СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОЙ БИОМАССЫ ГРИБА Российский патент 2002 года по МПК C12P21/00 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой, кормовой и медицинской промышленности. Получение белка и других физиологически активных веществ из высших базидиальных грибов может внести значительный вклад в решение устранения белкового дефицита в стране и получения ряда ценных медицинских препаратов.

В настоящее время мировое производство высших грибов достигло более 2 миллионов тонн в год, а в таких странах, как Япония, США, Франция, Германия, среднегодовое потребление на душу населения искусственно выращенных грибов составляет около 5 кг. Однако, несмотря на значительный опыт по плантационному (твердофазному) культивированию высших грибов в различных регионах РФ и других странах, это все-таки связано с сезонностью их выращивания, в основном май - август месяцы, с одной стороны, и нетехнологичностью процесса, так как невозможно осуществить аэрацию, перемешивание в толстом слое субстрата, в качестве которого в основном используются солома злаковых культур, опилки, кукурузные стебли и кочерыжки, пни деревьев, и поддерживать определенную температуру на указанных участках.

Разработанный в 50-е годы глубинный способ культивирования базидиальных грибов имеет решающее значение в ликвидации огромного дефицита белка и других физиологически активных веществ. Экспериментально установлено, что мицелий, полученный в условиях глубинного культивирования по качественному составу основных питательных компонентов, сходен с плодовыми телами этих грибов. Грибной белок содержит все незаменимые аминокислоты, переваримость его достигает 80-90%, является хорошим источником витаминов, в нем содержится больше витаминов группы В, С, D, РР, чем в большинстве овощей.

Известен штамм Panus tigrinus (Fr) Sing ИБК-131 - продуцент биомассы (см. авт. свидетельство СССР 883177, кл. С 12 N 15/00, БИ 1981 43), который растет на жидких средах, содержащих:
- пивное сусло (4^o по Баллингу) при рН среды - 6,0-7,0 единиц; максимальный урожай 12 г/л на 12 сутки поверхностного выращивания;
- среда с пептоном, в г/л: глюкоза 30; пептон 30; К₂НРO₄ - 2,0; КСl - 1,2; MgSO₄•7Н₂О - 0,25; рН среды - 6,5 единиц, урожай на 7 стуки глубинного культивирования - 17 г/л;
- минеральная среда с мелассой, в г/л: меласса - 25,0; (NH₄)₂SO₄ - 3,0; К₂НРO₄ - 1,2; дрожжевой экстракт - 2,0; рН среды 6,5 единиц, урожай - 10 г/л;
- минеральная основа, которая добавлялась к различным сложным субстратам (свекловичный жом, клеточный сок картофеля, картофельная мезга, творожная сыворотка), в г/л: NH₄NO₃ - 3,0; КН₂PO₄ - 0,6; К₂НРO₄ - 0,4; MgSO₄•7Н₂O - 0,8; рН среды 6,0 единиц; урожай на 3 сут соответственно равен 13,0 г/л, 12,0 г/л и 15,5 г/л.

Недостатком известного штамма гриба Panus tigrinus ИБК-131 является использование дорогих химических солей и длительность культивирования (7-12 суток), при этом урожай составляет 10-17 г/л.

Известен "Способ выращивания мицелиальных организмов" (см. патент РФ 1636445, кл. С 12 N 1/14, 1/00, БИ 1991 11), в котором выращивание базидиальных грибов Panus tigrinus 8/18, Panus tigrinus 144, а также Streptomyces tumemacerans BKM-502 осуществляют в условиях гидродинамического расслоения культуральной жидкости и локализации мицелия внутри объема культуральной среды в придонном слое. Недостатком известного способа является громоздкость лабораторного оборудования: ферментер, сконструированный из колбы Бунзена или емкость от ферментера АНКУМ-2, оборудованную перемешивающим узлом, подключают к стеклянной бутыли с питательной средой и бутыли для сбора культуральной среды. Через 20, 44 и 58 ч культивирования производят замену культуральной среды на свежую стерильную питательную среду. Процесс останавливают через 92 ч. Всю установку стерилизуют в автоклаве. В способе для культивирования грибов используют дорогие компоненты питательной среды как пептон, глюкоза, крахмал, лактоза, соевая мука, глицерин, сухие дрожжи. Концентрация биомассы к концу процесса составляет 13,1 г/л - 15,6 г/л у базидиомицетов и 9,5 г/л у Streptomyces tumemacerans BKM-502.

Наиболее близким по техническому решению и достигаемому результату является "Способ получения белковой биомассы (см. патент РФ 2126835, кл. С 12 Р 21/00, С 12 N 1/14, С 12 R 1:645, БИ 1999 6), в котором ведут глубинный процесс выращивания штамма гриба Pleurotus ostreatus ВКПМ F-720 отъемно-доливным методом при рН 6,0-7,5 единиц, температуре 26-28^oС на жидком пивном сусле (4^o по Баллингу) с добавлением 0,1% пептона в присутствии ПАВ (костный жир или растительные масла) в течение 92 ч.

Недостатком известного способа является использование дорогостоящих компонентов питательной среды: пептона, растительных масел или костного жира до 1 об.% на объем среды в аппарате. Предлагаемые в способе другие составы как: соевая мука + крахмал, геркулес + глюкоза, кукурузный экстракт + кукурузная мука, соевая мука + крахмал + пептон не обеспечивают снижение цены питательной среды для культивирования высшего базидиального гриба Pleurotus ostreatus ВКПМ F-720.

Технический результат предлагаемого изобретения достигается более быстрым и экономически выгодным способом глубинного культивирования гриба Panus tigrinus 3-204 ВКПМ F-810 на молочной сыворотке без предварительного гидролиза ее серной кислотой. Высушенная биомасса кроме белка характеризуется содержанием целого ряда физиологически активных веществ для медицинской промышленности, например ненасыщенные жирные кислоты, способствующие выведению холестерина из организма человека, полный набор минеральных микро- и макроэлементов в легкоусвояемой форме, что укрепляет здоровье человека, активизирует работу многих ферментных систем. Мицелий, полученный в глубинных условиях, может найти применение в технологии производства плодовых тел в твердофазном культивировании.

Глубинное культивирование высших базидиомицетов с целью получения белкового продукта, а также физиологически активных веществ для медицинской промышленности предполагает оптимальный выбор не только продуцента, но и комплексной питательной среды, не вызывающей претензий со стороны потребителей и удовлетворяющей медико-биологическим требованиям. Поэтому нами в качестве основного компонента питательной среды используется молочная сыворотка, а в качестве пеногасителя предлагается использовать нерафинированное растительное масло в значительно меньшем количестве 0,05 об.% на объем культуральной жидкости. В качестве источника азота предлагается аммоний сернокислый или аммоний фосфорнокислый двузамещенный.

Процесс ферментации ведется в стерильных условиях в периодическом режиме при значительном сокращении времени выращивания - 60-72 ч вместо 92 ч у прототипа и также отъемно-доливным способом с отбором до 40-50% объема культуральной жидкости для фильтрации и последующей сушки биомассы гриба при температуре 60^oС.

Высушенная биомассы гриба Panus tigrinus 3-204 ВКПМ F-810 характеризуется интересным жирокислотным составом - преобладают ненасыщенные жирные кислоты: олеиновая (C_18:1), линолевая (C_18:2), линоленовая (С_18:3), которые необходимы человеческому организму, так как способствуют выведению из него холестерина и препятствуют отложению жира и холестерина на стенках кровеносных сосудов и в печени, а также в сочетании с витаминами, аминокислотами и минеральными веществами активизируют процесс регенерации кожи и волос.

И, наконец, высушенная биомасса гриба имеет приятный грибной запах и полный набор минеральных микро- и макроэлементов в легкоусвояемой органической форме. Обеспечение пищи теми или иными минеральными элементами резко сказывается на состоянии здоровья человека, так, например, кальций необходим организму для формирования и правильного функционирования костной, нервной и гормональной систем, для нормальной свертываемости крови. Магний способствует более полному и нормальному усвоению кальция и вместе с ним поддерживает нервную и мышечную систему. Содержание калия и марганца нормализует работу нервной, мышечной и сердечно-сосудистой систем. [Скворцова М.М. и др. Биологическая активная добавка к пище "Мипро-вит". 1998 г.]
Применяемый в способе штамм-продуцент Panus tigrinus является новым, выделен из природных субстратов - тканевые изоляты плодовых тел.

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов за номером ВКПМ F-810 и хранится в коллекции ГУП "ГосНИИсинтезбелок" под номером 3-204.

Исследуемый штамм Panus tigrinus относится к классу Basidiomicetes, подклассу Homobasidiomycetidae, порядку Tricholomatales, семейству Pleuroteceae, роду Panus, виду tigrinus.

Условия культивирования: агаризованное сусло или мальц-агар, температура 30-34^oС. Условия хранения: в пробирках с агаризованным суслом при +4^oС до 6 месяцев без пересева.

Культурально-морфологические признаки:
- культура растет на сусло-агаре (СА) с средней скоростью, радиальная скорость роста и ростовой коэффициент представлены в таблице.

При инкубировании при температуре 4^o и 40^oС не дает обрастания инокулята, однако при помещении в условия с температурой 26^oС восстанавливается рост и образует нормально развитую колонию;
- колония на среде СА белая, шелковистая или шерстисто-войлочная, затем кожистая с бежевыми или коричневатыми пятнами, образованная низким сцепленным мицелием. Край колонии поднимающийся. Внешняя линия колонии гладкая;
- реверзум у молодой колонии неизмененный, затем побелевший;
- эксудат отсутствует;
- образует в культуре в чашках Петри на среде СА стадию телеоморфы;
- образует хламидоспоры;
- пряжки нерегулярные, одиночные, большие, крутоизогнуто-скошенные, мидальонные, часто прорастающие;
- гифы генеративные и вегетативные диаметром 0,7-1,4 мкм и 2,0-2,5 мкм;
- в культуре на СА образует кристаллы игольчатой формы.

Цветовые химические реакции: реакция Бавендамма (присутствие фенолоксидаз) с галловой кислотой положительная.

Протеолитическая активность:
- водный и мясопептонный желатин разжижает;
- молоко свертывает, не пептонизирует.

Отношение к антибиотикам: устойчив к ампициллину, канамицину, карбенициллину, левомицетину, рифампицину, тетрациклину, фузидину.

Культура относится к съедобным грибам и непатогенна.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1. Штамм базидиального гриба Panus tigrinus 3-204 ВКПМ F-810 выращивают на сусло-агаре в чашках Петри при температуре 32-34^oС. Затем переносят культуру стерильно лопаточной в качалочные колбы, содержащие 200 мл питательной среды, состоящей из 80-100 г/л сухой сыворотки или полностью из нативной молочной сыворотки с добавкой 0,250 г/л аммония сернокислого или 0,125 г/л двузамещенного аммония фосфорнокислого, рН среды после стерилизации 5,8-6,2.

Выращивание культуры проводят на качалке с 180-200 об/мин при температуре 32-34^oС в течение 48-60 ч. Затем выращенный посевной материал в виде мелких глобул стерильно переносят в 6-литровую стерильную колбу для засева ферментера рабочим объемом 100 л, в котором предварительно стерилизуют вышеуказанную питательную среду. Процесс ферментации протекает в течение 60-72 ч в условиях аэрации (V воздуха = 0,8-1 л/л среды в минуту) с автоматической подтитровкой 3%-ным раствором NaOH, скорость вращения мешалки - 200-250 об/мин.

На начальной стадии выращивания гриба в течение 18-20 ч образующуюся пену гасили стерильным подсолнечным нерафинированным маслом в концентрации 0,05 об.% к объему культуральной жидкости. К концу первых суток ферментации пенения дальше не наблюдалось.

Выход сухой биомассы гриба составил 20-23 г/л с питательной среды, содержание сырого протеина - 36-40% к АСВ, липидов - 3,2% к АСВ, относительное содержание жирных ненасыщенных кислот: олеиновой (C_18:1) - 23,2%, линолевой (C_18:2) - 13,6%, линоленовой (С_18:3) - 1,3%. Штамм обеспечивает низкое содержание нуклеиновых кислот 2,85% к АСВ, углеводов - 28,6%, органических кислот - 10,2 г/л, золы - 17,6%. Важно отметить, что в золу входит полный набор минеральных микро- и макроэлементов в легкоусвояемой органической форме, в 1 г: кальция - 45,8 мг, магния - 2,2 мг, калия - 9,87 мг, марганца - 4,5 мкг.

Пример 2. Штамм базидиального гриба Panus tigrinus 3-204 ВКПМ F-810 выращивают в 100-литровом ферментере по прописи среды, указанной в примере 1. Процесс ферментации продолжается 60 ч в условиях аэрации (воздуха 0,8-1,0 л/л•мин). После истечения этого времени стерильно отбирают выросшую биомассу в количестве 40-50% от всей культуральной жидкости на фильтрацию и последующую сушку, а аппарат доливают стерильной питательной средой, при этом подсолнечное масло не добавляется.

Выход сухой биомассы составил 17-25 г/л среды, имеющей грибной аромат. Содержание сырого протеина составило - 36-40% к АСВ, липидов - 3,2% к АСВ, относительное содержание жирных ненасыщенных кислот: олеиновой (C_18:1) - 25,2%, линолевой (C_18:2) - 14,6%, линоленовой (C_18:3) - 1,25%. Содержание нуклеиновых кислот - 2,4% к АСВ, углеводов 27,0%, органических кислот - 11,1 г/л, золы - 13,4%. Отмытая водой биомасса штамма обладает грибным ароматом.

Таким образом, предлагается более экономичный способ глубинного получения биомассы съедобного базидиального гриба Panus tigrinus 3-204 ВКПМ F-810, обеспечивающий кроме белка ряд физиологически активных веществ для медицинской промышленности, с другой стороны, глубинный мицелий выращенный в аппарате может найти применение в технологии производства плодовых тел как один из способов быстрого получения большого количества посевного материала и обеспечения оптимальных условий роста гриба в вегетативной фазе (см. фото).

Способ может быть использован в биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности, кормопроизводстве. Белковую биомассу получают путем глубинного культивирования Panus tigrinus 3-204 ВКПМ F-810 на молочной сыворотке в условиях аэрации при рН 5,8-6,5, температуре 32-34^oС, с последующим отделением биомассы. Предпочтительно используется отъемно-доливной метод культивирования в течение 60 ч с отъемом культуры в количестве 40-50% от общего объема культуральной жидкости. Способ позволяет получать биомассу с высоким содержанием белка и рядом физиологически активных веществ (ненасыщенные жирные кислоты и полный набор минеральных макро- и микроэлементов в легкоусвояемой форме), активизирующих работу многих ферментных систем организма человека. 1 з.п.ф-лы, 1 ил., 1 табл.

1. Способ получения физиологически активной белковой биомассы путем глубинного культивирования гриба Panus tigrinus на питательной среде в условиях аэрации с последующим отделением биомассы, отличающийся тем, что используют штамм Panus tigrinus 3-204 ВКПМ F-810, а культивирование осуществляют на молочной сыворотке при рН 5,8-6,5, температуре 32-34^oС. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование ведут отъемно-доливным методом в течение 60 ч с отъемом культуры в количестве 40-50% от общего объема культуральной жидкости.