Способ пероральной доставки химических соединений в организм рыб рода Nothobranchius для проведения доклинических исследований Российский патент 2024 года по МПК A01K61/00 A61K9/20 A61K36/02 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и биомедицины и может быть использовано при проведении экспериментальных доклинических исследований новых лекарственных средств и препаратов.

Уровень техники

Рыбы являются корректной и удобной моделью для проведения доклинических исследований ввиду наличия гомологий многих консервативных участков генома с геномом человека. Кроме того, функционирование и лиганд-зависимые ответы нервной системы аналогичны человеческим (Pappalardo A, Pitto L, Fiorillo С, Alice Donati М, Bruno С, Santorelli FM. Neuromuscular disorders in zebrafish: state of the art and future perspectives. Neuromolecular Med. 2013 Jun; 15(2):405-19. http://dx.doi.org/10.1007/s12017-013-8228-z.). В литературе описано 65 скринингов с использованием низкомолекулярных препаратов у D. rerio (MacRae СА, Peterson RT. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 2015 Oct; 14(10):721-31. http://dx.doi.org/10.1038/nrd4627.). Выявлены 11 препаратов-кандидатов, которые проходят клинические испытания (Patton ЕЕ, Zon LI, Langenau DM. Zebrafish disease models in drug discovery: from preclinical modelling to clinical trials. Nat Rev Drug Discov. 2021 Aug; 20(8):611-628. http://dx.doi.org/10.1038/s41573-021-00210-8).

Исследования рыб рода Nothobranchius показали, что этих животных возможно использовать для проведения пролонгированных исследований возраст-ассоциированных заболеваний и влияния различных фармацевтических препаратов (Cellerino A, Valenzano DR, Reichard М. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biol Rev Camb Philos Soc. 2016 May; 91(2):511-33. http://dx.doi.org/10.1111/brv.12183.).

N. furzeri - самые короткоживущие позвоночные, содержащиеся в неволе, со средней продолжительностью жизни 9-11 недель (Terzibasi Е, Valenzano DR, Benedetti М, Roncaglia Р, Cattaneo A, Domenici L, Cellerino A. Large Differences in Aging Phenotype between Strains of the Short-Lived Annual Fish Nothobranchius furzeri. PLoS One. 2008; 3:e3866. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0003866.; Valdesalici S, Cellerino A. Extremely short lifespan in the annual fish Nothobranchius furzeri. Proc Biol Sci. 2003 Nov 7;270 Suppl 2 (Suppl 2):S189-91. http://dx.doi.org/10.1098/rsbl.2003.0048.; Valenzano DR, Terzibasi E, Genade T, Cattaneo A, Domenici L, Cellerino A. Resveratrol prolongs lifespan and retards the onset of age-related markers in a short-lived vertebrate. Curr Biol. 2006; 16:296-300. http://dx.doi.org/10.1016/i.cub.2005.12.038). Родственный вид N. guenlheri обычно живет 10-14 месяцев (Wood JG, Rogina В, Lavu S, Howitz K, Helfand SL, Tatar M, Sinclair D. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 2004; 430:686-689. http://dx.doi.org/10.1038/nature02789). У Nothobranchius есть черты, общие со старением млекопитающих, такие как укорочение теломер, клеточное старение и накопление клеточных повреждений (Genade Т, Benedetti М, Terzibasi Е, Roncaglia Р, Valenzano DR, Cattaneo A, Cellerino A. Annual fishes of the genus Nothobranchius as a model system for aging research. Aging Cell. 2005; 4:223-33. http://dx.doi.org/10.1111/j.1474-9726.2005.00165.x.). Это делает Nothobranchius guentheri отличным модельным объектом для изучения комплексных биологических процессов в организме на протяжении всей жизни.

Учитывая, что увеличение количества исследований и общего интереса к рыбам рода Nothobranchius произошло относительно недавно, существует необходимость совершенствования ряда методов, в том числе метода доставки лекарств при проведении доклинических испытаний фармацевтических препаратов (Sneddon LU, Halsey LG, Bury NR. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. J Exp Biol. 2017 Sep 1; 220(Pt 17):3007-3016. http://dx.doi.org/10.1242/jeb.147058).

В настоящее время для доставки лекарств рыбам используют следующие методы::

1. Инкубационный метод - экспозиция экспериментальных особей рыб в растворе с исследуемым веществом (Sison М, Gerlai R. Behavioral performance altering effects of MK-801 in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 2011 Jul 7; 220(2):331-7. doi: 10.1016/j.bbr.2011.02.019.) Недостатком данного метода является невозможность оценить точную дозу вещества, попавшего в организм животного. Во время эксперимента исследуемая особь находится в небольшой емкости, испытывая стресс. (Kalueff AV, Echevarria DJ, Stewart AM. Gaining translational momentum: more zebrafish models for neuroscience research. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2014 Dec 3; 55:1-6. http://dx.doi.org/10.1016/j.pnpbp.2014.01.022.) Это влияет на интерпретацию результатов, что также является недостатком данного метода.

2. Внутривенная инъекция. Данный метод - наиболее эффективная и точная форма введения интересующего агента в модельное животное. Однако у рыб небольшого размера, таких как Danio rerio и рыб рода Nothobranchius, внутривенные инъекции сложно осуществимы из-за малого размера сосудов.

3. Пероральный ввод через зонд. Данный метод предполагает длительное пребывание рыбы на воздухе. Частое проведение подобной процедуры при длительных исследованиях может привести к гипоксии, что отразиться на результатах эксперимента.

4. Внутримышечные и внутрибрюшинные инъекции. Данный метод предполагает длительное нахождение рыбы на воздухе. Частое проведение подобной процедуры при длительных исследованиях может привести к гипоксии и травмам, что отразится на результатах эксперимента. Еще одним недостатком является инвазивность этих методов. Это свойство предполагает возникновение воспалений и увеличивает вероятность инфицирования, что отражается на результатах эксперимента.

5. Было предпринято несколько попыток разработать методы доставки лекарств в организм рыб путем пероорального введения в виде корма (Chang СТ, Doerr KM, Whipps СМ. Antibiotic treatment of zebrafish mycobacteriosis: tolerance and efficacy of treatments with tigecycline and clarithromycin. J Fish Dis. 2017 Oct; 40(10):1473-1485. http://dx.doi.org/10.1111/jfd.12619.; Lu Y, Patton EE. Long-term non-invasive drug treatments in adult zebrafish that lead to melanoma drug resistance. Dis Model Mech. 2022 May 1; 15(5):dmm049401. http://dx.doi.org/10.1242/dmm.049401.; Sciarra, John Benjamin, A.T. Tyler, and Amy Kolb. "A gelatin-based diet for oral dosing juvenile to adult zebrafish (Danio rerio)." Lab Animal Sci Prof (2014): 32-35.; Zang L, Morikane D, Shimada Y, Tanaka T, Nishimura N. A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish. Zebrafish. 2011 Dec; 8(4):203-10. http://dx.doi.org/10.1089/zeb.2011.0726.). Недостатком разработанных методик является невозможность расчета дозы в зависимости от массы тела животного.

В международном патенте Фумио Кавано и Норитака Хирасава (WO 2010/125991) описан метод борьбы с размножением рыбных паразитов, включающий введение рыбам от 1 до 50 мг/кг массы тела ингибитора синтеза или активации фолиевой кислоты. Согласно изобретению, ингибиторы синтеза и активации фолата могут быть введены перорально в виде порошка, гранул, таблеток или капсул в смеси с обычным кормом. Чтобы проанализировать эффективность метода, оценивали количественное и качественное содержание паразитических организмов на теле рыб. Однако оценка концентрации химических соединений в организме рыбы не проводилась.

Недостатками вышеперечисленных решений являются: сложность при расчете индивидуальной дозы в зависимости от массы тела животного, возможность возникновения воспалений и инфицирования, вероятность проявления гипоксии и влияние на рыбу стресса от нахождения в небольшой емкости во время проведения эксперимента.

Таким образом проблема доставки точной дозы активного вещества с возможностью индивидуальной адаптации порции для каждого модельного животного, участвующего в эксперименте остается актуальной.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом изобретения является способ изготовления дозированных форм (агарозных пастилок) с водным экстрактом артемии с индивидуальной дозировкой.

Для воплощения изобретения были использованы такие аспекты, как:

а) приготовление раствора действующего агента в необходимой концентрации;

б) соединение и тщательное перемешивание раствора действующего агента с носителем агар-агар, экстрактом науплий Artemia salina;

в) изготовление формовочной конструкции на 3D принтере;

г) нанесение полученной фармацевтической композиции на формовочную конструкцию и тщательное распределение по ней;

д) застывание фармацевтической композиции в формовочной конструкции при температуре +4°С;

е) экстракция полученных дозированных форм, а именно агарозных пастилок с помощью входящего в состав формовочной конструкции пуансона;

ж) кормление рыб путем перемещения дозированных форм, а именно агарозных пастилок в аквариум.

Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на фигуры и примеры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.

Краткое описание фигур и таблиц

Фигура 1. (А) Матрица формовочной конструкции для изготовления дозированных форм (агарозных пастилок) с указанием настроек для изготовления на 3D принтере; (Б) Заливочный столик формовочной конструкции для изготовления дозированных форм (агарозных пастилок) с указанием настроек для изготовления на 3D принтере; (В) Пуансон формовочной конструкции, предназначенный для выдавливания дозированных форм (агарозных пастилок), с указанием настроек для изготовления на 3D принтере.

Фигура 2. Последовательность использования элементов формовочной конструкции для производства дозированных форм (агарозных пастилок).

Осуществление изобретения

В большинстве экспериментов с пероральным введением химического вещества необходимую дозировку вычисляют исходя из средней массы животных в группе. Такой подход не учитывает индивидуальный вес каждой испытуемой особи, поэтому достоверность результатов снижается. В нашем изобретении эта проблема решается возможностью приготовления нескольких видов дозированных форм (агарозных пастилок) с разным количеством исследуемого вещества.

Данное изобретение предполагает способ доставки химических соединений в организм рыб рода Nothobranchius с помощью дозированной формы упругой консистенции с водным экстрактом науплий артемии.

Способ производства дозированных форм лекарственного препарата в форме агарозных пастилок

Агарозные пастилки получаются в четыре этапа:

1. Подготовка компонентов.

1.1. Приготовление раствора, придающего вкус (водный экстракт артемии).

Для приготовления водного экстракта артемии науплий артемий смешиваются с водой, очищенной системой Milli-Q (MilliporeSigma, США), в пропорции 1:1 (100 г/100 мл). Далее проводится экстракция артемий из полученной смеси в ультразвуковой ванне Elmasonic S10 (Elma, Германия) в течение 15 минут, после чего полученный раствор дважды процеживается через мелкое сито.

1.2. Приготовление раствора агарозы.

Для приготовления 4% раствора агарозы в мерный стакан помещается агар и вода, очищенная системой Milli-Q, в пропорции 1:25 (1 г/25 мл). Раствор тщательно перемешивается и нагревается в течение 30 секунд в микроволновой печи (мощность 700 Вт). Далее раствор вновь перемешивается и доводится до кипения (95-100°С) также за счет нагревания в микроволновой печи в течение 30 секунд.

1.3. Приготовление раствора действующего агента.

Для приготовления раствора действующего агента (из расчета дозировки 100 мг/кг) в пробирку помещается действующий агент и вода, очищенная системой Milli-Q, в пропорции 1:5 (100 мг/500 мкл). Раствор тщательно перемешивается.

2. Смешивание вспомогательных и лекарственных веществ.

Для изготовления наполнителя для дозированных форм (агарозных пастилок) раствор агарозы после полимеризации остужается до 80°С и смешивается с водным экстрактом артемии в пропорции 1:1. Полученный раствор смешивается с раствором действующего агента в 1.5 мл пробирке в соотношении 1:13 (100 мкл/1300 мкл). Пробирка помещается в термостат на 60°С. Раствор в пробирке тщательно перемешивается пипетированием.

3. Дозирование и формирование пастилок.

Предварительно перед формированием пастилок с помощью 3D принтера изготавливались следующие части формовочной конструкции: матрица, заливочный столик и пуансон. Соответствующие настройки 3д принтера указаны на Фигуре 1. Полученный наполнитель для дозированных форм (агарозных пастилок) заливается в матрицу, расположенную на заливочном столике. Далее матрица с заливочным столиком помещается в холодильник на 5 минут при температуре 4°С. Застывшие дозированные формы (агарозные пастилки) экстрагируются из матрицы при помощи пуансона. Полученные дозированные формы (агарозные пастилки) хранятся в холодильнике при температуре 4°С не дольше 2 суток.

Доставка вещества

Кормление

Перед кормлением исследуемых особей каждая из рыб взвешивается для подбора индивидуальной дозировки действующего агента. Дозированные формы (агарозные пастилки) помещаются в индивидуальные аквариумы (каждая особь находится в отдельном аквариуме) к исследуемым особям известной массы Время поедания пастилок фиксируется.

Образцы тканей и экстракция вещества

Во временных интервалах, зависящих от дизайна эксперимента и фармакокинетики исследуемого вещества, необходимо провести эвтаназию экспериментальных рыб в 200 мл раствора MS-222 (250 мг/л) в течение 10 минут после потери двигательной активности и ориентации в пространстве. Поверхность умерщвленных рыб просушивается и проводится препарирование. Необходимые для анализа ткани и органы извлекаются из рыб, несколько раз промываются водным раствором хлорида натрия (NaCl) (массовая доля ω (NaCl)≈0,9%) и просушиваются на фильтровальной бумаге. Отобранные ткани и органы взвешиваются и помещаются в микропробирки. Микропробирки либо помещаются в лед, либо замораживаются, если экстракция вещества будет производится позже.

Для экстракции исследуемого вещества из тканей предварительно приготавливается раствор из ацетонитрила, изопропанола и воды, очищенной системой Milli-Q, в соотношении 3:3:1. Полученный раствор для экстракции барботируется азотом в течение 10-15 минут, затем охлаждается до температуры -20°С. К свежей или замороженной ткани в микропробирках (ткань размораживается на льду) на одну массу ткани добавляется девять масс раствора для экстракции и несколько силикатных шариков. Содержимое микропробирок гомогенизируется с помощью прибора MagNA Lyser (Roche Applied Science, Германия) по стандартным протоколам. Далее в микропробирки добавляется 1 мл охлажденного раствора для экстракции, образцы перемешиваются в вортексе V-1 plus (BioSan, Латвия) в течение 10 секунд и встряхиваются в термошейкере TS-100 (BioSan, Латвия) в течение 20 минут при температуре 4°С. Образцы разделяются на составные части в Centrifuge 5424 R (Eppendorf, США) в течение 2 мин со скоростью 14000 об/мин при температуре 4°С. Разделенный супернатант в объеме 450 мкл отбирается в отдельные пробирки для последующей сушки в центрифужном настольном концентраторе Hyper VAC VC2200 (Helicon, Россия) до полного испарения жидкости (~ 1 часа). Полученная аликвота ресуспендируется при комнатной температуре в 450 мкл барботированного азотом раствора ацетонитрила и воды, очищенной системой Milli-Q, в соотношении 1:1. Полученные образцы разделяются на составные части в Centrifuge 5424 R (Eppendorf, США). Супернатант в объеме 450 мкл отбирается в отдельные микропробирки для последующей сушки в центрифужном настольном концентраторе до полного испарения жидкости (~ 1 часа).

В зависимости от структуры исследуемого вещества оценивается необходимость проведения дериватизации, в ходе которой полярные N-H и О-Н группы могут быть переведены в неполярные силильные группы. Перед силилированием проводится замещение кетогрупп на метоксимные. Для этих целей метоксиамин гидрохлорид смешивается с пиридином (концентрация 20 мг/мл), раствор перемешивается в вортексе V-1 plus (BioSan, Латвия) и обрабатывается ультразвуком при 60°С в течение 15 минут. К высушенным образцам добавляется 10 мкл полученного раствора, образцы на 1.5 часа помещаются в термошейкер при 30°С. Далее в качестве дериватизирующего агента к образцам добавляется 91 мкл N-метил-N-(триметилсилил)трифторацетамида (MSTFA), образцы помещаются в термошейкер на 30 мин при 37°С. Полученный раствор переносится в специальные стеклянные виалы с вкладышами, которые помещаются в хромато-масс-спектрометр для дальнейшего анализа.

При отсутствии необходимости в дериватизации, в микропробирки с высушенным веществом добавляется 100 мкл ацетонитрила, полученный раствор пипетируется, переносится в стеклянные виалы с вкладышами, которые затем помещаются в хромато-масс-спектрометр.

Количественная и качественная оценка

Количественный и качественный анализ исследуемого вещества выполняется с помощью хромато-масс-спектрометра Crystall-5000 (Chromatek, Россия). Перед оценкой количества вещества в образцах тканей проводится градуировка хромато-масс-спектрометра на исследуемое вещество. Для многоуровневой градуировки проводятся измерения растворов с известными концентрациями. При этом важно использовать смеси с максимально близкими концентрациями к определяемым значениям. Для каждой градуировочной точки проводится серия из двух параллельных вводов, значения которых усредняются. В качестве градуировочной функции выбирается функция у=kx, где у - количество компонента, х - площадь пика, k - градуировочный коэффициент. В ходе продувки инертным газом носителем (гелием) определяемых веществ через хроматографическую колонку (с силикагелем на стенках в качестве неподвижной фазы), проводится разделение веществ в образцах тканей и построение хроматограмм в режиме реального времени по полному ионному току (TIC). Проводится масс-спектрометрический анализ с применением ионизации электронным ударом (ЭУ), в ходе которого при нормированных условиях ионизации (70 эВ) получаются спектры исследуемого вещества, которые сравниваются с библиотечными масс-спектрами.

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.

В качестве примера эффективности представленного способа доставки химических веществ ниже приведен пример доставки β-гидроксибутирата калия в организм рыб Nothobranchius guentheri.

Пример 1 - Доставка β-гидроксибутирата калия в организм рыб Nothobranchius guentheri.

Перед началом эксперимента 10000 нг β-гидроксибутирата калия помещают в прибор для анализа и настраивают программы хромато-масс-спектрометра на улавливание искомого вещества. Далее строят калибровочную кривую для проведения количественного анализа β-гидроксибутирата калия по следующим известным количествам вещества: 10000, 5000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 нг.

Двум рыбам Nothobranchius guentheri каждая массой 1 г в утреннее время (12:00) предоставляют дозированные формы (агарозные пастилки) с β-гидроксибутиратом калия из расчета дозировки 100 мг/кг. Время поедания фиксируют, после чего проводят эвтаназию и препарирование исследуемых рыб: первая рыба - через минуту, вторая - через 30 минут после поедания. Исследуемые органы взвешивают: масса кишечника и мозга первой рыбы составили 3.3 мг и 8.69 мг; для второй рыбы эти значения составили 2.78 мг и 7.8 мг соответственно. Действующий агент экстрагируют из кишечника и головного мозга, дериватизируют и анализируют в хромато-масс-спектрометре. В результате анализа в кишечнике первой рыбы было зафиксировано 7884 нг β-гидроксибутирата калия, в мозге - 0.9 нг; в кишечнике второй рыбы зафиксировано 28.5 нг, в мозге 18.82 нг.

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и биомедицины и может быть использовано при проведении широкомасштабного скрининга лекарственных средств. Способ включает приготовление раствора действующего агента в необходимой концентрации, соединение и тщательное перемешивание раствора действующего агента с носителем агар-агар и экстрактом науплий Artemia salina. На 3D принтере изготавливают формовочную конструкцию. Наносят полученную фармацевтическую композицию на формовочную конструкцию и тщательное распределяют по ней. Фармацевтическая композиция застывает в формовочной конструкции при температуре 4°С. С помощью входящего в состав формовочной конструкции пуансона полученные пастилки экстрагируют. Дозированные формы перемещают в аквариум и кормят ими рыб. Изобретение обеспечивает точные дозы активного вещества, получаемого рыбой. 2 ил., 1 пр.

Способ пероральной доставки химических соединений в организм рыб рода Nothobranchius для проведения доклинических исследований, включающий следующие этапы:

а) приготовление раствора действующего агента в необходимой концентрации;

б) соединение и тщательное перемешивание раствора действующего агента с носителем агар-агар, экстрактом науплий Artemia salina;

в) изготовление формовочной конструкции на 3D принтере;

г) нанесение полученной фармацевтической композиции на формовочную конструкцию и тщательное распределение по ней;

д) застывание фармацевтической композиции в формовочной конструкции при температуре 4°С;

е) экстракция полученных дозированных форм, а именно агарозных пастилок с помощью входящего в состав формовочной конструкции пуансона;

ж) кормление рыб путем перемещения дозированных форм, а именно агарозных пастилок в аквариум.