ПРИМЕНЕНИЕ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ ЕЕ СОЛИ И/ИЛИ ТРЕГАЛОЗЫ ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ ЭРГОТИОНЕИНА И КОМПОЗИЦИЯ ЭРГОТИОНЕИНА, СОДЕРЖАЩАЯ ГИАЛУРОНОВУЮ КИСЛОТУ ИЛИ ЕЕ СОЛЬ И/ИЛИ ТРЕГАЛОЗУ Российский патент 2024 года по МПК A61K31/4172 A61K47/26 A61K47/36 A61P39/00 

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Настоящая заявка относится к технической области биохимической промышленности, в частности к применению гиалуроновой кислоты или ее соли и/или трегалозы для стабилизации эрготионеина, и композиции эрготионеина, содержащей гиалуроновую кислоту или ее соль и/или трегалозу.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Эрготионеин (2-меркаптогистидин триметилбетаин) представляет собой редкую аминокислоту с антиоксидантными, UV-защитными (UV - ультрафиолетовое излучение) и восстанавливающими свойствами. Эрготионеин существует во многих животных и растениях и не может быть синтезирован самим организмом животного и может поступать только с пищей. Существует три способа получения эрготионеина: химический синтез, экстракция и микробная ферментация. В связи с проблемами дороговизны и небезопасности при получении эрготионеина способами химического синтеза и экстракции все большее внимание привлекает получение продуктов эрготионеина методом микробной ферментации.

Когда эрготионеин получали путем микробной ферментации, сушка ферментационного бульона эрготионеина обычно представляет собой сушку распылением. Сушка распылением представляет собой способ сушки, при котором распыляется жидкое вещество на капли тумана и диспергируется при высокой температуре, так что влага, содержащаяся в подаваемой жидкости, быстро испаряется. Он обладает характеристиками быстрой теплопередачи, быстрого испарения воды и короткого времени высыхания, а продукт обладает хорошим качеством, ломкой текстурой, и характеристики растворения также хорошие, что может улучшить степень растворения некоторых препаратов. Обычными вспомогательными веществами для сушки распылением являются декстрин, β-циклодекстрин, растворимый крахмал, микропорошковый силикагель, микрокристаллическая целлюлоза, лактоза и мальтодекстрин. При сушке эрготионеина существующим способом сушки распылением эрготионеин легко разрушается, что влияет на выход порошкообразного продукта, полученного при сушке эрготионеина.

СОДЕРЖАНИЕ ЗАЯВКИ

Для решения проблем предшествующего уровня техники в настоящей заявке предложено применение гиалуроновой кислоты или ее соли и/или трегалозы для стабилизации эрготионеина, добавки для стабилизации эрготионеина и композиции. Техническая схема настоящей заявки заключается в следующем:

1. Применение гиалуроновой кислоты или ее соли и/или трегалозы для стабилизации эрготионеина.

2. Применение по п. 1, где гиалуроновую кислоту или ее соль и/или трегалозу применяли для улучшения термостабильности эрготионеина.

3. Применение по п. 1, где молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 3 до 30 кДа, предпочтительно от 3 до 10 кДа.

4. Добавка для стабилизации эрготионеина, содержащая гиалуроновую кислоту или ее соль и/или трегалозу.

5. Добавка по п. 4, содержащая гиалуроновую кислоту или ее соль и трегалозу, и массовое соотношение гиалуроновой кислоты или ее соли к трегалозе составляет от 1:99 до 50:50, предпочтительно от 1:19 до 1:10.

6. Добавка по п. 4, где молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 3 до 30 кДа, предпочтительно от 3 до 10 кДа.

7. Добавка по п. 4, где добавку использовали в качестве вспомогательного вещества для сушки распылением эрготионеинового ферментационного бульона.

8. Композиция, содержащая эрготионеин, гиалуроновую кислоту или ее соль и трегалозу.

9. Композиция по п. 8, где в массовых долях эрготионеин составляет 1 массовую долю, гиалуроновая кислота или ее соль составляет от 20 до 1000 массовых долей, предпочтительно от 100 до 180 массовых долей, трегалоза составляет от 1000 до 1980 массовых долей, предпочтительно от 1800 до 1900 массовых долей.

10. Композиция по п. 8, где молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 3 до 30 кДа, предпочтительно от 3 до 10 кДа.

11. Композиция по п. 8, обладающая антиоксидантным эффектом.

По сравнению с другими вспомогательными веществами, гиалуроновая кислота или ее соль и трегалоза, предложенные в настоящей заявке, могут, очевидно, снизить разрушение эрготионеина, вызванное высокой температурой, и улучшить выход порошковых продуктов эрготионеина. Композиция, полученная согласно настоящему изобретению, обладает лучшим антиоксидантным и антиапоптотическим эффектом. Ингибирующий и захватывающий эффект на внутриклеточные активные формы кислорода композиции, полученной одновременным использованием гиалуроновой кислоты или ее соли и трегалозы в качестве вспомогательных веществ, значительно выше, чем использованием в отдельности гиалуроновой кислоты или ее соли или трегалозы в качестве вспомогательных веществ.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ЗАЯВКИ

Если не указано иное, родственные технические и научные термины в данном описании имеют то же значение, которое обычно понимается специалистами в данной области техники. Хотя способы и вещества, аналогичные или идентичные описанным в настоящем документе, могут быть использованы в экспериментах или практических применениях, вещества и способы описаны ниже. В случае противоречия настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу, и в остальном, вещества, способы и примеры являются иллюстративными, а не ограничивающими. Настоящая заявка будет дополнительно описана ниже со ссылкой на конкретные примеры, но она не предназначена для ограничения объема настоящей заявки.

Экспериментальные способы, используемые ниже, являются общепринятыми способами, если не требуется иное.

Вещества и реагенты, используемые ниже, могут быть получены из коммерческих источников, если не указано иное.

Мацутакэ предпочтительно представляет собой Tricholoma Matsutake SR-LY, который был сохранен в Китайском центре коллекции типовых культур (CCTCC) в Уханьском университете (почтовый индекс 430072), Ухань, Китай, 16 октября 2020 года. Номер сохранения CCTCC №: M 2020587.

Hericium erinaceus предпочтительно представляет собой Hericium erinaceus (Ежовик гребенчатый) с номером сохранения CCTCC №: M 2018567, который был сохранен в Китайском центре коллекции типовых культур (CCTCC) в Уханьском университете, Ухань, Китай (почтовый индекс 430072), 23 августа 2018 года.

Оборудование для сушки распылением представляет собой центробежную или пневматическую распылительную сушилку.

В настоящей заявке предложено применение гиалуроновой кислоты или ее соли и/или трегалозы для стабилизации эрготионеина.

Гиалуроновая кислота (HA) представляет собой природный мукополисахарид, образованный из чередующихся звеньев D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина в линейной цепи. Гиалуроновая кислота проявляет множество важных физиологических функций в организме благодаря своей уникальной молекулярной структуре и физико-химическим свойствам. Самое главное, она обладает особым водоудерживающим эффектом и является лучшим увлажняющим веществом, встречающимся в природе, и известен как идеальный природный увлажняющий фактор (NMF). Кроме того, молекула гиалуроновой кислоты имеет форму жесткой спиральной колонны в пространстве. Внутренняя сторона колонны имеет сильное водопоглощение за счет наличия большого количества гидроксильных групп. С другой стороны, за счет непрерывной ориентации гидроксильных групп на молекулярной цепи гиалуроновой кислоты образуется гидрофобная область, так что гиалуроновая кислота может образовывать трехмерную сетевую структуру.

Трегалоза образуется путем конденсации двух молекул глюкозы через полуацетальную гидроксильную группу. Поскольку нет свободной альдегидной группы, это невосстанавливающий дисахарид. Молекулярная формула C₁₂H₂₂O₁₁ (содержит две кристаллической воды). Поскольку две молекулы глюкозы могут образовывать α-глюкопиранозу и β-глюкопиранозу, через α-1,1-гликозидную связь могут быть получены три изомера: трегалоза (α, α), изотрегалоза (β, α, β) и неотрегалоза (α, β). Поскольку трегалоза обладает уникальными биологическими функциями, она может эффективно поддерживать стабильность и целостность внутриклеточной биологической мембраны, белков и активных пептидов в неблагоприятных условиях. Он считается "сахаром жизни" и может широко использоваться в биологических препаратах, медикаментах, продуктах питания, продуктах для здоровья, тонких химикатах, косметике, кормах и сельскохозяйственной науке и других отраслях промышленности.

В конкретном варианте осуществления гиалуроновую кислоту или ее соль и/или трегалозу применяли для улучшения термостабильности эрготионеина. При этом соль гиалуроновой кислоты представляет собой по меньшей мере одну, выбранную из группы, состоящей из: соли натрия, соли калия, соли магния, соли цинка, соли кальция или соли четвертичного аммония.

Эрготионеин (2-меркаптогистидин триметилбетаин) представляет собой редкую аминокислоту с антиоксидантными, UV-защитными и восстанавливающими свойствами. Эрготионеин существует во многих животных и растениях и не может быть синтезирован самим организмом животного и может поступать только с пищей.

Когда эрготионеин получали путем микробной ферментации, сушка ферментационного бульона эрготионеина обычно осущестсяется сушкой распылением. Среди них сушка распылением представляет собой способ сушки, при котором жидкое вещество распыляется на капли тумана и диспергируется при высокой температуре, так что влага, содержащаяся в подаваемой жидкости, может быстро испаряться. Он обладает характеристиками быстрой теплопередачи, быстрого испарения воды и короткого времени высыхания, а продукта обладает хорошим качеством, ломкой текстурой, и растворимость также хорошая, и степень растворения некоторых препаратов может быть улучшена. Однако эрготионеин легко повреждается при высокой температуре, что в конечном итоге влияет на выход порошка эрготионеина, полученного при сушке.

В настоящей заявке предложена добавка для стабилизации эрготионеина, причем добавка содержит гиалуроновую кислоту или ее соль и/или трегалозу. То есть, добавка может представлять собой гиалуроновую кислоту или ее соль, трегалозу или комбинацию гиалуроновой кислоты или ее соли и трегалозы в любой пропорции. При этом соль гиалуроновой кислоты представляет собой по меньшей мере одну, выбранную из группы, состоящей из: соли натрия, соли калия, соли магния, соли цинка, соли кальция или соли четвертичного аммония.

В конкретном варианте осуществления добавка содержит гиалуроновую кислоту или ее соль и трегалозу. Массовое соотношение гиалуроновой кислоты или ее соли к трегалозе составляет от 1:99 до 50:50, например, 1:99, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:19, 1:10, предпочтительно от 1:19 до 1:10.

В конкретном варианте осуществления молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли в добавке составляет от 3 до 30 кДа, например, она может составлять 3 кДа, 5 кДа, 10 кДа, 15 кДа, 20 кДа, 25 кДа, 30 кДа, предпочтительно от 3 до 10 кДа.

В конкретном варианте осуществления добавку применяли в качестве вспомогательного вещества для сушки распылением эрготионеинового ферментационного бульона. При этом эрготионеиновый ферментационный бульон может представлять собой ферментационный бульон любых существующих микроорганизмов из уровня техники. Например, эрготионеиновый ферментационный бульон мацутакэ, Hericium erinaceus и др.

Предпочтительно распыление представляет собой центробежную или пневматическую сушку распылением, температура воздуха на входе составляет от 150 до 200°С, а температура воздуха на выходе составляет от 50 до 100°С.

Предпочтительно к эрготионеин-содержащему ферментационному бульону добавляли от 1 до 30% (мас./об., г/мл) вспомогательных веществ.

В настоящей заявке также предложена композиция, содержащая эрготионеин, гиалуроновую кислоту или ее соль и трегалозу. Композиция обладает лучшим антиоксидантным и антиапоптотическим эффектом. Ингибирующий и захватывающий эффект на внутриклеточные активные формы кислорода композиции, полученной одновременным использованием гиалуроновой кислоты или ее соли и трегалозы в качестве вспомогательных веществ, значительно выше, чем использованием в отдельности гиалуроновой кислоты или ее соли или трегалозы в качестве вспомогательных веществ. При этом гиалуронат представляет собой по меньшей мере одну, выбранную из группы, состоящей из: соли натрия, соли калия, соли магния, соли цинка, соли кальция или соли четвертичного аммония.

В конкретном варианте осуществления в композиции массовое соотношение эрготионеина, гиалуроновой кислоты или их соли составляет 1:(от 20 до 1000):(от 1000 до 1980). Например, она может составлять 1:20:1000, 1:20:1500, 1:20:1980, 1:100:1000, 1:100:1500, 1:100:1980, 1:500:1000, 1:500:1500, 1:500:1980, 1:1000:1000, 1:1000:1500, 1:1000:1980. В массовых долях, эрготионеин составляет 1 массовую долю, гиалуроновая кислота или ее соль составляет от 20 до 1000 массовых долей, например, 20 массовых долей, 50 массовых долей, 100 массовых долей, 300 массовых долей, 500 массовых долей, 700 массовых долей, 1000 массовых долей, предпочтительно от 100 до 180 массовых долей. Трегалоза составляет от 1000 до 1980 массовых долей, например, 1000 массовых долей, 1100 массовых долей, 1200 массовых долей, 1300 массовых долей, 1500 массовых долей, 1700 массовых долей, 1800 массовых долей, 1980 массовых долей, предпочтительно от 1800 до 1900 массовых долей. В конкретном варианте осуществления молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли в композиции составляет от 3 до 30 кДа, например, 3 кДа, 5 кДа, 10 кДа, 15 кДа, 20 кДа, 25 кДа, 30 кДа, предпочтительно от 3 до 10 кДа.

Применение гиалуроновой кислоты или ее соли и/или трегалозы в настоящей заявке может значительно улучшить стабильность эрготионеина, и особенно в процессе сушки распылением эрготионеинового ферментационного бульона оно может значительно уменьшить разрушение эрготионеина, вызванное высокой температурой. При использовании определенной доли гиалуроновой кислоты или ее соли в качестве вспомогательных веществ для сушки распылением при обработке эрготионеинового ферментационного бульона полученная композиция, содержащая эрготионеин, гиалуроновую кислоту или ее соль и трегалозу, обладает превосходным антиоксидантным и антиапоптотическим эффектом. Особенно когда массовое соотношение гиалуроновой кислоты или ее соли к трегалозе в композиции составляет от 1:19 до 1:10, эффект ингибирования и захвата активных форм кислорода является наилучшим.

Следующие примеры настоящей заявки используются только для иллюстрации конкретных вариантов осуществления настоящей заявки, и эти варианты осуществления не следует истолковывать как ограничивающие настоящую заявку. Любые другие изменения, модификации, замены, комбинации и упрощения, сделанные без отступления от сущности и принципа настоящей заявки, рассматриваются как эквивалентные способы замены и подпадают под объем защиты настоящей заявки.

ПРИМЕРЫ

Настоящая заявка будет дополнительно описана ниже в сочетании с примерами, и следует понимать, что примеры используются только для дальнейшего объяснения и иллюстрации настоящей заявки и не предназначены для ограничения настоящей заявки.

Экспериментальные способы, используемые в следующих примерах, являются общепринятыми способами, если не требуется иное.

Вещества, реагенты и т.д., используемые в следующих примерах, могут быть получены из коммерческих источников, если не указано иное.

Пример 1 Оптимизация получения композиции эрготионеина (ферментация мацутакэ)

Жидкая затравочная среда: 3,0% (масс./об.) лактозы, 2,0% (масс./об.) экстракта картофеля, 0,1% (масс./об.) гидрофосфата калия, 0,1% (масс./об.) сульфата натрия, остальное представляет собой воду, pH 4,0-4,5, стерилизованную при 121°C в течение 20 мин;

Ферментационная среда: 3,0% (масс./об.) глюкозы, 2,0% (масс./об.) мальтозы, 1,0% (масс./об.) говяжьего экстракта, 1,5% (масс./об.) триптона, 0,06% (масс./об.) дигидрофосфата натрия, 0,0003% (масс./об.) хлорида цинка, 0,0005% (масс./об.) ниацина, 0,0001% (масс./об.) витамина B₁, остальное представляет собой воду, pH 4,0~4,5, стерилизованную при 121°C в течение 20 минут.

Мицелиальные скошенные штаммы мацутакэ (TricholomaMatsutake) CCTCC №: M 2020587 инокулировали в жидкую затравочную среду и культивировали в течение 25 дней в условиях 23°C и при встряхивании 200 об/мин с получением затравочной жидкости мацутакэ. Затравочную жидкость инокулировали в ферментационную среду при инокуляте 5% по объему и культивировали в течение 25 дней в условиях 23°С и при встряхивании 200 об/мин, а вещества-предшественники цистеин, метионин и бетаин добавляли на 20-й день культивирования, каждый при 5 мМ, с получением ферментационного бульона. После ферментации ферментационный бульон мицелия гомогенизировали при 8000 об/мин в течение 30 мин с использованием машины для гомогенизации и эмульгирования. Затем, фильтрованием через тонкий фильтрующий картон 1,2 мкм и стерилизацией фильтрованием с помощью фильтрующего элемента из 0,22 мкм простого полиэфирсульфона, можно получить эрготионеин-содержащий раствор.

5% (масс./об., г/мл) мальтодекстрина, микрокристаллической целлюлозы, гиалуронат натрия 3 кДа, гиалуронат натрия 5 кДа, гиалуронат натрия 10 кДа, гиалуронат натрия 15 кДа, гиалуронат натрия 30 кДа, полиглутамат натрия 50 кДа, фукозу, маннит,

-циклодекстрин, лактозу, трегалозу и декстрин добавляли в ферментационный бульон отдельно, хорошо перемешивали и распыляли с помощью центробежной распылительной сушилки. Температура воздуха на входе, используемого при сушке распылением, составляла 180°C, а температура воздуха на выходе составляла 90°C. Полученный порошок представлял собой эрготионеин-содержащую композицию. Результаты содержания эрготионеина в каждой композиции приведены в таблице 1.

Таблица 1 Содержание эрготионеина, полученное при использовании различных вспомогательных веществ во время распыления Образец Вспомогательное вещество Содержание эрготионеина в композиции Образец C1 Мальтодекстрин 0,158% Образец C2 Микрокристалическая целлюлоза 0,151% Образец C3 Гиалуронат натрия (5 кДа) 0,167% Образец C4 Полиглутамат натрия 0,159% Образец C5 Фукоза 0,159% Образец C6 Маннит 0,158% Образец C7 β-циклодекстрин 0,157% Образец C8 Лактоза 0,155% Образец C10 Декстрин 0,154% Образец C11 Гиалуронат натрия (3 кДа) 0,168% Образец C12 Гиалуронат натрия (10 кДа) 0,169% Образец C13 Гиалуронат натрия (15 кДа) 0,165% Образец C14 Гиалуронат натрия (30 кДа) 0,167%

Эрготионеин неизбежно разрушается при высокотемпературном распылении. Как видно из результатов в таблице 1, в композиции, полученной с использованием гиалуроната натрия и трегалозы в качестве вспомогательных веществ, содержание эрготионеина составляет 0,167%, 0,168%, 0,169%, 0,165%, 0,167% и 0,168%, соответственно, что значительно выше, чем содержание порошков, полученных из нескольких других обычно используемых вспомогательных веществ для распыления. Это показывает, что гиалуронат натрия и трегалоза могут значительно уменьшить разрушение, вызванное высокой температурой, по сравнению с другими вспомогательными веществами.

Пример 2 Оптимизация получения композиции эрготионеина (ферментация Hericium erinaceus)

Жидкая затравочная среда: 4,0% (масс./об.) сахароза, 1,5% (масс./об.) порошок соевого жмыха, 0,2% (масс./об.) дигидрофосфата натрия, 0,1% (масс./об.) сульфата натрия, а остальное представляет собой воду, pH от 4,0 до 4,5, стерилизованную при 121°C в течение 20 минут;

Ферментационная среда: 3,0% (масс./об.) глюкозы, 1,5% (масс./об.) говяжьего экстракта, 0,05% (масс./об.) дигидрофосфата натрия, 0,03% (масс./об.) сульфата натрия, 0,0003% (масс./об.) хлорида цинка, 0,0006% (масс./об.) ниацина, 0,0001% (масс./об.) витамина B1, а остальное представляет собой воду, pH от 4,0 до 4,5, стерилизованную при 121°C в течение 20 мин.

Мицелиальные скошенные штаммы hericium erinaceus CCTCC №: M 2018567 инокулировали в жидкую затравочную среду и культивировали в течение 7 дней в условиях 23°С и при встряхивании 200 об/мин с получением затравочной жидкости hericium erinaceus. Затравочную жидкость инокулировали в ферментационную среду в количестве 5% по объему и культивировали в течение 10 дней в условиях 23°С и при встряхивании 200 об/мин, при этом вещества-предшественники цистеин, метионин и бетаин добавляли на 5-й день культивирования, каждый по 5 мМ, с получением ферментационного бульона. После ферментации ферментационный бульон мицелия гомогенизировали при 8000 об/мин в течение 30 мин с использованием машины для гомогенизации и эмульгирования. Затем, фильтрованием через тонкий фильтрующий картон 1,2 мкм и стерилизацией фильтрованием с помощью фильтрующего элемента из 0,22 мкм простого полиэфирсульфона, можно получить эрготионеин-содержащий раствор. 5% (масс./об., г/мл) мальтодекстрина, микрокристаллическую целлюлозу, гиалуронат натрия 3 кДа, гиалуронат натрия 5 кДа, гиалуронат натрия 10 кДа, гиалуронат натрия 15 кДа, гиалуронат натрия 30 кДа, полиглутамат натрия 50 кДа, фукозу, маннит,

-циклодекстрин, лактозу, трегалозу и декстрин добавляли в ферментационный бульон отдельно, хорошо перемешивали и распыляли с помощью центробежной распылительной сушилки. Температура воздуха на входе, используемая при распылительной сушке, составляла 180°С, а температура воздуха на выходе составляла 90°С. Полученный порошок представлял собой эрготионеин-содержащую композицию. Результаты содержания эрготионеина в каждой композиции приведены в таблице 2.

Таблица 2. Содержание эрготионеина, полученное при использовании различных вспомогательных веществ во время распыления Образец Вспомогательное вещество Содержание эрготионеина в композиции Образец D1 Мальтодекстрин 0,365% Образец D2 Микрокристалическая целлюлоза 0,353% Образец D3 Гиалуронат натрия (5 кДа) 0,392% Образец D4 Полиглутамат натрия 0,362% Образец D5 Фукоза 0,361% Образец D6 Маннит 0,364% Образец D7 β-циклодекстрин 0,359% Образец D8 Лактоза 0,355% Образец D9 Трегалоза 0,395% Образец D10 Декстрин 0,360% Образец D11 Гиалуронат натрия (3 кДа) 0,394% Образец D12 Гиалуронат натрия (10 кДа) 0,394% Образец D13 Гиалуронат натрия (15 кДа) 0,395% Образец D14 Гиалуронат натрия (30 кДа) 0,392%

Как видно из результатов, приведенных в таблице 2, с использованием hericium erinaceus для ферментации, в композиции, полученной с использованием гиалуроната натрия и трегалозы в качестве вспомогательных веществ, содержание эрготионеина также значительно выше, чем содержание порошка, полученного с использованием нескольких других обычно используемых вспомогательных веществ для распыления. Это показывает, что гиалуронат натрия и трегалоза могут значительно облегчить повреждение тионеина, вызванное высокой температурой во время распыления.

Пример 3 Оптимизация соотношения гиалуроновой кислоты к трегалозе

Из результатов Примера 1 и Примера 2 видно, что как гиалуронат натрия, так и трегалоза оказывают хороший стабилизирующий эффект на эрготионеин. Среди них гиалуронат натрия обладает хорошим увлажняющим, противовоспалительным и прочими эффектами, но цена относительно высока, поэтому с целью снижения затрат, и в то же время получения композиции с лучшим увлажняющим, противовоспалительным и прочими эффектами, рассматривалось применение гиалуроната натрия (5 кДа) и трегалозы с различными соотношениями в качестве вспомогательных веществ для распыления. При этом, используя ферментационный бульон из Примера 1, во время распылительной сушки ферментационного бульона смесь гиалуроната натрия и трегалоалуроната использовали в качестве вспомогательных веществ, причем массовое соотношение гиалуроната натрия к трегалоалуронату корректировали от 1:99 до 50:50. Также при добавлении вспомогательных веществ в количестве 5% (мас./об., г/мл) от ферментационного бульона и при использовании тех же условий работы распылительной сушки, что и выше, содержание эрготионеина в полученной композиции приведено в таблице 3.

Таблица 3. Образец Массовое соотношение гиалуроната натрия к тотрегалозе Содержание эрготионеина в композиции Образец S1 1:99 0,168% Образец S2 2:98 0,168% Образец S3 3:97 0,169% Образец S4 5:95 0,168% Образец S5 10:90 0,167% Образец S6 15:85 0,168% Образец S7 20:80 0,167% Образец S8 30:70 0,168% Образец S9 50:50 0,167%

Из приведенной выше таблицы видно, что применение гиалуроната натрия и трегалозы в качестве вспомогательного вещества при массовом соотношении от 1:99 до 50:50 может эффективно уменьшить разрушение эрготионеина, вызванное высокой температурой во время распыления. Однако, когда молекулярная масса гиалуроната натрия превышает 10 кДа, выход порошка, полученного распылением, слегка снижается из-за большой молекулярной массы и высокой вязкости, поэтому молекулярная масса гиалуроната натрия предпочтительно составляет от 3 до 10 кДа.

Пример 4 Антиоксидантная активность композиции

1. Активность на образование активных форм кислорода

Получение раствора образца: образцы C3, C9, S1-9, полученные в вышеупомянутых примерах, готовили в 0,1% (мас./об., г/мл) растворах с бессывороточной культуральной средой DMEM, соответственно, и образец S4 получали в концентрациях растворов 0,05% (мас./об., г/мл), 0,1% (мас./об., г/мл), 0,2% (мас./об., г/мл) и 0,3% (мас./об., г/мл) и стерилизовали фильтрованием через фильтрующую мембрану 0,22 мкм.

(1) Испытание на поглощение активных форм кислорода

Получение раствора зонда дихлорфлуоресцеиндиацетата (DCFH-DA): DCFH-DA разбавляли раствором PBS (0,1 M, pH 7,4) путем добавления 0,375 мкл к 1 мл PBS.

Клетки HaCaT в логарифмической фазе роста отбирали и инокулировали в 12-луночный культуральный планшет с плотностью 5×10⁴ клеток/мл, с 2 мл клеточной суспензии на лунку, и помещали в инкубатор с диоксидом углерода при 37°С и 5% CO₂ в течение 24 часов обычной культуры. Они работали в группах следующим образом:

(1) В группе облучения отбрасывали 1 мл культуральной среды, покрывали полиэтиленовой пленкой, облучали UVA (ультрафиолетовое излучение в области А) с интенсивностью 2000 мкВт/см2 в течение 2-3 ч и облучали UVB (ультрафиолетовое излучение области B) с интенсивностью 700 мкВт/см² в течение 7 мин; после облучения отбрасывали старый культуральный раствор и добавляли по 2 раствора каждого образца, по 2 мл в каждую лунку;

(2) В группе модели повреждений операция была такой же, как и в группе облучения. После облучения старую культуральную среду отбрасывали и добавляли бессывороточную культуральную среду по 2 мл в каждую лунку;

(3) Нормальную контрольную группу культивировали обычным способом, и среду заменяли в то же время, что и среду в группе облучения, и добавляли бессывороточную культуральную среду по 2 мл в каждую лунку;

Затем, после культивирования в течение 16 часов, всю культуральную среду отбрасывали и дважды промывали PBS (фосфатно-солевой буферный раствор). 1,5 мл раствора DCFH-DA добавляли в каждую лунку, и их помещали в клеточный инкубатор и продолжали инкубировать в течение 30 минут, и хорошо перемешивали каждые 5 минут, чтобы зонды связывались. Раствор зонда отбрасывали, их дважды промывали бессывороточной средой и в каждую лунку добавляли 1 мл бессывороточной среды и инкубировали при 37°С в течение 10 мин. После однократной промывки PBS клетки расщепляли трипсином, дважды промывали PBS, ресуспендировали в 300 мкл PBS и детектировали с помощью проточного цитометра с использованием двух каналов. Перед загрузкой в машину ячейки фильтровали. Через канал FL1-H отбирали 1000 клеток для каждого образца. В соответствии с данными сигнала, полученными в канале 1 (FL1-H) (т.е. интенсивность флуоресценции или общая флуоресценция, генерируемая DCF (дихлорфлуоресцеин)), рассчитывали степень захвата ROS (активные формы кислорода). Захват ROS рассчитывали по средней интенсивности флуоресценции:

Степень захвата ROS % = (1 - средняя интенсивность флуоресценции экспериментальной группы/средняя интенсивность флуоресценции контрольной группы)×100%

(2) Испытание ингибирования активных форм кислорода

Клетки HaCaT в логарифмической фазе роста отбирали и инокулировали в 12-луночный культуральный планшет с плотностью 4×10⁴ клеток/мл, с 2 мл клеточной суспензии на лунку, и помещали в инкубатор с диоксидом углерода при 37°С и 5% CO₂ в течение 24 часов обычной культуры.

Старую культуральную среду отбрасывали, раствор образца добавляли в экспериментальную группу, бессывороточную культуральную среду добавляли в нормальную контрольную группу, по 2 мл в каждую лунку, и культуру продолжали в течение 24 часов до облучения. Нормальную контрольную группу покрывали алюминиевой фольгой и не подвергали облучению.

В группе облучения отбрасывали 1 мл культуральной среды, покрывали полиэтиленовой пленкой, облучали UVA с интенсивностью 2000 мкВт/см² в течение 1 ч, облучали UVB с интенсивностью 700 мкВт/см² в течение 3 мин, а нормальную контрольную группу не облучали. Среду отбрасывали и дважды промывали PBS. 1,5 мл DCFH-DA добавляли в каждую лунку, и их помещали в клеточный инкубатор и продолжали инкубировать в течение 30 мин, и хорошо перемешивали каждые 5 мин, чтобы зонд полностью связывался. Зонды отбрасывали, их дважды промывали предварительно нагретой бессывороточной средой и в каждую лунку добавляли 1 мл бессывороточной среды и инкубировали при 37°С в течение 10 мин. После однократной промывки PBS клетки расщепляли трипсином, дважды промывали PBS, ресуспендировали в 300 мкл PBS и обнаруживали с помощью проточного цитометра с использованием двух каналов (клетки необходимо фильтровать перед загрузкой в аппарат). Через канал FL1-H отбирали 10000 клеток для каждого образца. В соответствии с данными сигнала, полученными в канале 1 (FL1-H) (т.е. интенсивность флуоресценции или общая флуоресценция, генерируемая DCF), рассчитывали степень захвата ROS. Поглощение ROS рассчитывали по средней интенсивности флуоресценции:

Степень ингибирования ROS % = (1 - средняя интенсивность флуоресценции экспериментальной группы/средняя интенсивность флуоресценции контрольной группы)×100%

Полученные результаты степени захвата ROS и степени ингибирования каждого образца приведены в таблице 4 и таблице 5.

Таблица 4: Эффекты образцов при концентрации 0,1% на образование активных форм кислорода (ROS) Образец C3 C9 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 Степень захвата ROS (%) 18,35 19,22 25,33 24,97 29,05 32,04 32,47 29,56 25,03 24,89 25,17 Степень ингибирования ROS (%) 9,48 9,33 14,86 14,21 17,11 19,37 19,69 17,04 14,34 14,11 14,56

Таблица 5: Эффект различных концентраций образца на образование активных форм кислорода (ROS) Концентрация образца 0,05 0,1 0,2 0,3 Степень захвата ROS (%) 20,19 32,43 26,71 23,15 Степень ингибирования ROS (%) 10,01 19,28 16,71 17,45

Из результатов, приведенных в таблице 4, видно, что композиция эрготионеина, полученная по настоящей заявке, обладает хорошим антиоксидантным эффектом, а ингибирующий и захватывающий эффект на внутриклеточные активные формы кислорода композиции, полученной при одновременном использовании гиалуроната и трегалозы в качестве вспомогательных веществ, значительно больше, чем у композиции, полученной при использовании в отдельности гиалуроната или трегалозы в качестве вспомогательного вещества, и когда добавляли гиалуронат и трегалозу в соотношении от 1:19 до 1:10, ингибирующий и захватывающий эффект на активные формы кислорода является наиболее очевидным. Из результатов в таблице 5 видно, что образец S4 находится в диапазоне концентраций 0,01%, 0,05%, 0,1% и 0,2%, а эрготионеин оказывает самый сильный ингибирующий и захватывающий эффект на внутриклеточные активные виды кислорода, вызванные UV-повреждением, при концентрации 0,1%. Степень ингибирования и поглощения составляет 19,28% и 32,43%, соответственно. Как при более низких, так и при более высоких концентрациях эффективность ингибирования и захвата снижается.

2. Испытание на поглощение свободных радикалов DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом)

Вышеподготовленный образец S4 растворяли в воде с получением растворов с конечными концентрациями 0,05% (масс./об.), 0,1% (масс./об.), 0,2% (масс./об.) и 0,3% (масс./об.) для применения. Точно измеряли 5,0 мл раствора 1,1-дифенил-2-тринитрофенилгидразина (DPPH) и 5,0 мл раствора образца S5 с различными концентрациями, помещали в пробирки с пробками и хорошо перемешивали. Для установки нуля использовали равный объем 95% смеси этанол/вода. Его помещали при комнатной температуре на 30 минут, и значение поглощения раствора измеряли при 523 нм, с 3 повторениями для каждой концентрации; другую группу устанавливали для точного измерения 5,0 мл раствора DPPH для смешивания с 5,0 мл очищенной воды, в качестве холостого контроля, и процесс был такой же, как указано выше. Способ расчета следующий:

Степень поглощения ROS (%) = (1 - значение поглощения образца/значение поглощения холостого контроля)×100%

Полученные результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6 Результаты активности поглощения свободных радикалов DPPH образцов с различными концентрациями Концентрация образца (%) 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Степень захвата свободных радикалов DPPH (%) 19,35 37,01 51,65 74,80 86,46 88,14

Из результатов в таблице 6 видно, что с увеличением концентрации композиции степень захвата свободных радикалов DPPH также увеличивается. Когда концентрация композиции составляет 0,3%, степень захвата может достигать 74,80%, а когда концентрация составляет 0,5%, степень захвата достигает 88,14%.

Пример 5 Оценка антиапоптотической эффективности композиции

Подготовка раствора образца: образец S4 подготавливали в растворах в концентрациях 0,1% (масс./об.), 0,3% (масс./об.) и 0,5% (масс./об.) с бессывороточной культуральной средой, соответственно, и стерилизовали фильтрованием через фильтрующую мембрану 0,22 мкм.

(1) Эффект восстановления испытуемого образца на апоптоз из-за UVB облучения

Планшет: отбирали клетки HaCaT в логарифмической фазе роста и расщепляли трипсином. Затем плотность клеток доводили до 1×10⁶ клеток/мл, и клетки инокулировали в 6-луночный планшет для культивирования клеток с 2 мл клеточной суспензии на лунку и помещали в инкубатор с диоксидом углерода при 37°С, 5% CO₂ для обычной культуры в течение ночи.

Облучение: открывали крышку 6-луночного планшета, покрывали планшет полиэтиленовой пленкой и облучали клетки HaCaT 70 мДж/см² UVB (400 мкВт 3 мин). Тестовые группы были показаны в таблице 7:

Таблица 7 Группирование эффекта восстановления испытуемых образцов на апоптоз из-за UVB облучения Группа Способы лечения Нормальная группа Без облучения, добавление бессывороточной среды Модельная группа После UVB облучения, добавление бессывороточной среды Испытуемая группа После UVB облучения, добавление различных концентраций растворов образцов эрготионеина

Добавление лекарственного средства: после облучения культуральную среду отбрасывали, в каждую лунку испытуемой группы добавляли 2 мл растворов образца различных концентраций, и такое же количество культуральной среды добавляли к нормальной группе и модельной группе, и их помещали в инкубатор для продолжения культивирования.

Обнаружение: после культивирования в течение 24 часов клетки в 6-луночных планшетах каждой группы собирали, и старую культуральную среду пипетировали в EP-пробирки (пробирка Эппендорфа). Клетки промывали один раз PBS, добавляли трипсин для расщепления, а затем старую культуральную среду добавляли для прекращения расщепления. Их собирали в вышеуказанные EP-пробирки, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут и отбрасывали супернатант. После двух промываний предварительно охлажденным PBS клетки ресуспендировали 1 связывающим буфером, плотность клеток доводили до 1×10⁶ клеток/мл и 100 мкл клеточной суспензии переносили в новую 1,5 мл EP-пробирку. В соответствии с инструкциями по набору добавляли 5 мкл окрашивающего раствора аннексина V-FITC (V-флуоресцеинизотиоцианат) и PI (пропидий йодид) соответственно, осторожно смешивали, инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте и детектировали с помощью проточной цитометрии.

(2) Защитный эффект испытуемого образца от апоптоза из-за UVB облучения

Планшет: отбирали клетки HaCaT в логарифмической фазе роста и расщепляли трипсином. Затем плотность клеток доводили до 1×10⁶ клеток/мл, и клетки инокулировали в 6-луночный планшет для культивирования клеток с 2 мл клеточной суспензии на лунку и помещали в инкубатор с диоксидом углерода при 37°С, 5% CO₂ для обычной культуры в течение ночи.

Добавление лекарственного средства: старую культуральную среду отбрасывали, в каждую лунку для испытуемой группы добавляли 2 мл растворов образца различных концентраций, и такое же количество культуральной среды добавляли к нормальной группе и модельной группе, и их помещали в инкубатор для продолжения культивирования.

Облучение: открывали крышку 6-луночного планшета, покрывали планшет полиэтиленовой пленкой и облучали клетки HaCaT 70 мДж/см² UVB (400 мкВт 3 мин). Тестовые группы были показаны в таблице 8:

Таблица 8 Группирование защитного эффекта испытуемых образцов от апоптоза из-за UVB облучения Группы Способы лечения Нормальная группа Добавление бессывороточной среды, без облучения Модельная группа После добавления бессывороточной среды, UVB облучение Испытуемая группа После добавления различных концентраций растворов образцов эрготионеина, UVB облучение

Обнаружение: после культивирования в течение 24 часов после облучения клетки в 6-луночных планшетах каждой группы собирали, и старую культуральную среду пипетировали в EP-пробирки. Клетки промывали один раз PBS, добавляли трипсин для расщепления, а затем старую культуральную среду добавляли для прекращения расщепления. Их собирали и переносили в вышеуказанные EP-пробирки, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут и отбрасывали супернатант. После двух промываний предварительно охлажденным PBS клетки ресуспендировали 1 раз связывающим буфером, плотность клеток доводили до 1×10⁶ клеток/мл и 100 мкл клеточной суспензии переносили в новую 1,5 мл EP-пробирку. В соответствии с инструкциями по набору добавляли 5 мкл окрашивающего раствора аннексина V-FITC и PI соответственно, осторожно смешивали, инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте и детектировали с помощью проточной цитометрии.

В нормальных клетках фосфатидилсерин (PS) распределяется только во внутренней стороне липидного бислоя клеточной мембраны, тогда как на ранней стадии апоптоза фосфатидилсерин (PS) в клеточной мембране поворачивается изнутри наружу липидной мембраны. Аннексин V представляет собой Ca²⁺-зависимый фосфолипидсвязывающий белок с молекулярной массой 35-36 кДа. Он обладает высоким сродством к фосфатидилсерину, поэтому он может связываться с клеточной мембраной ранних апоптотических клеток через фосфатидилсерин, находящийся снаружи клетки. Пропидий йодид (PI) представляет собой краситель нуклеиновой кислоты, который не может проникать через полную клеточную мембрану, но для клеток на средней и поздней стадиях апоптоза и мертвых клеток PI может проникать через клеточную мембрану и окрашивать ядро в красный цвет. Таким образом, согласованное применение аннексина V и PI может различать клетки на разных стадиях апоптоза.

Результаты приведены в таблице 9. Независимо от того, контактировал ли он с образцом до UV-повреждения или контактировал с образцом после повреждения UV облучением, ингибирующий эффект образца S4 в концентрации 0,1% является самым сильным, а с увеличением концентрации антиапоптотический эффект уменьшается

Таблица 9 Эффект S4 на апоптоз клеток HaCaT из-за UV-повреждения Концентрация образца (%) 0,05 0,1 0,2 0,3 Степень ингибирования апоптоза из-за защитного эффекта (%) 6,05 8,28 4,41 5,29 Степень ингибирования апоптоза из-за восстанавливающего эффекта (%) 21,31 34,22 27,63 19,81

Группа изобретений относится к композициям эрготионеина. Раскрыто применение гиалуроновой кислоты или ее соли и/или трегалозы для стабилизации эрготионеина, где гиалуроновую кислоту или ее соль и/или трегалозу применяют для улучшения термостабильности эрготионеина, и где молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 3 до 30 кДа. Также раскрыты добавка для стабилизации эрготионеина и композиция эрготионеина. Группа изобретений обеспечивает уменьшение разрушения эрготионеина при высокой температуре, увеличивая выход порошкового продукта эрготионеина. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 9 табл., 5 пр.

1. Применение гиалуроновой кислоты или ее соли и/или трегалозы для стабилизации эрготионеина, где гиалуроновую кислоту или ее соль и/или трегалозу применяют для улучшения термостабильности эрготионеина, и где молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 3 до 30 кДа.

2. Применение по п. 1, где молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 3 до 10 кДа.

3. Добавка для стабилизации эрготионеина, где добавка содержит гиалуроновую кислоту или ее соль и трегалозу, где массовое соотношение гиалуроновой кислоты или ее соли к трегалозе составляет от 1:99 до 50:50, и где молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 3 до 30 кДа.

4. Добавка по п. 3, где массовое соотношение гиалуроновой кислоты или ее соли к трегалозе составляет от 1:19 до 1:10.

5. Добавка по п. 3, где молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 3 до 10 кДа.

6. Добавка по п. 3, использующаяся в качестве вспомогательного вещества для сушки распылением эрготионеинового ферментационного бульона.

7. Композиция эрготионеина, содержащая эрготионеин, гиалуроновую кислоту или ее соль и трегалозу, где в массовых долях эрготионеин составляет 1 массовую долю, гиалуроновая кислота или ее соль составляет от 20 до 1000 массовых долей, трегалоза составляет от 1000 до 1980 массовых долей, и молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 3 до 30 кДа.

8. Композиция по п. 7, где в массовых долях эрготионеин составляет 1 массовую долю, гиалуроновая кислота или ее соль составляет от 100 до 180 массовых долей, трегалоза составляет от 1800 до 1900 массовых долей.

9. Композиция по п. 7, где молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 3 до 10 кДа.

10. Композиция по п. 7, обладающая антиоксидантным эффектом.