Способ комплексной коррекции нерубцовых алопеций в эксперименте Российский патент 2024 года по МПК A61K31/45 A61K31/47 A61K36/63 G09B23/28 A61P17/14 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной дерматологии, и может быть использовано в качестве способа комплексной коррекции нарушений цикла и морфофункциональной регенерации волосяных фолликулов в экспериментальных моделях нерубцовых алопеций.

Нерубцовые алопеции представляют собой гетерогенную группу заболеваний, в основе которых лежит нарушение цикла волосяного фолликула (ВФ) [1]. Наиболее распространенной формой нерубцовых алопеций является андрогенетическая алопеция (АГА) [2]. Цикл ВФ при АГА характеризуется преждевременным вступлением ВФ в фазу катагена и задержкой перехода ВФ из фазы телогена в фазу анагена, что ассоциировано с сокращением продолжительности фазы анагена [3]. Наличие противопоказаний, побочные эффекты, ограниченная эффективность и доступность существующих средств и методов лечения АГА определяют актуальность разработки новых способов лечения этого заболевания [4, 5].

Волосяные фолликулы в фазе анагена чрезвычайно чувствительны к различным токсическим воздействиям, особенно к химиотерапевтическим препаратам, применяемым в онкологической практике. Клинико-патологически алопеция, индуцированная химиотерапией, является сочетанием анагеновой и телогеновой алопеции [6]. Алопеция, индуцированная химиотерапией, остается важной нерешенной клинической проблемой, особенно, учитывая вероятность влияния трихотропных препаратов на эффективность противоопухолевой терапии с увеличением риска метастазов злокачественной опухоли в кожу головы [6, 7]. Несколько классов фармакологических препаратов с различными механизмами действия были оценены на животных моделях алопеции, индуцированной химиотерапией. На сегодняшний день информация об их клинической эффективности не представлена [7].

Независимо от этиологии и клинической разновидности эмоциональный стресс, вызванный выпадением волос, их поредением и отсутствием роста с формированием алопеции, существенно снижает качество жизни [4, 8].

Пентациклические тритерпеноиды обладают широким спектром биологической и фармакологической активности [9, 10]. К числу пентациклических тритерпеноидов относится милиацин, имеющий химическую формулу 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанен, и выделяемый из семян проса [11, 12]. В ряде экспериментальных исследований доказана его мембранопротекторная [13, 14], антиоксидантная [15], антимутагенная [16], антиапоптотическая активность, способность регулировать экспрессию генов, отвечающих за редокс-баланс клеток [17], повышать терапевтическую активность противоопухолевых препаратов, в частности метоторексата [18], и другие свойства, наряду с низкой токсичностью [19]. Установлено, что экстракт проса, называемый в ряде работ милиацин [20-22], значительно увеличивает пролиферативную и метаболическую активность кератиноцитов человека, указывая на то, что он может стимулировать рост волос [23].

Приоритетным для коррекции алопеций является топическое введение трихотропных средств, что позволяет создавать их высокие локальные концентрации в очагах поражения кожи [24]. Однако липофильных соединений, к числу которых относится милиацин - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанен, характеризуются низкой трансдермальной проницаемостью. С учетом морфологических особенностей кожи и различной полярности слоев кожи, относительно свободное прохождение липофильных соединений возможно только через роговой слой, обладающий гидрофобными свойствами, с ограниченной проницаемостью в более глубокие слои эпидермиса, дерму и гиподерму, где расположены кровеносные сосуды и луковицы волосяных фолликулов [25].

Уровень техники

Известно средство, предназначенное для предотвращения или замедления выпадения волос (Семейство патентов АТ-173608-Т; DE-69414857-D1; DE-69414857-T2; ЕР-0714276-А1; ЕР-0714276-В1; ES-2126136-Т3; FR-2708854-A1; FR-2708854-B1; WO-9505146-A1 Composition against hair loss and brittle nails» J.-P. Maurice Oury, 13.08.1993). Средство представляет композицию для лечения кожного покрова, в частности против выпадения волос и ломкости ногтей, предпочтительно перорального введения, отличающаяся тем, что содержит эффективную дозу одного, по крайней мере, из следующих компонентов: инозитол, кунжут (сухой экстракт), просо (экстракт), экстракт морских водорослей, цинк и магний, предпочтительно со следующими составляющими: серосодержащими аминокислотами, такими как L-цистин, витаминами, такими как витамин Н (биотин) и/или витамином В5 (пантотеновая кислота) в составе капсул. Недостатком известного технического решения является то, что, во-первых, используется экстракт проса, при этом содержание милиацина, как чистого активного вещества, не указывается, во-вторых, экстракт проса является необязательным компонентом композиции.

Известно применение композиции для улучшения внешнего вида волос и способ получения блестящих волос (семейство патентов СА-3016934-А1; DK-3453381-T3; ЕР-3453381-А1; ЕР-3453381-В1; ES-2850350-T3 «Method and use of a composition for improving hair арреагапсе» S. Boudon, P. Kurka, C. Gnacke [et al.], 08.09.2017). В указанных патентах раскрывается нетерапевтический метод, характеризующийся приемом пищевой добавки в форме капсул, содержащих экстракт проса, а также биотин, L-цистин, пантотеновую кислоту, для придания волосам блеска.

В качестве прототипа выбран способ применения косметической, фармацевтической или диетической композиции, содержащей масло проса, экстракт пшеницы с полярным органическим растворителем и фармацевтически приемлемую среду, а также способ получения такой композиции (Патент № US-9180135-B2 «Miliacin and sphingolipids and/or phospholipids composition for hair and scalp саге», F. Lamay, I. Lamour, E. Gaillard, 26.04.2013. Семейство патентов EP-2821052-A1 Combination of miliacin and polar lipids, in particular of sphingolipids and/or phospholipids, for care of the hair and scalp»; EP-2821052-B1; ES-2614379-T3 Association of miliacin and polar lipids, specifically sphingolipids and / or phospholipids, for hair and scalp саге»; FR-3004947-A1 «Association of miliacin and polar lipids, in particular sphingolipids and / or phospholipids, for the care of hair and scalp»; FR-3004947-B1; US-2014315864-A1 Association of miliacin and polar lipids, particularly sphingolipids and/or phospholipids, for hair and scalp саге»; US-9180135-B2 «Miliacin and sphingolipids and/or phospholipids composition for hair and scalp саге», F. Lamay, I. Lamour, E. Gaillard, 26.04.2013). В частности, изобретение относится к композиции для перорального введения или для нанесения на кожу, содержащей комбинацию активных веществ для борьбы с выпадением волос и/или стимуляции роста и/или повторного роста волос, и/или улучшения их красоты (блеска, мягкости, силы) и/или повышения комфорта кожи головы, или борьбы с чрезмерным выпадением волос, и/или стимуляции роста волос, и/или улучшения их красоты. Раскрыто, в том числе, в семействе перечисленных патентов, приготовление композиции путем получения масла проса, содержащего милиацин, получение экстракта пшеницы в полярном органическом растворителе, и смешивание масла проса и экстракта пшеницы. Просяное масло присутствует в композиции в количестве, эффективном для получения косметической или диетической композиции, содержащей от 0,01% до 10% по массе милиацина или от 0,1 до 2% по массе милиацина в расчете на общую массу указанной косметической или диетической композиции. Масло проса получают путем измельчения целых или очищенных семян проса Panicum miliaceum с получением муки проса. Затем проводят экстракцию, например, с помощью сверхкритического CO2. Полученный экстракт сушат в вакууме и стабилизируют экстрактом розмарина. Состав получаемого экстракта проса, предпочтительно следующий: от 85 до 99% триглицеридов (включая линолевую, олеиновую и пальмитиновую кислоты), от 0,5 до 2% стеролов, в том числе, β-ситостерол, δ-7-стимастерол и другие стерины, и от 0,1 до 2,0% милиацина. Недостатком данного способа является содержание в композиции триглицеридов с полиненасыщенной линолевой и мононенасыщенной олеиновой жирными кислотами, которые способны подвергаться окислению, как спонтанно, так и при воздействии кислорода воздуха, тепла, а также в случае естественного присутствия следов металлов, в используемых растительных экстрактах. В процессе окисления могут изменяться физико-химические показатели композиции и биологическая активность входящих в состав композиции соединений, сокращаться сроки годности средства. Кроме того, известно, что состав и содержание активных веществ в исходном растительном сырье может изменяться в зависимости от ряда факторов, в том числе, места произрастания и условий выращивания [26], что может приводить к значительным колебаниям количества милиацина в составе композиции. Это особенно важно, с учетом плохой биодоступности, присущей пентациклическим тритерпеноидам [27]. В связи с этим, недостатком способа является недоучет особенностей трансдермальной проницаемости композиции для наружного применения, так как жирные кислоты, в частности цис-олеиновая кислота выступает в основном как усилитель проницаемости только через роговой слой [28]. Кроме того, масло проса помимо милиацина, содержит совокупность других соединений растительного происхождения с известной трихотропной биологической активностью [29, 30]. В связи с этим эффективность известного средства не может быть объяснена только присутствием милиацина.

Задача изобретения.

Основной задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа коррекции нерубцовых алопеций у экспериментальных животных, основанного на методике использования комплекса милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена и полиоксиэтилированного-20-сорбитаноолеата в фиксированной комбинации.

Раскрытие изобретения

Сущность изобретения заключается в том, что по предлагаемому способу воспроизводятся нерубцовые алопеции с разным этиопатогенезом, а именно, животная модель андрогенетической алопеции и модель алопеции, индуцированной химиотерапией, путем введения циклофосфамида. Комплексная коррекция проявлений патологии волосяных фолликулов проводится топическим однократным ежедневным нанесением на кожу всей поверхности очага поражения милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена в концентрации 30 мг/мл в комплексе с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом. Выбор основы обусловлен сложностью трансдермального переноса милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена, характеризующегося липофильными свойствами. Полиоксиэтилированный-20-сорбитаноолеат является гидрофильным неионогенным поверхностно активным соединением со свойствами эффективного растворителя липофильных соединений, и отличается стабильностью, биосовместимостью, электронейтральностью, низкой токсичностью [31, 32, 33]. Свойства полиоксиэтилированного-20-сорбитаноолеата определяют его способность преодолевать кожный барьер и усиливать проницаемость введенных в его состав соединений [34]. Методика использования комплекса милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом зависит от разновидности экспериментальной нерубцовой алопеции. В модели андрогенетической алопеции комплекс милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом с концентрацией милиацина -3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена 30 мг/мл, наносится на весь очаг поражения в течение действия значимого этиопатогенетического фактора, 28 суток. В случае алопеции, индуцированной циклофосфамидом, нанесение комплекса милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом с концентрацией милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена 30 мг/мл, на очаг депиляции начинается с первых суток после индукции анагена, за 8 суток до введения алкилирующего химиотерапевтического средства циклофосфамида, и длится весь период наблюдения за животными (15 суток и 33 суток). Оценка результатов применения способа проводится морфологически с помощью количественной гистоморфометрии.

Осуществление способа

Эксперимент 1 проведен на мышиной модели андрогенетической алопеции. В стандартных условиях вивария 30 мышам-самцам линии C57BL/6 в возрасте 6-7 недель, был индуцирован анаген путем депиляции стержней волос с кожи спины. Длительность эксперимента составила 28 дней, день индукции анагена считался нулевым днем. Моделирование андрогенетической алопеции проводилось путем ежедневного нанесения всем животным опытных групп 1% геля тестостерона из расчета 5 мг/кг. Использовался препарат Андрогель® (производитель Besins-Healthcare), обеспечивающий непрерывную трансдермальную доставку тестостерона на протяжении 24 ч после однократного нанесения [35]. Способ коррекции включал топическое однократное нанесение на весь очаг поражения комплекса милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом. Концентрация милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена в составе равнялась 30 мг/мл. Для приготовления состава использовали кристаллы химически чистого милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена, полученные стандартным способом [12].

Животных разделили на 5 групп по 6 животных в каждой:

- контрольная группа - интактная;

- I опытная группа - мыши, получавшие 1% гель тестостерона 5 мг/кг наружно (модель андрогенетической алопеции);

- II опытная группа - мыши, получавшие наружно 1% гель тестостерона 5 мг/кг наружно с последующим нанесением 2% раствора миноксидила (положительный контроль);

- III опытная группа - мыши, получавшие наружно 1% гель тестостерона 5 мг/кг наружно однократно с последующим, через 30 минут, нанесением комплекса милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом;

- IV опытная группа - мыши получали наружно 1% гель тестостерона 5 мг/кг наружно с последующим, через 30 минут, нанесением полиоксиэтилированного-20-сорбитаноолеата (плацебо) на всю площадь поражения.

Животных выводили из эксперимента на 28 сутки после индукции анагена путем смещения шейных позвонков. Эксперименты с животными проводились с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Полученные образцы кожи области депиляции помещали в забуференный 10% нейтральный формалин и фиксировали при комнатной температуре в течение суток. После стандартной гистологической проводки материал заливали в парафиновые блоки, полученные срезы толщиной 5 мкм, окрашивали гематоксилином Майера и эозином. Стадии цикла волосяных фолликулов определяли исходя из данных, представленных S. Müller-Röver et al. [36]. Путем проведения гистоморфометрического анализа рассчитывался удельный вес волосяных фолликулов в каждой из фаз цикла волосяного фолликула и индекс цикла волосяного фолликула для каждой исследуемой группы, как описано Maurer М. et al. (1998) [37], с учетом следующего соответствия: фаза фаза раннего анагена=1, фаза среднего анагена=2, фаза позднего анагена=3, фаза катагена=4, телогена=5. Морфометрический анализ изображений фрагментов кожи проводился с помощью программного обеспечения ImageJ. Диаметры наружных корневых влагалищ измерялись на уровне впадения сальной железы. Статистический анализ полученных данных выполнялся с использованием таблиц Excel и программы Statistica 10.0. Количественные данные представлены в виде средней арифметической и стандартной ошибки среднего (М±m), 95% доверительные интервалы рассчитаны по методу Уилсона. Для сравнения показателей нескольких независимых групп использовали критерий Краскела-Уоллиса, попарные сравнения проводили с помощью критерия Манна-Уитни. Различия считались статистически значимыми при р≤0,05. Уровень изменчивости морфологических признаков оценивали с помощью коэффициента вариации (Cv).

Осуществление способа в экспериментальной модели андрогенетической алопеции привело к повышению плотности волосяных фолликулов на единицу площади (табл. 1); увеличению диаметра наружных корневых влагалищ при снижении показателя их вариабельности (табл. 2); увеличению удельного веса волосяных фолликулов в фазе анагена и увеличению соотношения количества ВФ в фазе анагена к таковому в фазе телогена (табл. 3, фиг. 1, фиг. 2).

Применение комплекса милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеаненом с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом, с концентрацией милиацина -3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена 30 мг/мл, увеличивает продолжительность фазы анагена. Об этом свидетельствуют значения индекса цикла ВФ, соответствующие о средней фазе цикла ВФ. Максимальное значение индекса ВФ, равное 5,0, соответствует фазе телогена ВФ кожи мышей контрольной группы и I опытной группы. Значения индекса ВФ кожи животных II и IV опытных группы свидетельствуют об анаген-катагеновой и катаген-телогеновой трансформации ВФ соответственно. В отличие от индексов цикла ВФ указанных выше, данный показатель в коже мышей III опытной группы говорит о переходе ВФ из подфазы среднего анагена в подфазу позднего анагена, таким образом, свидетельствует о продлении фазы анагена (табл. 4).

Эксперимент 2 выполнен на мышиной модели алопеции, индуцированной химиотерапией. В стандартных условиях вивария 30 мышам-самцам линии C57BL/6 в возрасте 6-7 недель, был индуцирован анаген путем депиляции стержней волос с кожи спины. День эпиляции считали нулевым днем эксперимента. Моделирование алопеции, индуцированной химиотерапией, осуществлялось путем однократного внутрибрюшинного введения животным 125 мг/кг циклофосфамида на 9-е сутки после индукции анагена, когда ВФ кожи мышей вступили в финальную стадию фазы роста, в фазу анагена VI [37]. Способ коррекции включал предварительное начало топического нанесения поражения комплекса милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом, которое начиналось на первые сутки после индукции анагена, то есть за восемь дней до введения циклофосфамида, и продолжалось до завершения эксперимента. Методика аппликации заключалась в ежедневном однократном нанесении комбинации на очаг алопеции. Концентрация милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена в составе равнялась 30 мг/мл. Для приготовления состава использовали кристаллы химически чистого милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена, полученные стандартным способом [12].

Животных разделили на 3 группы по 10 животных в каждой:

- I группа (контроль) - животные получили однократную инъекцию 0,9% раствора натрия хлорида в количестве еквиобъемном вводимому количеству циклофосфамида;

- II группа (группа сравнения) - мыши получили 125 мг/кг циклофосфамида внутрибрюшинно однократно на 9-е сутки после индукции анагена и, начиная с 1-х суток после индукции анагена на кожу области депиляции наружно ежедневно им наносили полиоксиэтилированный-20-сорбитаноолеат (плацебо);

- III группа (опытная группа) - животные получили 125 мг/кг циклофосфамида внутрибрюшинно однократно на 9-е сутки после депиляции и начиная с 1-х суток после индукции анагена на кожу области депиляции ежедневно наружно им наносили милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена в комбинации с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом.

Мыши выводились из эксперимента на 15-е и 33-и сутки после индукции анагена путем смещения шейных позвонков. Эксперименты с животными проводились с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Полученные образцы кожи области депиляции помещали в забуференный 10% нейтральный формалин и фиксировали при комнатной температуре в течение суток. После стандартной гистологической проводки материал заливали в парафиновые блоки, полученные срезы толщиной 5 мкм, окрашивали гематоксилином Майера и эозином. На 15-е сутки после индукции анагена оценивалась ранняя ответная реакция волосяных фолликулов на химическое повреждение циклофосфамидом. Количественная гистоморфометрия с расчетом индекса дистрофии ВФ проводилась исходя из данных и по методике, изложенной в работах Maurer, 1997; Bichsel, 2013 [37, 38], с учетом следующего соответствия: дистрофический анаген VI=1, ранний дистрофический катаген=2, средний дистрофический катаген=3, поздний дистрофический катаген=4, анаген I=4, анаген II=5, средний анаген=6, анаген VI=8.

На 33-и сутки оценивалась регенерация волосяных фолликулов в модели алопеции, индуцированной циклофосфамидом. Количественная гистоморфометрия с расчетом индекса цикла ВФ выполнена исходя из данных и методики, представленных Maurer, 1997; Bichsel, 2013 [37, 38], с учетом следующего соответствия: дистрофический анаген VI=1, ранний дистрофический катаген=2, средний дистрофический катаген=3, анаген I=4, анаген II=5, анаген III=6, анаген VI=7, катаген=8, телоген=9. Морфометрический анализ изображений фрагментов кожи проводился с помощью программного обеспечения ImageJ. Статистический анализ полученных данных выполнялся с использованием таблиц Excel и программы Statistica 10.0. Нормальность распределения данных определяли с использованием критерия Шапиро-Уилка. Количественные данные представлены в виде средней арифметической и стандартной ошибки среднего (М±m). Для сравнения показателей нескольких независимых групп использовали критерий Краскела-Уоллиса, попарные сравнения проводили с помощью критерия Манна-Уитни. Различия считались статистически значимыми при р≤0,05.

Осуществление способа на примере экспериментальной модели алопеции, индуцированной циклофосфамидом, привело к модификации цикла ВФ с ускорением морфофункциональной регенерации химически поврежденных ВФ.

В опытной группе животных, получавших милиацин - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена в комбинации с полиоксиэтилированным-20- сорбитаноолеатом, удельный вес дистрофических форм ВФ, представленных ВФ в фазе дистрофического катагена, было статистически значимо меньше и составило лишь 9,2±3,2%, остальные ВФ находились в фазах раннего и среднего анагена и не имели признаков химически индуцированной дистрофии (табл. 5, фиг. 3, фиг. 4). Это свидетельствует о том, что заявляемый способ коррекции способствует быстрой трансформации химически поврежденных ВФ в фазу дистрофического катагена, значительно укороченного телогена и последующей полной регенерацией ВФ с началом нового цикла. Последнее подтверждается расчетом индекса дистрофии ВФ (фиг. 5).

При анализе структурно-функциональных изменений ВФ кожи мышей, выявленных на 33-и сутки после индукции анагена, также получены данные, подтверждающие ускорение регенерации химически поврежденных ВФ при коррекции алопеции заявляемым способом. В коже мышей группы сравнения сохранялись ВФ в прогнозируемо длительном дистрофическом анагене VI, наряду ВФ, вступившие в новый цикл ВФ. В коже мышей опытной группы дистрофических форм ВФ не встречается (табл. 6, фиг. 6, фиг. 7).

Расчет индекса цикла ВФ свидетельствует о катаген-телогеновой трансформации ВФ кожи мышей опытной группы, в то время как средняя фаза цикла ВФ в коже мышей группы сравнения соответствует переходу ВФ из фазы дистрофического катагена в фазу раннего анагена, то есть началу вступления ВФ в новый цикл и начало полной их регенерации только к 33-м суткам после индукции анагена (фиг. 8).

Таким образом, реализация способа комплексной коррекции в модели андрогенетической алопеции и модели алопеции, индуцированной циклофосфамидом, имеющих разный патогенез, позволила выявить новые свойства милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена и установить влияния этого вещества на структурно-функциональную реорганизацию ВФ в условиях моделирования нарушений цикла ВФ и регенеративную способность ВФ при химически индуцированном повреждении.

Новизной изобретения является то, что впервые использована методика топического применения комплекса милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом, с фиксированной концентрацией милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена, равной 30 мг/мл, в условиях моделирования нерубцовых алопеций с различным этиопатогенезом и характером нарушения цикла волосяного фолликула.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является реализация способа комплексной коррекции нерубцовых алопеций с применением методики ежедневного однократного топического нанесения на весь очаг поражения комплекса милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена в с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом, с фиксированной концентрацией милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена, равной 30 мг/мл.

Преимуществами способа является, во-первых, использование чистого вещества милиацина-3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена, что позволяет стандартизировать состав и получать фиксированную концентрацию милиацина-3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена, с возможностью изучать его фармакокинетический профиль; во-вторых, учет физико-химических особенностей милиацина-3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена, а именно его липофильности и связанной с этим трудности его трансдермального переноса, что обосновало использование комплекса милиацина-3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом, являющимся усилителем проницаемости; в-третьих, химическая стабильность комплекса милиацина-3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом, его устойчивость к окислению, и, следовательно, удлинению сроков годности.

Способ иллюстрируется приведенными ниже примерами.

Пример 1. Самцам мышей линии C57BL/6 в возрасте 6-7 недель, которые содержались в стандартных условиях вивария, индуцировали анаген путем депиляции стержней волос с кожи спины восковыми полосками под эфирным наркозом (нулевой день эксперимента). Модель андрогенетической алопеции воспроизводили путем нанесения на кожу области депиляции 1% геля тестостерона. С целью оценки возможности использования милиацина-3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена для комплексной коррекции андрогенетической алопеции в модельном эксперименте была разработана методика применения комплекса милиацина-3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена с полиоксиэтилированным (20) сорбитаноолеатом, с концентрацией милиацина 30 мг/мл. С 1-го по 28-й день эксперимента на кожу области депиляции наносили 1% гель тестостерона из расчета 5 мг/кг (препарат Андрогель®, производитель Besins-Healthcare), спустя полчаса - комплекса милиацина-3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена с полиоксиэтилированным (20) сорбитаноолеатом, с концентрацией милиацина 30 мг/мл. На 28-й день после депиляции животных под эфирным наркозом умерщвляли. Отбор образцов кожи проводили с межлопаточной области, затем помещали их в 10% нейтральный формалин и фиксировали при комнатной температуре в течение суток. После стандартной гистологической проводки материал заливали в парафин. Гистосрезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином Майера и эозином. Морфометрический анализ изображений фрагментов кожи проводили с помощью программного обеспечения ImageJ. На микрофотографиях поперечных срезов проводили подсчет количества ВФ на единицу площади; на уровне впадения сальной железы проводили измерение диаметров наружных корневых влагалищ (фиг. 9). На продольных срезах оценивали морфологические признаки принадлежности ВФ к отдельным фазам цикла ВФ (фигура 10). Плотность волосяных фолликулов на единицу площади в коже мышей составила 5,33±0,12 (табл. 1, фиг. 11), средний диаметр наружных корневых влагалищ был равен 77,98±2,14 (табл. 2, фиг. 9), волосяных фолликулов в фазе анагена было 77,26±2,39, катагена - 1,24±0,42, телогена - 21,72±2,57, соотношение количества ВФ в фазе анагена к таковому в фазе телогена - 3,8±0,52 (табл. 3, фиг. 10, 11). Индекс фазы цикла, характеризующий среднюю фазу цикла ВФ в коже исследуемых мышей, составил 2,9±0,04 (табл. 4).

Пример 2. Самцам мышей линии C57BL/6 в возрасте 6-7 недель, которые содержались в стандартных условиях вивария, индуцировали анаген путем депиляции стержней волос с кожи спины восковыми полосками под эфирным наркозом (нулевой день эксперимента). С 1-х суток эксперимента мышам на кожу области депиляции наносили комплекс милиацина-3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена с полиоксиэтилированным (20) сорбитаноолеатом, с концентрацией милиацина 30 мг/мл. С целью моделирования алопеции, индуцированной химиотерапией, мышам внутрибрюшинно был введен алкилирующий цитостатический препарат циклофосфамид из расчета 125 мг/кг веса животного. Препарат вводился на 9-й день после депиляции, что у данной линии мышей соответствует раннему анагену VI. На 15-й день после депиляции половину животных умерщвляли под эфирным наркозом с целью оценки ранней ответной реакции ВФ кожи мышей на химическое повреждении циклофосфамидом. Оставшихся животных выводили из эксперимента на 33-и сутки после депиляции для изучения фазы регенерации химически поврежденных ВФ. Отбор образцов кожи проводили с межлопаточной области, затем помещали их в 10% нейтральный формалин и фиксировали при комнатной температуре в течение суток. После стандартной гистологической проводки материал заливали в парафин. Гистосрезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином Майера и эозином. Морфометрический анализ изображений фрагментов кожи проводили с помощью программного обеспечения ImageJ. На 15-е сутки после индукции анагена в коже мышей подавляющее большинство ВФ находилось в фазах анагена и не имело признаков химического повреждения: 14,2±2,66% - в фазе анагена I, 61,82±5,84% - в фазе анагена II, 14,78±4,3% - в фазе анагена III. Оставшиеся ВФ, составившие лишь 9,2±3,2% от общего числа классифицированных ВФ находилось в фазе позднего дистрофического катагена (табл. 5, фиг. 6, фиг. 12). На 33-и сутки после индукции анагена в коже мышей было обнаружено 11,34±2,7% ВФ в фазе анагена VI, 51,1±6,65% ВФ - в фазе катагена и 37,55±5,49% ВФ - в фазе телогена (табл. 6, фиг. 6, фиг. 13). Признаков дистрофических изменений обнаружено не было (табл.6). Индекс фазы дистрофии составил 5,16 на 15-е сутки, индекс цикла ВФ на 33-и сутки после индукции анагена был равен 8,28 (фиг. 8).

Результаты исследования поясняются графическими материалами:

На фиг. 1 показан удельный вес волосяных фолликулов в отдельных фазах цикла волосяного фолликула в контрольной и опытных группах в модели андрогенетической алопеции (* - попарные различия удельного веса ВФ в фазе анагена между опытными группами при уровне значимости р<0,01; ** - попарные различия удельного веса ВФ в фазе телогена между опытными группами при уровне значимости р<0,01)

Фигура 2. Фрагменты кожи спины мышей контрольной и опытных групп, 28-е сутки после индукции анагена. Модель андрогенетической алопеции. Окраска гематоксилином Майера и эозином. Ув. 300. (ВФ - волосяной фолликул): А. Контрольная группа. ВФ в фазе телогена. В. I опытная группа. ВФ в фазе телогена. С. II опытная группа. ВФ в фазе позднего анагена (анагена VI). D. II опытная группа. ВФ в фазе телогена. Е. III опытная группа. ВФ в фазе катагена. F. III опытная группа. ВФ в фазе раннего анагена (анаген II). G. III опытная группа. ВФ в фазе среднего анагена (анаген III). Н. IV опытная группа. Волосяные фолликулы в фазе телогена.

На фиг. 3 изображены репрезентативные микрофотографии волосяных фолликулов (ВФ) кожи мышей контрольной группы, группы сравнения и опытной группы на 15-е сутки после индукции анагена в модели алопеции, индуцированной циклофосфамидом. Окраска гематоксилином Майера и эозином. Ув. 300. А. Контрольная группа - ВФ в фазе анагена VI; Группа сравнения (В - Е) наблюдаются ВФ с признаками химически индуцированного повреждения: В. - ВФ в фазе дистрофического анагена VI, наблюдаются эктопированные гранулы меланина, сокращение зоны меланогенеза, искажение ВФ, нарушение пигментации стержня волоса; С. ВФ в фазе позднего дистрофического катагена, компактный округлый дермальный сосочек окружен конгломератами меланина; D. Расширение канала волоса, прерывание хода стержня волоса, нарушение пигментации стержня волоса; Е. Стержни волос с нарушенной пигментацией и структурой в каналах волос. Опытная группа (F - Н): ВФ в фазах раннего и среднего анагена не имеют признаков химического повреждения. F. ВФ в фазе позднего дистрофического катагена, конгломераты меланина окружают округлый дермальный сосочек; G. ВФ в фазе раннего анагена (анагена II), кератиноциты в виде полулуния окружают дермальный сосочек более чем на половину его объема; Н. ВФ в фазе среднего анагена (анаген IIIb), над верхним полюсом дермального сосочка наблюдается зона меланогенеза.

Фигура 4. Удельный вес волосяных фолликулов на разных стадиях цикла в коже мышей на 15-е сутки после депиляции в модели алопеции, индуцированной циклофосфамидом. Планки погрешностей отражают стандартную ошибку среднего; * - различия по удельному весу волосяных фолликулов фазе дистрофического катагена в коже мышей группы сравнения и опытной группы на уровне р<0,01.

Фигура 5. Индексы дистрофии волосяных фолликулов кожи мышей на 15-е сутки после депиляции в модели алопеции, индуцированной циклофосфамидом. Индекс дистрофии ВФ кожи мышей группы сравнения, равный 2,78, соответствует прогрессированию ВФ из фазы раннего дистрофического катагена в фазу позднего дистрофического катагена. Индекс дистрофии ВФ кожи мышей опытной группы, равный 5,16 означал трансформацию ВФ из фазы раннего анагена в фазу среднего анагена нового цикла ВФ. Планки погрешностей отражают стандартную ошибку среднего; - различия с индексом дистрофии волосяного фолликула контрольной группы с показателем опытной группы на уровне р<0,01; * - различия с индексом дистрофии волосяного фолликула группы сравнения с показателем опытной группы на уровне р<0,01.

Фигура 6. Удельный вес волосяных фолликулов на разных стадиях цикла в коже мышей на 33-и сутки после депиляции. Планки погрешностей отражают стандартную ошибку среднего; * - различия по удельному весу волосяных фолликулов в отдельных стадиях цикла в коже мышей группы сравнения и опытной группы на уровне р<0,01.

На фиг. 7 изображены репрезентативные микрофотографии волосяных фолликулов (ВФ) кожи мышей контрольной группы, группы сравнения и опытной группы на 33-и сутки после индукции анагена в модели алопеции, индуцированной циклофосфамидом. Окраска гематоксилином Майера и эозином. Ув. 300. *Ув. 150. А. Контрольная группа - ВФ в фазе телогена; Группа сравнения (В - Е) наблюдаются ВФ с как с признаками химически индуцированного повреждения, так и без них: В. - ВФ в фазе телогена; С. ВФ в фазе среднего анагена (анагена III); D. ВФ в фазе дистрофического анагена VI, расширение канала волоса, сокращение зоны меланогенеза в отдельных ВФ; Е. ВФ в фазе дистрофического анагена VI, искажение структуры ВФ. Опытная группа (F - Н): ВФ в фазах анагена, катагена и телогена не имеют признаков химического повреждения. F. ВФ в фазе телогена; G. ВФ в фазе среднего катагена; Н. ВФ в фазе анагена VI.

Фигура 8. Индексы цикла волосяных фолликулов кожи мышей на 33-и сутки после депиляции. Планки погрешностей отражают стандартную ошибку среднего; * - различия с индексом цикла волосяного фолликула контрольной группы на уровне р<0,01; - различия с индексом цикла волосяного фолликула группы сравнения на уровне р<0,01.

Фигура 9. Фрагмент кожи спины мыши, получавшей комплекс милиацина - 3-β-метокси-Δ18-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом в модели андрогенетической алопеции. 28-е сутки после индукции анагена. Поперечный срез на уровне впадения сальных желез, наружные корневые влагалища волосяных фолликулов. Окраска гематоксилин Майера и эозин. Ув. 300.

Фигура 10. Фрагмент кожи спины мыши, получавшей комплекс милиацина -3-β-метокси-Δ18-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом в модели андрогенетической алопеции. 28-е сутки после индукции анагена. Продольный срез, волосяной фолликул в фазе анагена I. Окраска гематоксилин Майера и эозин. Ув. 300.

Фигура 11. Фрагмент кожи спины мыши, получавшей комплекс милиацина -3-β-метокси-Δ18-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом в модели андрогенетической алопеции. 28-е сутки после индукции анагена. Продольный срез, волосяные фолликулы в фазе телогена. Окраска гематоксилин Майера и эозин. Ув. 300.

Фигура 12. Фрагмент кожи спины мыши, получавшей комплекс милиацина -3-β-метокси-Δ18-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом в модели алопеции, индуцированной циклофосфамидом. 15-е сутки после индукции анагена. Продольный срез, волосяные фолликулы в фазе позднего дистрофического катагена. Окраска гематоксилин Майера и эозин. Ув. 300.

Фигура 13. Фрагмент кожи спины мыши, получавшей комплекс милиацина -3-β-метокси-Δ18-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбитаноолеатом в модели алопеции, индуцированной циклофосфамидом. 33-и сутки после индукции анагена. Продольный срез, волосяные фолликулы в фазе анагена VI. Окраска гематоксилин Майера и эозин. У в. 300.

Список литературы:

1. Resting no more: re-defining telogen, the maintenance stage of the hair growth cycle / M. Geyfman [et al.] // Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. - 2015. - Vol. 90. - N4. - P. 1179-96.

2. Physiopathology and current treatments of androgenetic alopecia: Going beyond androgens and antiandrogens / T. Katzer [et al.] // Dermatologic Therapy. - 2019. - Vol. 32. - P. e13059.

3. Ramos, P.M. Female Pattern Hair Loss: a clinical and pathophysiological review / P.M. Ramos, H.A. Miot // An. Bras. Dermatol. - 2015. - Vol. 90. - N4. - P. 529-43.

4. Choi, B.Y. Targeting Wnt/β-Catenin Pathway for Developing Therapies for Hair Loss / B.Y. Choi // Int. J. Mol. Sci. - 2020. - Vol. 21. - N14. - P. 4915.

5. The Hair Growth-Promoting Effect of Rumex japonicus Houtt. Extract / H. Lee [et al.] // Evid Based Complement Alternat Med. - 2016. - Vol. 2016. - P. 1873746.

6. Chemotherapy-Induced Alopecia / A.C. Villasante [et al.] // J. Clin. Investigat. Dermatol. - 2014. - Vol. 2. - N2. - P. 8.

7. A Clinical and Biological Guide for Understanding Chemotherapy-Induced Alopecia and Its Prevention / C.J. Dunnill [et al.] //Oncologist. - 2018. - Vol. 23. - N1. - P. 84-96.

8. Сложный пациент трихолога: руководство по эффективному лечений алопеций и сопутствующих заболеваний / Ральф М. Трюб; пер. с англ. под ред. Н.Г. Баруновой, В.П. Ткачева. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2018. - 392.

9. The Potential Application of Pentacyclic Triterpenoids in the Prevention and Treatment of Retinal Diseases / Z. Cheng [et al.] // Planta Med. - 2021. - Vol. 87. - N7. - P. 511-527.

10. Tetracyclic and Pentacyclic Triterpenes with High Therapeutic Efficiency in Wound Healing Approaches / R. Ghiulai [et al.] // Molecules. - 2020. - Vol. 26. - N25(23). - P. 5557.

11. Олифсон, Л.Е. Химическая природа и биологическая активность милиацина /Л.Е. Олифсон, Н.Д. Осадчая, Б.Г. Нузов, [и др.] // Вопросы питания. - 1991. - №2. - С. 57-59.

12. Павлова, Маргарита Михайловна. Изучение влияния биологически активного стероида проса (3-β-метокси-Δ18-олеанена) при токсическом поражении печени четыреххлористым углеродом в эксперименте: диссертация … кандидата биологических наук: 03.00.04. - Оренбург, 1984. - 154 с.: ил.

13. Патент РФ на изобретение №1043860. «Средство, стабилизирующее биологические мембраны. Чернов А.Н., Павлова М.М., Олифсон Л.Е., 1983.

14. Фролов Б.А., Кириллова А.В. Милиацин как мембранопротектор. Защитное действие милиацина при детергент-индуцированной иммуносупрессии // Российский аллергологический журнал. - 2011. - Т. 4. - №1. - С. 402-403.

15. Панфилова, Т.В. Тритерпеноид милиацин снижает индуцируемое стрессом ПОЛ / Т.В. Панфилова, А.А. Штиль, Б.А. Фролов // Бюлл. экспер. биол и мед. - 2006. - Т. 141. - №6. - С. 633-635.

16. Сарычева Ю.А., Токарева А.А., Панфилова Т.В., Железнова А.Д., Штиль А.А., Красиков СИ., Фролов Б.А. Патент на изобретение RU 2698204 С1 от 23.08.2019. Заявка №2019111740 от 17.04.2019.

17. Природный тритерпеноид милиацин возбудительный метотрексатом окислительный стресс и форсирует экспрессию генов Syp 2e1 и глутатионредуктазы в печени / О.В. Калинина [и др.] // Патол. физиол. и экспер. терапия. - 2013а. - №1. - С. 70-74.

18. Калинина О.В., Фролов Б.А., Штиль А.А., Перетолчина НМ., Смирнова З.С.Патент на изобретение RU 2411947 С1 от 27.04.2009. Заявка №2009122188/15 от 09.06.2009.

19. Олифсон, Л.Е. Химическая природа и биологическая активность милиацина /Л.Е. Олифсон, Н.Д. Осадчая, Б.Г. Нузов, [и др.] // Вопросы питания. - 1991. - №2. - С. 57-59.

20. Патент №US-9180135-B2 «Miliacin and sphingolipids and/or phospholipids composition for hair and scalp саге», F. Lamay, I. Lamour, E. Gaillard, 26.04.2013.

21. Семейство патентов EP-2821052-A1 «Combination of miliacin and polar lipids, in particular of sphingolipids and/or phospholipids, for care of the hair and scalp»; F. Lamay, I. Lamour, E. Gaillard, 26.04.2013

22. Патент EP-2821052-B1; ES-2614379-T3 Association of miliacin and polar lipids, specifically sphingolipids and / or phospholipids, for hair and scalp саге» F. Lamay, I. Lamour, E. Gaillard, 26.04.2013

23. Патент Canada №EP-3453381-B1 «Method and use of a composition for improving hair арреагапсе» S. Boudon, P. Kurka, C. Gnacke [et al.], 08.09.2017

24. Yang, G. Transdermal Drug Delivery for Hair Regrowth / G. Yang, G. Chen, Z. Gu // Mol. Pharm. - 2021. - Vol.18. - N2. - P. 483-490.

25. Barry B.W. Skin transport // Dermatological formulations. Ed. Barry B.W. -New York: Marcel&Dekker, 1983. - P. 95-126.

26. Biostimulants in Plant Science: A Global Perspective / O.I. Yakhin [et al.] // Front. Plant. Sci. - 2017. - Vol. 26. - N7. - P. 2049.

27. Pentacyclic Triterpenoids with Nitrogen-Containing Heterocyclic Moiety, Privileged Hybrids in Anticancer Drug Discovery / V. Khwaza [et al.] // Molecules. - 2021. - Vol. 26. - N9. - P. 2401.

28. Lane, ME. Skin penetration enhancers/ ME. Lane // Int. J. Pharm. - 2013. - Vol. 447. - N1-2. - P. 12-21.

29. Upadhyay, K. Development and characterization of phyto-vesicles of β-sitosterol for the treatment of androgenetic alopecia / K. Upadhyay, N.K. Gupta, V.K. Dixit // Arch. Dermatol. Res. - 2012. - Vol. 304. - N7. - P. 511-9.

30. A Systemic Review on Topical Marketed Formulations, Natural Products, and Oral Supplements to Prevent Androgenic Alopecia: A Review / S. Ashique [et al.] // Nat. Prod. Bioprospect. - 2020. - Vol.10. - N6. - P. 345-365.

31. Шенфельд, H. Поверхностно-активные вещества на основе оксида этилена. - М.: Химия, 1982. - 748 с.

32. Som, I. Status of surfactants as penetration enhancers in transdermal drug delivery / I. Som, K. Bhatia, M. Yasir // J. Pharmacy Bioallied Sci. - 2012. - Vol. 4. - N1. - P. 2-9.

33. Задымова H.M., Ямпольская Г.П. Термодинамически устойчивые дисперсные системы // Практикум по коллоидной химии. Ред. Куличихин В.Г. - М.: Вузовский учебник: ИНФРА-М, 2012. Гл. 6. С. 141-172.

34. Akhtar N., Rehman M.U., Khan H.M.S., Rasool F., Saeed Т., Murtaza G. Penetration enhancing effect of polysorbate 20 and 80 on the in vitro percutaneous absorption of L-ascorbic acid // Tropical J. Of Pharmaceutical Research. - 2011. - Vol. 10. - N3. - P. 281-288.

35. Винаров, А.З. Влияние терапии тестостероном (1% трансдермальный гель) на качество жизни мужчин с андрогенодефицитом в условиях рутинной клинической практики: 6-месячное наблюдательное исследование / А.З. Винаров [и др.] // Андрология и генитальная хирургия. - 2016. - Т. 17 - №4. - С. 59-67.

36. Müller-Röver, S. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages / S. Muller-Rover [et al.] // J. Invest. Dermatol. - 2001. - Vol. 117. - N1. - P. 3-15.

37. Maurer, M. Intact hair follicle innervation is not essential for anagen induction and development / M. Maurer [et al.] // Arch. Dermatol. Res. - 1998. - Vol. 290. - N10. - P. 574-8.

38. Role for the Epidermal Growth Factor Receptor in Chemotherapy-Induced Alopecia / K.J. Bichsel [et al.] // PLoS ONE. - 2013. - Vol. 8. - N7. - P. e69368.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к экспериментальной дерматологии. В нулевой день эксперимента производят индукцию анагена путем депиляции стержней волос с кожи спины. С первого дня эксперимента на очаг депиляции ежедневно наносят 1% гель тестостерона из расчета 5 мг/кг с последующим нанесением через 30 минут комплекса милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбита-олеатом с концентрацией милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена 30 мг/мл. При моделировании андрогенной алопеции комплекс наносят в течение 28 суток. При моделировании алопеции, индуцированной циклофосфамидом, комплекс наносят в течение 15-33 дней с введением на девятый день эксперимента однократно внутрибрюшинно 125 мг/кг циклофосфамида. Группа изобретений позволяет изучить влияние комплекса милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбита-олеатом в условиях моделирования нерубцовых алопеций с различным этиопатогенезом и характером нарушения цикла волосяного фолликула для разработки новых способов лечения нерубцовых алопеций. 2 н.п. ф-лы, 13 ил., 6 табл., 2 пр.

1. Способ комплексной коррекции нерубцовой алопеции у мышей в эксперименте, отличающийся тем, что моделируют андрогенную алопецию, при этом в нулевой день эксперимента производят индукцию анагена путем депиляции стержней волос с кожи спины, с первого дня эксперимента на очаг депиляции ежедневно наносят 1% гель тестостерона из расчета 5 мг/кг с последующим нанесением через 30 минут комплекса милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбита-олеатом с концентрацией милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена 30 мг/мл в течение 28 суток.

2. Способ комплексной коррекции нерубцовой алопеции у мышей в эксперименте, отличающийся тем, что моделируют алопецию, индуцированную циклофосфамидом, при этом в нулевой день эксперимента производят индукцию анагена путем депиляции стержней волос с кожи спины, с первого дня эксперимента на очаг депиляции ежедневно наносят комплекс милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена с полиоксиэтилированным-20-сорбита-олеатом с концентрацией милиацина - 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена 30 мг/мл в течение 15-33 дней с введением на девятый день эксперимента однократно внутрибрюшинно 125 мг/кг циклофосфамида.