Способ выращивания продуцентов литических ферментов Советский патент 1980 года по МПК C12D13/10 

t

Изобретение относится к ферМентной отрасли микробиологичес-. кой пpo 4ЫIIШ ннocти и может быть использовано при получении препаратов литических ферментов путём 5 глубинного культивирования микроорганизмов, в частности бактерий рода BaclE us.

Известны способы получения литических ферментов путем глубин- 10 ного культивирования микрооргаийз- мов на различных питательных средах, содержащих источники органических соединений углерода и азота в суммарной концентрации до 10% и ми- )5 неральные соли. Культивирование проводится одностадийно или в две стадии соответственно без корректировки или с корректировкой состава питательной среды в ходе фер- 20 ментации 1.

Наиболее близким по своей технической сущности к заявленному является способ, согласно которсту 25 продуцентов литических ферментов выращивают глубинным методом на питательных средах, содержаниях ассик«лируемые источники органических соединений, углерода и азота в суммарноЛ концентрации не ниже 2% и минеральные соли, причём за 2-6 ч до окончания ферментации объем культуральной жидкости увеличивают в 1,5-2,5 раза за счет введения KCMimoHeHTOB питательной среды, не содержащих органических источников углерода и азота. В качестве таких компонентов используют водопроводную воду или водные растворы всех или ч&сггй «йнёра;лб них компонентов основной питательной среды в концентрациях, не превышающих их концентрации i основной питательной среде 2.

Недостатком известного способа является ТО, что увеличение культуральной жидкости за счет компонентов, не содержас их органических источников питания, приводит к сокращению продолжительности продуктивного состояния и автолизу клеток микроорганизмов вследствие снижения осмотического давления среды. Результатом этого является недостаточно высокая активность литиче ских ферментов, продуцируемых микроорганизмгши. I Целью изобретения является пре дотвращеиие автолиза клеток продуЧЙЙ й -- 5(- - --- - -йХ5 - 1----- --i- - ------------ - -- V---- - - ...--; И повшиение активности целе orortip&ffytcfa:- --..,Поставленная цель достигается тем, что одновременно с разбавлением культуры в питательную Ьрёду вводят ингибитор автолиза, представляющий собой экстракт ферментрлиэа биомассы бактерий, в концентрации , О, 02-0,10 %„ по ртношению к конечному объему культуральной жидкости.

Ингибиторы автолИза получают к9 биомассы продуцента или других бактерий известным способом.

Для выделения регуляторов может использоваться биомасса любой бактерии при условии, что выделенные регуляторы обладают отрицательным знаком действия на интенсивность ав

толйза продуцента лйтическ их ферментов, то есть снижают интенсиЬность

аШолйза.

Предлагаемый способ можетбыть исдальэован при получении литических ферментов путём глубиннбгб культивирования ми.кроорганизмов, например бактерий B.subtiBis и В. mesentericus, на различных питательных средах, содержащих в начальный момент культивирования ассимилируемые источники углерода и азота в суммарной концентрации 2-5%.

Введение в культуральную жидкость растворов ингибиторов автолиза приводит к стабилизации бактериальных клеток, увеличениюих жизнеспо- собнрсти и продолжительности продуктдвногр состояния в условиях обедненной питательной ..среды, следствием чего является повышение ак тйвности литических ферментов в культуральной жидкости.

Пример 1. Глубинную культуру B.subtiBis 402 выращивают в колбах емкостью 750 мл, срдержащих 40 мл среды следующего состава, г/л: ферментативный гидролизат дрожжей БВК 12; лактоза 10; (NH4)2HPO4 4; КС6 0,6; CaCKz 0,1; 0,1 при рН 7,0. После стерилизации и засева среды колбы инкубируют в течение 14 ч., на качалке при температуре 37.Затем в 4 контрольные колбы вносят дополнительно по 40 мл стерильной водопроводной воды, а в 4 о.пытные колбы- . по 40 мл стерильного водного раствора (вода водопроводная),содержащего йО мг йнгйб итора автолиза, вьщелённогр из биомассы B.subtiBis 402 (конечная концентрацйй ингибитора в культураль ной жидкости - 0,1%). Контррльные и опытные колбы вновЬ ; ставй н1с11 качалку njpii той же температурё, инкубируют 4 ч, а затем оП1рёделяют литическую активности по методу Кислухиной.

Средняя литическая активнЬсть в Хонтрйлбных колбах составила 13500 ед/мл, в опытных колбах 20800 ед/мл, или 154% по отношениюк контролю.

Пример 2. Глубинную культуру В. subti8 is 402 в течение первых 14 ч вьаращивают так же, как в примере 1. Затем в 4 контрольные

5 колбы вносят по 40 мл стерильного водного раствора солей, содержащегр, г/л: МдВОД-7Нг,0 0,1 . В 4 опытные кЬлбы вносят по 40 мл такого же солевого раствора, содержащего дополнительно по 60 мг . ингибитора автолиза, выделенного из культуры BaciSCus megateriun 400 (конечная концентрация ингибитора в культуральной жидкости - 0,075%).

5 Контрольные и опытные колбы инкубируют на качалке-.4 ч при температуре

37 С, после чего.определяют литическую активность.

Средняя литичеркая активность в

0 Контрольных колбах составила 12000 ед/мл, в .опытных колбах 18000 ед/мл или 150% по отношению к контвдлю.

П р и м е р . 3. Глубинную культуру B.subtifiis R 2 выращивают в

колбах объемом 750 мл на 50 мл среды л еду1Ьщего состава, в г/л: гидролизат бактериальной биомассы 10; мальтоза 10; (ЫН)а, HPOv4;KC 0,6; MgSO« .7HiO 0,1; CaCfj 0,1 при рН 7,2.

0 После стерилизации и засева колбы инкубир|уют в течение 12 ч на качалке при температуре . Затем, в контрольные колбы вносят по 50 мл стерильной водопроводной воды, а в

5 опытные - пр 50 мл стерильного водного раствора, содержащего по 30 мг ингибитора автолиза, выделенного из StseptococcHS Еactis (конечная концентрация ингибитора в культуральQ ной жидкости 0,03%). Контрольные и опытные колбы инкубируют на. качалке 5 ч, затем определяют литическую активность.

Средняя литическая активность в

контрольных колбах составила

5 5330 ед/мл, в опытных - 7200 ед/мл или 135% по отношению к контролю.

Таким образом, использование предлагаемого спосо.ба позволяет Q порыси ь активнрсть литических ферментов в культуральной жидкости на 35-54%.

Формула изобретения

Способ выращивания продуцентов литических ферментов путем культивирования микроорганизмов рода на питательной среде, соДер5к1ащей источники органических соединений.углерода и азота в суммарной концентрации 2-5% с разбавлением культуры в процессе культивирования в 1,5-2,5 раза за 2-6 ч до .окончания ферментов путем введения 5 76719 растворов, не содержащих ассимилирчёмые источники углерода и азота, отличающийся тем, что, с целью предотвращения автолиза клеток продуцента и повышения активности целевого продукта, одновременно с с разбавлением культуры в питательную среду вводят ингибитор автолиза, представляющий собой экстракт Ферментолизата биомассы тех же или других бактерий, в концентрации 66 0,02-0,10% по отношению к конечному объему культур льной жидкости. Источники информации, принятые но внимание при экспертизе I. Авторское свидетельство СССР по заявке 2595302/28-13, кл. С 12 D 13/10, 1978. 2, Авторское свидетельство СССР по заявке 2648462/28-13, ,кл. С 12 D 13/10, 1978 (прототип).