Способ получения полифенольного комплекса из ядровой древесины маакии амурской Российский патент 2024 года по МПК A61K36/48 B01D11/02 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способам выделения биологически активных веществ из растительного сырья, в частности к технологии получения полифенольного комплекса из ядровой древесины маакии амурской, который может быть использован в медицине в составе лекарственных средств и биологически активных добавок; в пищевой промышленности при производстве обогащенных функциональных, продуктов питания направленного действия; в кормовой индустрии для увеличения срока годности кормовых добавок.

Маакия амурская (Maackia amurensis Ruper et Max.) – растение семейства бобовых характеризуется высоким содержанием полифенольных соединений с выраженными антиоксидантными, антирадикальными свойствами и низкой токсичностью. При детальном химическом исследовании спиртовых экстрактов ядровой древесины маакии амурской было показано, что основными ее компонентами являются полифенолы, составляющие полифенольный комплекс (ПФК), на основе которого был создан гепатопротективный препарат Максар® (регистрационный номер P N003294/01).

В состав ПФК ядровой древесины маакии амурской входят свыше 20 полифенолов таких, как изофлавоны, птерокарпаны, флаваноны, изофлаваны, изофлаваноны, халконы, лигнаны, мономерные и димерные стильбены. Показано, что Максар® усиливает антиоксидантную защиту организма и снижает уровень перекисного окисления липидов. Этот препарат эффективен при лечении жировой дистрофии печени и снижает общее содержание липидов в крови, обладает антиагрегантными и противоопухолевыми свойствами [Федореев С.А. и др. Препарат максар из дальневосточного растения маакии амурской. Хим. - фарм. журн. 2004; 38 (11): 22-26; RU2342944 C1, 10.01.2009; RU2414920 C1, 27.03.2011].

Запатентовано применение полифенольного комплекса древесины маакии амурской в качестве средства, обладающего противовирусным действием в отношении герпесвируса человека I типа (HSV-1) и энтеровируса В [RU2798659 C1, 23.06.2023], а также в отношении коронавируса SARS-CoV-2 [RU2788762 C1, 24.01.2023].

Установлено, что перечисленные биологически активные свойства ПФК маакии амурской объясняются высокой антиоксидантной активностью входящих в его состав полифенолов [Мищенко Н.П. и др. Антиоксидантные свойства полифенолов из древесины дальневосточного растения маакии амурской //Известия ДВФУ. Экономика и управление. 2022. №3. 118-128.]. Поэтому выделение полифенольных антиоксидантов из древесины маакии амурской является актуальной задачей.

Известен способ получения растительных полифенолов, обладающих гепатозащитным действием, в котором измельченную ядровую древесину маакии амурской экстрагируют в соотношении 1:5 95%-ным спиртом при 50-55°С. Экстракцию повторяют 3 раза при времени настаивания 12-24 ч, экстракты объединяют, упаривают, очищают тяжелым петролейным эфиром или хлористым метиленом при соотношении водный остаток: растворитель 3-4 : 1. Затем целевой продукт извлекают этилацетатом или бутанолом при соотношении водный остаток: растворитель 3 : 1 [RU1510147 C, 30.11.1994]. К недостаткам этого способа можно отнести его длительность, использование токсичных растворителей и пожароопасность.

С целью устранения недостатков известного способа в ТИБОХ ДВО РАН был разработан усовершенствованный способ получения полифенольного комплекса, заключающий в том, что измельченную ядровую древесину маакии амурской экстрагируют 95%-ным спиртом при 50-55°C в соотношении сырье : экстрагент 1 : 5 в батарее перколяторов, затем спиртовые извлечения упаривают и сушат в вакууме [RU2104027 C1, 04.09.1996]. Этот способ принят нами за прототип.

Продукт, получаемый по способу-прототипу, зарегистрирован в МЗ РФ как «Маакии амурской экстракт сухой» для производства нестерильных лекарственных форм, в частности, в качестве активной субстанции гепатозащитного препарата Максар® (номер регистрационного удостоверения P N003309/01). В состав полифенольного комплекса, получаемого по этому способу, входят изофлавоны, птерокарпаны, халконы, лигнаны, мономерные и димерные стильбены [Федореев С.А. и др. Препарат максар из дальневосточного растения маакии амурской // Хим.-фарм. журн. 2004. Т. 38. № 11. С. 22-26].

К недостаткам способа-прототипа можно отнести длительность процесса и высокую материало- и энергозатратность. В этом способе используется батарея перколяторов, то есть каждая порция растворителя спирта используется трижды для полного извлечения полифенольного комплекса, поэтому расходуется не менее 7 кг спирта на кг сырья. Кроме этого, для получения одной порции конечного продукта проходит не менее 4 суток. Все это время используются электричество и водяной пар для обогрева батареи перколяторов, что в конечном итоге увеличивает стоимость целевого продукта.

Задача изобретения – создать способ получения полифенолов из ядровой древесины маакии амурской, лишенный недостатков, присущих известному способу, для удешевления процесса получения целевого продукта.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе получения полифенольного комплекса из ядровой древесины маакии амурской, включающем экстракцию измельченного сырья полярным растворителем при 50-55°С, упаривание экстракта и сушку в вакууме, согласно изобретению, сырье экстрагируют смесью этилового спирта и сверхкритического флюидного диоксида углерода в соотношении сырье : экстрагент 1 : 1,2, при этом этиловый спирт используют в количестве 20-40 масс. %, а диоксид углерода в количестве 60-80 масс. % от общей массы растворителя, под давлением диоксида углерода 100 бар, при скорости потока флюида 5 г/мин и продолжительности экстракции 50-70 мин.

Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в упрощении способа получения полифенолов из ядровой древесины маакии амурской с сохранением количественного и качественного состава целевого продукта.

Условия его проведения более мягкие, чем условия проведения способа-прототипа, т.к. требуется значительно меньше этилового спирта меньшей концентрации (расход этилового спирта до 1,8 против 7 кг на 1 кг сырья в способе-прототипе; снижена концентрация этилового спирта с 95 % до 20-40% в экстрагирующей смеси), длительность процесса экстракции значительно сокращена (с 3 суток до 1 час).

Все эти преимущества предлагаемого способа получения полифенолов из ядровой древесины маакии амурской в сравнении со способом-прототипом позволяют снизить материальные и энергетические затраты, что приводит к удешевлению получения целевого продукта, следовательно к уменьшению его себестоимости. В то же время, получаемый по заявляемому способу целевой продукт идентичен по качественному и количественному составам полифенолов. Антиоксидантные и антирадикальные свойства целевого продукта идентичны свойствам полифенольного комплекса, извлекаемого из ядровой древесины маакии амурской по способу-прототипу.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

Ядровую древесину маакии амурской измельчают в соответствии с нормативными документами на сырье РУ Р N003286/01-180711. Пластинки различной формы, коричневые или темно-коричневые с ярко выраженными полосами, длиной и шириной до 30 мм и толщиной до 1,5 мм. Сверхкритическую флюидную CO₂ экстракцию (СКФ) проводят с использованием системы для сверхкритической экстракции под давлением SFE-500 (Thar SCF Waters, США). Опции системы включают: насос для сорастворителя (насос высокого давления Thar Waters P-50) для извлечения полярных образцов; расходомер CO₂ (Siemens, Германия) для измерения количества CO₂, подаваемого в систему; и несколько экстракционных сосудов для извлечения образцов разных размеров или для увеличения производительности системы. Емкость экстрагирования нагревали с помощью горячего кожуха, температура контролировалась термостатом (±1°С).

Количество растворителей в экстракционной смеси, режимы сверхкритичной флюидной СО₂ экстракции подобраны экспериментальным путем так, чтобы обеспечить максимальный выход целевого продукта.

Количество этилового спирта составляет 20-40 масс. %. При количестве растворителя менее 20 масс. % уменьшается выход полифенолов, при этом начинают экстрагироваться жирные кислоты и другие неполярные вещества, а, следовательно, уменьшается антиоксидантная активность продуктов экстракции. Увеличение содержания этилового спирта в смеси, более 40 масс. %, не приводит к повышению выхода целевого продукта.

Присутствие диоксида углерода в количестве 60-80 масс. % в предлагаемых условиях (давление и скорость потока флюида составляет 100 бар и 5 г/мин соответственно), позволяет защитить полифенолы от окислительной деструкции и достигнуть максимального выхода идентичного по полифенольному составу комплексу, полученному по способу-прототипу. Изменение этих параметров в сторону увеличения или уменьшения приводит к изменению состава полифенолов в продукте.

Температурный режим составляет 50-55°С, т.к. при уменьшении температуры менее 50°С снижается выход целевого продукта, а при увеличении температуры более 55°С возможна деградация отдельных полифенолов.

Время экстракции составляет 50-70 мин. Если процесс вести менее 50 мин, то уменьшается выход продукта, оптимальное время экстракции с 50 до 70 мин.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. В колонку экстрактора загружают 100 г измельченной ядровой древесины маакии амурской. Затем в экстрактор подают 120 г смеси диоксида углерода в количестве 80 масс. % и этилового спирта в количестве 20 масс. %. Процесс СКФ-экстракции осуществляют при давлении 100 бар, скорости потока флюида 5 г/мин и температуре 50°С. Продолжительность экстракции 50 мин. Полученный экстракт упаривают в вакууме и высушивают. Выход полифенолов составил 55,3 мг/г сырья или 5,5 %.

Пример 2. В колонку экстрактора загружают 100 г измельченной ядровой древесины маакии амурской. Затем в экстрактор подают 120 г смеси диоксида углерода в количестве 60 масс. % и этилового спирта в количестве 40 масс. %. Процесс СКФ-экстракции осуществляют при давлении 100 бар, скорости потока флюида 5 г/мин и температуре 55°С. Продолжительность экстракции 70 мин. Выход полифенолов составил 58,3 мг/г сырья или 5,8 %.

Пример 3. В колонку экстрактора загружают 100 г измельченной ядровой древесины маакии амурской. Затем в экстрактор подают 120 г смеси диоксида углерода в количестве 70 масс. % и этилового спирта количестве 30 масс. %. Процесс СКФ-экстракции осуществляют при давлении 100 бар, скорости потока флюида 5 г/мин и температуре 50°С. Продолжительность экстракции 60 мин. Выход полифенолов составил 56,2 мг/г сырья или 5,6 %.

Идентификация выделенных химических соединений

На фиг. 1 представлены ВЭЖХ экстрактов, полученных по заявляемому способу (розовая линия) и способу-прототипу (черная линия) из одной и той же партии растительного сырья.

ВЭЖХ экстрактов проводили на хроматомасс-спектрометре LCMS-2020 (Shimadzu Corp., Япония) при длине волны 254 нм. Разделение полифенолов проводили на колонке Discovery HS C18 (150×2,1 мм, размер частиц 3 мкм, Supelco, США) с использованием бинарного градиента H₂O (A) : MeCN (Б) с добавлением 0,2 % уксусной кислоты, скорость потока 0,2 мл/мин, температура колонки 40 °C. Элюирование проводили по программе 0-6 мин, 25-35 % (Б); 6-11 мин, 35-60 % (Б); 11-14 мин, 60-90 % (Б); 14-16 мин, 90-25 % (Б); 16-20 мин, 25 % (Б).

На фиг. 2 представлены УФ-спектры поглощения экстрактов древесины маакии амурской, полученного по заявляемому способу (красная линия) и по способу-прототипу (черная линия). Аликвоту 10 мкл спиртового экстракта (3,0 мг/мл) растворяли в 3,0 мл спирта, длина оптического пути 10 мм. Спектры записаны на спектрофотометре UV-1800 (Shimadzu, Япония).

Как видно, из ВЭЖХ экстрактов, хроматограммы экстрактов, полученных по заявляемому способу (розовая линия) и способу-прототипу (черная линия) идентичны, так как содержат одни и те же пики основных полифенолов, входящих в состав полифенольного комплекса маакии амурской: изофлавонов, птерокарпанов, халконов, лигнанов, мономерных и димерных стильбенов.

Данные УФ-спектров поглощения полифенольного комплекса также позволяют судить о наличие изофлавонов (характеристичное поглощение в области λ_max 260 нм) и стильбенов (характеристичное поглощение в области λ 290-320 нм) как в экстракте, полученном по заявляемому способу, так и в экстракте, полученном по способу-прототипу, что свидетельствует не только об идентичном составе полифенолов в обоих экстрактах, но и, примерно, об одинаковом их содержании.

Определение антиоксидантной активности (АОА)

Исследование проводили на модели перекисного окисления линолевой кислоты при 40°С. Исходные растворы экстрактов готовили в концентрации 3 мг/мл в этаноле. В стеклянный флакон помещали 30 мкл каждого раствора и 300 мкл линолевой кислоты. Реакционные сосуды помещали в термостат (40°С). Массу предварительно охлажденных до комнатной температуры реакционных смесей измеряли дважды в сутки (точность 0,5 мг). При увеличении массы на 10 мг реакцию останавливали. Все опыты повторялись трижды.

Период ингибирования окисления линолевой кислоты рассчитывали, как разницу между временами, необходимыми для увеличения массы линолевой кислоты на 10 мг в опытах с добавлением и без добавления антиоксидантов, по формуле (1):

Δτ = τ – τ₀, (1)

где Δτ – период ингибирования окисления линолевой кислоты;

τ – время инициации окисления линолевой кислоты в присутствии антиоксиданта (ч);

τ₀ – время инициации окисления линолевой кислоты без добавления антиоксиданта (ч).

Определение антирадикальной активности (АРА) по взаимодействию со свободным радикалом дифенилпикрилгидразила (ДФПГ)

Исследование проводили по модифицированной методике [Антиоксидантная активность полифенолов из дальневосточного растения тиса остроконечного // Хим.-фарм. журн. 2007. Т. 41. № 2. С. 29-34. – DOI 10.1007/s11094-007-0019-0]. К 3 мл этанольного раствора ДФПГ (10^-4 М) добавляли растворы исследуемых экстрактов или фракций в диапазоне концентраций от 3 до 90 мкг/мл, растворы помещали в тёмное место и через 30 мин измеряли абсорбцию при 517 нм с помощью спектрофотометра Shimadzu UV 1240.

Процент ингибирования рассчитывали по формуле (2):

Ингибирование (%) = 100 – (А_{образец} × 100/А_{контроль}), (2)

где А_{образец} – оптическая плотность раствора образца при 517 нм;

А_{контроль} – оптическая плотность раствора ДФПГ (10^-4 М).

Значение ИК₅₀ находили из кривой зависимости процента ингибирования от концентрации. ИК₅₀ обозначает концентрацию соединения, необходимую для улавливания 50 % радикалов ДФПГ за 30 мин. Для каждого соединения измерение проводили трижды.

Результаты изучения АОА и АРА активности экстрактов представлены в таблице 1.

Таблица 1. АОА и АРА экстрактов, полученных заявляемым способом и способом-прототипом

Образец АОА*
Δτ, ч АРА**
ИК₅₀ (мкг/мл) Контроль 62,0±0,8 - Экстракт маакии амурской, полученный по заявляемому способу 210±21,5 11,74±0,48 Экстракт маакии амурской, полученный по способу-прототипу 221,2±6,8 11,0±0,33

* – Линолевая кислота 40°С, время индукции Δτ, час

** – ДФПГ (ИК₅₀ за 30 мин)

Из таблицы 1 видно, что данные антиоксидантной и антирадикальной активности полифенольных комплексов из образцов древесины маакии амурской, полученных заявляемым способом и способом-прототипом, практически совпадают.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу выделения полифенольного комплекса из ядровой древесины маакии амурской. Способ получения полифенольного комплекса из ядровой древесины маакии амурской, включающий экстракцию измельченного сырья полярным растворителем при 50-55°С, упаривание экстракта и сушку в вакууме, при этом сырье экстрагируют смесью этилового спирта и сверхкритического флюидного диоксида углерода в соотношении сырье : экстрагент 1 : 1,2, при этом этиловый спирт используют в количестве 20-40 масс. %, а диоксид углерода в количестве 60-80 масс. % от общей массы растворителя, под давлением диоксида углерода 100 бар, при скорости потока флюида 5 г/мин и продолжительности экстракции 50-70 мин. Вышеописанный способ упрощает способ получения полифенолов из ядровой древесины маакии амурской с сохранением количественного и качественного состава целевого продукта. А именно способ сокращает длительность процесса, материальные и энергетические затраты, что приводит к удешевлению получения целевого продукта, при этом сохранен количественный и качественный состав полифенольного комплекса из ядровой древесины маакии амурской, его антиоксидантные и антирадикальные свойства. 2 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ получения полифенольного комплекса из ядровой древесины маакии амурской, включающий экстракцию измельченного сырья полярным растворителем при 50-55°С, упаривание экстракта и сушку в вакууме, отличающийся тем, что сырье экстрагируют смесью этилового спирта и сверхкритического флюидного диоксида углерода в соотношении сырье : экстрагент 1 : 1,2, при этом этиловый спирт используют в количестве 20-40 масс. %, а диоксид углерода в количестве 60-80 масс. % от общей массы растворителя, под давлением диоксида углерода 100 бар, при скорости потока флюида 5 г/мин и продолжительности экстракции 50-70 мин.