Способ предупреждения лизиса кератотрансплантата при ургентной хирургии Российский патент 2024 года по МПК A61F9/01 A61K35/16 A61K35/19 A61P27/02 

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для предупреждения развития лизиса кератотрансплантата при ургентной хирургии.

Традиционная послеоперационная терапия пациентов после кератопластики предполагает применение противовоспалительных, антибактериальных препаратов, стимуляторов регенерации для ускорения репаративных процессов в кератотрансплантате. Однако такое лечение не всегда сопровождается полным приживлением донорской ткани. Кератопластика по неотложным показаниям проводится на фоне воспалительного процесса в ложе роговицы. Провоспалительные цитокины, сопровождающие воспалительный процесс, локально повышают активность ферментов матриксных металлопротеиназ, что приводят к деградации коллагена базальной мембраны эпителия и стромы роговицы, что значительно повышает риск развития посттрансплантационных осложнений, наиболее тяжелым из которых является лизис донорской роговицы (Чеснокова Н.Б., Безнос О.В. Гидролитические ферменты слезной жидкости в норме и при патологии. Российский офтальмологический журнал. 2012;4:107-111; Fini М, Girard М. Expression of collagenolytic/gelatinolytic metalloproteinases by normal cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1990;31(9):1779-88. PMID:2170294).

Причинами расплавления кератотрансплантата в послеоперационном периоде могут служить: замедленная эпителизация и длительно персистирующий язвенный дефект в послеоперационном периоде, рецидивирующая инфекция, нейротрофические и иммунологические нарушения, синдром сухого глаза, стойкая офтальмогипертензия, сопутствующая патология, в первую очередь, аутоиммунные заболевания, а также повышенная агрессия протеолитических ферментов слезы [Ченцова Е.В., Вериго Е.Н., Макаров П.В., Хазамова А.И. Кросслинкинт в комплексном лечении язв роговицы и трансплантата. Российский офтальмологический журнал. 2017;10(3):93-100. https://doi.org/10.21516/2072-0076-2017-10-3-93-100].

При лечении повреждений роговицы и кератотрансплантата хорошо себя показали препараты аутоплазмы в различных модификациях. Наиболее перспективным и безопасным является применение богатой тромбоцитами плазмы (БоТП или platelet rich plasma - PRP). Несколько лет она успешно применяется для купирования воспаления и ускорения регенерации различных тканей [Froum S.I., Wallace S.S., Tarnow D.P. et al. Effect of platelet rich plasma on bone growth and osseointegration in human maxillary sinus grafts: three bilateral case reports // Int J Periodont Restor Dent. - 2002. - Vol.22. - P. 45 - 53. Sacchi M.C., Bellanda M, Vercellotti T. IL- concentrato piastrinico in chirurgia orale e implantare // Dent Mod. - 2000. - Vol.1. - Р. 69-78].

Известны способы применения аутоплазмы при эрозиях и язвах роговицы кератотрансплантата (патент RU 2765601 от 01.02.2022). При эрозиях роговицы используют лизат БоТП в виде инстилляций по 1 капле 3 раза в день до полного заживления. При язве глубиной 100 мкм и менее - субконъюнктивальные инъекции 1 раз в день через день по 0.5 мл, всего 3 инъекции. При язве роговицы глубиной более 100 мкм - покрытие роговицы тромбофибриновым сгустком, фиксированным амниотической мембраной, в сочетании с субконъюнктивальным введением по лимбу в 4-х квадрантах аутологичной сыворотки в общем объеме 1 мл. Выполняют тарзорафию.

Данные способы показали свою эффективность в лечении дефектов роговицы в зависимости от характера и глубины ее повреждения с ускоренным заживлением поврежденной поверхности, формированием помутнения меньшей интенсивности при глубоких повреждениях, снижением частоты рецидивов.

Для лечения глубоких дефектов роговицы и кератотрансплантата в клинической практике известен способ применения аутоплазмы в другой модификации. Сначала получают аутологичную плазму путем одноэтапного центрифугирования из нестабилизированной крови. Инкубируют ее при комнатной температуре до образования геля. После полученный сгусток размещают на роговице, покрывают его амниотической мембраной и фиксируют швами. Субконъюнктивально в 4-х квадрантах по лимбу вводят аутологичную сыворотку в общем объеме 0.5 мл и проводят тарзорафию. При данном способе применения было отмечено сокращение сроков заживления поврежденной поверхности роговицы, улучшение качества ее заживления.

Известен способ применения аутологичных глазных капель лизата обогащенной тромбоцитами плазмы в режиме инстилляций 4-5 раз в день на фоне стандартной медикаментозной терапии, применяемой после плановой кератопластики до полной эпителизации деэпителизированного дефекта. (Н.П. Шахбазян Лечение персистирующего эпителиального дефекта после кератопластики с помощью дериватов аутокрови. Дис. кандидата медицинских наук, 2022 г.). Данный способ оказался эффективен при лечении персистирующих эпителиальных дефектов роговицы после кератопластики. Препарат лизата обогащенной тромбоцитами плазмы применяют при отсутствии завершенной эпителизации после проведенной плановой кератопластики в течение более, чем 14 дней на фоне стандартной репаративной терапии.

Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является способ того же назначения, в котором используют препарат Апротинин у пациентов после пересадки роговицы высокого риска с целью минимизации послеоперационных осложнений, предупреждения развития изъязвления и расплавления кератотрансплантата с первого дня после операции субконъюнктивально в суточной дозе 5000-10000 ед. и в виде инстилляций 6-8 раз в сутки (Ченцова Екатерина Валериановна. Система патогенетически обоснованного лечения ожоговой травмы глаз: Экспериментально-клиническое исследование: автореферат дис. доктора медицинских наук: 14.00.08 / Моск. НИИ глазных болезней. им. Гельмгольца - Москва, 1996. - 40 с.: ил. РГБ ОД, 9 96-2/704-8). Недостатками данного способа является наличие большого количества побочных эффектов, наиболее тяжелым из которых является анафилактический шок, что требует определенных условий при введении препарата off-libel, таким образом препарат Апротинин не является безопасным для пациентов; кроме того, учитывая наличие в составе препарата Апротинин белка животного происхождения, необходимо определение антител класса G у пациентов с помощью ИФА крови, что не всегда доступно врачу-офтальмологу. В настоящее время препарат не разрешен для применения off-libel.

Задачей изобретения: является разработка нового подхода профилактики лизиса трансплантата при ургентной хирургии.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является сохранение трансплантата и снижение риска повторных кератопластик после ургентной кератопластики/рекератопластики, проведенной на фоне лизиса собственной роговицы или кератотрансплантата.

Технический результат достигается за счет использования двух форм введения лизата богатой тромбоцитами плазмы в определенной концентрации: лизата богатой тромбоцитами плазмы в инстилляциях и субконъюнктивальных инъекциях с первого послеоперационного дня до полной эпителизации роговицы.

Существенным является наличие двух форм введения препарата, что позволяет обеспечить целевую концентрацию тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ и цитокинов в течение длительного времени после кератопластики на фоне уже имеющегося воспалительного процесса.

Тромбоциты человека содержат широкий набор цитокинов, факторов роста и дифференцировки клеток, а также показано наличие в них тромбоцитарно-ассоциированного ингибитора матриксной металлопротеиназы первого типа. [Cooper Т, Eisen A, Stricklin G, Welgus Н. Platelet-derived collagenase inhibitor: characterization and subcellular localization. Proc Natl Acad Sci USA. 1985;82(9):2779-2783. https://doi.org/10.1073/pnas.82.9.2779]. При это по данным авторов, уровень ТИМП-1 в крови достоверно коррелирует с количеством тромбоцитов. [Murate Т, Yamashita К, Isogai С, Suzuki Н, Ichihara М, Hatano S, et al. The production of tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) in megakaryopoiesis: possible role of platelet- and megakaryocyte-derived TIMPs in bone marrow fibrosis. Br J Haematol. 1997;99(1):181-189. PMID: 9359522 https://doi.org/10.1046/j.1365-2141.1997.3293146.x.]. Синергичное действие тромбоцитарного ТИМП, а также цитокинов и ростовых факторов будет способствовать купированию воспалительной реакции, коррекции локального протеолитического статуса и предупреждению лизиса кератотрансплантата при ургентной хирургии.

БоТП изготавливается по патенту RU 2681753 С1, 23.03.2020 из стабилизированной венозной крови пациента. Процесс получения состоит из взятия 30 мл венозной крови, взятой из кубитальной вены, центрифугирования ее в течение пяти мнут при 300g. Богатая тромбоцитами плазма забирается из верхней части пробирки так, чтобы над клеточным осадком осталось не меньше 1 мм плазмы. Далее проводят центрифугирование в течение 17 минут при 700g. Повторно отбирают верхнюю часть плазмы так, чтобы ее над осадком осталось 3,1 мл. Далее проводят количественный анализ функциональных тромбоцитов путем витального окрашивания флуорохромными красителями трипафлавином и акридиновым оранжевым с помощью флуоресцентного микроскопа, в случае необходимости, достигают целевые показатели путем коррекции объема БоТП за счет добавления или отбора плазмы. В случае меньшей концентрации - допускается дополнительное центрифугирование с ускорением 700G в течение 17 минут, отбором излишка плазмы и повторным определением концентрации функционально полноценных тромбоцитов. Конечные концентрации тромбоцитов с гранулами составляли 350 тыс/мкл и более. Для получения лизата пробирку с БоТП замораживают до температур - 40°С, с последующей разморозкой при температуре 2-6°С и центрифугированием 20 минут при 3000g. Вся надосадочная часть - это лизат БоТП, который отбирается и помещается в пробирку. Из 30 мл крови получается около 3 мл лизата БоТП. Лизат БоТП аликвотировали в стерильные эппендорфы по 0,5 мл, герметично закрывали и замораживали в морозилке при -20 до применения.

Были проведены эксперименты in vitro.

В первом эксперименте оценивали содержание ТИМП-1 в тромбоцитных препаратах, полученных разными способами. Исследовали тромбоциты 10 доноров-добровольцев. Из крови доноров выделяли богатую тромбоцитами плазму (БоТП), бедную тромбоцитами плазму, суспензию тромбоцитов, отмытых от плазмы (ОтмТр), проводили морфофункциональный анализ тромбоцитов, после этого из БоТП, ОтмТр и бедной тромбоцитами плазмы готовили лизат тромбоцитов. Концентрацию ТИМП-1 в лизатах определяли с помощью иммуноферментного анализа. По данным ИФА уровень ТИМП-1 в лизатах БоТП и ОтмТр достоверно не различался, в бедной тромбоцитами плазме уровень ТИМП-1 был достоверно ниже, чем в лизатах БоТП и ОтмТр (р=0,003). Во всех типах препаратов концентрация ТИМП-1 в 2-4 раза превышала аналогичные значения в сыворотке крови здоровых людей, приводимые в других исследованиях. Была выявлена слабая корреляция между концентрацией ТИМП-1 и количеством тромбоцитов в БоТП.

Во втором эксперименте была проведена оценка влияния тромбоцитных препаратов на активность коллагенолитических ферментов in vitro и стандартизирован по составу лизат БоТП для наиболее эффективного ингибирования коллагенолитических ферментов.

В качестве коллагеновых матриксов использовали образцы аллогенного амниона и коллагеновые повязки на основе коллагена 1 типа человека. Образцы амниона предварительно консервировали путем высушивания на поверхности силикатных гранул по стандартной методике. Коллагеновые повязки готовили из 0,7-0,8% раствора жидкого коллагена 1 типа человека, выделенного из сухожилий доноров тканей. В качестве источника коллагенолитических ферментов использовали препарат «Ферменкол», содержащий 9 типов коллагенолитических ферментов. Для разведения сухой фракции ферментов использовали изотонический физраствор (0,9% хлорид натрия), 4 мг сухой фракции разводили 40 мл физраствора. Опытные образцы амниона и коллагеновых повязок площадью 0,5-1 см² предварительно вымачивали в изотоническом физрастворе, затем помещали в эппендорфы и вымачивали в 500 мкл препарата «Ферменкол» или 500 мкл смеси «Ферменкола» и тромбоцитных препаратов в течение 10 мин при 20-22°С. Во всех случаях соотношение «Ферменкола» и тромбоцитных препаратов составляло 1:1. Для оценки содержания тромбоцитов с гранулами использовали способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов, основанный на витальном окрашивании клеток. Концентрация тромбоцитов с гранулами БоТП и ОтмТр варьировала от 280 до 480 тыс/мкл. Анти-коллагенолитическую активность препаратов оценивали после обработки трансплантатов по уровню автофлуоресценции коллагена в составе трансплантатов.

Результаты показали, что наиболее перспективным препаратом, способным ингибировать активность коллагенолитических ферментов, является лизат богатой тромбоцитами плазмы с концентрацией тромбоцитов с гранулами не менее 350 тыс/мкл.

В клинических условиях лизат богатой тромбоцитами плазмы с концентрацией тромбоцитов с гранулами не менее 350 тыс/мкл был использован у пациентов с перфорацией роговицы и с лизисом кератотрансплантата.

Способ осуществляют следующим образом.

У пациентов после ургентной кератопластики/рекератопластики для профилактики лизиса кератотрансплантата, начиная с первого послеоперационного дня, лизат богатой тромбоцитами плазмы, содержащий тромбоциты с гранулами в концентрации не менее 350 тыс/мкл вводят субконъюнктивально в объеме 0,5 мл 3 инъекции через день, всего 3 раза и ежедневно в инстилляциях 3 раза в день до полной эпителизации трансплантата и купирования воспалительной реакции.

Клинический пример 1.

Пациент М, 54 г. Диагноз OS-язва роговицы с перфорацией, осложненная катаракта. OD-старческая ядерная катаракта.

Со слов пациента всю жизнь зрение было хорошее. Примерно месяц назад стал отмечать боль и покраснение на OS (на фоне полного здоровья). По месту жительства был выставлен диагноз кератоувет OS и назначено лечение без особого положительного эффекта. Самостоятельно обратился в ОНП НМИЦ ГБ им. Гельмгольца, поставлен диагноз «OS - язва роговицы с перфорацией». Был госпитализирован для хирургического (сквозная кератопластика криоконсервированной роговицей) и консервативного лечения OD по неотложным показаниям.

При поступлении пациент предъявлял жалобы на резкое снижение зрения OS, боль, светобоязнь, слезотечение. Острота зрения левого глаза - счет пальцев у лица. Конъюнктива гиперемирована, в оптической зоне роговицы - язва ≈3×2 мм с перфорацией, тампонированной радужкой. Пациенту провели сквозную кератопластику криоконсервированной роговицей на OS. В послеоперационном периоде получал стандартную антибактериальную, противовспалительную, репаративную терапию. На 5 день после операции при окрашивании поверхности трансплантата флуоресцеином площадь эпителизации была менее 50%, в связи с этим провели покрытие амниотической мембраной для дополнительной стимуляции эпителизации. Через 5 дней после покрытая амниотической мембраной эпителизация была завершена. Спустя месяц на контрольном осмотре была отмечена эрозия трансплантата, назначена консервативная терапия со слабоположительным эффектом. Через 2 месяца после операции кератотрансплантат лизировался, швы провисли, пациент был направлен на рекератопластику.

Клинический пример 2.

Пациент С., 56 лет. Диагноз: OD - язва роговицы с перфорацией, тампонированная радужкой, осложненная катаракта; OS - начальная старческая катаракта

Со слов пациентки, зрение в течение жизни было высокое. Операции и травмы на OU отрицает. С февраля 2023 г. лечилась амбулаторно по месту жительства по поводу кератита на OD. 01.08.2023 г появилась резкая боль, снижение зрения на OD, был поставлен диагноз OD-кератит неясной этиологии, проведено консервативное лечение. Самостоятельно обратилась в Центр 16.08.2023, где поставлен диагноз «OD - перфорирущая язва роговицы, тампонированная радужкой, осложненная катаракта». Была госпитализирована для хирургического (сквозная кератопластика криоконсервированной роговицей) и консервативного лечения OD по неотложным показаниям.

При поступлении пациентка предъявляла жалобы на резкое снижение зрения OD, боль, светобоязнь, выраженный блефароспазм OD. Острота зрения правого глаза - 0,01 н.к. Конъюнктива гиперемирована, на 7 час - язва роговицы ≈2×1,5 мм с перфорацией, тампонированной радужкой, периферическая васкуляризация. Была проведена сквозная кератопластика криоконсервированной роговицей. В послеоперационном периоде, на фоне стандартной антибактериальной, противовспалительной, репаративной терапии, применяли лизат БоТП, полученный из богатой тромбоцитами плазмы, содержащей количество тромбоцитов с гранулами 350 тыс/мкл. Проводили субконъюнктивальные инъекции лизата БоТП 1 раз в день через день по 0.5 мл всего 3 инъекции и дополнительно инстилляции лизата БоТП ежедневно по 1 капле 3 раза в день до полной эпителизации трансплантата. На 4 день после операции при окрашивании поверхности трансплантата флуоресцеином, была отмечена полная эпителизация донорской роговицы, через месяц на контрольном осмотре трансплантат был полупрозрачным, полностью эпителизированным, швы адаптированные, чистые. Таким образом, удалось добиться эпителизации кератотрансплантата в кратчайшие сроки, обеспечить гладкое течение раннего и позднего послеоперационного периода.

Клинический пример 3

Пациент К., 48 лет. Диагноз: OS-язва с перфорацией сквозного кератотрансплантата, провисшие швы роговицы, OU-миопия слабой степени Со слов пациента, миопия слабой степени с юношеских лет. С детства отмечает периодически возникающее покраснение OS и появление пузырьковых высыпаний на коже левой половины лица, за помощью к врачам не обращался. В сентябре 2022 г покраснел левый глаз, появились пузырковые высыпания на коже спинки носа, век слева, лечился по месту жительства (назначены капли Тобрадекс, Диклофенак, Сульфацил натрия). самостоятельно. Через неделю на фоне терапии без эффекта, обратился к офтальмологу по м/ж (рп. Ольховатка) назначены капли Тобрадекс, Диклофенак, Сульфацил натрия. Через две недели на фоне лечения без положительной динамики резко снизилось зрение, появилась боль на OS после подъема тяжести. Самостоятельно обратился в НМИЦ ГБ им. Гельмгольца, был поставлен диагноз «OS-перфорирующая язва роговицы». Госпитализирован по неотложным показаниям. Проведена операция на OS - сквозная кератопластика криоконсервированной роговицей. Через месяц на контрольном осмотре диагностирована язва сквозного кератотрансплантата, угроза перфорации. Был госпитализирован по неотложным показания, проведена замена кератотрансплантата на OS и наложена амниотическая мембрана. Далее в течение 4 месяцев наблюдался в НМИЦ ГБ им. Гельмгольца с рецидивирующей эрозией кератотрансплантата, неоднократно проводили покрытие амниотической мембраной, на очередной консультации в НМИЦ ГБ им. Гельмгольца была диагностирована язва кератотрансплантата с истончением и угрозой перфорации, рекомендована госпитализация по неотложным показаниям в для проведения рекератопластики.

При поступлении пациент предъявлял жалобы на резкое снижение зрения OS, боль, покраснение и светобоязнь. Острота зрения левого глаза 0,05 sph-3,0=0,1. Конъюнктива гиперемирована, тотальная язва частичного сквозного кератотрансплантата с истончением, швы чистые, провисшие. Была проведена сквозная рекератопластика криоконсервированной роговицей. В послеоперационном периоде, на фоне стандартной антибактериальной, противовспалительной, репаративной терапии, применяли лизат БоТП, полученный из богатой тромбоцитами плазмы, содержащей количество тромбоцитов с гранулами не менее 580 тыс/мкл. Проводили субконъюнктивальные инъекции лизата БоТП 1 раз в день через день по 0.5 мл всего 3 инъекции и дополнительно инстилляции лизата БоТП ежедневно по 1 капле 3 раза в день до полной эпителизации трансплантата. На 7 день после операции при окрашивании поверхности трансплантата флуоресцеином, была отмечена полная эпителизация донорской роговицы. Через месяц на контрольном осмотре трансплантат был полупрозрачным, полностью эпителизированным, швы адаптированные, чистые. Таким образом, удалось добиться эпителизации кератотрансплантата в минимально возможные сроки. За 2 месяца наблюдения динамика была положительная, рецидивов эрозии трансплантата не было.

Таким образом, способ обеспечивает сохранение трансплантата и снижение риска повторных кератопластик после ургентной кератопластики/рекератопластики, проведенной на фоне лизиса собственной роговицы или кератотрансплантата.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для предупреждения лизиса кератотрансплантата при ургентной хирургии. Способ включает введение лизата богатой тромбоцитами плазмы (далее - БоТП). Начиная с первого послеоперационного дня, лизат БоТП, содержащий тромбоциты с гранулами в концентрации не менее 350 тыс./мкл, вводят субконъюнктивально 1 раз в день через день по 0,5 мл, всего 3 инъекции, и ежедневно в инстилляциях 3 раза в день до полной эпителизации трансплантата и купирования воспалительной реакции. Использование изобретения позволяет достичь сохранения трансплантата и снижения риска повторных кератопластик после ургентной кератопластики/рекератопластики, проведенной на фоне лизиса собственной роговицы или кератотрансплантата за счет использования двух форм введения лизата БоТП с концентрацией тромбоцитов с гранулами не менее 350 тыс./мкл, ингибирующего активность коллагенолитических ферментов. 3 пр.

Способ профилактики лизиса кератотрансплантата при ургентной кератопластике/рекератопластике, отличающийся тем, что, начиная с первого послеоперационного дня, лизат богатой тромбоцитами плазмы, содержащий тромбоциты с гранулами в концентрации не менее 350 тыс./мкл, вводят субконъюнктивально 1 раз в день через день по 0,5 мл, всего 3 инъекции, и ежедневно в инстилляциях 3 раза в день до полной эпителизации трансплантата и купирования воспалительной реакции.