Настоящее изобретение относится в своем наиболее широком аспекте к составу, содержащему экстракт растения табак, и/или составу, содержащему соединение формулы I, представленное в данном документе, в частности анатабин, и его соответствующим вариантам применения для снижения уровня инфестации эктопаразитами, в частности насекомыми и/или паукообразными. Также в данном документе представлены способы получения обогащенных экстрактов и/или составов по настоящему изобретению и способы контроля эктопаразитов с использованием экстрактов и/или составов, представленных в данном документе.
Инфестация животных или людей паразитами является чрезвычайно нежелательным явлением. Люди или животные, например лошади, собаки и кошки, могут служить хозяевами для большого числа внутренних и внешних паразитов. Присутствие паразитов может приводить к дискомфорту, ослаблению здоровья и продуктивности и даже смерти. Каждый год, например, миллионы собак и котов в Соединенных Штатах обрабатывают от блох, иксодовых клещей и клещей. Случаи инфестации блохами, иксодовыми клещами и клещами вызывают сильный дискомфорт, при этом заболевание передается домашним питомцам и людям.
Несколько классов инсектицидов являются эффективными для борьбы с паразитами. Например, для лечения животных от инфестации паразитами используются пиретроиды, органофосфаты, органокарбаматы и фенилпиразолы. В последнее время для контроля эктопаразитов у собак и кошек начали применять недавно открытый класс изоксазолинов. Из уровня техники известны различные способы составления противопаразитарных средств. Эти составы включают средства для лечения для перорального применения, диетические добавки, порошки, спреи, средства для лечения для местного применения (например, для погружения и для обливания) и шампуни. Хотя каждый из этих составов характеризуется определенным уровнем эффективности в отношении борьбы с паразитами, составы обычно содержат синтетические инсектициды или репелленты. Синтетические инсектициды, как известно, оказывают на окружающую среду виды влияния, которые являются вредными для людей и животных. Аналогично, пиретрин, который хотя и экстрагируется из цветка хризантемы, является сложным для обработки и стандартизации.
Натуральные инсектициды, т. е. инсектициды, которые содержат натуральные растительные эфирные масла в качестве активного ингредиента, как известно, уничтожают бытовых паразитов, таких как муравьи, тараканы и блохи, при применении натурального инсектицида в виде спрея, порошка или жидкости на место или область, которые необходимо защитить от паразитов, как раскрыто в патентах США №№ 5439690, 5693344, 6114384 и 6531163.
Натуральные соединения или экстракты также были описаны в данной области, например, Jufri et al. (2016) International Journal of PharmTech Research 9, No. 7, pp. 140-145.
Кроме того, листья, порошок, экстракты или средства для окуривания из табака (виды рода Nicotiana) использовались столетиями для контроля сельскохозяйственных вредителей или паразитов медицинского или ветеринарного значения. Однако по причинам безопасности, касающимся основного алкалоида табака - никотина и открытия более специфичных и сильных синтетических пестицидов, в настоящее время коммерчески не доступны никакие продукты на основе никотина. Синтетические неоникотиноиды структурно родственны никотину и широко используются в качестве сельскохозяйственных и ветеринарных пестицидов; однако, в отличие от родственных табаку алкалоидов, синтетические неоникотиноиды характеризуются высокой степенью селективности в отношении никотинового ацетилхолинового рецептора (nAChR) насекомого и сниженным уровнем связывания с никотиновыми рецепторами позвоночных животных. Их уникальные физико-химические свойства (светоустойчивость, нелетучесть и гидрофильность) объясняют их успешное использование в качестве пестицидов, а также их чрезмерное использование, что приводит к сильному загрязнению окружающей среды. Неоникотиноиды в настоящее время стали основной угрозой для выживания экосистем. Доказанное влияние на опылителей, водные и почвенные популяции и более сложный профиль токсичности, чем считалось ранее, способствуют осуществлению инициатив в отношении ограничения или полного запрета их использования в сельском хозяйстве и ухода от использования синтетических пестицидов по всему миру.
Ввиду проблем, ассоциированных с использованием основного алкалоида табака - никотина или структурно родственных синтетических неоникотиноидов, все еще существует необходимость в природных соединениях и композициях для использования для контроля эктопаразитов у людей и/или животных, которые характеризуются лучшим профилем безопасности, чем никотин или синтетические неоникотиноиды благодаря дифференциальному характеру действия и предлагают более экологичное решение.
Решение вышеуказанной технической проблемы охарактеризовано в представленных в данном документе вариантах осуществления и формуле изобретения.
Следовательно, настоящее изобретение относится, помимо прочего, к следующим вариантам осуществления.
1. Состав для снижения уровня инфестации эктопаразитами, содержащий табачный экстракт, обогащенный соединением формулы Ia,
Формула Ia.
2. Применение соединение формулы I или его соли или кристалла для снижения уровня инфестации эктопаразитами,
Формула I,
где
R представляет собой водород или C1-C5алкил, и
представляет собой одинарную или двойную связь.
3. Применение по варианту осуществления 2, где R представляет собой водород или C1-C3алкил.
4. Применение по варианту осуществления 2 или 3, где R представляет собой водород.
5. Применение по любому из вариантов осуществления 2-4, где представляет собой двойную связь.
6. Состав по варианту осуществления 1 или применение по любому из вариантов осуществления 2-5, где эктопаразит относится к классу насекомых или паукообразных, включая блох, иксодовых клещей и клещей.
7. Состав по варианту осуществления 1 или 6 или применение по любому из вариантов осуществления 2-6, где соединение представляет собой анатабин, S-(-) анатабин, R-(+) анатабин, смесь S-(-) анатабина и R-(+) анатабина или рацемат S-(-) анатабина и R-(+) анатабина.
8. Применение по любому из вариантов осуществления 2-7, где состав является таким, как определено в п. 1.
9. Состав по любому из вариантов осуществления 1, 6 или 7, где табачный экстракт получен из Nicotiana tabacum, Nicotiana glutinosa, Nicotiana glauca или Nicotiana debneyi.
10. Состав по варианту осуществления 9, где Nicotiana tabacum представляет собой PMT, TN90 или ITB683.
11. Состав по варианту осуществления 9, где Nicotiana tabacum относится к сорту PMT, TN90, K326, Stella или ITB683.
12. Состав по варианту осуществления 9, где табачный экстракт получен из сорта Nicotiana tabacum, в котором основной алкалоид не представляет собой никотин.
13. Состав по варианту осуществления 1 или применение по любому из вариантов осуществления 2-8, где состав или соединение применяют в виде состава для местного применения, композиции для использования в качестве шампуня, очищающей композиции или композиции для лечения.
14. Состав или применение по варианту осуществления 13, где состав для местного применения, композиция для использования в качестве шампуня, очищающая композиция или композиция для лечения находятся в виде лосьона, крема, мази, геля, пены, пластыря, порошка, твердого вещества, губки, ленты, пара, пасты, настойки или спрея.
15. Состав или применение по варианту осуществления 13 или 14, где состав или соединение применяют в отношении млекопитающего, в частности человека, собаки, кошки, крупного рогатого скота, лошади или овцы.
16. Состав по варианту осуществления 1 или применение по варианту осуществления 2, где состав или соединение применяют в отношении объекта или ткани.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к следующим аспектам.
Аспект 1. Соединение формулы I или его соль или кристалл для применения в снижении уровня инфестации эктопаразитами, предпочтительно для применения в качестве репеллента для снижения уровня инфестации эктопаразитами,
Формула I,
где
R представляет собой водород или C1-C5алкил, и
представляет собой двойную связь.
Аспект 2. Соединение формулы I или его соль или кристалл для применения в лечении инфестации эктопаразитами, предпочтительно для применения в качестве эктопаразитицида в лечении инфестации эктопаразитами,
Формула I,
где
R представляет собой водород или C1-C5алкил, и
представляет собой двойную связь.
Аспект 3. Применение соединения формулы I или его соли или кристалла для снижения уровня инфестации эктопаразитами, предпочтительно в качестве репеллента для снижения уровня инфестации эктопаразитами,
Формула I,
где
R представляет собой водород или C1-C5алкил, и
представляет собой одинарную или двойную связь.
Аспект 4. Применение соединения формулы I или его соли или кристалла для лечения инфестации эктопаразитами, предпочтительно в качестве эктопаразитицида для лечения инфестации эктопаразитами,
Формула I,
где
R представляет собой водород или C1-C5алкил, и
представляет собой одинарную или двойную связь.
Аспект 5. Соединение для применения по аспекту 1 или аспекту 2 или применение по аспекту 3 или аспекту 4, где R представляет собой водород или C1-C3алкил, где предпочтительно R представляет собой водород.
Аспект 7. Соединение для применения по любому из аспектов 1-2 и 5-6 или применение по любому из аспектов 3-6, где представляет собой двойную связь.
Аспект 8. Соединение для применения по любому из аспектов 1-2 и 5-7 или применение по любому из аспектов 3-7, где эктопаразит относится к классу насекомых или паукообразных, включая блох, иксодовых клещей и клещей.
Аспект 9. Соединение для применения по любому из аспектов 1-2 и 5-8 или применение по любому из аспектов 3-8, где соединение представляет собой анатабин, S-(-) анатабин, R-(+) анатабин, смесь S-(-) анатабина и R-(+) анатабина или рацемат S-(-) анатабина и R-(+) анатабина.
Аспект 10. Соединение для применения по любому из аспектов 1-2 и 5-9 или применение по любому из аспектов 3-9, где соединение применяется в виде состава для местного применения, композиции для использования в качестве шампуня, очищающей композиции или композиции для лечения.
Аспект 11. Соединение для применения по аспекту 10 или применение по аспекту 10, где состав для местного применения, композиция для использования в качестве шампуня, очищающая композиция или композиция для лечения находятся в виде лосьона, крема, мази, геля, пены, пластыря, порошка, твердого вещества, губки, ленты, пара, пасты, настойки или спрея.
Аспект 12. Соединение для применения по любому из аспектов 1-2 и 5-11 или применение по любому из аспектов 3-11, где соединение или состав для местного применения применяют в отношении млекопитающего, в частности человека, собаки, кошки, крупного рогатого скота, лошади или овцы.
Аспект 13. Соединение для применения по любому из аспектов 1 и 5-11 или применение по любому из аспектов 4-11, где соединение применяют в отношении объекта или ткани.
Аспект 14. Состав для снижения уровня инфестации эктопаразитами, содержащий табачный экстракт, обогащенный соединением формулы Ia,
Формула Ia.
Аспект 15. Состав по аспекту 14 для применения в качестве эктопаразитицида.
Аспект 16. Состав по аспекту 14 для применения в качестве репеллента.
Аспект 17. Состав по аспекту 14 или состав для применения по аспекту 15 или 16, где табачный экстракт получен из Nicotiana tabacum, Nicotiana glutinosa, Nicotiana glauca или Nicotiana debneyi.
Аспект 18. Состав или состав для применения по аспекту 17, где сорт Nicotiana tabacum представляет собой PMT, TN90, K326, Stella или ITB683, предпочтительно PMT, TN90 или ITB683.
Аспект 19. Состав или состав для применения по аспекту 17, где табачный экстракт получен из сорта Nicotiana tabacum, в котором основной алкалоид не представляет собой никотин.
Аспект 20. Состав по любому из аспектов 14 и 17-19 или состав для применения по любому из аспектов 15-19, где эктопаразит относится к классу насекомых или паукообразных, включая блох, иксодовых клещей и клещей.
Аспект 21. Состав по любому из аспектов 14 и 17-20 или состав для применения по любому из аспектов 15-20, где соединение представляет собой анатабин, S-(-) анатабин, R-(+) анатабин, смесь S-(-) анатабина и R-(+) анатабина или рацемат S-(-) анатабина и R-(+) анатабина.
Аспект 22. Состав по любому из аспектов 14 и 17-21 или состав для применения по любому из аспектов 15-21, где состав применяют в виде состава для местного применения, композиции для использования в качестве шампуня, очищающей композиции или композиции для лечения.
Аспект 23. Состав по аспекту 22 или состав для применения по аспекту 22, где состав для местного применения, композиция для использования в качестве шампуня, очищающая композиция или композиция для лечения находятся в виде лосьона, крема, мази, геля, пены, пластыря, порошка, твердого вещества, губки, ленты, пара, пасты, настойки или спрея.
Аспект 24. Состав по любому из аспектов 14 и 17-23 или состав для применения по любому из аспектов 15-23, где состав применяют в отношении млекопитающего, в частности человека, собаки, кошки, крупного рогатого скота, лошади или овцы.
Аспект 25. Состав по любому из аспектов 14 и 17-24 или состав для применения по любому из аспектов 15-24, где состав или соединение применяют в отношении объекта или ткани.
Аспект 26. Состав по любому из аспектов 14 и 17-25 или состав для применения по любому из аспектов 15-25, где содержание соединения формулы Ia в табачном экстракте выше, чем в необработанном растении табак.
Аспект 27. Состав или состав для применения по аспекту 26, где соединение формулы Ia получено способом, включающим по меньшей мере одну стадию, которая обеспечивает определенную степень обогащения соединением формулы Ia.
Аспект 28. Состав или состав для применения по аспекту 26 или аспекту 27, где относительное содержание соединения формулы I, содержащегося в экстракте по настоящему изобретению, повышен на 1%.
Аспект 29. Состав или состав для применения по аспекту 26 или аспекту 27, где относительное содержание соединения формулы I, содержащегося в экстракте по настоящему изобретению, повышается на 1%-2%.
Аспект 30. Состав или состав для применения по аспекту 26 или аспекту 27, где относительное содержание соединения формулы I, содержащегося в экстракте по настоящему изобретению, повышен на по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50%.
Аспект 31. Состав по любому из аспектов 14 и 17-30 или состав для применения по любому из аспектов 15-30, где табачный экстракт обогащен таким образом, что содержание соединения формулы Ia в табачном экстракте является на по меньшей мере 1% выше, чем в необработанном растении табак, из которого получен табачный экстракт.
Аспект 32. Состав по любому из аспектов 14 и 17-31 или состав для применения по любому из аспектов 15-31, где табачный экстракт обогащен таким образом, что содержание соединения формулы Ia в табачном экстракте является на по меньшей мере 1% выше, чем в необработанном растении табак сорта Nicotiana tabacum Stella.
Аспект 33. Состав по любому из аспектов 14 и 17-32 или состав для применения по любому из аспектов 15-32, где табачный экстракт обогащен таким образом, что он содержит на по меньшей мере 1% по весу больше соединения формулы Ia, чем экстракт, получаемый экстракцией листьев растения вида Nicotiana tabacum сорта Stella возрастом 4 месяца, которые были высушены при 60°C и относительной влажности 70% в течение 24 часов и затем измельчены с использованием 10 мл метанола на г измельченных листьев, при температуре 60°C.
Таким образом, настоящее изобретение относится к составу для снижения уровня инфестации эктопаразитами, содержащему табачный экстракт, обогащенный соединением формулы Ia,
Формула Ia.
Это конкретный пример соединения формулы I:
Формула I,
где
R представляет собой водород или C1-C5алкил, и
представляет собой одинарную или двойную связь.
В контексте настоящего изобретения понятно, что термин эктопаразит охватывает организмы, которые живут на коже или наружных покровах, таких как чешуя, перья, волосы, другого организма (организма-хозяина) в течение различных периодов, и в частности организмы, которые зависят от другого организма в отношении питания, например высасываемой крови. А именно, термин эктопаразит включает как те организмы, которые остаются на коже или наружных покровах организма-хозяина в течение относительно длительного периода, такие как иксодовые клещи и блохи, так и организмы, которые остаются на хозяине в течение относительно короткого времени, такие как москиты и мухи цеце, которые могут называться временными эктопаразитами.
Авторы настоящего изобретения неожиданно и непредвиденно обнаружили, что соединения формулы I, в частности анатабин, характеризуются улучшенным эффектом в отношении снижения уровня инфестации эктопаразитами, в частности насекомыми или паукообразными, включая блох, иксодовых клещей и клещей, в частности иксодовых клещей. Как показано в прилагаемых примерах, эффект соединений формулы I, в частности анатабина, является, в частности, улучшенным относительно эффекта никотина, который рассматривается в уровне техники как наиболее эффективный репеллент, содержащийся в табачных экстрактах. Следовательно, настоящее изобретение, помимо прочего, относится к составам для снижения уровня инфестации эктопаразитами, содержащим табачный экстракт, который обогащен в отношении присутствия соединений формулы Ia, в частности анатабина.
Как показано на фиг. 3a и 3b, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что анатабин в своем исходном виде является значительно лучшим репеллентом от москитов, чем в виде HCl-соли. Таким образом, в настоящем изобретении предпочтительно, чтобы анатабин использовался в виде свободного основания.
В настоящем изобретении термин «обогащенный» означает, что содержание соединения формулы Ia, в частности анатабина, в составе, содержащем табачный экстракт по настоящему изобретению, является повышенным по сравнению с содержанием, ожидаемым специалистом в данной области техники, в частности по сравнению со средним содержанием, обнаруживаемым в табачных экстрактах, известным в данной области техники. Поскольку авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что соединения формулы Ia, в частности анатабин, показывают более высокую эффективность в качестве репеллентов/эктопаразитицидов, предпочтительно репеллентов, по сравнению с никотином или обогащенными никотином экстрактами, составы, содержащие табачные экстракты по настоящему изобретению, которые обогащены в отношении присутствия соединений формулы Ia, в частности анатабина, характеризуются неожиданно более высокой эффективностью в отношении снижения уровня инфестации эктопаразитами, в частности насекомыми и/или иксодовыми клещами.
Предпочтительно термин «обогащенный» указывает на то, что содержание соединения формулы Ia в табачном экстракте на по меньшей мере 1% выше, чем в необработанном растении табак, из которого получают табачный экстракт. Также предпочтительно термин «обогащенный» указывает на то, что табачный экстракт характеризуется содержанием соединения формулы Ia в табачном экстракте, которое на по меньшей мере 1% выше, чем в необработанном растении табак вида Nicotiana tabacum сорта Stella. Также предпочтительно, термин «обогащенный» указывает на то, что табачный экстракт содержит на по меньшей мере 1% по весу больше соединения формулы Ia, чем экстракт, полученный экстракцией листьев растения вида Nicotiana tabacum сорта Stella возрастом 4 месяца при таких же условиях и с использованием такого же растворителя, как и используемый для получения заявленного табачного экстракта. Также предпочтительно, термин «обогащенный» указывает на то, что табачный экстракт содержит на по меньшей мере 1% по весу больше соединения формулы Ia, чем экстракт, полученный экстракцией листьев растения вида Nicotiana tabacum сорта Stella возрастом 4 месяца (предпочтительно традиционно выращенного до полного созревания и предпочтительно подвергнутого процессу прищипывания верхушек (удаления цветущих частей)), которые были высушены при 60°C и относительной влажности 70% в течение 24 часов и затем измельчены с использованием 10 мл метанола на г измельченных листьев при температуре 60°C. Экстракция листьев предпочтительно проводится следующим образом. Все листья растения высушивают в печи при 60°C и относительной влажности 70% в течение 24 ч. и измельчают путем встряхивания со стеклянными шариками при 400 об./мин. в течение 8 ч. Для каждого выбранного сорта/вида табака 2 г порошка измельченных листьев помещают в стеклянные бутылки объемом 50 мл. К измельченным листьям добавляют двадцать мл метанола (например, степени чистоты для высокоэффективной жидкостной хроматографии, ≥ 99,9%, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США) при 60°C. Затем смесь подвергают ультразвуковой обработке (например, с использованием установки ультразвуковой очистки 3510-DTH компании Branson; Данбери, штат Коннектикут, США) в течение 30 мин. и декантируют в фильтровальной колонне, содержащей бумажный фильтр (диаметр 125 мм, целлюлозная бумага; предпочтительно Whatman®, Мейдстон, Великобритания). Фильтрат подвергают ультразвуковой обработке с использованием 20 мл метанола и снова фильтруют. Полученный фильтрат затем помещают в роторный испаритель для удаления растворителя, а оставшийся экстракт дополнительно лиофилизируют (например, Labconco, кат. №7934030; Канзас-Сити, штат Миссури, США) в течение 16 ч. (до полного удаления воды).
Кроме того, термин «обогащенный» может указывать на то, что весовое соотношение содержания соединения формулы Ia в табачном экстракте и содержания никотина в экстракте составляет 0,05 или больше, предпочтительно 0,1 или больше, более предпочтительно 0,2 или больше, еще более предпочтительно 0,5 или больше, еще более предпочтительно 1,0 или больше, еще более предпочтительно 2,0 или более или даже 4,0 или более.
В настоящем изобретении снижение уровня инфестации эктопаразитами может достигаться за счет отталкивающей активности состава или соединения по настоящему изобретению и/или уничтожающей активности состава или соединения по настоящему изобретению. Таким образом, составы или соединения по настоящему изобретению могут иметь как отталкивающую, так и уничтожающую активность, или отталкивающую, или уничтожающую активность в отношении эктопаразитов, таких как насекомые и/или иксодовые клещи. Отталкивающую и/или уничтожающую активность можно определять с помощью способов, представленных в данном документе, в частности способов, используемых в данном документе ниже в разделе примеров. В настоящем изобретении предпочтительно, чтобы достигалось снижение уровня инфестации на по меньшей мере 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% по сравнению с контролем без активного ингредиента и при применении идентичного метода анализа.
В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению соединения формулы I или его соли или кристалла, в частности анатабина, для контроля эктопаразитов, в частности насекомых и/или иксодовых клещей, предпочтительно насекомых, где формула I представляет собой
Формула I,
где
R представляет собой водород или C1-C5алкил, и
представляет собой одинарную или двойную связь.
Примеры C1-C5алкильной группы включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил (амил), 2-пентил (втор-пентил), 3-пентил, 2-метилбутил, 3-метилбутил (изопентил или изоамил), 3-метилбут-2-ил, 2-метилбут-2-ил и 2,2-диметилпропил (неопентил).
В настоящем изобретении предпочтительно, чтобы R представлял водород или C1-C3алкил.
Также предпочтительно, чтобы R представлял водород.
В дополнение или альтернативно, предпочтительно, чтобы представлял двойную связь.
Соединение, используемое в данном документе или содержащееся в составе по настоящему изобретению, может быть в чистом виде или объединено, например, с подходящим вспомогательным веществом или добавкой.
В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения соединение представляет собой анатабин. В настоящем изобретении анатабин может представлять собой рацемат, или одна энантиомерная форма может присутствовать в энантиомерном избытке. Следовательно, анатабин может представлять собой S-(-) анатабин или R-(+) анатабин, или он может присутствовать в виде любого соотношения обеих энантиомерных форм.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения соединение формулы Ia, представленное в данном документе, в частности анатабин, представлен в виде экстракта из растения. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения растение представляет собой табак.
В настоящем изобретении предпочтительно, чтобы растение табак относилось к виду Nicotiana tabacum, Nicotiana glutinosa, Nicotiana glauca или Nicotiana debneyi. Особенно предпочтительно, чтобы Nicotiana tabacum представляло собой растение табак TN90, ITB683 или PMT. Nicotiana tabacum может также предпочтительно представлять собой растение табак K326 или Stella.
Также предпочтительно, чтобы табачный экстракт был получен из сорта Nicotiana tabacum, в котором основной алкалоид не представляет собой никотин.
Термин PMT, используемый в данном документе, относится к мутантным растениям табак, в которых биосинтез никотина был модифицирован, что привело к снижению количества получаемого никотина и увеличению количества соединений формулы I. Биосинтез никотина начинается с метилирования полиамина путресцина с получением N-метилпутресцина с помощью фермента путресцин-N-метилтрансферазы (PMT) с использованием S-аденозилметионина в качестве кофактора. Эта первая стадия, в результате которой образуются метаболиты-предшественники для биосинтеза никотина. Согласно системе классификации ферментов PMT-ферменты классифицируются как EC 2.1.1.53. В геноме табака известны пять генов, которые кодируют путресцин-N-метилтрансферазы, обозначенные как PMT la, PMT lb, PMT2, PMT3 и PMT4. Рассматриваются растения табак, в которых активность любого одного или более из этих генов PMT можно использовать преимущественно для обеспечения исходного источника экстракта по настоящему изобретению. Активность любого одного или более из этих генов PMT можно снижать с помощью методик рекомбинантной ДНК, таких как методики с использованием антисмысловых нуклеотидов, в частности РНК-интерференции. Альтернативно, можно применять традиционную селекцию для создания (с помощью мутагенеза), отбора и селекции мутантных растений, содержащих мутацию(мутации) в любом одном или более из этих генов, которые обеспечивают продуцирование меньшего количества никотина. Применение мутантных растений табак (PMT), полученных трансгенными методами, или применение стабильных мутантных растений табак охватывается настоящим изобретением. Примеры растений табак PMT описаны в WO 2015157359, который включен в данный документ посредством ссылки.
В настоящем изобретении соединение формулы I, в частности анатабин, или формулы Ia в виде экстракта или состава по настоящему изобретению можно применять в виде состава для местного применения.
Специалисту в данной области техники известны различные составы для местного применения. В настоящем изобретении, однако, предпочтительно, чтобы состав для местного применения был в виде лосьона, крема, мази, геля, пены, пластыря, порошка, твердого вещества, губки, ленты, пара, пасты или настойки. Состав для местного применения может, кроме того, предпочтительно быть выбран из жидких составов, таких как составы для обливания, точечного нанесения и распыления.
Следовательно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения соединение применяют в отношении кожи млекопитающего, в частности человека, собаки, кошки, крупного рогатого скота или лошади.
Хотя соединение, экстракт, состав по настоящему изобретению являются эффективными в отношении широкого ряда паразитов, в настоящем изобретении предпочтительным является, что паразит представлял собой эктопаразита, в частности эктопаразита из типа членистоногие, более конкретно эктопаразита из класса насекомые или паукообразные, включая блох, иксодовых клещей и клещей.
Следовательно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено применение соединения, экстракта или состава по настоящему изобретению в качестве инсектицида или эктопаразитицида.
В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено применение соединения, экстракта или состава по настоящему изобретению в качестве репеллента от насекомых или репеллента от эктопаразитов.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения состава, содержащего экстракт растения табак, при этом способ включает стадии (a) получения измельченного порошка из листьев растения табак; (b) добавления в измельченный порошок растворителя для экстракции, в одном варианте осуществления метанола; (c) необязательно ультразвуковой обработки смеси, полученной на стадии (b); (d) фильтрации смеси, при этом стадию (d) предпочтительно повторяют несколько раз; (e) выпаривания фильтрата, полученного на стадии (d); и (f) необязательно лиофилизации экстракта.
Также в данном документе предусмотрены составы, содержащие экстракты, полученные способом, представленным выше в данном документе.
Дополнительные аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения станут очевидными далее в данном описании.
Фиг. 1. Схематическое изображение теста на отталкивающую способность у иксодовых клещей. 30-60 личинок иксодовых клещей располагали на необработанной области круглого поля (8,96 см2), при этом одна четверть поверхности круга (2,25 см2) была обработанной. Через 1 минуту распределение иксодовых клещей в обработанной и необработанной областях измеряли в течение 2 минут. Эффект отталкивания/сдерживания выражен в %: 100% означает, что иксодовые клещи полностью избегали обработанной поверхности. Токсичность измеряли в такой же схеме в течение 8 минут, и смертность выражали в % снижения подвижности между началом и концом периода продолжительностью 8 минут. Дозировки выражены в виде количества (мг или молярность) на единицу поверхности (м2) после осаждения соединения или экстракта на дне лунки. Чистые соединения: доза представлена в микромоль/м2; экстракты: доза представлена в микрограммах/м2. Тесты проводили по три раза.
Фиг. 2. Отталкивающая активность восьми экстрактов табачных листьев в отношении (A) личинок иксодовых клещей R. sanguineus, (B) взрослых особей иксодовых клещей R. sanguineus и (C) нимф Ixodes ricinus. Для каждой концентрации показаны медианные значения эффективности, рассчитанные по трем повторам тестов. N, N-диэтил-м-толуамид (DEET) использовали в качестве положительного контроля и тестировали только при 8,5 мг/м2, при тестируемой концентрации помимо отталкивающей способности также определяли активность, представляющую собой нокдаун-эффект, в отношении иксодовых клещей в процентах. Мониторинг отталкивающей способности осуществляли в течение двух минут, начиная через минуту после высвобождения иксодовых клещей в обработанную лунку. Нокдаун-эффект определяли в виде разницы значения подвижности в первую минуту и девятую минуту после высвобождения иксодовых клещей.
Фиг. 3. Данные из анализа отталкивающей способности в отношении москитов для анатабина в виде HCl-соли и в его исходном виде.
Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют те же значения, которые обычно понимает специалист средней квалификации в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение.
Термин «приблизительно» при использовании для характеристики энантиомерного избытка означает ±4% в отношении представленного численного значения, если не указано иное. В каждом варианте осуществления настоящего изобретения «приблизительно» можно удалить.
Термин «предпочтительно» используется для описания признаков или вариантов осуществления, которые не являются необходимыми в настоящем изобретении, но могут приводить к улучшению технических эффектов и, таким образом, являются желательными, но не обязательными.
Относительно численных значений, указанных в данном документе, если явно не указано иное, последний знак после запятой численного значения предпочтительно указывает на его степень точности. Таким образом, если не указаны другие пределы погрешности, максимальный предел предпочтительно устанавливается путем применения правила округления до последнего знака после запятой. Таким образом, значение 2,5 предпочтительно характеризуется пределом погрешности от 2,45 до 2,54.
Настоящее изобретение относится, помимо прочего, к составу для снижения уровня инфестации эктопаразитами, содержащему экстракт табака, обогащенный соединением формулы Ia,
Формула Ia.
Это конкретный пример соединения формулы I:
Формула I,
где
R представляет собой водород или C1-C5алкил, и
представляет собой одинарную или двойную связь.
Соединения формулы I, включая формулу Ia, содержат хиральный атом углерода и могут, таким образом, например, характеризоваться стереохимической структурой, показанной в следующих формулах I-1 и I-2:
I-1
и
I-2,
где применимы определения, указанные относительно формулы I.
Далее, если не указано иное, ссылки, касающиеся соединения формулы I, если рассматривается состав, содержащий экстракт по настоящему изобретению, считаются относящимися к соединению формулы Ia. В контексте применения согласно настоящему изобретению, однако, ссылки, касающиеся соединения формулы I, следует понимать как относящиеся к соединению формулы I в общем, включая его любые соли или кристаллы, и предпочтительно к соединению формулы Ia.
Экстракт считается «обогащенным» в контексте настоящего изобретения, если содержание представленного выше соединения формулы Ia, в частности анатабина, в табачном экстракте является выше, чем в необработанном растении табак. Следовательно, табачный экстракт по настоящему изобретению получают способом, включающим по меньшей мере одну стадию, которая обеспечивает определенную степень обогащения соединением формулы Ia, в частности анатабином.
Соединение формулы Ia, в частности анатабин, может быть обогащенным в любой степени, при условии, что его содержание является повышенным. Например, обогащение может составлять 1%, что означает, что относительное содержание соединения формулы I, в частности анатабина, содержащегося в экстракте по настоящему изобретению, повышен на 1%, например на 1%-2%. В настоящем изобретении предпочтительно, чтобы обогащение представляло собой обогащение на по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50%.
В настоящем изобретении предпочтительно, чтобы соединение формулы I представляло собой анатабин. Как известно специалисту в данной области техники, анатабин может присутствовать в двух энантиомерных формах, S- и R-анатабин. Анатабин, содержащийся в экстракте или составе по настоящему изобретению, может присутствовать в виде любого общего диапазона соотношений R-(+) анатабина и S-(-) анатабина, альтернативно выраженного в виде энантиомерного избытка (R)-(+) анатабина, который, как было неожиданно показано, является еще более эффективным, чем S-(-) анатабин.
Следует понимать, что «соотношение» R-(+) анатабина и S-(-) анатабина при использовании в данном документе относится к весовому соотношению R-(+) анатабина и S-(-) анатабина, если явно не указано иное. Если используются сольваты R-(+) анатабина и/или S-(-) анатабина, из такого расчета, следовательно, необходимо исключить растворитель. Другими словами, «соотношение R-(+) анатабина и S-(-) анатабина» рассчитывается следующим образом: 
Как известно специалисту в данной области техники, соотношение соединений, отличающихся только хиральностью, как, например, в случае R-(+) анатабина и S-(-) анатабина, можно определять с помощью ряда известных в данной области техники способов, включая без ограничения хроматографию с использованием хирального носителя, поляриметрическое измерение угла вращения поляризованного света, ядерную магнитно-резонансную спектроскопию с использованием хиральных сдвигающих реагентов или дериватизацию соединения с использованием хирального соединения, такого как кислота Мошера, с последующей хроматографией или ядерной магнитно-резонансной спектроскопией. Энантиомеры можно также выделять из смесей способами, известными специалистам в данной области техники, включая хиральную высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC) и прямую фракционную кристаллизацию рацемата, т. е. анатабина, с использованием методик хиральной сокристаллизации, в которых используется образование конкретных взаимодействий водородной связи в сокристаллах (см. Springuel GR, et al., 2012; и патент США № 6570036). Пригодные партнеры сокристаллизации включают энантиомеры миндальной кислоты, яблочной кислоты, винной кислоты и их производные; или энантиомеры можно получать путем асимметричного синтеза. См., например, Eliel and Wilen, 1994.
Соотношение R-(+) анатабина и S-(-) анатабина (которое также может называться хиральной чистотой) композиции по настоящему изобретению можно также выражать в виде ее энантиомерного избытка (ee), обычно и предпочтительно определяемого с помощью хиральной HPLC и рассчитываемого с помощью уравнения:
ee=(AR - AS)/(AR+AS) × 100%,
где AR представляет собой площадь пика R-(+) анатабина, а AS представляет собой площадь пика S-(-) анатабина на хроматограмме, полученной при HPLC раствора образца.
Соединение формулы Ia, в частности анатабин, может присутствовать в экстракте или составе по настоящему изобретению или в вариантах применения, предусмотренных в данном документе, в виде сольвата или сокристалла.
В этом отношении в настоящем изобретении «сольват» относится к ассоциации или комплексу одной или более молекул растворителя и либо R-(+) анатабина, либо S-(-) анатабина. Примеры растворителей, которые образуют сольваты, включают без ограничения воду, изопропанол, этанол, метанол, диметилсульфоксид (DMSO), этилацетат, уксусную кислоту и этаноламин. Термин «гидрат» относится к комплексу, где молекулой растворителя является вода.
«Сокристалл» относится к кристаллической структуре, которая содержит по меньшей мере два различных соединения, которые являются твердыми в их чистом виде при условиях окружающей среды. По меньшей мере два различных соединения могут включать R-(+) анатабин и/или S-(-) анатабин и/или любые дополнительные компоненты состава или экстракта, представленных в данном документе. Сокристаллы получают из нейтральных молекулярных частиц, и все частицы остаются нейтральными после кристаллизации; кроме того, обычно и предпочтительно, они являются кристаллическими гомогенными материалами, где два или более составляющих соединения присутствуют в определенном стехиометрическом соотношении. См. в отношении этого Wang Y and Chen A, 2013; и Springuel GR et al., 2012; и патент США № 6570036. Следует понимать, что R-(+) анатабин и S-(-) анатабин могут быть в виде любого полиморфа. Различные сокристаллы и методики получения таких сокристаллов описаны в RSC Drug Discovery, Pharmaceutical Salts and Co-crystals, опубликованной в 2012 г. Royal Society of Chemistry и под ред. Johan Wouters и Luc Quéré, в частности в главах 15 и 16. Предпочтительные примеры компонентов сокристаллов описаны в таблице 16.1 этой ссылки. Еще более предпочтительные сокристаллы включают сокристаллы α-гидроксикислот, α-кетокислот и/или α-кетоамидов с энантиомерами анатабина в соотношениях (R) и (S), раскрытых в данном документе. Примеры α-гидроксикислот включают атролактиновую кислоту, бензиловую кислоту, 4-хлорминдальную кислоту, лимонную кислоту, 3,4-дигидроксиминдальную кислоту, этилпируват, галактуроновую кислоту, глюконолактон, глюкуроновую кислоту, глюкуронолактон, гликолевую кислоту, 2-гидроксибутановую кислоту, 2-гидроксипентановую кислоту, 2-гидроксигексановую кислоту, 2-гидроксигептановую кислоту, 2-гидроксиокстановую кислоту, 2-гидроксинонановую кислоту, 2-гидроксидекановую кислоту, 2-гидроксиундекановую кислоту, 4-гидроксиминдальную кислоту, 3-гидрокси-4-метоксиминдальную кислоту, 4-гидрокси-3-метоксиминдальную кислоту, α-гидроксиарахидоновую кислоту, α-гидроксимасляную кислоту, α-гидроксиизомасляную кислоту, α-гидроксилауриновую кислоту, α-гидроксимиристиновую кислоту, α-гидроксипальмитиновую кислоту, α-гидроксистеариновую кислоту, 3-(2′-гидроксифенил)молочную кислоту, 3-(4′-гидроксифенил)молочную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, миндальную кислоту, метилмолочную кислоту, метилпируват, муциновую кислоту, α-фенилуксусную кислоту, α-фенилпировиноградную кислоту, пировиноградную кислоту, сахарную кислоту, винную кислоту и тартроновую кислоту. Примеры α-кетокислот включают 2-кетоэтановую кислоту (глиоксиловую кислоту), метил-2-кетоэтаноат, 2-кетопропановую кислоту (пировиноградную кислоту), метил-2-кетопропаноат (метилпируват), этил-2-кетопропаноат (этилпируват), пропил-2-кетопропаноат (пропилпируват), 2-фенил-2-кетоэтановую кислоту (бензоилмуравьиную кислоту), метил-2-фенил-2-кетоэтаноат (метилбензоилформиат), этил-2-фенил-2-кетоэтаноат (этилбензоилформиат), 3-фенил-2-кетопропановую кислоту (фенилпировиноградную кислоту), метил-3-фенил-2-кетопропаноат (метилфенилпируват), этил-3-фенил-2-кетопропаноат (этилфенилпируват), 2-кетомасляную кислоту, 2-кетопентановую кислоту, 2-кетогексановую кислоту, 2-кетогептановую кислоту, 2-кетооктановую кислоту, 2-кетодекановую кислоту и метил-2-кетооктаноат. Примеры α-кетоамидов включают любые соединения, получаемые реакцией любого из вышеуказанных примеров α-кетокислот с первичными или вторичными аминами.
Экстракт, соединение или состав по настоящему изобретению также предназначены для применения в контроле насекомых, которые являются паразитами, в частности эктопаразитами, в частности для снижения уровня инфестации ими. Следовательно, настоящее изобретение, помимо прочего, относится к применению экстракта, соединения или состава, предусмотренных в данном документе, для снижения уровня инфестации эктопаразитами, в частности эктопаразитами из типа членистоногие, более конкретно эктопаразитом из класса насекомые или паукообразные, включая блох, иксодовых клещей и клещей и т. д.
В контексте настоящего изобретения насекомые могут, в частности, представлять собой блох. Однако в настоящем изобретении термин «насекомые» включает насекомых из порядка Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Heteroptera, Diptera, Thysanoptera, Orthoptera, Anoplura, Siphonaptera, Mallophaga, Thysanura, Isoptera, Psocoptera и Hymenoptera. Однако, настоящее изобретение относится, в частности, к тем, которые доставляют беспокойство людям или животным и переносят патогены, например, мухам, таким как Musca domestica, Musca vetustissima, Musca autumnalis, Fannia canicularis, Sarcophaga carnaria, Lucilia cuprina, Hypoderma bovis, Hypoderma lineatum, Chrysomyia chloropyga, Dermatobia hominis, Cochliomyia hominivorax, Gasterophilus intestinalis, Oestrus ovis, Stomoxys calcitrans, Haematobia irritans и Nematocera, таким как мошки, Ceratopogonidae, Simuliidae и Psychodidae, включая род Phlebotoma и Lutzomyia, например, блохам, таким как Ctenocephalides felis и Ctenocephalides canis (блохи кошек и собак), Xenopsylla cheopis, Pulex irritans, Dermatophilus penetrans, кровососущие вши (Anoplura), таким как Hematopinus spp., Solenopotes spp., Linognathus spp., Pediculus humanis, пухоедам (Mallophaga), таким как Bovicola (Damalina) ovis и Bovicola bovis, кусающим мухам и мухам лошадей (Tabanidae), Haematopota spp., таким как Haematopota pluvialis, Tabanidea spp., таким как Tabanus nigrovittatus, Chrysopsinae spp., таким как Chrysops caecutiens, мухам цеце, таким как виды Glossinia, доставляющим неприятности насекомым, в частности тараканам, таким как Blatella germanica, Blatta orientalis и Periplaneta americana.
В контексте настоящего изобретения эктопаразиты класса паукообразных могут, в частности, быть эктопаразитами порядка Acarina, включающего клещей и иксодовых клещей. Типичные представители клещей представляют собой, например, Dermanyssus gallinae, Sarcoptes scabiei, Psoroptes ovis и Psorergates spp. Известные представители иксодовых клещей представляют собой, например, Boophilus, Amblyomma, Anocentor, Dermacentor, Haemaphysalis, Hyalomma, Ixodes, Rhipicentor, Margaropus, Rhipicephalus, Argas, Otobius и Ornithodoros и т. п., которые предпочтительно обуславливают инфестацию теплокровных животных, включая сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, лошади, свиньи, овцы и козы, домашнюю птицу, такую как цыплята, индюки и гуси, пушных зверей, таких как норки, лисы, шиншиллы, кролики и т. п., а также животных-компаньонов, таких как коты и собаки, а также людей.
Иксодовых клещей можно поделить на твердых и мягких иксодовых клещей. Твердые иксодовые клещи характеризуются тем, что обуславливают инфестацию одного, двух или трех животных-хозяев. Они прикрепляются к проходящему животному-хозяину и сосут кровь или биологические жидкости организма. Полностью наевшиеся самки иксодовых клещей падают с животного-хозяина и откладывают большие количества яиц (2000-3000) в подходящей трещине в полу или в любом другом защищенном месте, где вылупляются личинки. Они, в свою очередь, ищут животное-хозяина, чтобы высосать из него кровь. Личинки иксодовых клещей, которые обуславливают инфестацию только одного животного-хозяина, линяют дважды и, таким образом, становятся нимфами и наконец взрослыми особями иксодовых клещей, не оставляя хозяина, которого выбрали. Личинки иксодовых клещей, которые обуславливают инфестацию двух или трех животных-хозяев, оставляют животное после потребления крови, линяют в окружающей среде и ищут второго или третьего хозяина в виде нимфы или взрослых особей иксодовых клещей, чтобы высосать из него кровь.
Во всем мире иксодовые клещи ответственны за перенос и распространение многих заболеваний людей и животных. Ввиду их экономического влияния наиболее важными родами иксодовых клещей являются Boophilus, Rhipicephalus, Ixodes, Hyalomma, Amblyomma и Dermacentor. Они являются переносчиками вирусных, бактериальных заболеваний (в том числе риккетсий и спирохет) и заболеваний, обусловленных простейшими, и вызывают клещевой паралич и клещевой токсикоз. Даже один иксодовый клещ может вызвать паралич, при условии, что его слюна проникает в животное-хозяина при питании. Заболевания, вызываемые иксодовыми клещами, обычно переносятся иксодовыми клещами, которые обуславливают инфестацию нескольких животных-хозяев. Такие заболевания, например анаплазмоз, эрлихиоз, бабезиоз, тейлериоз и сердечная водянка, ответственны за гибель или ухудшение состояния здоровья большого числа домашних и сельскохозяйственных животных во всем мире. Во многих странах с умеренным климатом иксодовые клещи рода Ixodes переносят возбудителя болезни Лайма, оказывающего вредное воздействие в течение продолжительного времени, от диких животных к людям. Помимо переноса заболевания, иксодовые клещи ответственны за большие экономические потери производства животноводческой продукции. Потери не ограничены гибелью животных-хозяев, но также включают повреждение шерсти, негативный эффект в отношении роста, снижение молочной продуктивности и снижение качества мяса. Хотя пагубные эффекты инфестации иксодовыми клещами животных были известны на протяжении многих лет, и огромный прогресс был сделан с помощью программ защиты от иксодовых клещей, до сих пор не было найдено полностью удовлетворяющих способов контроля этих паразитов или их устранения, и, кроме того, иксодовые клещи часто развивали стойкость к химически активным ингредиентам.
Аналогично, инфестация домашних животных и питомцев блохами для владельца все еще является проблемой, которая не имеет удовлетворительного решения или решение которой требует существенных затрат. Как и в случае с иксодовыми клещами, блохи не только причиняют беспокойство, но и являются переносчиками заболевания. Например, в данном документе следует упомянуть блошиный атипичный дерматит (FAD), серьезное заболевание кожи у собак, которое сложно лечить. Блохи могут переносить различные грибковые заболевания от животного-хозяина к животному-хозяину и владельцу животного, в частности во влажных, теплых климатических зонах, например, в Средиземноморье, в южной части США и т. д. В группе риска, в частности, оказываются люди с ослабленной иммунной системой или дети, чья иммунная система еще полностью не развилась. Из-за их сложного жизненного цикла, ни один из известных способов контроля блох не является полностью удовлетворительным, в частности, поскольку большинство известных способов в основном направлены на обеспечение контроля взрослых блох в шерсти, и оставляют полностью нетронутыми различные молодые стадии блох, которые существуют не только в шерсти животного, но и также на полу, в коврах, в подстилках для животных, на стульях, в саду и всех других местах, с которыми контактирует подвергнувшееся инфестации животное. Обработка от блох может быть дорогой и должна продолжаться в течение длительных периодов времени.
Успех обычно зависит от обработки не только подвергнувшегося инфестации животного, например человека, собаки, кошки, крупного рогатого скота, лошади, но и в то же время всех мест, которые часто посещает животное, подвергшееся инфестации.
Такая сложная процедура не нужна при использовании соединений формулы (I) по настоящему изобретению, поскольку конкретное обсуждаемое преимущество соединений формулы I состоит в том, что они очень эффективны и в то же время характеризуются очень низкой токсичностью для теплокровных животных.
Перед применением соединения формулы (I) согласно настоящему изобретению могут быть смешаны с другими веществами, имеющими такую же сферу активности, или с паразитицидами, или с другими веществами, обеспечивающими повышение активности, для достижения дополнительно улучшенного или более длительного действия.
Поскольку активные ингредиенты во многих случаях применяют в отношении теплокровных животных и, конечно, они вступают в контакт с кожей, подходящие вспомогательные вещества составов представляют собой вспомогательные вещества и формы введения, которые известны в косметике. Их можно вводить в виде растворов, эмульсий, мазей, кремов, паст, порошков, спреев и т. д.
Соединения формулы (I) согласно настоящему изобретению могут быть составлены для применения в отношении животного с помощью любой методики, подходящей для местного введения, включая методики с распылением, погружением или обливанием. Дополнительные предпочтительные методики применения включают устройства медленного высвобождения, такие как браслет, ошейник или ушные бирки (для скота), предназначенные для обеспечения длительной защиты против эктопаразитов.
Соединения формулы (I) согласно настоящему изобретению предпочтительно применяют внешне в отношении кожи животного, используя устройство для нанесения, такое как пульверизатор, распылитель, или животное погружают в ванну с жидким составом.
В частности, подходящие составы можно применять в жидком виде или в виде аэрозоля. Для аэрозольной формы в качестве вытеснителя может применяться жидкость или газ. Они включают, например, обычные газы-вытеснители, необходимые для аэрозольных баллончиков, такие как пропан, бутан, диметиловый эфир, CO2 или газы галогенированных низших алкилов (например, галогенированные C1-C4алкилы), и смеси двух или более из них.
В частности, соединения формулы (I) согласно настоящему изобретению составляют так, что их можно распылять непосредственно в области инфестации или их можно связывать с твердой подложкой или инкапсулировать в материал, обеспечивающий пролонгированное высвобождение.
Твердая подложка может быть обеспечена в виде ошейников, которые разработаны для борьбы с обычными внешними паразитами на животных-компаньонах. Эти ошейники обычно состоят из матрицы, обычно из матрицы из пластикового материала, содержащей от 5% до 40% активного вещества, и обеспечивают высвобождение активного ингредиента в течение длительного времени. Эти ошейники, таким образом, обеспечивают длительную защиту от эктопаразитов.
Для введения сельскохозяйственным животным или домашним питомцами, таким как коровы, лошади, ослы, верблюды, собаки, кошки, птица, овцы, козы и т. д., также подходят так называемые составы для «обливания» или «точечно наносимые» составы; эти жидкие или полужидкие составы имеют преимущество заключающееся в том, что их необходимо применять в отношении только небольшой области шерсти или оперения, и, благодаря наличию некоторой доли растекающихся масел или других растекающихся добавок, они сами распределяются по всей шерсти или оперению, без необходимости в других действиях, и становятся активными по всей области.
Конечно, материалы, относящиеся к неживой природе, например, одежду или корзинки для собак и котов, стойла, ковры, шторы, жилые помещения, склады и т. д., можно обрабатывать указанными составами и, таким образом, защищать от инфестации паразитами.
Для применения у людей могут добавляться приятно пахнущие эссенции, например духи, чтобы сделать применение более привлекательным.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения соединение по настоящему изобретению или экстракт по настоящему изобретению применяют в виде состава для местного применения.
Таким образом, согласно настоящему изобретению предусмотрен состав, содержащий соединение формулы I, в частности анатабин.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы I может быть помещено в липосомы. Согласно настоящему изобретению любой фосфолипид и/или производное фосфолипида, такое как лизофосфолипид, можно использовать для получения липосомы для инкапсуляции соединения формулы I. Подходящие фосфолипиды и/или производные фосфолипидов включают без ограничения лецитин, лизолецитин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозит, фосфатидилглицерин, фосфатидную кислоту, фосфатидилсерин, лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин, лизофосфатидилглицерин, лизофосфатидиловую кислоту, лизофосфатидилсерин, PEG-фосфатидилэтаноламин, PVP-фосфатидилэтаноламин, их комбинации и т. п.
В некоторых вариантах осуществления в качестве фосфолипида можно использовать лецитин, полученный из яйца или сои. Такие варианты лецитина включают коммерчески доступные варианты лецитина, такие как PHOSPHOLIPON® 85G, PHOSPHOLIPON® 90G и PHOSPHOLIPON® 90H (полностью гидрированная версия PHOSPHOLIPON® 90G) от American Lecithin Company, Оксфорд, штат Коннектикут. Другие подходящие лецитины включают лецитин LECINOL S-10® от Nikko Chemicals.
Вышеуказанные фосфолипиды или их производные можно использовать для получения липосом, содержащих соединение формулы I, или альтернативных составов, содержащих соединение формулы I. В вариантах осуществления лецитин с высоким содержанием фосфатидилхолина можно использовать для получения липосомы. В некоторых вариантах осуществления лецитин с высоким содержанием фосфатидилхолина, который можно использовать, включает PHOSPHOLIPON® 85G, полученный из сои лецитин, содержащий минимум приблизительно 85% фосфатидилхолина на основе линолевой кислоты. Этот лецитин легко применять, и он способен давать субмикронные липосомы при низких температурах обработки (от приблизительно 20°C до приблизительно 55°C) без добавления каких-либо других специальных добавок. PHOSPHOLIPON® 85G содержит, помимо фосфатидилхолина, приблизительно 5-7% фосфатидной кислоты. Фосфатидная кислота придает полученным составам отрицательный поверхностный заряд, снижает время обработки и энергию процесса и способствует образованию стабильных форм.
В некоторых вариантах осуществления дополнительные компоненты можно объединять с составом для улучшения общих реологических и технологических свойств, и для обеспечения микробиологической целостности при хранении. Такие компоненты включают без ограничения абсорбенты, противовспениватели, подкисляющие средства, подщелачивающие средства, буферы, противомикробные средства, антиоксиданты (например, токоферолы, BHT, полифенолы, фитиновую кислоту), связующие, биологические добавки, хелатирующие средства (например, динатрия EDTA, тетранатрия EDTA, метасиликат натрия и т. п.), денатурирующие средства, консерванты (например, имидазолидинилмочевину, диазолидинилмочевину, феноксиэтанол, метилпарабен, этилпарабен, пропилпарабен и т. п.), восстанавливающие средства, солюбилизирующие средства, растворители, модификаторы вязкости, увлажняющие средства, загустители и их комбинации. Эти дополнительные компоненты могут присутствовать в количестве, составляющем от приблизительно 0,001% по весу до приблизительно 10% по весу дисперсии, в вариантах осуществления - от приблизительно 0,1% по весу до приблизительно 1% по весу дисперсии.
Примеры подходящих увлажняющих средств, которые можно добавлять в состав, включают без ограничения полиолы и производные полиолов, включая глицерин, диглицерин, триглицерин, этиленгликоль, пропиленгликоль, бутиленгликоль, пентиленгликоль (иногда называемый в данном документе 1,2-пентандиол), изопренгликоль (1,4-пентандиол), 1,5-пентандиол, гексиленгликоль, эритрит, 1,2,6-гексантриол, полиэтиленгликоли, такие как PEG-4, PEG-6, PEG-7, PEG-8, PEG-9, PEG-10, PEG-12, PEG-14, PEG-16, PEG-18, PEG-20, их комбинации, сахара и производные сахаров (включая фруктозу, глюкозу, мальтозу, мальтит, маннит, инозит, сорбит, сорбитилсиландиол, сахарозу, трегалозу, ксилозу, ксилит, глюкуроновую кислоту и ее соли), этоксилированный сорбит (Sorbeth-6, Sorbeth-20, Sorbeth-30, Sorbeth-40) и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления может использоваться коммерчески доступный 1,2-пентандиол, такой как пентиленгликоль HYDROLITE-5® (коммерчески доступный от Symrise GmbH). В других вариантах осуществления может использоваться пропиленгликоль. Если используются, такие увлажняющие средства могут присутствовать в количествах от приблизительно 0,1% по весу до приблизительно 20% по весу дисперсии, в вариантах осуществления - от приблизительно 3% по весу до приблизительно 10% по весу дисперсии.
В некоторых вариантах осуществления в состав может быть добавлен консервант, такой как феноксиэтанол, и увлажняющее средство, такое как бутиленгликоль, гексиленгликоль, пентиленгликоль и/или пропиленгликоль. В вариантах осуществления пентиленгликоль и/или пропиленгликоль могут обеспечивать влагоудерживающую способность и способствовать консервации концентрата при объединении с феноксиэтанолом. Смесь феноксиэтанола и пентиленгликоля и/или пропиленгликоля должна являться водорастворимой и нелетучей.
Соединение формулы I может присутствовать в полученном концентрате в количестве, составляющем от приблизительно 10% по весу концентрата до приблизительно 30% по весу концентрата, в вариантах осуществления - от приблизительно 18% по весу концентрата до приблизительно 26% по весу концентрата, в некоторых вариантах осуществления - от приблизительно 21% по весу концентрата до приблизительно 22% по весу концентрата. Количество фосфолипидов в концентрате может составлять от приблизительно 1% по весу концентрата до приблизительно 20% по весу концентрата, в вариантах осуществления - от приблизительно 4% по весу концентрата до приблизительно 12% по весу концентрата, при этом остаток представляет собой растворитель, увлажняющее средство и консервант.
Полученный состав можно вводить непосредственно или в вариантах осуществления он может быть объединен с любым приемлемым носителем. При использовании в данном документе термины «приемлемый носитель» и «приемлемые носители» относятся к тем соединениям, которые подходят для применения в контакте с тканями человека или животного, не вызывая токсичности, раздражения, аллергической реакции и т. п., характеризуются приемлемым соотношением польза/риск и являются эффективными для своего предполагаемого применения, а также солям и биосовместимым производным этих соединений. При использовании в данном документе фармацевтически приемлемый носитель включает все без исключения растворители, включая воду, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, стабилизирующие вспомогательные вещества, средства, повышающие или задерживающие абсорбцию, полимеры, включая полимерные связующие и полимерные адгезивные средства, их комбинации и т. п. Такие материалы должны быть нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и могут включать буферы, такие как TRIS-HCI, фосфат, цитрат, ацетат и другие соли органических кислот; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота; низкомолекулярные (менее чем приблизительно десять остатков) пептиды, такие как полиаргинин, белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота или аргинин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая целлюлозу или ее производные, глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; противоионы, такие как натрий, и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN, PLURONICS и/или полиэтиленгликоль.
Применение таких сред и средств находится в компетенции специалистов в данной области техники. Также в композиции могут быть включены добавочные активные ингредиенты.
В вариантах осуществления вышеуказанные носители могут использоваться отдельно или в комбинации с образованием системы носителей. Подходящие системы носителей находятся в компетенции специалистов в данной области техники и могут включать без ограничения лосьоны, кремы, гели, эмульсии, дисперсии, твердые вещества, твердые стики, полутвердые вещества, пены в аэрозольной или неаэрозольной упаковке, спреи, сыворотки, системы трансдермальных адгезивных пластырей, их комбинации и т. п. В вариантах осуществления липосомы могут находиться в виде липосомного концентрата и могут вводиться со средством для повышения проницаемости, как описано выше. В вариантах осуществления средство для повышения проницаемости может присутствовать в водной фазе, добавленной в липосомный концентрат для образования композиции по настоящему изобретению. В вариантах осуществления состав можно применять для трансдермальной доставки.
Соединение формулы I может, таким образом, присутствовать в готовой композиции, в вариантах осуществления - лосьоне, креме или любом другом подходящем виде, описанном выше, - в количествах от приблизительно 0,5% по весу до приблизительно 20% по весу композиции, в вариантах осуществления - от приблизительно 0,75% по весу до приблизительно 10% по весу композиции, в других вариантах осуществления - от приблизительно 1% по весу до приблизительно 7,5% по весу композиции, в других вариантах осуществления - от приблизительно 1,25% по весу до приблизительно 5% по весу композиции, в других вариантах осуществления - от приблизительно 1,5% по весу до приблизительно 3% по весу композиции. В других вариантах осуществления соединение формулы I может присутствовать в готовой композиции, в вариантах осуществления - лосьоне, креме или любом другом подходящем виде, описанном выше, - в количествах от приблизительно 0,2% по весу до приблизительно 50%, предпочтительно от приблизительно 5% по весу до приблизительно 50% по весу композиции, в вариантах осуществления - от приблизительно 10% по весу до приблизительно 50% по весу композиции.
Например, в некоторых вариантах осуществления лосьон или крем может содержать масляную фазу, которая, в свою очередь, может содержать смягчающие средства, жирные спирты, эмульгаторы, их комбинации и т. п. Например, масляная фаза может включать смягчающие средства, такие как C12-15алкилбензоаты (коммерчески доступные в виде FINSOLV™ TN от Finetex Inc. (Эдисон, штат Нью-Джерси)), каприновые-каприловые триглицериды (коммерчески доступные от Huls в виде MIGLYOL™ 812) и т. п. Другие подходящие смягчающие средства, которые можно использовать, включают масла, полученные из растений (кукурузное масло, сафлоровое масло, оливковое масло, масло ореха макадамия и т. п.); различные синтетические сложные эфиры, включая капраты, линолеаты, дилинолеаты, изостеараты, фумараты, себацинаты, лактаты, цитраты, стеараты, пальмитаты и т. п.; синтетические среднецепочечные триглицериды, силиконовые масла или полимеры; жирные спирты, такие как цетиловый спирт, стеариловый спирт, цетиариловый спирт, лауриловый спирт, их комбинации и т. п.; и эмульгаторы, включая глицерилстеарат, PEG-100 стеарат, глицерилстеарат, глицерилстеарат SE, нейтрализованные иди частично нейтрализованные жирные кислоты, включая стеариновую, пальмитиновую, олеиновую и т. п.; экстракты растительных масел, содержащие жирные кислоты, Ceteareth-20, Ceteth-20, PEG-150 стеарат, PEG-8 лаурат, PEG-8 олеат, PEG-8 стеарат, PEG-20 стеарат, PEG-40 стеарат, PEG-150 дистеарат, PEG-8 дистеарат, их комбинации, и т. п.; или другие неполярные косметические или фармацевтически приемлемые материалы, используемые для смягчения кожи, находящиеся в компетенции специалистов в данной области техники, их комбинации и т. п.
Смягчающие средства, C12-15алкилбензоаты, могут быть включены для обеспечения смягчения и растекаемости. При наличии, смягчающее средство может присутствовать в количестве, составляющем от приблизительно 0,2% по весу до приблизительно 15% по весу всей композиции, в вариантах осуществления - от приблизительно 2% по весу до приблизительно 6% по весу всей композиции. Спирты, такие как цетиловый спирт и стеариловый спирт, могут добавляться для придания крему объема или текстуры. Если используются как цетиловый спирт, так и стеариловый спирт, отношение цетилового спирта к стеариловому спирту может составлять от приблизительно 2:1 до приблизительно 1:2, причем восковые спирты составляют от приблизительно 1 до приблизительно 6 весового процента всей композиции, в вариантах осуществления - от приблизительно 2% по весу до приблизительно 4% по весу всей композиции.
Как отмечалось выше, эта масляная фаза может также содержать эмульгаторы. Подходящие эмульгаторы включают без ограничения стеараты, включая глицерилстеарат, PEG-100 стеарат, глицерилстеарат SE, глицерилстеарат-цитрат, их комбинации и т. п. В вариантах осуществления комбинация стеаратов может использоваться в масляной фазе в качестве эмульгатора. Например, смесь глицерилстеарата и PEG-100 стеарата (в вариантах осуществления смесь глицерилстеарата и полиэтиленгликоля 100 стеарата, коммерчески доступная в виде ARLACEL® 165 от ICI Americas) может использоваться в качестве эмульгатора с образованием эмульсии «масло в воде» (o/w). В такой комбинации PEG-100 стеарат может выступать в качестве первичного эмульгатора, а глицерилстеарат может представлять собою вспомогательный эмульгатор. Эмульгатор может присутствовать в количестве, составляющем от приблизительно 2% по весу до приблизительно 8% по весу всей композиции, в вариантах осуществления - от приблизительно 3% по весу до приблизительно 5% по весу всей композиции.
Весовое соотношение эмульгатора и смягчающих средств, описанных выше, в этой масляной фазе может составлять от приблизительно 10:1 до приблизительно 1:2, в некоторых вариантах осуществления - от приблизительно 2:1 до приблизительно 1:1.
При наличии, масляная фаза может присутствовать в количестве, составляющем от приблизительно 5% до приблизительно 20% по весу лосьона или крема, в вариантах осуществления - от приблизительно 8% до приблизительно 15% по весу лосьона или крема. Лосьоны или кремы, образованные с использованием вышеуказанных липосом, могут также содержать водную фазу, которая может в вариантах осуществления содержать средства для повышения проницаемости, описанные выше, а также эти компоненты, объеденные с образованием второй фазы, описанной выше, содержащей увлажняющие средства и консерванты. Таким образом, в вариантах осуществления водная фаза, используемая при образовании лосьона или крема, содержащих липосомы, как описано в данном документе, может содержать вторую фазу, описанную выше. Кроме того, в вариантах осуществления может быть необходимым добавление модификатора вязкости, иногда называемого в данном документе средством для регулирования вязкости, для получения лосьона и/или крема с необходимым значением вязкости.
Подходящие средства для регулирования вязкости, которые можно добавлять в водную фазу, включают водорастворимые полимеры, включая анионные полимеры и неионные полимеры. Пригодные полимеры включают виниловые полимеры, такие как сшитые полимеры акриловой кислоты с названием по CTFA КАРБОМЕР, пуллулан, маннан, склероглюканы, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, гуаровая камедь, гидроксипропилгуаровая камедь, ксантановая камедь, аравийская камедь, гуммиарабик, трагакантовая камедь, галактан, камедь рожкового дерева, камедь карайи, камедь бобов рожкового дерева, каррагинан, пектин, амилопектин, агар, семена айвы (Cydonia oblonga Mill), крахмал (рисовый, кукурузный, картофельный, пшеничный), коллоиды водорослей (экстракт водорослей), полимеры микроорганизмов, такие как декстран, сукциноглюкан, полимеры на основе крахмала, такие как карбоксиметилкрахмал, метилгидроксипропилкрахмал, полимеры на основе альгиновой кислоты, такие как альгинат натрия, сложные эфиры альгиновой кислоты и пропиленгликоля, акрилатные полимеры, такие как полиакрилат натрия, полиэтилакрилат, полиакриламид, полиэтиленимин, и неорганические водорастворимые материалы, такие как бентонит, алюмосиликат магния, лапонит, гектонит и безводная кремниевая кислота. В вариантах осуществления также могут использоваться комбинации вышеуказанного. В некоторых вариантах осуществления может быть добавлен КАРБОМЕР, такой как КАРБОМЕР 940, в качестве средства для регулирования вязкости для контроля реологических свойств составов крема и добавления стабильности первичной эмульсии.
Если используется, средство для регулирования вязкости может присутствовать в количестве, составляющем от приблизительно 0,1% до приблизительно 2% по весу композиции, в вариантах осуществления - от приблизительно 0,25% до приблизительно 0,6% композиции.
Альтернативно, водная фаза может содержать другие растворимые увлажняющие средства, такие как гликоли, полиолы, соли лактатов, аминокислоты, пептиды, сахара, мочевина, натрия PCA, гиалуроновая кислота или ее соли, или любое другое подходящее увлажняющее средство или водорастворимый или диспергируемый в воде увлажнитель в компетенции специалистов в данной области. Весовое соотношение увлажняющих веществ, и средства для повышения проницаемости, и консерванта, и средства для регулирования вязкости может составлять от приблизительно 20:10:1:1 до приблизительно 10:20:1:1, в некоторых вариантах осуществления - от приблизительно 15:10:2:1 до приблизительно 10:15:1:1.
Таким образом, как отмечалось выше, водная фаза, используемая для образования лосьона и/или крема по настоящему изобретению, может содержать воду, увлажняющие средства, консерванты, средства для регулирования вязкости и средства для повышения проницаемости. Например, в вариантах осуществления подходящая водная фаза может содержать комбинацию глицерина, пентиленгликоля и/или пропиленгликоля, этоксидигликоля, феноксиэтанола, воды и КАРБОМЕРА 940.
В некоторых вариантах осуществления средство для регулирования вязкости, можно добавлять в водную фазу в виде дисперсии в увлажняющем средстве, как описано выше, необязательно в комбинации с водой, необязательно в комбинации с консервантом, как описано выше. Например, в вариантах осуществления КАРБОМЕР 940 можно добавлять в виде дисперсии, такой как 2% дисперсия, содержащая КАРБОМЕР 940, диспергированный в смеси воды, пропиленгликоля и феноксиэтанола. Эта дисперсия КАРБОМЕРА 940 может быть получена отдельно в процессе производства партиями. Если средство для регулирования вязкости, такое как КАРБОМЕР 940, добавлено в водную фазу в виде отдельной дисперсии, весовое соотношение средства для регулирования вязкости, и увлажняющего средства, и консерванта, и воды может составлять от приблизительно 0,3:2:0,05:10 до приблизительно 0,5:1:0,2:10, в некоторых вариантах осуществления - от приблизительно 0,1:0,5:0,05:9 до приблизительно 0,2:1:0,1:9.
При наличии, водная фаза может присутствовать в количестве, составляющем от приблизительно 60% до приблизительно 80% по весу лосьона или крема, в вариантах осуществления - от приблизительно 63% до приблизительно 71% по весу лосьона или крема.
В некоторых вариантах осуществления третья фаза, которая может называться в данном документе фазой нейтрализации или буферной фазой, может также добавляться при образовании крема или лосьона. Компоненты такой фазы могут включать без ограничения воду, амины, включая триэтаноламин, триизопропаноламин, 2-амино-2-метил-1,3-пропандиол, трис(гидроксиметил)амин, 2-аминобутанол, гидроксид натрия, гидроксид калия, соли, такие как лактат натрия, лактат калия, цитрат натрия, цитрат калия, моно-, ди или трифосфат натрия или калия, борат натрия, борат калия, кислоты, такие как молочная кислота, лимонная кислота, фосфорная кислота, борная кислота, их комбинации и т. п. Вода может выступать в качестве растворителя и разбавителя для других ингредиентов в этой фазе. Амин, такой как триэтаноламин, может выступать в качестве нейтрализатора кислотного компонента в водной фазе, такого как сополимер акриловой кислоты - КАРБОМЕР; дополнительные соли, такие как раствор лактата натрия (60% вес./вес. в воде), и дополнительные кислоты, такие как молочная кислота, можно добавлять в качестве буферной системы для регулирования и поддержания конечного pH крема на уровне от приблизительно 4,8 до приблизительно 6, в некоторых вариантах осуществления - от приблизительно 5 до приблизительно 5,5 (в диапазоне природного pH кожи). В вариантах осуществления может быть пригодным значение pH, составляющее приблизительно 5 или выше, поскольку в водной фазе сополимер акриловой кислоты - КАРБОМЕР 940, или подобный материал следует полностью нейтрализовать и проявить его полный потенциал вязкости.
В вариантах осуществления может быть добавлено подходящее количество амина, такого как триэтаноламин, такое, что он присутствует в количестве, составляющем от приблизительно 0,5% до приблизительно 2% по весу готовой композиции, в вариантах осуществления - от приблизительно 1% до приблизительно 1,5% по весу готовой композиции. Может быт добавлено подходящее количество соли, такой как лактат натрия, такое, что она присутствует в количестве, составляющем от приблизительно 0,5% до приблизительно 3% по весу готовой композиции, в вариантах осуществления - от приблизительно 1% до приблизительно 1,5% по весу готовой композиции. В вариантах осуществления может быть добавлено подходящее количество кислоты, такой как молочная кислота, такое, что она присутствует в количестве, составляющем от приблизительно 0% до 1% по весу готовой композиции, в некоторых вариантах осуществления - от приблизительно 0,25% до приблизительно 0,75% по весу готовой композиции, в некоторых вариантах осуществления - приблизительно 0,5% по весу готовой композиции. Может быть добавлен нейтрализатор и/или буфер, так что они присутствуют в количестве, составляющем от приблизительно 0,01% до приблизительно 10% по весу готовой композиции, в вариантах осуществления - от приблизительно 2% до приблизительно 4% по весу готовой композиции.
При наличии, нейтрализующая фаза может присутствовать в количестве, составляющем от приблизительно 0,1% до приблизительно 15% по весу лосьона или крема, в вариантах осуществления - от приблизительно 5% до приблизительно 8% по весу лосьона или крема.
В вариантах осуществления другие растворимые ингредиенты можно также добавлять, которые включают без ограничения средства регулирования pH и буферы, средства регулирования тоничности, смачивающие средства и т. п., например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, сорбитанмонолаурат, олеат триэтаноламина и т. п. Другие буферы, которые можно добавлять, включают гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, моноэтаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, диизопропаноламин, аминометилпропанол, триметиламин, тетрагидроксипропилэтилендиамин, лимонную кислоту, уксусную кислоту, молочную кислоту и соли молочной кислоты, включая лактат натрия, лактат калия, лактат лития, лактат кальция, лактат магния, лактат бария, лактат алюминия, лактат цинка, цитрат натрия, ацетат натрия, лактат серебра, лактат меди, лактат железа, лактат марганца, лактат аммония, их комбинации и т. п. Эти добавки можно добавлять в любую фазу, описанную выше, используемую для получения крема или лосьона, включая масляную фазу, водную фазу, нейтрализующую фазу, пигмент, их комбинации и т. п.
В вариантах осуществления применение составов, описанных выше, может допускать оптимизацию получения различных композиций с соединением формулы I при различных концентрациях. Например, в вариантах осуществления композиция может содержать соединение формулы I в концентрации в от приблизительно 10 до приблизительно 15 раз больше, чем количество соединения формулы I в готовой композиции для введения. Для производства можно получать большую партию концентрата, а затем множество порций концентрата можно использовать для получения множества композиций, содержащих биоактивное средство в различных концентрациях. Это обеспечивает большую гибкость при оптимизации концентрации соединения формулы I в композиции по настоящему изобретению.
Полученные крема, лосьоны и т. п. могут иметь длительный срок годности; т. е. они могут оставаться стабильными при хранении в течение по меньшей мере приблизительно 2 лет, в вариантах осуществления - от приблизительно 2 до приблизительно 10 лет.
Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения предусмотрена очищающая композиция или композиция для использования в качестве шампуня, в частности очиститель или шампунь для животных, включая людей, содержащий соединение формулы I, в частности анатабин. Композиция может содержать необязательно по меньшей мере одно увлажняющее средство или увлажнитель, по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, по меньшей мере один кондиционер для кожи, по меньшей мере один кондиционер для волос, по меньшей мере одно очищающее средство, по меньшей мере одно средство для отшелушивания, по меньшей мере одно масло, по меньшей мере один антиоксидант, по меньшей мере один консервант, по меньшей мере одно смягчающее средство (успокаивающее средство), по меньшей мере одно вяжущее средство, отдушку(отдушки) и воду.
Некоторые увлажняющие средства, которые можно использовать в шампуне, могут также служить в качестве кондиционера для волос и/или кондиционера для кожи. Некоторые поверхностно-активные вещества, которые можно использовать, могут также служить в качестве кондиционера для волос, и/или в качестве усилителя пенообразования, и/или в качестве очищающего средства. Некоторые кондиционеры для волос, которые можно использовать, могут также служить в качестве кондиционера для кожи. Некоторые масла, которые можно использовать, могут также служить в качестве кондиционера для кожи. Некоторые смягчающие средства, которые можно использовать, могут также служить в качестве кондиционера для кожи. Некоторые антиоксиданты, которые можно использовать, могут также служить в качестве кондиционера для кожи. Некоторые вяжущие средства, которые можно использовать, могут также служить в качестве кондиционера для кожи.
Необязательно композиция может также быть составлена с использованием средства регулирования вязкости, например хлорида натрия. Необязательно композиция может также быть составлена с использованием любой общеизвестной буферной системы, если необходимо поддержание определенного уровня pH. Например, для регулирования pH можно использовать лимонную кислоту.
Общая концентрация увлажнителя(увлажнителей) в композиции может составлять от приблизительно 1 до 10 вес. % всей композиции. Некоторые неограничивающие примеры увлажнителей, которые можно использовать, включают глицерин, мед и экстракты водорослей. Другие неограничивающие примеры увлажнителей, которые можно использовать, включают мочевину, лактат натрия и некоторые аминокислоты, такие как глицин или гистидин.
Общая концентрация очищающего средства (средств) в композиции может составлять от приблизительно 25 до 40 вес. % всей композиции. Некоторые неограничивающие примеры очищающих средств, которые можно использовать, включают натрия лаурилсульфат и PEG-80 сорбитанлаурат.
Общая концентрация поверхностно-активного(активных) вещества(веществ) в композиции может составлять от приблизительно 10 до 20 вес. % всей композиции. Некоторые неограничивающие примеры поверхностно-активных веществ, которые можно использовать, включают натрия C14-16олефинсульфонат, динатрия кокамфодиацетат и PEG-80 сорбитанлаурат.
Общая концентрация кондиционера(кондиционеров) для кожи в композиции может составлять от приблизительно 2 до 15 вес. % всей композиции. Некоторые неограничивающие примеры кондиционеров для кожи, которые можно использовать, включают глицерин, аминокислоту пшеницы, экстракт Lavandula angustifolia (лаванды), PEG-120 метилглюкозы триолеат, мед, экстракт Mentha pulegium, экстракт плода Cucumis sativus (огурца), экстракт листьев Camellia simensis, экстракт цветов Chamomilla recutita (ромашки лекарственной), экстракт листьев Rosmarinus officinalis (розмарина), ацетат токоферола, экстракт водорослей и Hamamelis virginiana (гамамелиса).
Общая концентрация кондиционера(кондиционеров) для волос в композиции может составлять от приблизительно 2 до 10 вес. % всей композиции. Некоторые неограничивающие примеры кондиционеров для волос, которые можно использовать, включают глицерин, динатрия кокамфодиацетат и аминокислоту пшеницы.
Общая концентрация средства(средств) для отшелушивания в композиции может составлять от приблизительно 0,1 до 1 вес. % всей композиции. Одним неограничивающим примером средства для отшелушивания, который можно использовать, является бромелайн.
Общая концентрация масла(масел) в композиции может составлять от приблизительно 0,1 до 2 вес. % всей композиции. Некоторые неограничивающие примеры масла, которые можно использовать, включают экстракт Lavandula angustifolia (лаванды) и масло коры Cedrus atlantica (кедрового дерева).
Общая концентрация антиоксиданта(антиоксидантов) в композиции может составлять от приблизительно 0,1 до 3 вес. % всей композиции. Некоторые неограничивающие примеры антиоксидантов, которые можно использовать, включают масло листьев Melaleuca altermifolia (чайного дерева), экстракт листьев Camellia simensis и ацетат токоферола.
Общая концентрация консерванта(консервантов) в композиции может составлять от приблизительно 0,1 до 1 вес. % всей композиции. Некоторые неограничивающие примеры консервантов, которые можно использовать, включают метилизотиазолин и метилхлоризотиазолин.
Общая концентрация смягчающего средства(средств) в композиции может составлять от приблизительно 0,1 до 2 вес. % всей композиции. Некоторые неограничивающие примеры смягчающих средств, которые можно использовать, включают PEG-120 метилглюкозы триолеат и экстракт плода Cucumis sativus (огурца).
Общая концентрация вяжущего средства(средств) в композиции может составлять от приблизительно 0,1 до 1 вес. % всей композиции. Одним неограничивающим примером вяжущего средства, которое можно использовать, является Hamamelis virginiana (гамамелис).
Любая композиция, удовлетворяющая вышеописанным требованиям, может быть получена с помощью общих техник составления, известных специалистам средней квалификации в данной области техники. Например, вышеописанные компоненты можно смешивать друг с другом с последующим добавлением воды с образованием водной композиции, например, путем использования быстрого перемешивания. Альтернативно, каждый компонент в отдельном контейнере можно предварительно растворять в воде или иным образом смешивать с водой с получением нескольких систем на водной основе, каждая из которых содержится в отдельном контейнере. Содержимое всех контейнеров можно затем объединять, например, перемешиванием или встряхиванием с образованием готовой композиции.
При необходимости, специалисты средней квалификации в данной области техники могут разработать другие способы смешивания компонентов для образования композиции. Несмотря на способ смешивания, который выбран, специалисты средней квалификации в данной области техники будут обеспечивать такие количества каждого компонента, чтобы концентрация каждого из компонентов в композиции удовлетворяла вышеописанным пределам.
Дополнительно предусмотрен способ обработки животного. Композицию можно получать согласно процедуре, описанной выше, необязательно с последующим мытьем животного. Композицию можно затем применять местно в отношении кожи животного, которое требует защиты от эктопаразитов. Для применения композиции в отношении кожи животного можно использовать различные способы. Например, композицию можно распылять с помощью обычного ручного насоса. Альтернативно, композиция может быть составлена для получения аэрозоля, используя общеизвестные способы получения аэрозолей. Специалисты средней квалификации в данной области техники могут разработать другие способы применения композиции.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ защиты объектов от инфестации, в частности инфестации насекомыми или паукообразными, включая насекомых или паукообразных, которые являются эктопаразитами. В одном варианте осуществления способ может включать приведение в контакт поверхности объекта с композицией для лечения, содержащей соединение формулы I, в частности анатабин, или покрытие ею. Обеспечения приведения в контакт поверхности объекта или ее покрытия можно достигать, например, путем использования распылительного устройства, содержащего композицию для лечения по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение также предусматривает объекты, отталкивающие насекомых, или объекты, отталкивающие паукообразных, такие как, например, ткани или элементы одежды. Ткани содержат молекулы, отталкивающие насекомых, абсорбированные в волокнах тканей. Ткани подходят для применения в одежде и, более конкретно, подходят для применения в защитной одежде, разработанной для надевания индивидуумами, которые могут подвергаться риску воздействия насекомыми, в частности эктопаразитами. Отталкивающие соединения по настоящему изобретению можно включать в ткани различными путями, включая без ограничения погружение волокон или тканей в ванну, содержащую соединение формулы I, обеспечение распыления на волокна или ткани или стирку волокон или тканей. В настоящем изобретении количества состава по настоящему изобретению на волокнах или тканях могут изменяться специалистом в данной области техники для достижения необходимого эффекта снижения уровня инфестации эктопаразитами. В настоящем изобретении предпочтительным является применение количеств, достаточных для достижения концентраций по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мкмоль/м² состава или соединений по настоящему изобретению на волокнах или тканях. Кроме того, в настоящем изобретении предпочтительным является применение количеств до 300 мкмоль/м² состава или соединений по настоящему изобретению на волокнах или тканях. В частности, предпочтительно применять количество, достаточное для достижения защиты от эктопаразитов в течение от 0,1 дня до 30 дней, в частности в течение от 1 ч. до 48 ч., наиболее конкретно - от 4 ч. до 8 ч.
В дополнительных вариантах осуществления состав для местного применения по настоящему изобретению, содержащий соединение формулы I, в частности анатабин, может быть в виде лосьона, крема, мази, геля, пены, пластыря, порошка, твердого вещества, губки, ленты, пара, пасты или настойки. Дополнительным примером является анатабин в виде жидкости, такой как раствор.
Следующие примеры дополнительно описывают настоящее изобретение без ограничения его содержанием примеров.
Примеры
1. Организмы
1.1 Растения табак
Описание видов и сортов рода Nicotiana дано в таблице 1. Выбор был основан на содержании в них алкалоидов, ранее известном из данных авторов настоящего изобретения и литературных источников, и на доступности растения в хозяйстве.
Таблица 1. Характеристики растения и обозначение соответствующего неочищенного экстракта
1.2. Иксодовые клещи для биоанализа
Иксодовых клещей R. sanguineus получали в виде полностью наполненных кровью самок или взрослых некормленых иксодовых клещей от Ecto Services Inc. (Хендерсон, штат Северная Каролина, США). Для откладывания яиц и развития личинок самок выдерживали при 28°C и относительной влажности 80%. Вылупившиеся личинки и взрослых особей иксодовых клещей выдерживали при таких же условиях окружающей среды до применения.
Нимфы Ixodes ricinus получали от Insect Service GmbH (Берлин, Германия) и выдерживали при 28°C и относительной влажности 80% до применения.
2. Выращивание растений
Семена N. tabacum культиваров TN90 и K326, а также N. glauca, N. Glutinosa и N. debneyi получали из хранилища семян автора настоящего изобретения. PMT трансгенной линии TN90 (06TN2048) получали от Altria Client Services LLC (Ричмонд, штат Вирджиния, США). Линии PMT получали, используя опосредованную агробактериями трансформацию, как описано в патенте WO2015157359A1. Семена сеяли в плавающие подносы, содержащие почву. Хорошо развитые проростки переносили в 5 л горшки и выращивали с 16/8-ч. искусственным световым периодом день/ночь до полного вырастания.
Во время цветения все растения обрезали. Через две недели после обрезания с каждого растения собирали иллюстративные, полностью выросшие листья. Все образцы немедленно использовали для получения неочищенного экстракта в метаноле.
Для выращивания на поле семена N. tabacum Stella (табак Берлея) и N. tabacum ITB 683 (табак Вирджиния) получали из местного источника и сеяли в плавающие подносы, содержащие почву, выращивали в теплице и пересаживали на поле согласно сельскохозяйственным практикам выращивания табака. Проростки сажали с плотностью 24000 на гектар в западной Швейцарии (кантон Во). Образцы листьев собирали с полностью созревших растений через 2 недели после обрезания и немедленно транспортировали в лабораторию для получения неочищенного экстракта в метаноле.
3. Получение неочищенного экстракта
Все листья растений высушивали в печи при 60°C в течение 24 ч. и измельчали путем встряхивания со стеклянными шариками при 400 об./мин. в течение 8 ч. Для каждого выбранного сорта/вида табака 2 г порошка измельченных листьев помещали в стеклянные бутылки объемом 50 мл. К измельченным листьям добавляли двадцать мл метанола (например, степени чистоты для HPLC, ≥ 99,9%, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США). Смесь затем подвергали ультразвуковой обработке (например, с использованием установки ультразвуковой очистки 3510-DTH компании Branson; Данбери, штат Коннектикут, США) в течение 30 мин. и декантировали в фильтровальной колонне, содержащей бумажный фильтр (диаметр 125 мм, целлюлозная бумага; Мейдстон, Великобритания). Фильтрат подвергали ультразвуковой обработке с использованием 20 мл метанола и снова фильтровали. Полученный фильтрат затем помещали в роторный испаритель для удаления растворителя, а оставшийся экстракт дополнительно лиофилизировали (Labconco кат. №7934030; Канзас-Сити, штат Миссури, США) в течение 16 ч. до полного удаления воды. Экстракты листьев в метаноле получали либо на базе AnalytiCon Discovery GmbH (Потсдам, Германия), либо на месте, следуя такой же процедуре экстракции.
4. Количественное определение алкалоида в неочищенных экстрактах табака
Образцы для анализа пиридинового алкалоида (никотин, норникотин, анатабин, анабазин, котинин и миозмин) с помощью ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии, объединенной с масс-спектроскопией (UHPLC-MS), получали путем растворения приблизительно 25 мг неочищенного экстракта в смеси вода/метанол (3:7, с использованием 500 нг/мл хинолина в качестве внутреннего стандарта; 5 мл), фильтрации (с использованием стерильного PES шприцевого фильтра Fisherbrand™ с размером пор 0,2 мкм; Thermo Fisher Scientific, Уолтем, штат Массачусетс, США) и разбавления 1:200 смесью для экстракции. Одновременное определение всех шести алкалоидов проводили на системе для UHPLC Ultimate 3000, объединенной с масс-спектрометром Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific). Хроматографическое разделение проводили на колонке Acquity HSS T3 (1,7 мкм, 100 × 2,1 мм; Waters, Милфорд, штат Массачусетс, США); температуру колонки устанавливали на 45°C. Элюенты представляли собой раствор ацетата аммония в воде (10 мM; pH 8,9; элюент A) и раствор ацетата аммония в метаноле (10 мM; элюент B), применяемые в виде градиента (0 мин. 10% B; 0,25 мин. 10% B; 4,25 мин. 98% B; 5,25 мин. 98% B; расход: 0,5 мл/мин.). Объем впрыска составлял 5 мкл. Никотин, норникотин, анабазин, анатабин, котинин и миозмин элюировали в течение 3,89, 2,76, 3,27, 3,36, 2,62 и 3,47 мин. соответственно, и детектировали в виде [M+H]+ псевдомолекулярных ионов после положительной ионизации методом электрораспыления. Концентрацию каждого целевого алкалоида выражали в миллиграммах на грамм сухого веса. Молярную концентрацию целевых алкалоидов в неочищенном экстракте рассчитывали для концентраций неочищенных экстрактов, используемых в тесте на отталкивающую способность у иксодовых клещей, и выражали в микромолях на квадратный метр согласно следующей формуле:
5. Соединения
5.1 Алкалоиды табака
Чистые алкалоиды табака использовали для контактного теста на отталкивающую способность/нокдаун-эффект у иксодовых клещей для определения активности, наблюдаемой при использовании экстрактов листьев табака. Стандарты (S)-никотина, (S)-норникотина, (S)-анабазина, (S)-котинина и миозмина получали от Sigma-Aldrich. Энантиомеры (S)- и (R)-анатабина были синтезированы WuXi AppTec Co., Ltd. (Шанхай, Китай) (таблица 2).
Таблица 2. Выбранные алкалоиды табака MW - молекулярная масса
Рацемический анатабин получали согласно модифицированной процедуре, описанной в Deo and Crooks (1996) Tetrahedron Letters 37(8), pp. 1137-1140. (S)- и (R)-энантиомеры разделяли с помощью хиральной сверхкритической жидкостной хроматографии и превращали в соли хлористоводородной кислоты для улучшения стабильности алкалоидов.
Исходные растворы алкалоидов готовили в виде 20-миллимолярных (мM) растворов в этаноле непосредственно перед применением. Исходные растворы выдерживали при 22°C в темноте для более длительного хранения.
5.2 Положительные контроли для биоанализа
Положительный контроль N-N-диэтил-м-толуамид [DEET], используемый в биоанализах, получали от Merck (Кенилворт, штат Нью-Джерси, США).
6. Биоанализ
Концентрации экстрактов в биоанализах выбирали согласно верхнему пределу организма в отношении переносимости DMSO или конкретным ограничениям биоанализа. Положительные контроли тестировали при их минимальной эффективной концентрации.
6.1 Контактный тест на отталкивающую способность/нокдаун-эффект у иксодовых клещей
Анализ использовали для оценки тестируемого соединения или экстракта в отношении отталкивающего/сдерживающего потенциала. Тест включал первичную оценку эффективности нокдаун-эффекта в качестве вторичной конечной точки. Нокдаун-эффект можно определять как состояние интоксикации и паралича, которое обычно предшествует гибели (Wickham et al. (1974) Pesticide Science 5(5): 657-664). Тест основан на ищущем поведении иксодовых клещей, которые исследуют свое место обитания, чтобы найти подходящее место охоты на хозяина и их склонности к избеганию областей, обработанных отталкивающими или раздражающими веществами. Нокдаун-эффект у иксодовых клещей выражается в виде снижения общей подвижности в течение определенного периода времени, а не сбором и подсчетом числа погибших и живых иксодовых клещей в конце времени воздействия.
Экстракты растений или синтетические чистые алкалоиды, разведенные в метаноле (экстракты) или этаноле (алкалоиды), располагали на дне лунок в шестилуночном планшете. Только одна четверть (2,54 см2) поверхности дна каждой лунки была обработана. Растворитель оставляли испаряться. Конечная концентрация экстрактов растений была, таким образом, выражена в мг/м2, или в микромоль на квадратный метр (мкмоль/м2) для синтетических алкалоидов. Применяемые конечные концентрации для экстрактов растений составляли 893 (только взрослые R. sanguineus), 446, 141, 44,6, 14,1 и 4,46 мг/м2 и 300, 100, 30, 10 и 3 мкмоль/м2 для чистых алкалоидов. Приблизительно 50 личинок иксодовых клещей R. sanguineus и точно 5 взрослых особей R. sanguineus, или 5 нимф I. ricinus добавляли на необработанную область каждой лунки. Положительные (DEET, коммерческий репеллент от иксодовых клещей) и отрицательный (метанол или этанол) контроли оценивали параллельно. Каждую тестируемую концентрацию анализировали в трех или более повторностях теста. После 1-мин. инкубации на термоплите частоту движения иксодовых клещей в обработанной четверти и в каждой из необработанных четвертей записывали посредством машинного зрения. Движение иксодовых клещей на необработанной поверхности рассчитывали в виде медианного значения движения на трех необработанных четвертях. Для оценки сдерживающей способности запись осуществляли в течение 2-мин. периода для личинок R. sanguineus и в течение 3 минут для взрослых особей R. sanguineus и нимф I. ricinus, после 1-мин. периода предварительного воздействия. Для оценки нокдаун-эффекта запись продлевали до 9 мин. (начиналась после 1-мин. периода предварительного воздействия и длилась дополнительно 8 минут).
Сдерживающую активность рассчитывали следующим образом:
Сдерживающая способность в процентах=1 − (движения на обработанной области/движения на необработанной области) × 100.
Существенной считали разницу между общим количеством движений, записанным в обработанной области, и количеством движений, записанным в необработанной области, составляющую 50%.
Нокдаун-эффект у иксодовых клещей рассчитывали аналогично:
Значение нокдаун-эффекта в процентах=1 − (движения в конце периода визуализации/ движения в начале периода визуализации) × 100.
Существенной считали разницу между общим количеством движений, записанным в течение 1-мин. предварительного воздействия, и общим количеством движений, измеренным на 9 мин. записи, составляющую 50%.
6.2 Статистический анализ
Для статистического анализа использовали медианное значение результатов измерений паразитицидной активности в повторе, наблюдаемое при использовании неочищенных экстрактов табака (SAS 9.2, SAS Institute Inc., штат Северная Каролина, США). На первой стадии провели анализ мультиколлинеарности, и он привел к исключению котинина из дальнейшего статистического анализа. Затем использовали линейные модели с пошаговым включением прогностических факторов, а также их взаимодействие второго порядка, для прогнозирования роли алкалоида в обеспечении наблюдаемой эффективности.
7. Результаты
7.1 Количественное определение выбранных алкалоидов в табачных экстрактах
Виды в роде Nicotiana, включая сорта N. tabacum, накапливают алкалоиды в различной степени. Среди множества составляющих табака (углеводы, аминокислоты, пиридиновые алкалоиды, пигменты, изопреноиды, терпеноиды, карбоновые кислоты, полифенолы, стеролы и неорганические соединения, алкалоиды вызывают особенный интерес из-за истории применения никотина в качестве противопаразитарного средства. Чтобы понять, будут ли алкалоиды играть роль в обеспечении биологической активности, наблюдаемой в отношении иксодовых клещей, и какой алкалоид может быть ответственным за эту эффективность, авторы настоящего изобретения осуществляли количественное определение основных пиридиновых алкалоидов в выбранных растениях табак (никотин, норникотин, анабазин, анатабин, котинин и миозмин), используя UHPLC-MS (таблица 3).
Таблица 3. Концентрации пиридинового алкалоида в табачных экстрактах, выраженные в виде миллиграммов на грамм веса неочищенного экстракта
Значения в скобках означают процентный состав всех алкалоидов, для которых осуществляли измерение. Значение основного пиридинового алкалоида в каждом экстракте растения указан жирным шрифтом.
Никотин являлся основным алкалоидом в неочищенных экстрактах сортов Stella и ITB 683 N. tabacum, выращенных на поле, и в сортах TN90 и K326, выращенных в теплице. Анатабин был основным алкалоидом в неочищенном экстракте трансгенной линии TN90 PMT N. Tabacum, но никотин также присутствовал в этом сорте (18,1%). Наибольшая концентрация норникотина (4,78 мг/г) была измерена в экстракте N. glutinosa (Glutinosa), но никотин (11,02 мг/г) был основным алкалоидом в этом экстракте. Наибольшая концентрация анабазина была обнаружена в экстракте N. glauca (Glauca, 5,02 мг/г), но никотин присутствовал в этом экстракте в аналогичном количестве и доле. Анабазин также характеризовался относительно высокой концентрацией в виде доли всех алкалоидов, для которых осуществляли измерение, в экстракте N. debneyi (Debneyi, 0,88 мг/г), хотя никотин основным соединением являлся никотин (6,57 мг/г).
Для понимания потенциальной роли основных алкалоидов в неочищенных экстрактах табака, протестированных на активность в отношении иксодовых клещей, авторы настоящего изобретения анализировали кривые зависимости полных доз и ответов при использовании чистых алкалоидов - (S)-никотина, (S)-норникотина, (S)-анабазина и (S)- и (R)-анатабина, в биоанализе на отталкивающую способность/нокдаун-эффект у иксодовых клещей. Для установления подходящего диапазона концентраций для этого анализа количество каждого алкалоида, измеренное в каждом разведении экстракта (4,46-893 мг/м2), представляли в виде значений молярной концентрации. Диапазоны концентрации алкалоидов в неочищенных экстрактах составляли 1-596 мкмоль/м2 никотина, 0,14-28,8 мкмоль/м2 норникотина, 0,024-27,6 мкмоль/м2 анабазина и 0,5-93 мкмоль/м2 анатабина.
7.2 Биоанализы паразитов с использованием неочищенных экстрактов табачных листьев
Для всех восьми экстрактов табачных листьев показали значительную отталкивающую активность в отношении личинок R. sanguineus при нескольких разведениях (фиг. 3A). Пять экстрактов (Stella, K326, TN90, ITB 683 и Glauca) имели минимальные эффективные концентрации, аналогичные таковым у положительного контроля DEET или ниже. Более того, Stella и TN90 обеспечивали быстрое наступление нокдаун-эффекта у 74% и 77% личинок иксодовых клещей соответственно при концентрации 446 мг/м2. При той же концентрации два других экстракта, K326 и ITB 683, обеспечивали наступление нокдаун-эффекта у 42% и 48% иксодовых клещей соответственно.
Кривые зависимости концентрации и ответов для всех экстрактов были колоколообразными, и наибольшая концентрация (446 мг/м2) не являлась наиболее эффективной. Хотя активность, представляющая собой нокдаун-эффект, проявлявшаяся у половины экстрактов, могла влиять на подвижность иксодовых клещей при записи отталкивающей способности и вносила погрешность в оценку отталкивающей способности, этот эффект также наблюдали в экстрактах без активности, представляющей собой нокдаун-эффекта. В биоанализе иксодовых клещей ограничивали закрытой областью без возможности уйти из нее. При высоких концентрациях табачный экстракт, расположенный на одной четверти тестовой лунки, может влиять на большие части лунки, и в зависимости от давления пара его множества составляющих может насыщать всю атмосферу лунки. Подвергнутые воздействию иксодовые клещи будут пытаться уйти из этой раздражающей среды, не находя выхода, таким образом создавая больше движений в лунке, в том числе на обработанной поверхности.
На основе этих положительных результатов восемь экстрактов табачных листьев дополнительно снова тестировали в отношении взрослых особей R. sanguineus (фиг. 2B, таблицы 6 и 7) и нимф I. ricinus (фиг. 2C) для оценки их спектра активности в отношении других стадий и видов иксодовых клещей.
У взрослых особей иксодовых клещей R. sanguineus (фиг. 2B) отталкивающая активность экстрактов была в общем ниже, чем наблюдаемая у личинок (фиг. 2A). Шесть экстрактов, - K326, TN90, ITB 683, Glutinosa, Glauca и Debneyi, проявляли значительную отталкивающую способность при наибольшей концентрации 893 мг/м2. Исходя из медианного значения эффективности, минимальные эффективные концентрации составляли 141 мг/м2 для TN90, 44,6 мг/м2 для K326 и ITB 683 и 14 мг/м2 для Glauca. Нокдаун-эффект у иксодовых клещей наблюдали при использовании экстракта Stella при трех концентрациях (893-44,6 мг/м2) и при использовании TN90 при 893 и 446 мг/м2. Нокдаун-эффект у иксодовых клещей также наступал при использовании экстрактов Glauca и Debneyi при 14 мг/м2 и 44,6 мг/м2 соответственно.
В биоанализе нимф иксодовых клещей I. ricinus (фиг. 2C) лишь небольшое число экстрактов проявляли значительную отталкивающую способность в отношении иксодовых клещей. Stella и K326 являлись активными при 446 мг/м2 и TN90 - при 44,6 мг/м2. Кроме того, для Glutinosa показана граничная активность при двух концентрациях (446 и 141 мг/м2). Нокдаун-эффект у иксодовых клещей был, напротив, очень высоким (от 89% до 99,8%) в Stella, K326, TN90 и ITB 683 при наивысшей протестированной концентрации, составляющей 446 мг/м2, и семьдесят процентов иксодовых клещей все еще подвергались воздействию при использовании 141 мг/м2 экстракта листьев TN90.
7.3 Эффективность выбранных чистых алкалоидов в отношении отталкивающей способности/нокдаун-эффекта у иксодовых клещей при воздействии на личинок R. sanguineus
(S)-никотин, (S)-норникотин, (S)-анабазин и изомеры (S) и (R) анатабина тестировали при 300, 100, 30, 10 и 3 мкмоль/м2, что охватывает большинство концентраций, измерение которых осуществляли в восьми экстрактах табачных листьев. Котинин и миозмин не рассматривали для тестирования, поскольку они составляли не более 1,3% всего содержания алкалоидов в экстрактах (см. таблицу 3). При использовании трех повторностей было получено три независимые наборы данных теста (таблица 4). Все чистые алкалоиды, за исключением (S)-анабазина, проявляли отталкивающую активность в отношении личинок R. sanguineus при 300 мкмоль/м2. Интересно, что (S)-анабазин был более активным при 100 мкмоль/м2 с медианным значением активности 58%. (S)-Норникотин являлся активным только при наивысшей протестированной концентрации, составляющей 300 мкмоль/м2 (активность 81%). Наилучшие отталкивающие эффекты в отношении иксодовых клещей наблюдали при использовании (R)-анатабина (62% при 30 мкмоль/м2, 84% при 100 мкмоль/м2) и (S)-анатабина (54% при 30 мкмоль/м2, 86% при 100 мкмоль/м2). При 30 мкмоль/м2 (S)-никотин и (R)-анатабин все еще проявляли отталкивающую способность, составляющую 55% и 62% соответственно. Эти результаты являлись сопоставимыми с эффектами положительного контроля DEET при такой же концентрации, медианное значение активности в процентах для DEET составляло 64% при 30 мкмоль/м2. DEET, однако, оставался более активным при 10 мкмоль/м2, чем два изомера анатабина, с медианным значением 57% (по сравнению с медианными значениями 34% и 38% для (R)- и (S)-анатабина соответственно).
(S)-никотин и (R)-анатабин эффективно обеспечивали нокдаун-эффект у личинок R. sanguineus при 300 мкмоль/м2 (медианные значения 95% и 53% соответственно) (таблица 4). При 100 мкмоль/м2 медианное значение активности (R)-анатабина все еще составляло 55%, но падало ниже предела значимости для никотина при медианном значении 37%. При использовании других чистых алкалоидов у иксодовых клещей не наблюдали никакого другого значительного нокдаун-эффекта.
Таблица 4. Активность чистых алкалоидов табака, представляющая собой отталкивающую способность и нокдаун-эффект, в отношении личинок иксодовых клещей R. sanguineus
(Q1-Q3) [%]
[мкмоль/м2]
(Q1-Q3) [%]
[мкмоль/м2]
Q1 - первая квартиль (25%) набора данных. Q3 - третья квартиль (75%) набора данных. N - чисто повторов теста. н/о - не определено.
Минимальная эффективная концентрация представляет собой меньшую концентрацию, для которой рассчитанное медианное значение активности больше, чем предел значимости активности (50%). Значения в процентах, превышающие предел значимости активности, указаны жирным шрифтом.
7.4 Вклад основных алкалоидов табака в активность экстрактов листьев, представляющую собой отталкивающую способность/нокдаун-эффект, в отношении иксодовых клещей, статистический анализ
На содержание алкалоидов в растении табак влияет множество факторов, таких как сорт растения, партия, условия роста в теплице, место, загрязнение воздуха и погодные условия для полевых сортов, условия хранения и сушки. Неочищенные экстракты листьев, полученные из таких растений, являются очень сложными смесями с неизвестными взаимодействиями между составляющими. Все перечисленное влияет на вариабельность, наблюдаемую в биоанализах, делая оценку роли отдельных составляющих экстрактов листьев очень сложной. Принимая во внимание эти ограничения, авторы настоящего изобретения исследовали гипотетический вклад основных алкалоидов, определенных количественно в восьми различных экстрактах листьев табака, в наблюдаемую в биоанализе активность, представляющую собой отталкивающую способность/нокдаун-эффект, в отношении иксодовых клещей. Данные из биоанализа личинок и взрослых особей иксодовых клещей R. sanguineus и нимф иксодовых клещей I. ricinus объединяли и анализировали с помощью линейных статистических моделей. Также оценивали влияние видов и стадий роста иксодовых клещей на активность экстрактов листьев. Из-за вариабельности в пределах трех повторностей в статистическом анализе отталкивающей способности и нокдаун-эффекта в отношении иксодовых клещей использовали медианное значение.
В линейной модели, используемой для прогнозирования активности, представляющей собой нокдаун-эффект, никотин обеспечивал 35% дисперсии модели и характеризовался значительной степенью корреляции с активностью экстрактов листьев, представляющей собой нокдаун-эффект (p < 0,0001). Виды и стадии роста иксодовых клещей умеренно влияли на модель, обеспечивая только 2,3% дисперсии (p <0,05). В линейной модели, используемой для прогнозирования отталкивающей способности, ни один из алкалоидов нельзя идентифицировать в качестве преимущественно влияющего на активность, наблюдаемую при использовании протестированных экстрактов. Однако виды и стадия роста иксодовых клещей значительно влияли на отталкивающую активность экстрактов, обеспечивая 51% дисперсии модели (p < 0,0001).
Для никотина результат модели согласовался с результатами, полученными при использовании чистого алкалоида, хотя он был протестирован только в отношении личинок иксодовых клещей R. sanguineus (см. таблицу 4). Чистый (S)-никотин обеспечивали нокдаун-эффект у 95% личинок иксодовых клещей при 300 мкмоль/м2 (48,7 мг/м2) и 37% при 100 мкмоль/м2 (16,2 мг/м2), что также наблюдали в неочищенных экстрактах, приводящих к летальным эффектам при 446 мг/м2 у тех же видов и стадий роста иксодовых клещей (TN90: 77%, 40,5 мг/м2 никотина; Stella: 74%, 48,3 мг/м2 никотина; K326: 42%, 21,8 мг/м2 никотина; ITB 683: 48%, 17,3 мг/м2 никотина). Нокдаун-эффект экстрактов листьев, содержащих высокие уровни никотина, также наблюдали при 446 мг/м2 у взрослых особей R. sanguineus (Stella и TN90) и нимф I. ricinus (Stella, K326, TN90 и ITB 683).
Хотя для (R)-анатабина в виде чистого соединения показали значительную активность, представляющую собой нокдаун-эффект, при 300 и 100 мкмоль/м2, в модели анатабин не был определен как имеющий влияние на эффект, наблюдаемый при использовании экстрактов листьев. В статистической модели анатабин не анализировали в виде двух отдельных энантиомеров, но в виде рацемата этот алкалоид составлял только 13,1 мкмоль/м2 в Stella, 11,1 мкмоль/м2 в TN90, 7,9 мкмоль/м2 в ITB 683 и 5,35 мкмоль/м2 в K326, при концентрации экстракта листьев, составляющей 893 мг/м2, а именно в десять раз ниже предела минимальной эффективной концентрации чистого алкалоида. Кроме того, никакого конкретного нокдаун-эффекта нельзя было наблюдать в обогащенном анатабином экстракте листьев PMT, по тем же причинам.
В отношении отталкивающей способности, минимальные эффективные концентрации экстрактов находились в диапазоне от 4,7 мг/м2 до 44,6 мг/м2 для личинок R. sanguineus. Алкалоиды, протестированные в виде чистых соединений, в общем не были активными при концентрациях, эквивалентных измеренным в неочищенных экстрактах (молярность соответствующего алкалоида при минимальной ингибирующей концентрации неочищенного экстракта: 3 мкмоль/м2 никотина, 0,45 мкмоль/м2 норникотина, 0,14 мкмоль/м2 анабазина и 4,7 мкмоль/м2 анатабина). Поскольку отталкивающая способность, оказываемая экстрактами листьев в отношении взрослых особей R. sanguineus, была ниже на 3-10 порядков и практически никогда не достигала предела значимости биоанализа против нимф I. ricinus, никакого сравнения активности нельзя провести между экстрактами листьев и чистыми алкалоидами. Эта разница в чувствительности между видами и стадиями роста иксодовых клещей также сильно подчеркивалась статистической моделью.
При использовании против личинок R. sanguineus, среди протестированных чистых алкалоидов (S)-анатабин и (R)-анатабин проявляли наименьшее значение минимальной эффективной концентрации, близкое к таковому при использовании DEET. (R)-анатабин также приводил к значительному нокдаун-эффекту у иксодовых клещей при 300 и 100 мкмоль/м2.
Таблица 5. Эффективность соединений алкалоидов (анатабин*HCl, N=3, поднабор данных, показанных в таблице 4)
Таблица 6. Эффективность табачных экстрактов (1)
Таблица 7. Эффективность табачных экстрактов (2)
8. Анализ на отталкивающую способность соединений анатабина в отношении москитов
Соединение по настоящему изобретению смешивали с этанолом с получением композиции, которую можно применять в отношении поверхности, и позволяли высохнуть. После обработки поверхности соединениями по настоящему изобретению и высыхания, ее нагревали до температуры тела человека, и число приземлений москитов и общее время, проводимое москитами на теплой поверхности, для взрослых особей москитов Aedes aegypti записывали автоматически посредством машинного зрения для измерения отталкивающей способности каждого соединения.
Отталкивающую способность (на основании числа отдельных приземлений на теплую поверхность) выражали в виде процентного значения снижение уровня контроля, где подсчитывали среднее число приземлений москитов на теплую поверхность, обработанную только растворителем, представляющим собой среду-носитель. 100% означает отсутствие приземлений москитов на теплую поверхность.
Для москитов, которые все еще приземлялись на теплую поверхность, время, проведенное на теплой поверхности, также записывали и выражали в виде процентного значения уровня контроля, соответствующего среднему времени, которое москиты проводили на такой же теплой поверхности, если она была обработана только растворителем, представляющим собой среду-носитель. 100% означает, что москиты проводили такое же время на обработанной теплой поверхности, как и на теплой поверхности, обработанной только растворителем, представляющим собой среду-носитель.
Каждое соединение/дозу тестировали в трех повторностях с использованием поверхности площадью 18,9 см2 и 100 микролитров раствора без соединения (плацебо) или с разбавлением соединения, которые распределяли по поверхности и позволяли высохнуть перед тестом. По трем повторностям рассчитывали среднюю и стандартную погрешность. Анализ контроля (применение только растворителя, представляющего собой среду-носитель) проводили с этанолом. Такую же популяцию москитов подвергали действию сначала теплой поверхности, обработанной растворителем, представляющим собой среду-носитель, затем поверхности, обработанной соединением. Концентрацию раствора, содержащего тестовое соединение, регулировали для обеспечения того, что доза соединения при обработке будет соответствовать конечной концентрации на единицу площади поверхности в таблице.
В таблице 7 и на фиг. 3a и 3b показаны результаты тестирования анатабина в виде HCl-соли и в его исходном виде. Неожиданно, анатабин в его исходном виде является значительно лучшим репеллентом от москитов, чем в виде HCl-соли. Это также выражается в том, что москиты проводят намного меньше времени на поверхности, обработанной анатабином в его исходном виде, по сравнению с анатабином в виде его HCl-соли.
Таблица 8
Анатабин
с контролем]
Настоящее изобретение относится к применению соединения формулы I, где R представляет собой водород или C1-C5алкил, 
представляет собой двойную связь, или его соли или кристалла для снижения уровня инфестации эктопаразитами, а также для лечения инфестации эктопаразитами. Кроме того, предложено применение состава, содержащего табачный экстракт, обогащенный соединением формулы Ia, для снижения уровня инфестации эктопаразитами. Изобретение позволяет использовать природные соединения и композиции для контроля эктопаразитов у людей и/или животных, которые характеризуются лучшим профилем безопасности, чем никотин или синтетические неоникотиноиды, благодаря дифференциальному характеру действия, и предлагает более экологичное решение. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 6 ил., 8 табл.
1. Применение соединения формулы I или его соли или кристалла для снижения уровня инфестации эктопаразитами,
Формула I,
где R представляет собой водород или C1-C5алкил и
представляет собой двойную связь.
2. Применение по п. 1 в качестве репеллента для снижения уровня инфестации эктопаразитами.
3. Применение соединения формулы I или его соли или кристалла для лечения инфестации эктопаразитами,
Формула I,
где R представляет собой водород или C1-C5алкил и
представляет собой двойную связь.
4. Применение по п. 3 в качестве эктопаразитицида для лечения инфестации эктопаразитами.
5. Применение по любому из пп. 1-4, где R представляет собой водород или C1-C3алкил.
6. Применение по п. 5, где R представляет собой водород.
7. Применение по любому из пп. 1-6, где соединение представляет собой анатабин, S-(-) анатабин, R-(+) анатабин, смесь S-(-) анатабина и R-(+) анатабина или рацемат S-(-) анатабина и R-(+) анатабина.
8. Применение состава, содержащего табачный экстракт, обогащенный соединением формулы Ia
Формула Ia,
для снижения уровня инфестации эктопаразитами.
9. Применение состава по п. 8, где табачный экстракт получен из сорта Nicotiana tabacum, в котором основной алкалоид не представляет собой никотин.
10. Применение по любому из п. 8 или 9, где соединение представляет собой анатабин, S-(-) анатабин, R-(+) анатабин, смесь S-(-) анатабина и R-(+) анатабина или рацемат S-(-) анатабина и R-(+) анатабина.
11. Применение по любому из пп. 8-10, где содержание соединения формулы Ia в табачном экстракте выше, чем в необработанном растении табак.
12. Применение по п. 11, где соединение формулы Ia получено способом, включающим по меньшей мере одну стадию, которая обеспечивает определенную степень обогащения соединением формулы Ia.
13. Применение по п. 11 или 12, где относительное содержание соединения формулы I, содержащегося в экстракте по настоящему изобретению, повышено на 1%, или 1%-2%, или на по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50%.
14. Применение по любому из пп. 8-13 в качестве эктопаразитицида.
15. Применение по любому из пп. 8-13 в качестве репеллента.
| KR 201800262293 A, 12.03.2018 | |||
| QUAN P.M | |||
| et al | |||
| The Synthesis of Anatabine and Related Compounds, The Journal of Organic Chemistry, 1965, v | |||
| Способ обработки медных солей нафтеновых кислот | 1923 |
|
SU30A1 |
| Топка с несколькими решетками для твердого топлива | 1918 |
|
SU8A1 |
| Приспособление к паровозному регулятору для плавного открытия золотника или клапана | 1925 |
|
SU2769A1 |
| WO 2017117575 A1, 06.07.2017 | |||
| SCHUMACHER J.N | |||
| et al | |||
| Smoke Composition | |||
| An Extensive Investigation of the Water-Soluble Portion of Cigarette Smoke, J | |||
| Agric | |||
| Food Chem., 1977, v | |||
| Видоизменение пишущей машины для тюркско-арабского шрифта | 1923 |
|
SU25A1 |
