СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОЙ БИОМАССЫ ГРИБА Российский патент 2002 года по МПК C12P21/00 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой, кормовой и медицинской промышленности.

Одним из перспективных ресурсов увеличения белка и других физиологически активных веществ, применяемых в пищевой, кормовой и медицинской промышленности, является крупнотоннажное глубинное культивирование базидиальных грибов на различных дешевых отходах: гидролизной, спиртовой, пищевой промышленности, сельского хозяйства, например различные гидролизаты, этиловый спирт, меласса, кукурузный экстракт, молочная сыворотка, растительные отвары крапивы, картофеля, моркови, коры дуба, переработка фруктов и др. Все ценные съедобные грибы, традиционно употребляемые человеком для питания, относятся к высшим базидиомицетам [Бухало А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. 1988 г.].

Известен способ получения белковой биомассы (см. патент РФ 2092559, кл. С 12 Р 21/00, С 12 N 1/14, С 12 R 1:645, БИ 1997 г., 28) путем выращивания штамма Pleurotus ostreatus ВКПМ F-697 в 100 литровом ферментере в условиях аэрации 0,5 л воздуха/л среды на жидком пивном сусле (4^o по Баллингу), содержащем 0,1% пептона и с добавкой ПАВ (костный жир или растительные масла) в количестве 0,1-3,0% об. на объем питательной среды, при рН среды 6,0-7,5. Посевной материал штамма Pleurotus ostreatus ВКПМ F-697 предварительно подвергается "захолаживанию" при температуре 4-6^oС в течение 4-24 ч. Выход сухой биомассы - 13-23 г/л, содержание сырого протеина - 20-50%. Недостатком известного способа является большой расход дорогостоящего ПАВ - костного жира или растительного масла - до 3%, пептона, крахмала, глюкозы в качестве компонентов питательной среды, увеличение срока подготовки посевного материала предварительным "захолаживанием" его до 24 ч.

Наиболее близким по техническому решению и достигаемому результату является "Способ получения белковой биомассы" (см. патент РФ 2126835, кл. С 12 Р 21/00, С 12 N 1/14, С 12 R 1:645, БИ 1999 г., 6), где выращивают в глубинных условиях базидиальный гриб Pleurotus ostreatus ВКПМ F-720 отъемно-долевным методом с предварительным приемом "захолаживания" посевного материала при 4-12^oС в течение 4-8 ч. Ферментацию ведут на пивном сусле (4^o по Баллингу) с добавкой 0,1% пептона и до 1% растительного масла в течение 92 ч. Выход составил 13-20 г/л. Недостатком известного способа является использование дорогостоящего компонента питательной среды пептона и растительного масла до 1% об. на объем среды. Предлагаемые в способе другие составы питательной среды, как соевая мука + крахмал, геркулес + глюкоза, кукурузный экстракт + кукурузная мука или соевая мука + крахмал + пептон, не обеспечивают снижение цены питательной среды для культивирования высшего базидиального гриба Pleurotus ostreatus ВКПМ F-720.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в разработке более экономичного и быстрого способа получения белковой биомассы и ряда физиологически активных веществ для медицинских целей при глубинном культивировании нового штамма гриба Pleurotus ostreatus 2-204 ВКПМ F-811 на отходах пищевой промышленности, т.е. на молочной сыворотке, как нативной, уходящей с многих молочных заводов на очистные сооружения, так и сухой без предварительного гидролиза ее серной кислотой.

На крупных заводах, обеспеченных электроэнергией, производят сгущение и сушку творожной сыворотки и продают в виде сухой сыворотки для комбикормовой, пищевой промышленности как продукт дальнейшей переработки.

Глубинное культивирование высших базидиомицетов с целью получения белкового продукта, а также физиологически-активных веществ для медицинской промышленности предполагает оптимальный выбор не только продуцента, но и комплексной питательной среды, не вызывающей претензий со стороны потребителей и удовлетворяющей медико-биологическим требованиям. Поэтому нами в качестве основного компонента питательной среды используется молочная сыворотка, а в качестве пеногасителя предлагается использовать нерафинированное растительное масло. В качестве источника азота предлагается аммоний сернокислый или аммоний фосфорнокислый двузамещенный. Процесс ферментации ведется в стерильных условиях в периодическом режиме при значительном сокращении времени выращивания - 60-72 ч вместо 92 ч у прототипа и также отъемно-доливным способом с отбором до 40-50% объема культуральной жидкости для фильтрации и последующей сушки биомассы гриба при температуре 60^oС.

Мицелий, полученный в глубинных условиях, может найти применение в технологии производства плодовых тел для твердофазного культивирования как один из способов быстрого получения посевного материала.

Высушенная биомассы гриба Pleurotus ostreatus характеризуется интересным жирнокислотным составом - преобладают ненасыщенные жирные кислоты: олеиновая (C_18:1), линолевая (C_18:2), линоленовая (С_18:3), которые необходимы человеческому организму, так как способствуют выведению из него холестерина и препятствуют отложению жира и холестерина на стенках кровеносных сосудов и в печени, а также в сочетании с витаминами, аминокислотами и минеральными веществами активизируют процесс регенерации кожи и волос.

В целом предлагаемый способ позволяет получать пищевой мицелий высшего гриба Pleurotus ostreatus 2-204 на дешевом субстрате, с минимальными затратами на ферментацию и временем культивирования. Биомасса гриба имеет грибной аромат и содержит ряд физиологически активных веществ.

Применяемый в способе штамм-продуцент Pleurotus ostreatus 2-204 ВКПМ F-811 является новым, выделен из природных субстратов - тканевые изоляты плодовых тел гриба. Глубинный мицелий, отобранный из аппарата, при высевах на плотные среды образует плодовые тела со зрелыми спорами, что может быть использовано для быстрой его идентификации по макропризнакам. Культура депонирована во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика за номером ВКПМ F-811 и хранится в коллекции института ГУП "ГосНИИсинтезбелок".

Характеристики штамма
Выделенный штамм гриба относится к классу Basidiomicetes, подклассу Homobasidiomycetidae, порядку Tricholomatales, семейству Pleuroteceae, роду Pleurotus, виду ostreatus.

Условия культивирования: агаризованное сусло или мальц-агар, температура 26^oС. Условия хранения: в пробирках с агаризованным суслом при +4^oС до 6 месяцев без пересева.

Культурально-морфологические признаки:
- культура растет на сусло-агаре (СА) с средней скоростью, радиальная скорость роста и ростовой коэффициент представлены в таблице.

При 4^oС в течение 7 суток наблюдается только обрастание инокулята, при помещении в условия с температурой 26^oС восстанавливается нормальный рост колонии. При 40^oС обрастания нет, при помещении в условия с температурой 26^oС восстановления роста не происходит.

- колония на среде СА белая, пушистая, с ясно выраженной у молодой культуры концентрической зональностью, при старении кожистая; край колонии прижатый, у молодой колонии - поднимающийся; внешняя линия колонии гладкая;
- реверзум побелевший;
- эксудат отсутствует;
- образует в культуре на среде СА стадию телеоморфы;
- анаморфы не наблюдается;
- пряжки одиночные, большие и маленькие, крутоизогнутые и скошенные без зазора и с зазором, наблюдаются на гифах большого и малого диаметров;
- гифы скелетные и тонкостенные двух диаметров 2,8-3,5 мкм и 1,5-2,1 мкм.

Цветовые химические реакции: реакция Бавендамма (присутствие фенолоксидаз) с галловой кислотой положительная.

Протеолитическая активность:
- водный и мясопептонный желатин разжижает;
- молоко свертывает, не пептонизирует.

Устойчивость к антибиотикам: устойчив к ампициллину, канамицину, карбенициллину, левомицетину, рифампицину, стрептомицину, тетрациклину, фузидину.

Культура относится к съедобным грибам и непатогенна.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления предлагаемого изобретения.

Пример 1. Культуру высшего гриба Pleurotus ostreatus 2-204 ВКПМ F-811 выращивают на сусло-агаре в чашках Петри при температуре 26-28^oС. Затем переносят культуру стерильной лопаточкой в качалочные колбы объемом 750 мл, где приготовлена питательная среда, содержащая 80 г/л сухой сыворотки, 0,250 г/л (NH₄)₂SO₄ или 0,125 г/л (NH₄)₂HPO₄ и 100 мкг/л тиамина только для засевного материала (вносят стерильно отдельно). Выращивание штамма проводят на качалке с 180-200 об/мин при температуре 26-28^oС, рН среды 5,8-6,2 в течение 48-60 ч. Затем выращенный посевной материал в виде мелких глобул стерильно переносят в 6 литровую стерильную колбу для засева ферментера рабочим объемом 100 л. В аппарате "Ферматрон" предварительно была простерилизована питательная среда при 0,7 атм в течение 40-45 мин, состоящая из 80 г/л сухой сыворотки, 0,250 г/л (NH₄)₂SO₄. Процесс культивирования протекает в течение 60-72 ч в условиях аэрации, расход воздуха составил 0,5-0,8 л/л среды в минуту, с автоматической подтитровкой 3% NaOH. Вращение мешалки соответствовало 200-250 об/мин. На начальной стадии в течение 18-20 ч выращивания гриба образующуюся пену гасили стерильным подсолнечным нерафинированным маслом в концентрации 0,05% об. к рабочему объему аппарата. К концу первых суток ферментации пенения дальше не наблюдалось. Выход сухой биомассы гриба составил 20-23 г/л с питательной среды, содержание сырого протеина - 28-40% к АСВ, липидов - 4,5% к АСВ, относительное содержание жирных ненасыщенных кислот: олеиновой (C_18:1)-19,5%; линолевой (C_18:2)-7,1%; линоленовой (C_18:3)-1,3%. Штамм обеспечивает низкое содержание нуклеиновых кислот - 2,85% к АСВ, углеводов - 18,6%, органических кислот - 8,9 г/л, зола - 12%. Важно отметить, что в состав биомассы входит полный набор минеральных микро- и макроэлементов в легкоусвояемой органической форме в 1 г: кальция - 54,3 мг, калия - 8,3 мг, марганца - 5,6 мкг, натрия - 11,7 мг, магния - 4,5 мг, железа - 0,06 мг, цинка - 0,21 мг, меди - 4,5 мкг.

Пример 2. Штамм базидиального гриба Pleurotus ostreatus 2-204 ВКПМ F-811 выращивали в 100-литровом ферментере по прописи среды, указанной в примере 1. Процесс ферментации продолжался 60 ч в условиях аэрации (объем воздуха 0,8-1,0 л/л мин). По истечении этого времени стерильно отбирали выросшую биомассу в количестве 40-50% от всей жидкости на фильтрацию и последующую сушку при 50-60^oС, а аппарат доливали стерильной питательной средой, при этом подсолнечное масло не добавляли.

Выход сухой биомассы составил 17-25 г/л среды, имеющей грибной аромат, содержание сырого протеина - 28-39% к АСВ, липидов - 4,0% к АСВ, относительное содержание жирных ненасыщенных кислот: олеиновой (C_18:1)-20,1%; линолевой (C_18:2)-7,3%; линоленовой (С_18:3)-1,3%. Содержание нуклеиновых кислот - 2,4% к АСВ, углеводов - 17,9%, органических кислот - 6,48 г/л, зола - 13,4%. Отмытая водой биомасса обладает грибным ароматом.

Таким образом, предлагается более экономичный способ получения биомассы съедобного базидиального гриба Pleurotus ostreatus, обеспечивающий кроме белка ряд физиологически активных веществ для медицинской промышленности. С другой стороны, глубинный мицелий, выращенный в аппарате, может найти применение в технологии производства плодовых тел как один из способов быстрого получения большого количества посевного материала и обеспечения оптимальных условий роста гриба в вегетативной фазе (см. фото).

Использование: биотехнология, пищевая и медицинская промышленность, кормопроизводство. Белковую биомассу получают путем глубинного культивирования штамма Pleurotus ostreatus 2-204 ВКПМ F-811 на питательной среде в условиях аэрации с последующим отделением биомассы. Предпочтительно используется отъемно-доливной метод культивирования в течение 60 ч с отъемом культуры в количестве 40-50% от общего объема культуральной жидкости. Способ позволяет получать биомассу с высоким содержанием белка и рядом физиологически активных веществ (ненасыщенные жирные кислоты и полный набор минеральных макро- и микроэлементов в легкоусвояемой форме), активизирующих работу многих ферментных систем организма человека. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.

1. Способ получения физиологически активной белковой биомассы путем глубинного культивирования гриба Pleurotus ostreatus на питательной среде в условиях аэрации с последующим отделением биомассы, отличающийся тем, что используют штамм Pleurotus ostreatus 2-204 ВКПМ F-811. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование ведут отъемно-доливным методом в течение 60 ч с отъемом культуры в количестве 40-50% от общего объема культуральной жидкости.