Применение лидокаина для анестезии модельного организма Danio rerio в экспериментальных условиях Российский патент 2022 года по МПК A01K61/95 A61P23/00 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и может быть использовано при проведении экспериментальных доклинических исследований новых лекарственных средств и препаратов.

Danio rerio (Фиг. 1) это тропическая рыба семейства карповых. К настоящему времени является одним из изученных модельных объектов для оценки влияния различных генов на эмбриогенез, для скрининга лекарственных препаратов. Вместе с тем по сравнению с другими модельными объектами, такими как плодовая мушка Drosophila melanogaster и червем Caenorhabditis elegance между геномом человека и Danio rerio установлена сильная консервативная связь. Это делает Danio rerio отличной моделью для изучения комплексных биологических процессов таких как развитие нервной, сердечно-сосудистой системы и гемопоэтической систем, а также ангиогенеза, апоптоза и токсических эффектов различных факторов и фармакологических субстанций [Bencan Z, Sledge D, Levin ED. Buspirone, chlordiazepoxide and diazepam effects in a zebrafish model of anxiety. - Pharm. Biochem. and Behavior. 2009; 94(1):75-80].

Danio rerio легко разводится: в результате каждого спаривания можно получить до 200 икринок. Развитие ex utero и оптическая прозрачность эмбрионов в процессе эмбриогенеза позволяет проводить визуальный анализ эмбрионов на разных стадиях развития [Рорре, Т.Т., Ferguson, Н. W. (2006). Cardiovascular system. In Systemic Pathology of Fish (H.W. Ferguson, ed.), 2nd ed., pp. 141-67. London, UK: Scotian Press.]. К настоящему времени уже получены сотни генетических мутантов Danio rerio, фенотип которых напоминает и может быть клиническим эквивалентом заболеваний у человека. Также получено несколько химерных моделей с рецепторами и сигнальными молекулами человека. Гены, кодирующие определенные рецепторы и сигнальные молекулы, как правило связаны с развитием кардиоваскулярной патологии, заболеваниями кроветворной, нервной систем, миопатиями и миодистрофиями, что позволяет анализировать эффективность перспективных лекарственных препаратов [Drummond В.Е., Wingert R.A., World J. Stem Cells, 8(2), 22-31 (2016); Westerfield M., Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. The University of Oregon Press, Eugene, OR (1993)].

Одним из самых распространенных способов тестирования фармакологических препаратов считается инкубационный метод (экспозиция D. rerio в растворе с исследуемым веществом в течение определенного времени). Однако при использовании этого метода очень сложно оценить и рассчитать точную дозировку фармакологической субстанции, которая оказывается в рыбе путем поглощения через рот, жабры и кожу. Внутривенная инъекция часто является наиболее эффективной и точной формой введения интересующего агента в модельный организм. У D. rerio внутривенное введение фармакологических субстанций долгое время было проблемой из-за малого диаметра сосудов. Исторически инъекции в кровоток делались непосредственно через сердце. Однако эта процедура имеет очень высокий уровень смертности, так как сердце часто прокалывается во время инъекции, в результате чего рыба подвержена инфекции, массивной кровопотере или смертельному повреждению органов [Рорре, Т.Т., Ferguson, Н.W. (2006). Cardiovascular system. In Systemic Pathology of Fish (H.W. Ferguson, ed.), 2nd ed., pp. 141-67. London, UK: Scotian Press].

Была разработана новая процедура инъекции для рыб D. rerio, при которой место инъекции находится анатомически за глазным яблоком - ретроорбитальный венозный синус. Этот метод инъекции успешно применялся для инъекции лекарств взрослым рыбам. У способа гораздо более низкий уровень смертности, чем у традиционных внутрисердечных инъекций. Рыбы, которым проводят инъекции ретроорбитально, имеют меньшую кровопотерю, высокий уровень выживаемости после эксперимента [Pinkerton W, Webber M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp.Bio. Med. 1964; 116:959-961]. Кроме того, при правильном выполнении, лекарственные средства быстро попадают в кровоток, позволяя соединениям оказывать свое влияние на весь организм в целом. При выполнении этой методики введения фармакологических препаратов, предварительно используют анестезирующий препарат Трикаин метансульфонат (MS 222) (4.2 мл (4 мг/мл) Трикаин/100 мл - инкубационный аквариум), который снимает ноцицептивную реакцию посредством воздействия на болевые нейромедиаторы [Pugach EK, Li Р, White R, Zon L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp.2009; (34):1645. Published 2009 Dec 7. doi: 10.3791/1645]. Однако этот препарат дорог и труднодоступен.

В индустриальном рыбоводстве широкое распространение получила анестезия рыб для таких целей как поимка, просмотр, взвешивание производителей, их бонитировка, инъецирование, получение половых продуктов, проверка на зрелость. Анестезирующие вещества используют для обездвиживания рыб на несколько минут с целью пересадки из одной емкости в другую, при искусственном получении икры и спермы, при проведении морфологических измерений, индивидуальном взвешивании, для длительного снижения активности рыб на время их перевозки. Концентрация анестетика обусловлена видом рыбы, видовой активностью и размерами тела.

Термин "анестезия" в медицине означает обезболивание, что не соответствует сути эффекта, который известные анестетики вызывают у рыб. Чаще всего с их помощью достигается обездвиживание, успокаивающее (седативное) действие. Самые распространенные анестетики для рыб представлены в табл. 1.

Различают следующие стадии наркоза у рыб:

1. Начальный эффект - учащенное дыхание и с повышением движения и последующим замедлением.

2. Утрата равновесия - плавательное движение очень замедленное, происходит опрокидывание тела.

3. Потеря ориентировочного рефлекса - рыбы лежат на боку, не реагируют на раздражители.

4. Остановка дыхания и полная неподвижность рыб.

Стадиями восстановления после анестезирующего воздействия наркозного средства считаются:

1. Восстановление плавательных движений и равновесия.

2. Возбуждение.

3. Нормализация.

Вышеописанные стадии приведены для понимания эффективности анестезирующих средств и для проведения их сравнительной оценки.

Модельный организм D. rerio используется в экспериментальных целях в РФ сравнительно недавно. Большинство доклинических исследований новых фармакологических субстанций проводятся инкубационным методом. Как уже было сказано выше, альтернативным методом введения субстанций является внутривенный способ с предварительной анестезией рыбы. Таким образом, вопрос анестезии D. rerio является актуальным на сегодняшний день.

Известен метод обезболивания радужной форели трикаином, когда анестезирующие средство применяют в форме ванн (инкубационным методом). Дозировку рассчитывают на основе объема воды, а не массы рыбы. Трикаин использовался в рабочей дозировке 100/0,01, обездвиживание рыбы достигалось через 3-5 мин. К недостаткам способа относится длительность стадии возбуждения 15-30 минут и необходимость в контроле рН [Завьялова Е.А., Дрошнев А.Е., Гулюкин М.И. Калинина Н.Р. Анестезия радужной форели. - Российский ветеринарный журнал. СВЖ. 2012, №4, с. 22-24].

В качестве прототипа по наиболее близкой технической сущности нами выбран способ анестезии рыб (радужной форели) [White R.М., Sessa А., Burke Ch., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis, Cell Stem Cell, Vol. 2, Is. 2, 2008, Pages 183-189, ISSN 1934-5909, https://doi.org/10.1016/j.stem.2007.11.002], заключающийся в том, что на средний вес радужной форели 10 кг используют рабочую концентрацию (%) лидокаина от 120 мг/л до 200 мг/л от 0.012 до 0.02, при этом обездвиживание рыб достигалось через 5-10 минут.

Недостатком прототипа является то, что расчет доз лидокаина и времени экспозиции с лидокаином для радужной форели неприменим для модельного организма Danio Rerio в силу значительно меньшей массы тела. Кроме того, в способе, выбранном в качестве прототипа не проводится расчет времени восстановления мелкой моторики животных после обездвиженного состояния и времени полного восстановления типичного поведения животного после анестезии.

Технической задачей изобретения является расчет дозировок лидокаина и времени экспозиции раствора с лидокаином для D. Rerio, а также определение среднего времени восстановления мелкой моторики животного после обездвиженного состояния и времени полного восстановления типичного поведения животного после анестезии.

Техническим результатом изобретения является создание протокола анестезии и обездвиживания модельного организма D.rerio с применением лидокаина при проведении экспериментальных манипуляций при доклинических исследований.

Способ осуществляют следующим образом. Приготавливают раствор с применением аквариумной воды, характеристики которой приведены в табл. 2, в объеме 1 литр с добавлением 4 мл 2% лидокаина.

Аквариумным сачком пересаживают 1 особь D. rerio в экспериментальный аквариум (1 особь в расчете на один просматриваемый аквариум). Через 5-6 минут происходит потеря ориентировочного рефлекса -рыбы лежат на боку, не реагируют на раздражители.

Рыбу извлекают из водной среды и помещают на влажную подкладную. Проводится инъекция в ретроорбитальный синус в качестве примера манипуляции (1 микролитр 0.9% NaCl), после чего рыба помещается в новый просматриваемый аквариум, объемом 1 литр с чистой аквариумной водой без фармакологических субстанций, проводится расчет времени, через которое восстанавливается мелкая моторика рыбы, оцениваются поведенческие характеристики (время, через которое рыба самостоятельно поднимется в верхнюю треть толщи воды в экспериментальном аквариуме).

Заключение.

Экспериментальным методом подобрана оптимальная дозировка для анестезии D.rerio. Апробированы различные дозировки лидокаина от 10 мг/л до 160 мг/л и подобраны оптимальные дозировки, позволяющие проводить в дальнейшем инвазивные манипуляции на рыбе с причинением меньшего вреда животному. Исследования проведены па группе из 20 животных.

Произведен расчет оптимального времени анестезиологического пособия с использованием лидокаина для полного обездвиживания, что позволяет произвести экспериментальные манипуляции.

Произведен расчет времени полного восстановления перемещения рыбы по аквариуму после обездвиживания, в том числе в верхней трети толщи воды, что позволяет создать протокол анестезии для экспериментальных методов введения препаратов.

Результаты апробации заявляемого способа применения лидокаина для анестезии модельного организма Danio rerio в доклинических исследованиях в экспериментальных целях, по сравнению с прототипом, представлены в таблице 3.

Как видно из представленной таблицы, способ был апробирован на 20 D. rerio. Был произведен расчет дозировок раствора лидокаина для D. rerio. Время нахождение животного в растворе с лидокаином (мин.) по заявляемому способу 5-6 минут, по прототипу в среднем 10-15 минут. Время восстановления мелкой моторики D. rerio после анестезиологического пособия 7-8 минут. В прототипе данные отсутствуют. Время полного восстановления перемещения рыбы по аквариуму - 11 минут. В прототипе данные отсутствуют.

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и может быть использовано при проведении экспериментальных доклинических исследований новых лекарственных средств и препаратов. Cпособ анестезии модельного организма Danio rerio для проведения доклинических исследований включает: предварительно в отдельном резервуаре объемом 1 литр приготавливают анестезирующий раствор, состоящий из аквариумной воды со следующими характеристиками: рН 6,8-6,85; температура 24-26° С; нитраты менее 200 мг/л; углекислый газ 20 мг/л; жесткость воды 75-200 мг/л; нитриты отсутствуют; растворенный кислород не менее 4 мг/л, добавляют в нее 1 мл 2% раствора лидокаина, после чего аквариумным сачком перенося особь Danio rerio в резервуар, где в течение 5-6 минут до потери ориентировочного рефлекса у рыбы и полного ее обездвиживания. Изобретение обеспечивает достижение технического результата, заключающегося в повышении качества исследований за счет сокращения времени полного восстановления перемещения рыбы по аквариуму после обездвиживания, в том числе в верхней трети толщи воды, и обеспечения возможности создания протокола анестезии и обездвиживания модельного организма Denio rerio с применением лидокаина при проведении экспериментальных манипуляций при доклинических исследованиях. 1 ил., 3 табл.

Способ анестезии и обездвиживания модельного организма Danio rerio для проведения доклинических исследований, заключающийся в том, что предварительно в отдельном резервуаре объемом 1 литр приготавливают анестезирующий раствор, состоящий из аквариумной воды со следующими характеристиками: рН 6,8-6,85; температура 24-26° С; нитраты менее 200 мг/л; углекислый газ 20 мг/л; жесткость воды 75-200 мг/л; нитриты отсутствуют; растворенный кислород не менее 4 мг/л, добавляют в нее 1 мл 2% раствора лидокаина, после чего аквариумным сачком перенося особь Danio rerio в резервуар, где в течение 5-6 минут до потери ориентировочного рефлекса у рыбы и полного ее обездвиживания.