Устройство и способ исследования локомоторной активности рыбы Российский патент 2024 года по МПК A01K63/00 A01K61/00 

Группа изобретений относится к области нейробиологии, в частности, к устройству и способу исследования локомоторной активности рыбы.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рыба зебраданио (лат. Danio rerio), упоминаемая в уровне техники также как зебрафиш, Данио рерио - вид небольших пресноводных костных рыб южно-азиатского происхождения из семейства карповых (лат. сем. Cyprinidae), средний размер тела которой составляет около 3,3 см. Зебраданио является хорошим модельным организмом для научных биомедицинских исследований и получила большую популярность у исследователей за счёт неприхотливости к условиям содержания, малых размеров и короткого срока полового созревания при относительно большой продолжительности жизни: 3 месяца и 3 года, соответственно.

Высокая гомология генов и нейротрансмиттерных путей между зебраданио и другими позвоночными животными позволяет транслировать результаты исследования между видами. Более того, современные технологические возможности позволили создавать адекватные модели заболеваний человека у рыб зебраданио. Таким образом, зебраданио на сегодняшний день становится популярной моделью среди позвоночных животных для изучения неврологических расстройств человека и разработки лекарственных препаратов. Их плодовитость, простота и скорость разведения, генетическая гомология и оптическая прозрачность личинок стали ключевыми факторами для выбора этой модели для самых разнообразных исследований.

Зебраданио обладает консервативными физиологическими механизмами и системами, а также сходством с человеческими основных молекулярных мишеней (примерно на 85%), клеток, тканей и органов [1]. Многие анатомические характеристики и работа большинства сигнальных систем зебраданио сходны с таковыми у человека и млекопитающих [4]. Геном зебраданио имеет высокую (примерно 70%) гомологию с геномом человека [5], а более 80% генов, ассоциированных с болезнями человека, имеют как минимум один ортолог у зебраданио [6-8].

На сегодняшний день наблюдается значительный рост количества экспериментальных исследований с использованием зебраданио в нейробиологии, однако на данный момент не существует достаточно чувствительных тестов для оценки моторных функций животного. Нарушение моторных функций может служить ярким маркером изменения моноаминового обмена [9], травм головного [10] и спинного [11] мозга, симптомом психиатрических заболеваний [12].

Исследование локомоторной активности (скорости, частоты поворотов) входит в батарею классических поведенческих тестов зебраданио [13], однако готовых решений для определения моторной координации рыб ранее представлено не было.

Анализ уровня техники и поиск общедоступных источников информации выявил следующие ближайшие аналоги предлагаемой группы изобретений.

Из уровня техники известно техническое решение из непатентного документа
П.А. Куликов «Долговременная непрерывная компьютерная регистрация и анализ двигательной активности группы рыбок Данио рерио», Bull Exp Biol Med. 2023 Май;175(1):106-111. doi: 10.1007/s10517-023-05820-3 . Epub 2023 от 19 июня [14]. В соответствии с источником информации разработан новый алгоритм долговременной непрерывной компьютерной регистрации и анализа двигательной активности группы рыбок данио рерио в домашнем аквариуме. Движения группы рыбок Данио рерио в течение всего светового периода и в течение нескольких дней регистрируются с частотой 1 кадр/сек в виде коротких (15 мин) файлов. Затем эти файлы анализируются уникальным программным обеспечением DanioStudio, которое, используя пороговый алгоритм и соответствующие маски, вычисляет для каждого кадра сумму пикселей, связанных с рыбой (сумма силуэтов рыб), а для двух последовательных кадров - сумму измененных пикселей (сумма измененных силуэтов рыб). Рассчитываются следующие показатели: скорость изменения суммы силуэтов как отношение суммы измененных силуэтов к сумме силуэтов (1) и время, проведенное в выбранной области домашнего аквариума, как отношение суммы силуэтов в этой области к сумме силуэтов во всем аквариуме (2). Средняя скорость изменения силуэта коррелирует с длиной пути, пройденного рыбой, и, следовательно, служит правильным показателем двигательной активности группы рыб. С помощью этих алгоритмов были получены совершенно новые данные: было показано, что двигательная активность рыб остается постоянной на протяжении всего светового периода, но зависит от размера домашнего аквариума. Предлагаемый подход совместно с программным обеспечением DanioStudio может быть эффективным при изучении динамики изменений в поведении рыб при длительном воздействии короткого светового дня, лекарств и токсичных веществ.

Недостатком известного из уровня техники решения является то, что невозможно оценить направленное движение рыбы в определенном направлении, а также оценить уровень утомляемости животного и его вынужденную, а не спонтанную локомоцию.

Из уровня техники известен способ неинвазивной прижизненной оценки физиологического состояния рыб (взятый за прототип) по патентному документу RU 2596498, дата публикации: 10.09.2016 [15]. При реализации способа фотографируют один из функциональных элементов организма рыбы при естественном освещении, получают цветное изображение этого органа (плавник) и проводят определение цветовых координат в выбранной цветовой модели пространства L*a*b. Преобразуют полученное изображение, применяя цветовой профиль, сгенерированный для данных условий освещения с помощью цветовой шкалы X-rite ColorCheker Passport и сохраняют его в формате TIFF 16 бит на канал. В пространстве L*a*b производят измерение цветовых координат, усредненных по всей поверхности плавника в канале *а, полученные значения сравнивают со значениями нормы, определенными для данного вида рыбы, сезона, местности. При этом значения, превышающие показатели нормы, указывают на болезненное состояние исследуемого животного, перенесение им стресса. Изобретение позволяет проводить неинвазивный прижизненный мониторинг состояния рыб.

Недостатком известного изобретения является то, что указанное изобретение не относится к приборам для оценки локомоторной активности рыб в лабораторных условиях, а также не предполагает изменение этих условий в ходе эксперимента, а представляет собой метод мониторинга рыб в естественных условиях.

В результате проведенного анализа уровня техники можно сделать вывод о том, что предлагаемая группа изобретений может быть признана соответствующей критериям патентоспособности «Новизна» и «Изобретательский уровень» до даты испрашиваемого приоритета.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для устранения недостатков имеющихся аналогов и прототипа, заявителем предложены устройство и способ исследования локомоторной активности рыб. Группа изобретений объединена единым изобретательским замыслом.

Целью предлагаемых технических решений является создание устройства и способа, обеспечивающего достоверное прижизненное исследование моторной координации рыб, локомоторной активности зебраданио, их способности к обучению и утомляемости.

Существует потребность в разработке новых более эффективных устройств и способов исследования локомоторной активности живых рыб.

Технический результат заявленной группы изобретений, которая объединена единым изобретательским замыслом, заключается в следующем:

- в повышении эффективности исследования локомоторной активности рыб, в частности живых рыб зебраданио, используемых в качестве модельного организма для исследования психиатрического состояния у людей;

- увеличение полноты и объемов исследования травм головного и спинного мозга;

- расширение оперативных возможностей использования в экспериментах на рыбах теста локомоторной активности при исследовании травм спинного мозга и реабилитации под воздействием фармацевтических препаратов или других механизмов лечения при проведении in vivo прижизненных исследований;

- увеличение полноты и объемов исследования влияний лекарственных молекул и изменения функций нервной системы при использовании тех или иных лекарственных препаратов на модельном организме (рыбах);

- проведение тестов на формирование долговременной и кратковременной памяти на основе получения стимула к активности в виде постоянного электрического тока при нахождении в опасной для зебраданио зоне;

- обеспечение получения достоверных результатов исследований моторной координации рыб, в частности зебраданио, их способности к обучению и утомляемости;

- проведение теста на утомляемость особи под действием постоянного динамического движения воды от устройства для создания потока воды;

- устранения недостатков, имеющихся у аналогов и прототипа;

- расширение арсенала средств для проведения экспериментов на живых рыбах, например, на рыбе зебраданио.

Каждое из представленных технических решений можно адаптировать под изучение влияния фармакологических и других методов воздействия на рыбах.

Заявленное устройство может обеспечивать динамическое исследование локомоторных функций рыбы после воздействия тех или иных инвазивных или не инвазивных методов на рыбах.

Использование группы изобретений позволяет повысить надежность проведения исследований по изучению локомоторной активности объекта исследования и упростить технику прижизненных исследований рыбы.

ОБЪЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящей группе изобретений описаны устройство и способ исследования локомоторной активности рыб.

Указанный технический результат достигается совокупностью существенных признаков, представленной в формуле изобретения.

Для достижения технического результата заявлено устройство для исследования локомоторной активности рыбы, в частности, половозрелой особи рыбы Danio rerio, включающее:

аквариум, в котором установлен прибор в форме, например, симметричной трубы/желоба с двумя отверстиями на противоположных концах для постоянной циркуляции воды внутри прибора, желоб (например, это может быть труба) содержит третье отверстие в верхней части для помещения рыбы в прибор;

- насос, обеспечивающий направленный напор воды внутри прибора;

- два электрода, обеспечивающие подачу постоянного тока внутри прибора и установленные с противоположной стороны от насоса;

- при этом прибор размечен на зоны: безопасная, в которой отсутствует воздействие постоянного тока, и опасная, в которой происходит воздействие постоянным током;

- безопасная зона прибора находится ближе к насосу и разграничена от опасной зоны, которая находится ближе к электродам, полупроницаемой для воды системой изоляции, защищающей рыбу от соприкосновения с электродами.

Ещё в одном примере реализации изобретения в устройстве дополнительно установлена камера для видеосъемки.

Ещё в одном примере реализации изобретения в устройстве дополнительно установлено сенсорное устройство, регистрирующие местоположение рыбы внутри прибора.

Ещё в одном примере реализации изобретения устройство содержит насос, который выполнен с возможностью регулирования напора воды внутри прибора

Ещё в одном примере реализации изобретения в устройстве дополнительно установлена защита рыбы от электродов. Это полупроницаемая для воды система изоляции рыбы от электродов выполнена в виде сетки, решетки или другой перегородки с отверстиями, обеспечивающей беспрепятственное прохождение через нее воды, но не рыбы.

Ещё в одном примере реализации изобретения устройство содержит полупроницаемую для воды систему изоляции рыбы от электродов, которая выполнена из пластмасс (поливинилхлорид (ПВХ), полиэтилен (ПЭТ), полипропилен), полиамида (капрон, нейлон), полиэфира (акрил, полиэфирный шелк, лавсан), или их комбинации.

Ещё в одном примере реализации изобретения устройство в качестве источника постоянного тока содержит генератор, с которым соединены два электрода.

Ещё в одном примере реализации изобретения устройство содержит электроды, которые выполнены из олова или серебра.

Ещё в одном примере реализации изобретения желоб, входящий в состав устройства, выполнены с возможностью свободного передвижения рыбы вдоль, но не поперек прибора.

Также технический результат достигается за счет того, что предложен способ исследования локомоторной активности рыб с помощью вышеуказанного устройства, при котором осуществляют следующие стадии:

- помещают рыбу в прибор в форме желоба;

- обеспечивают напор воды внутри прибора с помощью насоса;

- обеспечивают подачу постоянного тока внутри прибора с противоположной стороны от насоса;

- при заплыве рыбы в опасную зону происходит воздействие постоянным током, а при заплыве рыбы в безопасную зону отключают воздействие постоянного тока.

Ещё в одном примере реализации изобретения осуществляют запись с помощью камеры для видеосъемки или фиксируют нахождение рыбы в зонах и ее поведение визуально.

Ещё в одном примере реализации изобретения во время видеосъемки рыба не подвергается воздействию постоянного тока.

Ещё в одном примере реализации изобретения обеспечивают напряжение в приборе в диапазоне от 0 до 20 В, например, 1,78-2,2 В.

Ещё в одном примере реализации изобретения при заплыве рыбы в опасную зону происходит воздействие постоянным током, а при заплыве рыбы в безопасную зону отключают воздействие постоянного тока, при этом исследование повторяется в течение 5-10 минут.

Ещё в одном примере реализации изобретения исследование длится 5-10 дней.

Ещё в одном примере реализации изобретения в последний день исследования регистрируют местонахождение рыбы в приборе при отключенном электрическом токе, определяя в какой зоне находится рыба в опасной или безопасной.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР, ТАБЛИЦ, ИНЫХ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Изобретение иллюстрируются следующими графическими материалами.

На фигуре 1 - устройство для исследования локомоторной активности рыбы (общий вид);

На фигуре 2 - устройство для исследования локомоторной активности рыбы (вид сверху);

На фигуре 3 - устройство для исследования локомоторной активности рыбы (вид сбоку);

На фигурах 1-3 обозначены:

1 - аквариум;

2 - устройства для создания потока воды (например, фильтр, насос);

3 - труба/желоб (от 10 см до 30 см длина, от 5 см до 10 см высота);

4 - цветное покрытие дна трубы/желоба (разделение на опасную (красную) и безопасную (желтую) зоны);

5 - соединение трубы и выходного отверстия устройства для создания потока воды;

6 - съемная сетка, отделяющая рабочую опасную зону от электродов для подачи электрического тока;

7 - электроды (2 шт);

8 - выходное отверстие трубы;

9 - разъем для подключения к источнику питания;

10 - отверстия для электродов.

На фигуре 4 показано снижение суммарной длительности нахождения в красной зоне, свидетельствующее об обучении рыб избеганию опасной зоны. Тест Манна-Уитни, **- р< 0.01.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения и общая терминология.

Далее будут приведены ссылки на определенные варианты осуществления изобретения, примеры которых проиллюстрированы предлагаемым способом и устройством. Подразумевается, что изобретение охватывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в объем настоящего изобретения, как определено в формуле изобретения.

Специалисту в данной области известны многие способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, которые могут быть использованы при практическом осуществлении настоящей группы изобретений.

Настоящее изобретение не ограничивается изложенными в данном документе способами и материалами. В случае, если один или несколько из включенных литературных ссылок, патентов и аналогичных материалов отличается от или противоречит данной заявке, включая, в частности, определенные термины, использование терминов, описанные приемы и т.п., преимущественную силу имеет настоящая заявка.

Далее следует принять во внимание, что определенные признаки изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления изобретения, могут быть представлены также совместно в одном варианте. И наоборот, разнообразные признаки изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления изобретения, могут быть представлены отдельно или в любой подходящей подкомбинации.

Если представлен диапазон значений, то следует понимать, что каждое промежуточное значение, до десятых долей единицы нижнего предела, если из контекста явно не следует иное между верхней и нижней границами этого диапазона и любые другие указанные или промежуточные значения в этом установленном интервале охватываются настоящим изобретением. Верхние и нижние пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны, что также входит в объем изобретения, с учетом любого конкретно исключенного предела в указанном диапазоне. Когда указано, что диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие любое из обоих включенных пределов, также входят в объем изобретения.

Все публикации, патенты и заявки на патенты включены в настоящий документ посредством ссылки. Хотя в вышеприведенном описании это изобретение было описано в отношении некоторых предпочтительных вариантов его осуществления, и многие детали были изложены в целях иллюстрации, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что изобретение допускает дополнительные варианты осуществления и что некоторые детали, описанные в данном документе, могут значительно изменяться без отклонения от сущности изобретения.

Использование терминов в единственном числе в контексте описания изобретения должно толковаться как охватывающее как единственное, так и множественное число, если иное не указано в данном документе или явно не противоречит контексту.

Термины «состоящий из», «имеющий», «включающий» и «содержащий» следует толковать как неограничивающие термины, т.е. означающие «включая, но не ограничиваясь», если не указано иное.

Использование любых и всех примеров или иллюстративного языка (например, «такой как»), представленных в данном документе, предназначено просто для лучшего описания изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если иное не заявлено.

Никакие формулировки в описании не следует истолковывать как указывающие на какой-либо не заявленный элемент как существенный для практического применения изобретения.

Здесь описаны варианты осуществления этого изобретения, включая лучший из известных изобретателям способа осуществления изобретения. Разновидности этих вариантов осуществления могут стать очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения предшествующего описания. Авторы ожидают, что квалифицированные специалисты будут использовать такие варианты в зависимости от обстоятельств, и авторы предполагают, что изобретение будет реализовано на практике иначе, чем конкретно описано в данном документе. Соответственно, это изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты признаков, изложенных в прилагаемой формуле изобретения, как это разрешено действующим законодательством. Более того, любая комбинация вышеописанных признаков во всех их возможных вариациях охватывается изобретением, если иное не указано в данном документе или иным образом явно не противоречит контексту.

Для описания настоящего изобретения используются следующие термины.

Все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют такое значение, какое обычно понимается специалистами в области, к которой относится изобретение, если не указано иное. Все патенты и публикации, на которые имеются ссылки в данном документе, полностью включены в изобретение посредством ссылки.

Сокращения, используемые в настоящем описании, включая приведенные в иллюстративных схемах и последующих примерах, хорошо известны среднему специалисту. Некоторые из сокращений используют как нижеследующие:

Danio rerio - костная рыба зебраданио. В настоящей группе изобретений для проведения исследований были отобраны взрослые полосатые короткоплавниковые зебраданио (Danio rerio) дикого типа возрастом 6-8 месяцев.

В - вольт, в Международной системе единиц (СИ) единица измерения электрического потенциала, разности потенциалов, электрического напряжения и электродвижущей силы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ

Заявленные устройство и способ исследования локомоторной активности рыб включают размещение исследуемой живой рыбы Danio rerio в желоб или трубу устройства, включение устройства для создания потока воды с возможностью регулировать напор воды, подачу электрического тока для стимулирования плавания рыбы, наблюдение за поведением исследуемой рыбы с помощью камеры.

Представленный процесс заключается в том, что для зебраданио, как живого объекта, эффективнее прибиться к стенке, не позволяющей ей выбраться из аквариума под действием напора воды, исходящим от устройства для создания потока воды. При воздействии стимула в виде двух электродов, помещенных в конец усеченного прямоугольного устройства, на которые подается постоянный ток, способно приводить зебраданио в движение, чтобы избежать неблагоприятного для рыбы удара током, что заставляет ее плыть против напора воды. Таким образом, при захождении в безопасную зону происходит отключение постоянного тока, и рыба обучается тому, что захождение в безопасную зону благоприятно для нее, в то время, как в зоне, где происходит удар током, неблагоприятно для зебраданио.

В течение 5-10 дней происходит обучение рыбы поставленной задаче, благодаря чему возможно провести измерение ее локомоторной активности с помощью установленных камер. Во время съемки зебраданио не подвергается воздействию постоянного тока, поэтому исключается воздействие исследователя на процесс и результаты, полученные в ходе исследования, будут отвечать высокой достоверности.

Одной из сопутствующих физиологических характеристик можно изучать утомляемость зебраданио, которая наблюдается после длительного воздействия потока воды и ударов электрическим током при заплывании в опасную зону. Изучение этой физиологической реакции на избыточную локомоторную активность можно проводить с помощью записывания поведения с помощью установленной камеры.

Среди технических признаков установки можно рассмотреть использование механизма, позволяющего создавать направленный поток воды с изменяемой силой напора, что позволяет адаптировать условия эксперимента под конкретную особь. Таким образом, на устройстве для создания потока воды можно изменять скорость потока воды под конкретные условия поставленной задачи в эксперименте, чтобы добиться необходимых данных по изучению локомоторной активности, как и обучаемости и утомляемости каждой зебраданио.

Среди записывающих устройств можно выделить камеры.

В качестве источника обучающих стимулов использовался генератор постоянного тока для обучения зебраданио избегать опасную зону с меньшим напором воды и направить ее движение в зону с повышенным напором воды, чтобы качественно оценить локомоторную активность особи.

Все представленные технические признаки были интегрированы в одно комплексное техническое решение, которое эргономично используется для изучения локомоторной активности и не способно наносить повреждения и травмы зебраданио.

Одной из возможных задач настоящего технического решения является создание оптимального устройства, способного измерить локомоторную активность половозрелой особи зебраданио в условиях продолжительной динамической активности рыбы в предлагаемом изобретении. Специалисту в данной области техники понятно, что данное изобретение может решать и другие технические задачи, например, проводить исследования на других видах рыб разных размеров и форм. Также возможно проводить исследования по обучаемости рыб, в том числе длительной и кратковременной памяти, поведения отчаяния. Возможно изучение такой физиологической реакции на длительную двигательную активность, как утомляемость особи.

Один общий пример заявленного устройства, неограничивающий реализации заявленного технического решения, может состоять из устройства подачи воды под регулируемым напором, который подает достаточный поток рециркулирующей воды в аквариуме для проведения теста на исследование локомоторной активности зебраданио. Устройство также состоит из узкого прямоугольного аквариума, в который помещается исследуемая половозрелая особь зебраданио, разделенного на две зоны, безопасной, занимающей две трети аквариума, выстланного желтой несъедобной, нелиняющей и не токсичной поверхностью, сигнализирующей рыбе о зоне без стимула в виде постоянного электрического тока, а также из опасной зоны, выстланной красной несъедобной, нелиняющей и не токсичной поверхностью, сигнализирующей рыбе о зоне со стимуляцией к двигательной активности в виде постоянного электрического тока. Стимулом к подаче постоянного электрического тока, который включается во время заплывания в опасную зону, является генератор постоянного электрического тока, сообщающийся с исследовательским прямоугольным усеченным аквариумом с помощью двух стальных электродов, помещенных в конец аквариума (опасную зону), где наблюдается пониженная скорость напора воды. Для понижения травматического повреждения зебраданио об оголенные электроды в опасной зоне прямоугольного аквариума была помещена сетка, сплетенная из нетоксичных и безопасных для рыб нитей, чтобы не допустить попадание зебраданио в область нахождения электродов. Прибор помещается в глубокий аквариум, который является источником воды для фильтрационной установки и подачи постоянного напора воды в симметричном желобе (также это может быть труба или малый прямоугольный аквариум), в котором находится исследуемая особь зебраданио.

Для проведения эксперимента необходимо с помощью сачка поместить рыбу в желоб с включенным напором воды и во время попадания особи в опасную красную зону включить источник постоянного тока для создания болевого стимула для обучения рыбы, заставляющего ее выйти в безопасную желтую зону, после чего необходимо выключить источник постоянного тока. Ежедневное повторение этих процедур в течение определенного времени способно выработать у зебраданио устоявшегося фенотипа, избегающего попадание в красную опасную зону без включения постоянного источника тока.

Специалисту в области техники понятно, что возможны различные вариации источника постоянного направленного потока воды с изменяемым напором для достижения поставленных задач в ходе эксперимента по изучению локомоторной активности половозрелой особи зебраданио. В том числе возможно применение насосных установок для прокачивания воды через малый аквариум, как и другие фильтрационные установки.

Специалисту в области техники понятно, что возможно уменьшение в размерах, как удлинение, так и укорочении желоба (а также трубы или малого, например, усеченного, прямоугольного аквариума), в который помещается зебраданио. Также возможны изменения в покрытии на дне этого аквариума, чтобы фиксировать необходимые физиологические реакции или отслеживать местоположение рыбы.

Специалисту в области техники понятно, что можно применять различные источники тока, в том числе и переменного тока, чтобы достичь того же принципа работы установки, что и на постоянном токе. Также очевидно, что можно менять электроды, передающие ток в малый аквариум. Например, использование оловянных, серебряных или других металлов в качестве электродов.

Специалисту в области техники понятно, что можно заменить сетку для защиты зебраданио от травматизации от контакта с электродами на другие приспособления. Например, пластмассовые перекрытия с множеством пор, через которые вода способна уходить без формирования обратных потоков.

В используемом устройстве были определены основные характеристики, заключающиеся в применении напряжения в диапазоне от 0 до 20 В в приборе (например, 2,2 В в опасной зоне). Были проведены измерения, показавшие, что в опасной (красной) зоне сразу после сетки, предохраняющей рыбу от травматизации, напряжение было в диапазоне от 0 до 20 В в приборе (например, 1,78 В в опасной зоне после сетки). В середине малого аквариума напряжение было в диапазоне от 0 до 20 В в приборе (например, 0,6 В в безопасной зоне), а в начале прибора было в диапазоне от 0 до 20 В (например, 0,2 В в желтой (безопасной) зоне). Поэтому необходимо отключать источник постоянного тока во время захождения особи зебраданио в безопасную (желтую) зону для формирования ассоциативного обучения.

В ранее представленных аналогах не была представлена система, сопровождающаяся выявлением локомоторной активности рыб посредством направленного потока воды в аквариуме. Специалисту в области техники понятно, что представленная установка предназначена для проведения не инвазивных манипуляций по исследованию локомоторной активности на особи зебраданио. Ранее не была использована закрытая водная система на зебраданио в качестве устройства для исследования локомоторной активности рыбы. В том числе ранее не применяли механизм защиты особи зебраданио от электродов в виде сетки из нитей, понижающей травматизацию рыб. Новым приемом является применение зебраданио в качестве модели спинномозговых травм для изучения и коррекции локомоторной активности у особей.

Предлагается устройство для не инвазивного исследования локомоторной активности, утомляемости и обучаемости рыбы зебраданио, содержащее усеченный прямоугольный аквариум, состоящий из двух прямоугольных симметричных пластиковых пластин одинаковой длины и ширины, соединенных с двумя пластиковыми пластинами той же длины, но меньшей ширины, выполняющих роль основания и крыши аквариума. В верхней пластине имеется возможность контролировать открывать или закрывать аквариум для различных целей, в том числе присутствуют два отверстия для электродов.

В передней части аквариума имеется круглый вход, к которому подсоединена фильтрационная установка, через который проходит направленный поток воды.

В задней части аквариума после сетки из нитей и электродов располагается круглый выход, через который выходит поток воды из фильтрационной установки.

Фильтрационная установка, выполняющая роль постоянного источника направленного напора воды, способная изменять скорость и силу потока с помощью ручной манипуляции.

На фиг. 1 показан общий вид устройства исследования локомоторной активности рыбы.

На фиг. 2 показан вид сверху устройства исследования локомоторной активности рыбы.

На фиг. 3 показан вид сверху устройства исследования локомоторной активности рыбы.

Последовательность реализации заявленного способа может быть представлена следующим образом:

1. Включение устройства для подачи потока воды, обеспечивают напор воды внутри прибора с потоком, направленным в сторону выходного отверстия разработанного прибора.

2. Помещение рыбы в аквариум (в прибор в форме трубы или желоб) с помощью сачка, избегая механического воздействия на тело рыбы, сдавливания.

3. Во время всего тестирования исследователь непрерывно наблюдает за перемещение исследуемого животного внутри прибора. Обеспечивают подачу постоянного тока с напряжением в диапазоне от 0 до 20 В внутри прибора с противоположной стороны от устройства для создания потока воды. В опасной красной зоне сразу после сетки, предохраняющей рыбу от травматизации, напряжение было в диапазоне от 0 до 20 В. В середине малого аквариума в безопасной желтой зоне напряжение было в диапазоне от 0 до 20 В, а в начале желтой зоны в диапазоне от 0 до 20 В. Таким образом, исследования локомоторной активности рыб в опасной зоне устройства применяют напряжение в диапазоне от 0 до 20 В, предпочтительно от 1,78 В до 2,2 В. В безопасной зоне устройства применяют напряжение в диапазоне от 0 до 20 В, предпочтительно от 0 В до 0,2 В. Для формирования ассоциативного обучения необходимо отключать источник постоянного тока во время захождения особи зебраданио в желтую безопасную зону.

4. При заплыве рыбы в опасную зону животное подвергается воздействию постоянным током, а при заплыве рыбы в безопасную зону отключают воздействие постоянного тока. Данная процедура повторяется в течение всего времени тестирования (5-10 минут) для формирования устойчивого поведения избегания опасной зоны прибора.

5. Обучение рыб проводится в течение 5-7 дней, после чего проводится контрольное тестирование животного при отключенном электрическом токе.

Сущность и промышленная применимость заявленной группы изобретений поясняются следующими примерами, ни в коей мере не уменьшая притязания по формуле изобретения во всех частных формах воплощения признаков.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Были проведены исследования локомоторной активности рыбы представленным способом (далее - способ) на взрослых полосатых короткоплавниковых зебраданио (Danio rerio) дикого типа возрастом 6-8 месяцев. Исследуемые рыбы поодиночке помещались в заявленное устройство (далее - устройство) на 5 - 10 минут в течение 5 - 10 дней. Эксперимент проводился в дневное время.

Было проведено исследование поведения рыбы Danio rerio № 1 (возраст 6 месяцев) с помощью заявленной устройства (далее - устройство) для исследования локомоторной активности рыбы вышеуказанным способом.

Устройство для исследования локомоторной активности рыбы, включает:

- аквариум, в котором установлен прибор в форме симметричной трубы/желоба с двумя отверстиями на противоположных концах для постоянной циркуляции воды внутри прибора, труба/желоб содержит третье отверстие в верхней части для помещения рыбы в прибор;

- насос, обеспечивающий направленный напор воды внутри прибора;

-два электрода, обеспечивающие подачу постоянного тока внутри прибора и установленные с противоположной стороны от насоса;

- при этом прибор размечен на зоны: безопасная, в которой отсутствует воздействие постоянного тока, и опасная, в которой происходит воздействие постоянным током;

- безопасная зона прибора находится ближе к насосу и разграничена от опасной зоны, которая находится ближе к электродам, полупроницаемой для воды системой изоляции, защищающей рыбу от соприкосновения с электродами.

Прибор помещается в глубокий аквариум, который является источником воды для фильтрации и подачи постоянного напора воды. Прибор представляет собой симметричный желоб или малый прямоугольный аквариум, в который помещается исследуемая особь зебраданио.

Для проведения эксперимента необходимо с помощью сачка поместить рыбу в прибор (представляющий собой желоб или малый аквариум с включенным напором воды с помощью фильтра) и во время попадания исследуемой особи в опасную красную зону прибора включить источник постоянного тока для создания болевого стимула для обучения рыбы, заставляющего ее выйти в безопасную желтую зону прибора, после чего необходимо выключить источник постоянного тока. Ежедневное повторение этих процедур в течение определенного времени способно выработать у зебраданио устоявшийся фенотип, поведение, избегающее попадание в красную опасную зону даже без включения постоянного источника тока.

Напряжение электрического тока, которое подавалось при заходе рыбы в опасную красную зону, составляло 1,78 В. Напряжение электрического тока, которое подавалось при заходе рыбы в безопасную желтую зону, составляло 0 В.

Последовательность стадий исследования локомоторной активности рыбы следующая:

1. Включают устройство для подачи потока воды (фильтр), обеспечивают напор воды внутри прибора с потоком, направленным в сторону выходного отверстия разработанного прибора.

2. Помещают рыбу № 1 в аквариум (в прибор в форме трубы или желоб) с помощью сачка, избегая механического воздействия на тело рыбы, сдавливания.

3. Во время всего тестирования исследователь непрерывно наблюдает за перемещение исследуемого животного внутри прибора.

Таким образом, исследования локомоторной активности рыб в опасной зоне устройства применяют напряжение в диапазоне от 0 до 20 В, например, от 1,78 В. В безопасной зоне устройства применяют минимальное напряжение, близкое или равно 0 В. Для формирования ассоциативного обучения необходимо отключать источник постоянного тока во время захождения особи зебраданио в желтую безопасную зону.

4. При заплыве рыбы в опасную красную зону рыба подвергается воздействию постоянным током, а при заплыве рыбы в безопасную желтую зону отключают воздействие постоянного тока. Данная процедура повторяется в течение всего времени тестирования (5 минут, 300 секунд) для формирования устойчивого поведения избегания опасной зоны прибора.

5. Исследование (обучение) рыбы № 1 проводилось в течение 7 дней, после чего проводилось контрольное тестирование исследуемой рыбы при отключенном электрическом токе.

Поведение рыбы № 1 фиксировалось видеокамерой, находящейся сверху установки.

Для валидации методики поведение рыбы № 1 фиксировалось до обучения и на 8й день, после ежедневного обучения в течение 7 дней.

Полученные видеозаписи поведения рыбы № 1 анализировали вручную с помощью программы RealTimer. Подсчитывали количество и суммарную продолжительность (с) заходов в красную и желтую зону. Данные обрабатывали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,05 (общие результаты для группы исследованных рыб отображены на Фиг.4).

В результаты исследования было обнаружено, что рыба № 1 проводит меньше времени в опасной красной зоне после обучения в течение 7 дней, по сравнению с продолжительностью заходов в красную зону до обучения.

Пример 2

Было проведено исследование поведения рыбы Danio rerio № 2 (возраст 7 месяцев) с помощью заявленной устройства для исследования локомоторной активности рыбы и способом, описанными в примере 1.

Отличием является то, что:

- Напряжение электрического тока, которое подавалось при заходе рыбы № 2 в опасную красную зону, составляло 1,5 В. Напряжение электрического тока, которое подавалось при заходе рыбы в безопасную желтую зону, составляло 0 В.

- При заплыве рыбы № 2 в опасную красную зону рыба подвергается воздействию постоянным током, а при заплыве рыбы в безопасную желтую зону отключают воздействие постоянного тока. Данная процедура повторяется в течение всего времени тестирования (6 минут, 360 с) для формирования устойчивого поведения избегания опасной зоны прибора.

- Исследование (обучение) рыбы № 2 проводилось в течение 6 дней, после чего проводилось контрольное тестирование исследуемой рыбы при отключенном электрическом токе.

Полученные видеозаписи поведения рыбы № 2 также анализировали вручную с помощью программы RealTimer. Подсчитывали количество и суммарную продолжительность (с) заходов в красную и желтую зону. Данные обрабатывали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р< 0.05.

В результате исследования было обнаружено, что рыба № 2 также проводит меньше времени в опасной красной зоне после обучения в течение 6 дней, по сравнению с продолжительностью заходов в красную зону до обучения.

Пример 3

Было проведено исследование поведения рыбы Danio rerio № 3 (возраст 8 месяцев) с помощью заявленной устройства для исследования локомоторной активности рыбы и способом, описанными в примере 1.

Отличием является то, что:

- Напряжение электрического тока, которое подавалось при заходе рыбы № 3 в опасную красную зону, составляло 2,2 В. Напряжение электрического тока, которое подавалось при заходе рыбы в безопасную желтую зону, составляло 0 В.

- При заплыве рыбы № 3 в опасную красную зону рыба подвергается воздействию постоянным током, а при заплыве рыбы в безопасную желтую зону отключают воздействие постоянного тока. Данная процедура повторяется в течение всего времени тестирования (10 минут, 600 с) для формирования устойчивого поведения избегания опасной зоны прибора.

- Исследование (обучение) рыбы № 3 проводилось в течение 5 дней, после чего проводилось контрольное тестирование исследуемой рыбы при отключенном электрическом токе.

Полученные видеозаписи поведения рыбы № 3 также анализировали вручную с помощью программы RealTimer. Подсчитывали количество и суммарную продолжительность (с) заходов в красную и желтую зону. Данные обрабатывали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р< 0,05.

В результате исследования было обнаружено, что рыба № 3 также проводит меньше времени в опасной красной зоне после обучения в течение 5 дней, по сравнению с продолжительностью заходов в красную зону до обучения.

Пример 4

Было проведено исследование поведения рыбы Danio rerio № 4 (возраст 8 месяцев) с помощью заявленной устройства для исследования локомоторной активности рыбы и способом, описанными в примере 1.

Отличием является то, что:

- Напряжение электрического тока, которое подавалось при заходе рыбы № 4 в опасную красную зону, составляло 1,5 В. Напряжение электрического тока, которое подавалось при заходе рыбы в безопасную желтую зону, составляло 0 В.

- При заплыве рыбы № 4 в опасную красную зону рыба подвергается воздействию постоянным током, а при заплыве рыбы в безопасную желтую зону отключают воздействие постоянного тока. Данная процедура повторяется в течение всего времени тестирования (8 минут, 480 с) для формирования устойчивого поведения избегания опасной зоны прибора.

- Исследование (обучение) рыбы № 4 проводилось в течение 10 дней, после чего проводилось контрольное тестирование исследуемой рыбы при отключенном электрическом токе.

Полученные видеозаписи поведения рыбы № 4 также анализировали вручную с помощью программы RealTimer. Подсчитывали количество и суммарную продолжительность (с) заходов в красную и желтую зону. Данные обрабатывали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р< 0,05.

В результате исследования было обнаружено, что рыба № 4 также проводит меньше времени в опасной красной зоне после обучения в течение 10 дней, по сравнению с продолжительностью заходов в красную зону до обучения.

Резюмируя вышеприведенное, были проведены исследования локомоторной активности рыбы представленным способом на взрослых полосатых короткоплавниковых зебраданио (Danio rerio) дикого типа возрастом 6-8 месяцев. Общее количество исследованных рыб - 24. Исследуемые рыбы поодиночке помещались в заявленное устройство на 5 - 10 минут в течение 5 - 10 дней.

В используемом устройстве были определены основные характеристики, заключающиеся в применении напряжения в диапазоне от 0 до 20 В. Были проведены измерения, показавшие, что в опасной красной зоне сразу после сетки, предохраняющей рыбу от травматизации, напряжение было в диапазоне от 0 до 20 В (например, 1,78 В). В середине малого аквариума в безопасной зоне напряжение было в диапазоне от 0 до 20 В (например, 0,6 В), а в начале желтой зоны было в диапазоне от 0 до 20 В (например, 0,2 В). Поэтому необходимо отключать источник постоянного тока во время захождения особи зебраданио в желтую безопасную зону для формирования ассоциативного обучения.

На Фиг. 4 показано снижение суммарной длительности времени нахождения рыб в опасной красной зоне, свидетельствующее об обучении рыб избеганию опасной зоны. Тест Манна-Уитни, **- р< 0,01.

В результаты исследования локомоторной активности рыб заявленным способом с помощью предложенного устройства было обнаружено, что при 5 - 10-дневном обучении рыбы демонстрируют поведение избегания опасной зоны, что может свидетельствовать об обучаемости рыб в данном тесте, что позволяет использовать данный способ и устройство для исследования обучаемости рыб, памяти, поведения отчаяния, а также оценки общей локомоторной активности взрослых рыб зебраданио.

Эквиваленты.

Специалистам в данной области будут очевидны, или они смогут достоверно установить при помощи обычных экспериментальных методик, многочисленные эквиваленты конкретных вариантов реализации, описанные в настоящем документе. Предполагается, что такие эквиваленты входят в объём охраны следующей формулы изобретения.

Резюмируя вышесказанное, группа изобретений может быть признана соответствующей критерию патентоспособности «Промышленная применимость» во всех частных формах воплощения признаков формулы изобретения до даты испрашиваемого приоритета.

Источники литературы:

1. Кротова Н.А., Лакстыгал А.М., Таранов А.С., Ильин Н.П., Бытов М.В., Волгин А.Д. и др. «Зебраданио (zebrafish) как новая перспективная модель в трансляционной нейробиологии». Российский физиологический журнал им И.М. Сеченова. 2019;105(11):1417-1435.

2. Галстян Д.С., Колесникова Т.О., Косицын Ю.М., Забегалов К.Н., Губайдуллина М.А., Маслов Г.О. и др. «Моделирование и оценка судорожной активности у зебраданио (Danio rerio)». Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2022;20(2):193-9.

3. Державина К.А., Ильин Н.П., Серединская М.В., Неруш М.О., Захарченко К.В., Сорокин Д.В. и др. «Зебраданио (zebrafish) как модель редких (орфанных) заболеваний нервной системы». Российский журнал персонализированной медицины. 2022;2(2):17-32.

4. Калуев А.В. «Принципы моделирования заболеваний мозга и их терапии на зебраданио (zebrafish)». Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2022;2(2):119-122.

5. Lowery L.A., De Rienzo G., Gutzman J.H., Sive H. «Characterization and classification of zebrafish brain morphology mutants». Anat Rec. 2009;292(1):94-106.

6. Howe K., Clark MD, Torroja C.F., Torrance J., Berthelot C., Muffato M., et al. «The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome». Nature. 2013;496(7446):498-503.

7. Kalueff A.V., Stewart A.M., Gerlai R.. «Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders». Trends Pharmacol Sci. 2014;35(2):63-75.

8. Burgess H.A., Burton E.A. «A critical review of zebrafish neurological disease models-1». The premise: neuroanatomical, cellular, and genetic homology, and experimental tracta- bility. Oxford Open Neuroscience. 2023.

9. Fuxe K., Hökfelt T. and Ungerstedt U., 1970. «Morphological and functional aspects of central monoamine neurons». In International review of neurobiology (Vol. 13, pp. 93-126). Academic Press.

10. Fujimoto S.T., Longhi L., Saatman K.E. and McIntosh T.K., 2004. «Motor and cognitive function evaluation following experimental traumatic brain injury». Neuroscience & biobehavioral reviews, 28(4), pp.365-378.

11. Dimitrijević M.R., 1988. «Residual motor functions in spinal cord injury». Advances in neurology, 47, pp.138-155.

12. Peralta V. and Cuesta M.J., 2017. «Motor abnormalities: from neurodevelopmental to neurodegenerative through “functional” (neuro) psychiatric disorders». Schizophrenia bulletin, 43(5), pp.956-971.

13. Iturriaga-Vásquez P., Osorio F., Riquelme S., Castro S. and Herzog R., 2012. «Zebrafish: a model for behavioral pharmacology». Farmacología de Chile, 5, pp.27-32.

14. П.А. Куликов «Долговременная непрерывная компьютерная регистрация и анализ двигательной активности группы рыбок Данио рерио», Bull Exp Biol Med. 2023 Май;175(1):106-111. doi: 10.1007/s10517-023-05820-3. Epub 2023 от 19 июня.

15. Патентный документ RU 2596498 (Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Уральский научно-практический центр радиационной медицины" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России) (RU)), 10.09.2016 «Способ неинвазивной прижизненной оценки физиологического состояния рыб (прототип).

Группа изобретений относится к области нейробиологии, в частности к устройству и способу исследования локомоторной активности рыбы. Устройство включает аквариум, в котором установлен прибор в форме желоба с двумя отверстиями на противоположных концах для постоянной циркуляции воды внутри прибора. Желоб содержит третье отверстие в верхней части для помещения рыбы в прибор. Также содержит насос, обеспечивающий направленный напор воды внутри прибора, два электрода, обеспечивающие подачу постоянного тока внутри прибора и установленные с противоположной стороны от насоса. Прибор размечен на зоны: безопасная, в которой отсутствует воздействие постоянного тока, и опасная, в которой происходит воздействие постоянным током. Зоны разграничены полупроницаемой для воды системой изоляции, защищающей рыбу от соприкосновения с электродами. Способ заключается в том, что помещают рыбу в прибор, обеспечивают напор воды внутри прибора с помощью насоса. Затем обеспечивают подачу постоянного тока внутри прибора с противоположной стороны от насоса. При заплыве рыбы в опасную зону происходит воздействие постоянным током, а при заплыве рыбы в безопасную зону отключают воздействие постоянного тока. Осуществляют запись с помощью камеры для видеосъемки или фиксируют нахождение рыбы в зонах и ее поведение визуально. Группа изобретений позволяет повысить эффективность исследования локомоторной активности рыбы. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

1. Устройство для исследования локомоторной активности рыбы, включающее:

- аквариум, в котором установлен прибор в форме желоба с двумя отверстиями на противоположных концах для постоянной циркуляции воды внутри прибора, желоб содержит третье отверстие в верхней части для помещения рыбы в прибор;

- насос, обеспечивающий направленный напор воды внутри прибора;

- два электрода, обеспечивающие подачу постоянного тока внутри прибора и установленные с противоположной стороны от насоса;

- при этом прибор размечен на зоны: безопасная, в которой отсутствует воздействие постоянного тока, и опасная, в которой происходит воздействие постоянным током;

- безопасная зона прибора находится ближе к насосу и разграничена от опасной зоны, которая находится ближе к электродам, полупроницаемой для воды системой изоляции, защищающей рыбу от соприкосновения с электродами.

2. Устройство для исследования локомоторной активности рыбы по п.1, в котором дополнительно установлена камера для видеосъемки.

3. Устройство для исследования локомоторной активности рыбы по п.1, в котором дополнительно установлено сенсорное устройство, регистрирующие местоположение рыбы внутри прибора.

4. Устройство для исследования локомоторной активности рыбы по п.1, в котором насос выполнен с возможностью регулирования напора воды внутри прибора.

5. Устройство для исследования локомоторной активности рыбы по п.1, в котором полупроницаемая для воды система изоляции рыбы от электродов выполнена в виде сетки, решетки или перегородки с отверстиями, обеспечивающей беспрепятственное прохождение через нее воды.

6. Устройство для исследования локомоторной активности рыбы по п.1, в котором полупроницаемая для воды система изоляции рыбы от электродов выполнена из пластмасс, полиамида, полиэфира или их комбинации.

7. Устройство для исследования локомоторной активности рыбы по п.1, в котором в качестве источника постоянного тока установлен генератор электрического тока, с которым соединены два электрода.

8. Устройство для исследования локомоторной активности рыбы по п.1, в котором электроды выполнены из олова или серебра.

9. Устройство для исследования локомоторной активности рыбы по п.1, в котором желоб выполнен с возможностью свободного передвижения рыбы вдоль прибора.

10. Способ исследования локомоторной активности рыбы с помощью устройства по п.1, при котором осуществляют следующие стадии:

- помещают рыбу в прибор в форме желоба;

- обеспечивают напор воды внутри прибора с помощью насоса;

- обеспечивают подачу постоянного тока внутри прибора с противоположной стороны от насоса;

- при заплыве рыбы в опасную зону происходит воздействие постоянным током, а при заплыве рыбы в безопасную зону отключают воздействие постоянного тока.

11. Способ исследования локомоторной активности рыбы по п.10, в котором осуществляют запись с помощью камеры для видеосъемки или фиксируют нахождение рыбы в зонах и ее поведение визуально.

12. Способ исследования локомоторной активности рыбы по п.10, в котором во время видеосъемки рыба не подвергается воздействию постоянного тока.

13. Способ исследования локомоторной активности рыбы по п.10, в котором обеспечивают напряжение в приборе в диапазоне от 0 до 20 В.

14. Способ исследования локомоторной активности рыбы по п.10, в котором при заплыве рыбы в опасную зону происходит воздействие постоянным током, а при заплыве рыбы в безопасную зону отключают воздействие постоянного тока, при этом исследование повторяется в течение 5-10 минут.

15. Способ исследования локомоторной активности рыбы по п.10, в котором исследование длится 5-10 дней.

16. Способ исследования локомоторной активности рыбы по п.10, в котором в последний день исследования регистрируют местонахождение рыбы в приборе при отключенном электрическом токе, определяя в какой зоне находится рыба, в опасной или безопасной.