ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2005 года по МПК A61K35/78 A61K31/05 A61P1/16 

Изобретение относится к медицине и фармакологии и касается средств, которые могут быть использованы для лечения хронических гепатитов.

Известны гепатопротекторы растительного происхождения, такие как ЛИВ-52, Катерген, Силибор. В настоящее время наиболее широко используется препарат Карсил (синонимы: Легалон, Силимарин, Силибинин), получаемый из семян растения расторопши пятнистой, который является аналогом отечественного препарата Силибора [1].

Однако при лечении этими препаратами в ряде случаев отмечается низкая терапевтическая эффективность, а также наличие у этих препаратов различного рода побочных эффектов [2, 3].

Наиболее близким к предлагаемому гепатопротекторному средству является гепатопротектор Максар, представляющий собой сухой экстракт из ядровой древесины маакии амурской. Он отличается более высокой эффективностью при лечении хронических гепатитов по сравнению с препаратом Карсил и отсутствием побочных эффектов [4].

Однако Максар получают из древесины растения маакия амурская (Maackia amurensis Rupr. et Maxim), относящегося к редким видам. Ресурсоведческие исследования показывают, что интенсивные заготовки дикорастущих лекарственных растений приводят к повсеместному истощению их запасов, исчезновению популяций и некоторых видов растений, поэтому поиск альтернативных сырьевых источников является актуальной проблемой. В настоящее время развитие биотехнологии (культивирование клеток с целью получения биологически активных веществ) позволяет решить эту проблему.

Задача изобретения - расширение арсенала гепатопротекторных средств.

Задача решена созданием нового гепатопротекторного средства на основе экстракта Maackia amurensis и представляет собой экстракт биомассы Maackia amurensis Rupr. et Maxim, полученной методом культуры каллусов, и содержит полифенольный комплекс, состоящий из даидзеина, ретузина, генистеина, формононетина, маакиаина, медикарпина.

Культуру каллусов растения Maackia amurensis Rupr. et Maxim получают следующим образом: экспланты различных частей растения Maackia amurensis Rupr. et Maxim помещают в колбы Эрленмейера объемом 230 мл, содержащие 50 мл агаризованной питательной среды следующего состава, мг/л воды:

NH₄NO₃ 350–450

KNO₃ 1500-2300

К₂НРO₄ 150-190

CaCl₂×_{6H2O 600–730}

MgSO₄× 7Н₂O 350–390

Н₃ВO₄ 4,2-8,0

MnSO₄× 4H₂O 15,6-26,7

CuSO₄× 5Н₂О 0,02-0,03

CoCl₂× 2Н₂O 0,02-0,03

ZnSO₄× 7H₂O 6,0-10,3

Na₂MoO₄× 2Н₂O 0,2-0,3

KI 0,52-0,90

FeSO₄× 7Н₂O 25,0-30,6

Na₂EDTA× 2Н₂O 33,6-41,0

Мезоинозит 80-120

Тиамина гидрохлорид 0,15-0,25

Никотиновая кислота 0,4-0,6

Пиридоксина гидрохлорид 0,4-0,6

6-Бензиламинопурин 0,45-0,55

α -Нафтилуксусная кислота 1,5-2,5

Казеина гидролизат 40-60

Сахароза 24000-26000

Агар 5800-6200

Вода до 1 л

рН среды 5,6-5,8 до автоклавирования

Экспланты инкубируют в течение 30 суток в темноте при 25° С. Образующиеся на эксплантах каллусы отделяют и культивируют на среде такого же состава в течение десяти пассажей с месячными интервалами для стабилизации биосинтетической активности каллусов. Затем каллусы извлекают из культуральных сосудов и высушивают в токе горячего воздуха при 50-55° С.

Высушенные каллусы обрабатывают 95%-ным этиловым спиртом при 50-55° С в соотношении сырье:экстрагент - 1:5 в батарее перколяторов с последующим упариванием и сушкой спиртовых извлечений под вакуумом. Полученный порошок темно-коричневого цвета представляет собой препарат, содержащий комплекс полифенолов, состав которого проанализирован методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Химическое и фармакологическое исследования препарата из каллусов маакии амурской проведено в сравнении с препаратом Максар из древесины маакии амурской (ПКМ-ЯДР).

Химическое исследование полифенольного комплекса, содержащегося в каллусах маакии амурской (ПКМ-КЛ), показало, что по составу он существенно отличается от полифенольного комплекса, содержащегося в экстракте из ядровой древесины маакии амурской. Установлено, что культура каллусов маакии амурской не содержит в отличие от древесины растения стильбенов, а именно пицеатаннола и резвератрола. Кроме того, в отличие от нативного растения полученная каллусная культура не продуцирует стильбены и димерные стильбены, в то время как полярные фракции экстрактов древесины маакии амурской содержат до 30% олигомерных стильбенов (сцирпусин А, сцирпусин В, маакин, маакин А) [5-7], а также стильбенолигнан мааколин [7] и изофлавоностильбен маакиазин [8]. Однако каллусы синтезируют большее, чем в растении, количество изофлавонов (ретузина, генистеина и формомонетина) и, особенно, птерокарпанов (маакиаина и медикарпина) (табл.1).

Таблица 1
Состав полифенолов древесины и каллусов маакии амурской (мг/г сухой массы)КомпонентыПицеатаннолРезвератролДаидзеинРетузинГенистеинФормононетинМаакиаинМедикарпинДревесина6.32±
0.526.10±
0.18следы1.15±
0.061.92±
0.231.15±
0.190.35±
0.060.28±
0.05Каллусы--0.52±
0.180.91±
0.342.53±
0.424.23±
1.015.78±
1.942.68±
0.45

Суммарное содержание полифенолов в древесине и каллусах составило 17,3±0,18 и 16,7±0,27 мг/г сухой массы соответственно. Таким образом, каллусы маакии накапливают сопоставимое с древесиной маакии амурской количество полифенолов. Но при этом имеются существенные отличия как в составе, так и в соотношении полифенолов, синтезируемых каллусами маакии амурской и древесиной этого растения. Поэтому нельзя было с очевидностью предположить, что полифенольный комплекс каллусов Maackia amurensis Rupr. et Maxim будет обладать гепатопротекторной активностью, подобно полифенольному комплексу древесины Maackia amurensis Rupr. et Maxim.

Исследования гепатопротекторного действия препарата каллусов маакии проведены на группе лабораторных мышей, у которых вызывался искусственный гепатит действием тетрахлорметана (CCl₄) (табл.2).

Таблица 2
Гепатопротекторная активность полифенольного комплекса маакии, полученной из каллусной культуры, по сравнению с комплексом, выделенным из ядровой древесины, при ССl₄-гепатите у мышейОпытные группы
ПоказателиИнтактные животныеССl₄-гепатитССl₄-гепатит + (ПКМ-ЯДР)ССl₄-гепатит + (ПКМ-КЛ)Летальность, %03312,50Изменение массы тела, г+0,95±0,24-1,63±0,97^a-1,15±0,75^a-1,13±0,64^аУдельная масса печени, мг60,6±3,378,3±3,9^а66,0±5,770,6±2,6^аПродолжительность гексеналового сна, мин18,5±0,970,2±2,2^а40,5±2,4^а,б45,3±3,0^а,бЖировая дистрофия печени, баллы0±03,0±0^a2,1±0,33^а,б1,9±0,22^a,бПримечание: (M± m, средние из 6-8 наблюдений), р<0,05 по отношению: ^а - к интактным животным; ^б - к ССl₄-гепатиту

В результате этих исследований установлено, что на седьмой день эксперимента у животных развился выраженный ССl₄-гепатит, который характеризовался четырехкратным увеличением продолжительности гексеналового сна, свидетельствующим об угнетении активности микросомальных ферментов печени. На фоне понижения массы тела к концу эксперимента на 30% возрастала удельная масса печени. Степень жировой инфильтрации гепатоцитов соответствовала по пятибалльной шкале 3 баллам. Гибель в группе мышей с индуцированным гепатитом составила 33%. Смертность в группе мышей, леченных препаратом из ядровой древесины, составила 12,5%. В группе животных, леченных препаратом из культуры каллусов, смертности не наблюдалось. Оба препарата существенно (более чем на 50%) сокращали длительность гексеналового сна и степень ожирения гепатоцитов (до 1,9-2,1 балла), отмечены более умеренные величины удельной массы печени. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о наличии выраженных гепатопротекторных свойств у полифенольного комплекса, выделенного из культуры клеток маакии амурской. При этом полифенольный комплекс из культуры каллусов маакии амурской обладает более выраженной фармакологической активностью.

Одновременно фармакологические исследования проведены на крысах с индуцированным ССl₄-гепатитом. В результате выявлено, что препарат из ядровой древесины в дозе 150 мг/кг (ранее установленная оптимальная эффективная доза) препятствует гиперлипидемии и гипербилирубинемии, уменьшает активность аланин- и аспартатаминотрансфераз, а также щелочной фосфатазы. Препарат из каллусной культуры обладает равным эффектом с препаратом из ядровой древесины при его применении в меньшей дозе, 100 мг/кг. У препарата из каллусной культуры регистрируется тенденция к более выраженному нормализующему влиянию на повышенную токсикантом концентрацию липидов в сыворотке крови. Следовательно, эффективная доза препарата из каллусной культуры в 1,5 раза ниже по сравнению с эффективной дозой препарата из ядровой древесины, что, очевидно, обусловлено более высоким содержанием биологически активных веществ в препарате, полученном из каллусной культуры.

Таким образом, фармакологические исследования препарата каллусной культуры Maackia amurensis показали, что он проявляет значительный гепатопротекторный эффект.

ЛИТЕРАТУРА

1. Яковенко Э.П. и др. Эффективность терапии у больных хроническими гепатитами гепатопротекторами // Материалы итоговой научно-практической конференции “Вопросы клинической медицины”, МЗ РСФСР, М., 1989, с.228-231.

2. Григорьев П.Я. и др. “Диагностика и лечение хронического гепатита и цирроза печени” // Советская медицина, 1985, №12, с.61-67.

3. Блинков И.Л. и др. Опыт клинического применения гепатопротективного средства легалона // Симпозиум “Клиническое значение препарата легалон”, М., 1981, с.113-123.

4. Патент РФ №2175237, А 61 К 35/78, А 61 Р 1/16, 2001.

5. Хим. прир. соед., 1988, №6, с.801-804.

6. Хим. прир. соед., 1992, №5, с.468-476.

7. Phytochemistry, 1995, vol.40, №3, p.1001-1003.

8. Хим. прир. соед., 1986, №1, с.39-42.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и используется для лечения хронических гепатитов. Гепатопротекторное средство представляет собой экстракт биомассы Maackia amurensis Rupr. et Maxim, полученный методом культуры каллусов, и содержит полифенольный комплекс, состоящий из даидзеина, ретузина, генистеина, формононетина, маакиаина, медикарпина. Гепатопротекторное средство способствует эффективному лечению хронических гепатитов. 2 табл.

Гепатопротекторное средство на основе экстракта Maackia amurensis, отличающееся тем, что оно представляет собой экстракт биомассы Maackia amurensis Rupr. et Maxim, полученный методом культуры каллусов, и содержит полифенольный комплекс, состоящий из даидзеина, ретузина, генистеина, формононетина, маакиаина, медикарпина.