

• «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ». Москва, изд-во ОАО Медицина, 2005, 832 с.

• Тюзиков И.А., Калинченко С.Ю. Доброкачественная гиперплазия предстательной железы как системное гормонально-метаболическое заболевание: время изменить парадигмы патогенеза и фармакотерапии // Урология и нефрология. 2016, 3, 32-53.

Схема синтеза соединений общей формулы I

Cхема 1

Изобретение относится к фармацевтической химии, конкретно к соединениям, представляющим собой оксадиазольные производные дезоксихолевой кислоты формулы I, в которой R представляет собой Me или Ph. Технический результат заключается в расширении ряда простатопротекторных средств, обладающих также плейотропными эффектами – противовоспалительным и гипохолестеринемическим. 5 табл., 13 пр., 2 ил.

I

Оксадиазольные производные дезоксихолевой кислоты общей формулы I:

I

где, Ia: R = -Me, Iб: R = -Ph;

обладающие простатопротекторным действием, а также гипохолестеринемической и противовоспалительной активностями.