Ферментативный способ получения лактулозосодержащего продукта-постбиотика Российский патент 2024 года по МПК A23C9/12 A23C21/02 C12N9/14 A61K31/7016 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к пищевой биотехнологии и молочной промышленности и может быть использовано при производстве лактулозосодержащего продукта-постбиотика из вторичного молочного сырья ферментативным методом.

Уровень техники

Лактулоза является пребиотиком, который находит широкое применение в медицине и пищевой промышленности. Производство лактулозы основано на изомеризации лактозы в щелочных средах при высоких температурах. Альтернативой являются ферментативные способы, которые считаются более экологически чистыми и позволяют проводить процессы в более мягких условиях. Еще одно преимущество биосинтеза лактулозы – это возможность использования в качестве источников лактозы вторичного молочного сырья.

В настоящее время существует два основных пути ферментативного превращения лактозы в лактулозу – изомеризация (прямой) и трансгалактозилирование (с промежуточным гидролизом). Для первого применяют целлюлозо-2-эпимеразы, которые пока не имеют статуса безопасности, их не производят в промышленных масштабах, а побочным продуктом реакции является эпилактоза. Применение целлобиозо-эпимераз позволяет достигать высоких выходов лактулозы, но для получения этих ферментов используют методы генной инженерии и мутагенеза, что ставит под сомнение их безопасность (Биотехнология лактулозы: современные достижения, проблемы и перспективы / С. А. Рябцева, А. Г. Храмцов , М. А. Шпак , А. Д. Лодыгин , Г. С. Анисимов, С. Н. Сазанова, Ю. А. Табакова // Техника и технология пищевых производств. 2023. Т. 53. № 1. С. 97–122. (На англ.). https://doi.org/10.21603/2074-9414-2023-1-2419).

Известен способ получения лактулозы с помощью цельноклеточного катализа (патент CN104004699A, опубл. 2014-08-27), согласно которому в качестве продуцирующих штаммов бактерий берут рекомбинантную кишечную палочку E. coli BL 21 (DE3) для получения целлобиозоэпимеразы, вместо изопропил-бета-D-сульфогалактозида (ИПТГ) используют лактозу в качестве индуцирующего агента для ферментного культивирования, а осадок, полученный центрифугированием, подвергают пермеабилизации этиловым спиртом и сушке вымораживанием в вакууме, чтобы они служили клеточным биокатализатором для прямого превращения лактозы в лактулозу. 1-100 мл центрифужного осадка ферментированной жидкости суспендируют в 1 л в этаноле 1-90% (предпочтительно 40%) (об./об.) при 4-30°С, перемешивании в течение 5-120 мин. Порошок получают путем вакуумной лиофилизации, используют для получения лактулозы в качестве клеточного катализатора. Лактозу смешивают с буферной жидкостью до 50-800 г/л, регулируют рН до 6,0-9,5. Клеточный биокатализатор добавляют в раствор субстрата, условие конверсии: катализатор 1-100 ЕД/мл, температура реакции 40-95°С, время реакции 1-24 часа. К недостаткам способа относится применение генно-модифицированных микроорганизмов и фермента с недоказанной безопасностью, дополнительные этапы центрифугирования клеток, их пермеабилизации (для повышения проницаемости клеточных стенок для фермента, с внесением больших количеств этилового спирта) и лиофильной сушки.

Второй возможный путь ферментативного получения лактулозы основан на трансгалактозилировании лактозы в присутствии фруктозы, для которого чаще всего применяют β-галактозидазы (лактазы), имеющие международный статус безопасности (GRAS) и доступные на рынке, с хорошо изученным механизмом действия. Основными продуцентами β-галактозидаз для получения лактулозы являются дрожжи Kluyveromyces lactis или плесени Aspergillus оryzae. Синтез лактулозы в основном осуществляют с использованием коммерческих (очищенных, концентрированных) препаратов β-галактозидазы, что существенно удорожает стоимость готового продукта (Биотехнология лактулозы: современные достижения, проблемы и перспективы / С. А. Рябцева, А. Г. Храмцов , М. А. Шпак, А. Д. Лодыгин , Г. С. Анисимов, С. Н. Сазанова, Ю. А. Табакова // Техника и технология пищевых производств. 2023. Т. 53. № 1. С. 97–122. (На англ.). https://doi.org/10.21603/2074-9414-2023-1-2419).

Источником лактазы могут быть и другие микроорганизмы, возможно также применение частично очищенных или неочищенных ферментов, полученных в едином цикле производства лактулозы. Известен ферментный метод получения лактулозы (патент CN104805152A, опубл.12.07.2015). Способ начинается с получения лактазы с использованием мутантного штамма Arthrobacter. Культивирование проводят в среде, содержащей: источник углерода (глюкоза 1 %, лактоза 2 % или глицерин 0,2 %), один или несколько источников азота (дрожжевой экстракт 0,5 – 1,4 % и/или пептон 0,5 – 1 % или кукурузный экстракт 2,5 %), неорганическую соль (хлорид кальция, Zn ²⁺, сульфат магния, гидрофосфат калия, один или несколько первичных фосфатов калия или хлорида железа, их концентрация составляет 12-28 ммоль/л. Условия культивирования штамма Arthrobacter: температура 25 – 30 °С, продолжительность 0,8 – 1,5 ч при постоянном перемешивании со скоростью 200 об/мин. Затем полученный раствор центрифугируют в течение 10 – 15 минут при скорости 5000-6000 об/мин. Осадок растворяют в буфере с фосфорной кислотой того же объема (10 ммоль/л, pH 7,0). Далее проводят разрушение клеток ультразвуком и раствор еще раз центрифугируют в течение 10-15 минут при 10000-12000 об/мин. Отбирают надосадочную жидкость, которая представляет собой ферментный препарат лактазы. Для синтеза лактулозы используют субстрат, состоящий из: фосфорнокислого буферного раствора рН 5,5-8,0, лактозы 300 г/л и фруктозы 250 г/л. Дополнительно субстрат может содержать 10 ммоль/л Zn²⁺ и 4-6 ммоль/л хлорида железа. Ферментный препарат лактазы добавляют в количестве 600 ед/л, раствор выдерживают при 20°С в течение 1,5 ч. С целью доочистки в полученную смесь вносят безводный спирт, доводя его конечную концентрацию до 65 %, центрифугируют в течение 10 мин при 12000 об/мин, надосадочную жидкость концентрируют при 65°C и определяют количество лактулозы. Недостатки: использование мутантного штамма и сложных дорогих питательных сред для его культивирования, неоднократное центрифугирование для отделения клеток, использование больших объемов этилового спирта для выделения лактулозы.

Применение неочищенных ферментов снижает стоимость готовых продуктов. Более того, ферментированные смеси могут содержать разнообразные полезные для здоровья человека продукты метаболизма и компоненты клеток микроорганизмов-продуцентов ферментов, и могут быть использованы для получения продуктов-постбиотиков, которые считаются очень перспективными (Рожкова И.В., Леонова В.А., Бегунова А.В. Постбиотики как потенциальные компоненты кисломолочных продуктов с функциональными свойствами // Молочная промышленность. 2022. № 3. С. 16-18.) Хотя этот новый термин появился недавно, и его определение уточняется, многие ученые считают, что концепция постбиотиков включает инактивированные микроорганизмы, благотворно влияющие на здоровье хозяина. (Salminen, S.; Collado, M.C.; Endo, A.; et al. The International Scientific Association of Probiotics and Prebiotics (ISAPP) consensus statement on the definition and scope of postbiotics. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2021, 18, 649–667.). В последние годы появились патенты на способы получения продуктов-постбиотиков.

В патенте CN115606805 (2023-01-17 Postbiotic composition and application thereof in oral health) описано получение постбиотической композиции, которая включает следующие компоненты в массовых частях: 2-25 частей инактивированной Lactobacillus crispatus, 5-50 частей дрожжевого бета-глюкана и 1-10 частей порошка цветков жимолости. Продукт предназначен для ухода за полостью рта, так как может эффективно ингибировать нежелательные микроорганизмы. Недостатком является сложность композиции, включающей дрожжевой бета-глюкан (иммуномодулятор) как отдельный компонент, что удорожает готовый продукт.

В патенте RU2658777 (2018-06-22 Способ производства постбиотического продукта) готовят гидролизатно-молочную среду на основе гидролизата белкового компонента, полученного ферментативным гидролизом, включающего обезжиренное коровье молоко и экстракт соевых бобов в соотношении 9:1. Вводят в гидролизат стабилизирующие добавки и факторы роста микроорганизмов, стерилизуют полученную гидролизатно-молочную среду, раздельно вводят в нее суточные культуры микроорганизмов рода Lactobacillus и рода Bifidobacterium или рода Lactobacillus и рода Streptococcus в равных соотношениях и культивируют. Полученную смесь разрушают прогреванием 56-80°С в течение 45-90 мин или замораживанием при температурах -5-(-10)°С, выдерживают при этой температуре в течение 10-24 ч с последующим медленным размораживанием при комнатной температуре или введением в микробную суспензию органических кислот, выдерживают полученную смесь в течение суток при комнатной температуре и хранят готовый продукт при температуре 2-30°С. Недостатком способа является применение сложных по составу и дорогих питательных сред, отсутсвие постбиотиков дрожжевого происхождения и лактулозы.

Наиболее близкими по технической сущности к предлагаемому способу являются способы, описанные в патенте ЕР 3542641 и патенте RU 2622078.

В патенте ЕР 3542641 (Лактулозосодержащий продукт и способ получения лактулозосодержащего продукта, опубл. 25.09.2019) описан способ получения лактулозосодержащего продукта, включающий следующие стадии: а) получение лактозосодержащего субстрата, b) обработка лактозосодержащего субстрата β-галактозидазой и/или β-глюкозидазой в присутствии фруктозы для получения субстрата, содержащего лактулозу; c) инактивация β-галактозидазы и/или β-глюкозидазы путем нагревания; и d) получение лактулозосодержащего ретентата путем нанофильтрации и/или диафильтрации лактулозосодержащего субстрата. В качестве сырья используют пермеаты, полученные путем ультрафильтрации предпочтительно молока, сыворотки, производного молока или производного сыворотки. Пермеат нагревают (пастеризуют и/или стерилизуют). Для проведения стадии b) используют β-галактозидазу из Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis, Bacillus licheniformis или Bifidobacterium bifidum и/или β-глюкозидазу из Aspergillus oryzae или Pyrococcus furiosus. Процесс проводят при температуре от 2°С до 42°С, в частности от 5°С до 15°С, предпочтительно от 5°С до 7°С, в диапазоне рН от 4,0 до 7,0, в частности от 4,0 до 6,5, предпочтительно от 4,5 до 6,5, с ферментативной активностью, в частности нормализованной ферментативной активностью, от 0,1 нкат до 20 нкат, в частности от 1 нкат до 10 нкат, предпочтительно 2 нкат, на мл лактозосодержащего субстрата и в течение периода от 12 до 72 часов, в частности от 24 до 60 часов, предпочтительно от 40 до 56 часов. Этап с) проводят при температуре от 90°С до 150°С, в частности от 100°С до 130°С, предпочтительно от 120°С до 130°С. Нанофильтрацию проводят при трансмембранном перепаде давления от 10 до 50 бар, в частности от 10 до 40 бар, предпочтительно от 20 до 40 бар. Перед диафильтрацией снижают трансмембранный перепад давления, в частности, с 30 бар до 20 бар. Недостатки способа: применение дорогостоящих коммерческих (очищенных) ферментов, длительный и дорогостоящий процесс выделения лактулозы.

В патенте RU 2622078 (С1, МПК С12N 9/14. Способ получения комбинированного ферментного препарата бета-галактозидаз / Рябцева С.А., Скрипнюк А.А., Котова А.А., Храмцов А.Г., Родная А.Б., Лодыгин А.Д., Мартак А.А.// приор. 12.01.2016, опубл. 9.06.2017, бюл. № 16) описан способ получения комбинированного ферментного препарата бета-галактозидаз, включающий подготовку лактозосодержащего сырья, культивирование микроорганизмов, извлечение ферментов, их очистку методом ультрафильтрации и концентрирование, отличающийся тем, что в лактозосодержащем сырье с массовой долей лактозы 3-15 % культивируют одновременно лактозосбраживающие дрожжи и термофильные молочнокислые бактерии при температуре (30±2) °С в течение 7-16 ч, а извлечение ферментов проводят путем автолиза при температуре (50±5) °С в течение 6-12 часов. Недостатком является медленное развитие термофильных молочнокислых бактерий при температурах, оптимальных для дрожжей (30±2) °С, недостаточное накопление продуктов метаболизма продуцентов лактаз, и, как следствие, низкая эффективность автолиза и активность полученного ферментного препарата, особенно в отношении трансгалактозилирования для биосинтеза лактулозы.

Осуществление изобретения

Технический результат предлагаемого способа заключается в получении активного комбинированного препарата лактаз для биосинтеза лактулозы и производства лактулозосодержащего продукта-постбиотика из вторичного молочного сырья в рамках единого цикла. Данный технический результат достигается за счет двухэтапного культивирования продуцентов лактаз (лактозосбраживающих дрожжей и молочнокислых бактерий), их эффективного автолиза и биосинтеза лактулозы с использованием полученного неочищенного ферментного препарата, инактивации и концентрирования полученной ферментированной смеси.

Предлагается ферментативный способ получения лактулозосодержащего продукта-постбиотика, включающий подготовку лактозосодержащего сырья, культивирование лактозосбраживающих дрожжей и термофильных молочнокислых бактерий, извлечение лактаз, биосинтез лактулозы с использованием полученных лактаз, инактивацию клеток и ферментов путем нагревания, концентрирование ферментированной смеси путем сгущения и/или сушки, отличающийся тем, что используют двухэтапное культивирование продуцентов лактаз: на первом этапе раздельное в аэробных условиях, дрожжи при температуре (25 ÷ 35) °С в течение (8 ÷ 24) ч. при интенсивном перемешивании, молочнокислые бактерии при температуре (37 ÷ 45) °С в течение (8 ÷ 24) ч. без перемешивания; на втором этапе совместное в анаэробных условиях при температуре (25 ÷ 40) °С в течение (12 ÷ 36) ч., извлечение ферментов проводят путем автолиза при температуре (40 ÷ 60) °С в течение (18 ÷ 30) ч., а биосинтез лактулозы проводят с использованием полученного неочищенного ферментного препарата при температуре (30 ÷ 60) °С в течение (0,1 ÷ 14) ч.

Способ заключается в следующем.

В качестве сырья и питательной среды для культивирования микроорганизмов используют вторичное молочное сырье (в т.ч. подсырную и/или творожную сыворотку, ультрафильтрационные (УФ) пермеаты обезжиренного молока и сыворотки), содержащее лактозу, азотистые и минеральные вещества, необходимые для развития лактозосбраживающих дрожжей и молочнокислых микроорганизмов. При использовании молочной сыворотки, как правило, ее очищают от остатков молочного жира и казеиновой пыли на специальных сепараторах. Для уничтожения нежелательных микроорганизмов, которые могут влиять на культивирование продуцентов лактаз и качество готового продукта, проводят пастеризацию или стерилизацию сырья при режимах, принятых в отрасли. Например, могут быть использованы режимы высокотемпературной пастеризации при (85 ÷ 87) °С в течение 3-5 сек. Лактозосодержащее сырье может быть натуральным или подсгущенным, с массовой долей лактозы в исходном растворе от 3 до 15 %, что указано в патенте RU 2622078. Режимы обработки и желательный для культивирования состав молочного сырья известны и не являются отличительными признаками изобретения.

Подготовленное вторичное молочное сырье используют для двухэтапного культивирования продуцентов лактаз, в качестве которых используют безопасные лактозосбраживающие дрожжи и термофильные молочнокислые бактерии, применяемые в пищевой промышленности и биотехнологии, обладающие способностью вырабатывать лактазы, предпочтительно дрожжи Kluyveromyces marxianus или Kluyveromyces lactis, и термофильные молочнокислые микроорганизмы Lactobacillus acidophilus или Streptococcus thermophilus.

Первый этап культивирования проводят раздельно в аэробных условиях для накопления биомассы продуцентов. Дрожжи культивируют при температуре (25 ÷ 35) °С в течение (8 ÷ 24) ч. при интенсивном перемешивании. При температурах ниже 25 °С дрожжи-продуценты лактаз развиваются очень медленно, выше 35° клетки начинают гибнуть. При культивировании менее 8 ч. не накапливается достаточной биомассы и не достигается необходимая активность ферментного препарата, после 24 ч. культивирования скорость прироста биомассы снижается, а у некоторых культур наблюдается снижение активности ферментного препарата. Интенсивное перемешивание способствует аэрации среды, при котором дрожжи накапливают биомассу быстрее, так как идет реакция полного окисления углеводов с выделением большого количества энергии. Термофильные молочнокислые бактерии лучше растут при более высокой температуре и без доступа кислорода (так как являются факультативными анаэробами), поэтому их культивируют отдельно, при температуре (37 ÷ 45) °С в течение (8 ÷ 24) ч. без перемешивания. При температурах ниже 37 °С термофильные бактерии развиваются медленно, выше 45° клетки начинают гибнуть. При культивировании менее 8 ч. не накапливается достаточной биомассы и не достигается необходимая активность ферментного препарата, после 24 ч. культивирования скорость прироста биомассы снижается, а у некоторых культур наблюдается снижение активности ферментного препарата.

Второй этап культивирования проводят совместно в анаэробных условиях при температуре (25 ÷ 40) °С в течение (12 ÷ 36) ч. Анаэробные условия необходимы для протекания процесса спиртового брожения дрожжей, при котором образуется этиловый спирт, который может способствовать пермеабилизации клеток дрожжей и молочнокислых бактерий, в результате чего облегчается процесс выхода (извлечения) лактаз из клеток. При анаэробном брожении также накапливаются другие продукты метаболизма молочнокислых бактерий и дрожжей, в т.ч. ферменты, молочная, уксусная и другие органические кислоты, витамины и др., которые могут способствовать интенсификации разрушения клеток и получению более активного ферментного препарата, а также обогащать продукт-постбиотик.

Извлечение ферментов проводят путем автолиза клеток продуцентов в совместной культуре при температуре (40 ÷ 60) °С в течение (18 ÷ 30) ч. При температуре ниже 40 °С автолиз клеток протекает медленно, выше 60 °С снижается активность ферментного препарата. При автолизе менее 18 ч. часть клеток продуцента остается неразрушенной, и они могут в дальнейшем утилизировать лактозу и лактулозу при биосинтезе. При автолизе более 30 ч. снижается активность ферментного препарата. Ферментный препарат не подвергается очистке, благодаря чему сохраняется его высокая трансгликозилирующая активность, и сразу используется для биосинтеза лактулозы.

Биосинтез лактулозы проводят с использованием полученного неочищенного ферментного препарата, который вносят в лактозосодержащее сырье с добавлением фруктозы, при температуре (30 ÷ 60) °С в течение (0,1 ÷ 14) ч. При температуре ниже 30°С выше 60°С наблюдается скорость образования лактулозы резко снижается. Лактулоза начинает синтезироваться в первые минуты проведения реакции, и максимум ее концентрации при использовании некоторых комбинаций ферментов может быть достигнут уже через 6 мин., после 14 ч. ферментации наблюдается снижение ее концентрации, по-видимому, за счет преобладания реакции гидролиза. Содержание лактозы и фруктозы в субстрате может колебаться в широких пределах соотношений молярных концентраций, преимущественно при соотношении от 1:1 до 1:4, что известно из публикаций (Биотехнология лактулозы: современные достижения, проблемы и перспективы / С. А. Рябцева, А. Г. Храмцов , М. А. Шпак, А. Д. Лодыгин , Г. С. Анисимов, С. Н. Сазанова, Ю. А. Табакова // Техника и технология пищевых производств. 2023. Т. 53. № 1. С. 97–122. (На англ.). https://doi.org/10.21603/2074-9414-2023-1-2419) и не является отличительным признаком изобретения.

Ферментированную смесь с лактулозой инактивируют нагреванием и концентрируют с получением лактулозосодержащего продукта-постбиотика с полезными для здоровья компонентами. Режимы инактивации клеток и ферментов известны (например, в рассмотренном выше патенте ЕР 3542641 при температуре от 90°С до 150°С), самый простой способ – кипячение в течение 3-5 минут. Благодаря тому, что в технологии используются заквасочные микроорганизмы с доказанной безопасностью, не требуется сложной очистки продукта от токсичных продуктов их метаболизма. Более того, продукты метаболизма и компоненты инактивированных клеток лактозосбраживающих дрожжей (например, витамины, антиоксиданты, глюканы, маннаны, аминокислоты, биоактивные пептиды и др.) и молочнокислых бактерий (органические кислоты, экзополисахариды, пептидогликаны и др.). обладают полезными для здоровья свойствами. При этом недорогое побочное молочное сырье (сыворотку или пермеат) используют как в качестве лактозосодержащего сырья для культивирования дрожжей и молочнокислых бактерий, так и в качестве источника лактозы для ее биотрансформации в лактулозу, что снижает стоимость готового продукта. Концентрирование ферментной смеси производят в вакуум-выпарных аппаратах и/или путём распылительной сушки при известных технологических режимах.

Способ подтверждается примерами.

Пример 1. Подсырную сыворотку, очищенную от жира и казеиновой пыли, пастеризуют при (85 ÷ 87) °С в течение 3-5 сек. Далее сыворотку охлаждают и используют для культивирования продуцентов лактаз и для биосинтеза лактулозы в промышленных ферментерах. На первом этапе дрожжи Kluyveromyces lactis культивируют в аэробных условиях при температуре (25 ÷ 30) °С в течение (22 ÷ 24) ч. при интенсивном перемешивании, молочнокислые бактерии Lactobacillus acidophilus культивируют в аэробных условиях при температуре (37 ÷ 40) °С в течение (22 ÷ 24) ч. без перемешивания. Полученные суспензии дрожжей и молочнокислых бактерий объединяют и проводят второй этап совместного культивирования в анаэробных условиях при температуре (25 ÷ 30) °С в течение (12 ÷ 14) ч. После этого проводят извлечение лактаз из клеток микроорганизмов путем автолиза при температуре (40 ÷ 45) °С в течение (28 ÷ 30) ч. По окончании автолиза полученный ферментный препарат добавляют в пастеризованную и охлажденную подсырную сыворотку с растворенной в ней фруктозой при молярном соотношении лактоза:фруктоза 1:1 и проводят биосинтез лактулозы при температуре (30 ÷ 40) °С в течение (12 ÷ 14) ч., после чего смесь инактивируют кипячением в течение нескольких минут, охлаждают и отправляют на вакуум-сгущение, которое проводится при температуре 65 °С. Сгущение проводят до массовой доли сухих веществ (40-45) %. Получают сгущенный продукт-постбиотик, содержащий около 5% лактулозы, а также метаболиты и компоненты инактивированных клеток дрожжей и молочнокислых бактерий.

Пример 2. Сухой УФ-пермеат обезжиренного молока растворяют в горячей воде при (90 ÷ 95) °С исходя из достижения массовой доли лактозы в растворе 15 %. Далее пермеат охлаждают и используют для культивирования продуцентов лактаз и для биосинтеза лактулозы в промышленных ферментерах. На первом этапе дрожжи Kluyveromyces marxianus культивируют в аэробных условиях при температуре (30 ÷ 35) °С в течение (8 ÷ 10) ч. при интенсивном перемешивании, Молочнокислые бактерии Streptococcus thermophilus культивируют в аэробных условиях при температуре (40 ÷ 45) °С в течение (8 ÷ 10) ч. без перемешивания Полученные суспензии дрожжей и молочнокислых бактерий объединяют и проводят второй этап культивирования – совместное в анаэробных условиях при температуре (35 ÷ 40) °С в течение (34 ÷ 36) ч. После этого проводят извлечение лактаз из клеток микроорганизмов путем автолиза при температуре (55 ÷ 60) °С в течение (18 ÷ 20) ч. По окончании автолиза полученный ферментный препарат добавляют в пермеат с растворенной в нем фруктозой при молярном соотношении лактоза:фруктоза 1:2 и проводят биосинтез лактулозы при температуре (55 ÷ 60) °С в течение (0,1 ÷ 0,5) ч., после чего смесь инактивируют кипячением в течение нескольких минут, охлаждают и отправляют на распылительную сушку. Получают сухой продукт-постбиотик с массовой долей сухих веществ 95%, содержащий около 15% лактулозы, а также метаболиты и компоненты инактивированных клеток дрожжей и молочнокислых бактерий.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен ферментативный способ получения лактулозосодержащего продукта-постбиотика, включающий подготовку лактозосодержащего сырья, двухэтапное культивирование продуцентов лактаз: на первом этапе - раздельное культивирование в аэробных условиях: дрожжи при 25-35 °С в течение 8-24 ч при интенсивном перемешивании, молочнокислые бактерии при 37-45 °С в течение 8-24 ч без перемешивания; на втором этапе – совместное - в анаэробных условиях при 25-40 °С в течение 12-36 ч; извлечение ферментов проводят путем автолиза при 40-60 °С в течение 18-30 ч; биосинтез лактулозы проводят с использованием полученного неочищенного ферментного препарата, который вносят в лактозосодержащее сырье с добавлением фруктозы в соотношении молярных концентраций лактоза:фруктоза от 1:1 до 1:2, при 30-60 °С в течение 0,1-14 ч, затем ферментированную смесь концентрируют сгущением и/или сушкой. Изобретение обеспечивает повышение выхода целевого продукта из вторичного молочного сырья в рамках единого цикла. 2 пр.

Ферментативный способ получения лактулозосодержащего продукта-постбиотика, включающий подготовку лактозосодержащего сырья, двухэтапное культивирование продуцентов лактаз: лактозосбраживающих дрожжей и термофильных молочнокислых бактерий, извлечение лактаз, биосинтез лактулозы с использованием полученных лактаз, инактивацию клеток и ферментов путем нагревания, концентрирование ферментированной смеси путем сгущения и/или сушки, при этом на первом этапе культивирования осуществляют раздельное культивирование в аэробных условиях: дрожжи при температуре 25-35 °С в течение 8-24 ч при интенсивном перемешивании, молочнокислые бактерии при температуре 37-45 °С в течение 8-24 ч без перемешивания; на втором этапе – совместное - в анаэробных условиях при температуре 25-40 °С в течение 12-36 ч; извлечение ферментов проводят путем автолиза при температуре 40-60 °С в течение 18-30 ч, а биосинтез лактулозы проводят с использованием полученного неочищенного ферментного препарата, который вносят в лактозосодержащее сырье с добавлением фруктозы в соотношении молярных концентраций лактоза:фруктоза от 1:1 до 1:2, при температуре 30-60 °С в течение 0,1-14 ч.