Способ получения гибридного препарата фицина и аскорбата хитозана в виде густого раствора Российский патент 2024 года по МПК C12N11/02 C12N9/50 A61K38/46 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой и химико-фармацевтической промышленности, медицине, косметологии и исследовательских целях.

Фицин (КФ 3.4.22.3) - протеолитический фермент класса гидролаз, выделяемый из латекса растений рода Ficus. Фицин состоит из одной полипептидной цепи, содержащей две сульфгидрильные группы, но только одна из них расположена в активном центре фермента. Его молекулярная масса составляет 25-26 кДа. Активный центр состоит из каталитической триады, которая включают Cys, His и Asp [Mahmoud S.Y.M., Gad-Rab S.M.F., Hussein N., Shoreit A. A.M. / Global Journal of Biotechnology and Biochemistry. -2010. V. 5, №3. -P. 198-205].

Оптимальными условиями для функционирования энзима является диапазон значений рН 6.5-9.5 и диапазон температур 60-65°С. Изоэлектрическая точка фермента составляет 9.0 [Holyavka M.G., Kondratyev M.S., Lukin A.N. Agapov B.L., Artyukhov V.G. / International Journal of Biological Macromolecules. - 2019. V. 138. - P. 681-692].

Фицин применяется в мясной промышленности для «смягчения» и улучшения качества мяса благодаря своей способности гидролизовать мышечные и соединительные ткани. Фицин активно используют в косметической промышленности для восстановления и смягчения кожи. Он обладает противоожоговыми, ранозаживляющими и противовоспалительными свойствами, которые предполагают возможность применения фицина в биотехнологии и медицине [Aider М. Potential applications of ficin in the production of traditional cheeses and protein hydrolysates / JDS Communications. - 2021. V. 2, №5. - P. 233 - 237].

Тиольная группа цистеина легко окисляется в достаточно «мягких» условиях. Поэтому для промышленного использования цистеиновых протеаз необходимо «защитить» активный центр от негативного воздействия факторов окружающей среды путем его иммобилизации на носителях, способных к взаимодействию с белком [Ol'shannikova S. S., Red'ko Yu. A., Lavlinskaya М. S., Sorokin A.V., Holyavka M.G., Artyukhov V.G. Preparation of papain complexes with chitosan microparticles and evaluation of their stability using the enzyme activity level / Pharmaceutical Chemistry Journal. - 2022. V. 55. - 1240-1244]. Одними из таких носителей является хитозан и его производные.

Хитозан является промышленно значимым производным хитина. Он представляет собой статистический сополимер, макромолекулы которого состоят из звеньев D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина, связанных 1,4-β-гликозидными связями [Редько Ю.А., Олыыанникова С.С., Холявка М.Г., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Артюхов В.Г. Разработка методики получения ассоциатов бромелина с микро- и наночастицами хитозана / Химико-фармацевтический журнал. - 2022. - Т. 56, №7. - С.45-49].

Хитозан и его производные обладают уникальными свойствами в качестве носителей для различных ферментов, применяемых в медицинской и фармацевтической промышленностях. Низкая стоимость, доступность, антимикробная активность, биоразлагаемость и адгезивные свойства делают хитозан перспективным носителем для доставки лекарств. Хитозан является биосовместимым и не вызывает побочных реакций при контакте с клетками человека. Благодаря волокнистой структуре и возможности образовывать пористые эластичные пленки, матрицы на основе хитозана представляют интерес в тканевой инженерии для контролируемого высвобождения лекарственных средств, а также для ремоделирования [Скрябин К.Г., Вихорева Г.А., Варламов В.П. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение. - 2002. - 365 с].

Применение хитозана в биомедицинских областях ограничено из-за его низкой растворимости в физиологических средах. Это затруднение может быть преодолено посредством химической модификации полимера путем введения активных групп в гидроксильные (С3 и С6) и аминогруппы (С2) молекул хитозана [Hafsa J., Charfeddine В., Smach М.А., Limem К., Majdoub H., Sonia R. Synthesis, characterization, antioxidant and antibacterial proprieties of chitosan ascorbate / International journal of pharmaceutical, chemical and biological sciences. - 2014. - V. 4, №4. - P. 1072-1081]. Особый интерес представляет его производное - аскорбат хитозана.

Аскорбат хитозана - органическая соль, образующаяся в результате взаимодействия аминополисахарида хитозана с аскорбиновой кислотой в водной среде [Аль Зубейди А.Ф.А., Малинкина О.Н., Чемодурова А.А., Ксенофонтова О.Ю., Зудина И.В. Оценка антибактериальной активности L- И D-изоформ аскорбиновой кислоты и их солей с хитозаном / Современные проблемы науки и образования. - 2016. №5. - С.298].

Аскорбат хитозана в отличие от хитозана обладает более независимым от рН профилем растворимости, что обеспечивает его преимущества при обработке и изготовлении биоматериалов [Nurgaliev I.N. DFT Study of Chitosan Ascorbate Nanoparticles Structure / Article. - 2011. - V. 107, №3. - P. 218-226]. Входящая в его состав аскорбиновая кислота придает полимеру антиоксидантные свойства.

Существует способ получения иммобилизованного протеолитического комплекса для применения в медицине [Патент RU 1041567, МПК C12N 11/10, опубл. 15.09.1983, Бюл. №34]. В качестве носителя используют ксилоуронид, растворенный в 0,1 М трисоксиметиламинометановом буфере, рН 8,05.

Недостатком способа является дорогостоящий носитель - ксилоуронид и необходимость хранения препарата при температурных значениях 0-4°С.

Известен способ получения препарата на основе фицина и низкомолекулярного хитозана 50-190 кДа, который позволяет "сократить расход противовоспалительного, ранозаживляющего средства благодаря пролонгированному действию и высокой стабильности получаемой субстанции [Патент RU 2769243 С1, СПК А61К 31/722 (2021.08); А61К 38/46 (2021.08); А61К 38/48 (2021.08); А61К 31/56 (2021.08); А61Р 17/02 (2021.08), опубл. 29.03.2022, Бюл. №10]. Он включает иммобилизацию энзима в буферном растворе на матрицу кислоторастворимого низкомолекулярного хитозана (50-190 кДа) в соотношении 20 мл буферного раствора фицина в концентрации 1 мг/мл на 1 г хитозана, при этом в качестве буферного раствора используют 0,05 М боратный буфер с добавлением KCl с рН 8,0; инкубирование в течение 24 часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; промывание образовавшегося осадка 0,05 М боратным буфером с добавлением KCl с рН 8,0 до отсутствия в промывных водах фицина.

Существует способ получения гетерогенного биокатализатора на основе фицина, иммобилизованного на ионообменных смолах [Патент RU 2769734 С1, СПК C12N 11/10 (2022.01); C12N 9/50 (2022.01), опубл. 05.04.2022, Бюл. №10], включающий адсорбционную иммобилизацию фицина в буферном растворе на матрицу ионообменной смолы, инкубацию при комнатной температуре, промывку образовавшегося осадка буфером, при этом иммобилизацию проводят на матрицу воздушно-сухой ионообменной смолы АВ-17-2П или АВ-16-ГС, а в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М фосфатный буфер для ионообменной смолы АВ-17-2П, рН 11,0 или 0,05 М NaOH-KCl буфер для АВ-16-ГС.

Недостатком данных способов является то, что в результате получается нерастворимая форма фермента, которая не дает возможность проводить реакции на твердых субстратах.

Известен способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе фицина, гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами [Патент RU 2744457 CI, А61К 38/00, А61К 38/46, А61К 47/36, C12N 11/08, А61Р 17/02, опубл. 09.03.2021, Бюл. №7], включающий иммобилизацию ферментного препарата на основе фицина, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты, растворение фицина в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 к Да, или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа, или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в соотношении 10 мг энзима на 2 мл водного раствора гиалуроновой кислоты различной молекулярной массы в концентрации 1,5%, при перемешивании до полного растворения при комнатной температуре; проведение иммобилизации фицина путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы с молекулярной массой 50-100 кДа (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с молекулярной массой 50-100 кДа с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля. Недостатком способа является высокая стоимость гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами. Кроме того, модификация полисахаридов виниловыми мономерами - трудозатратный процесс, требующий привлечения высоко квалифицированных кадров. Использование аскорбата хитозана методически существенно упрощает и соответственно удешевляет процесс получения гибридного препарата папаина.

Существует способ стабилизации протеаз для использования в косметологических целях [US 2011/0177052]. Недостатком способа является использование 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, который вызывает серьезные ожоги кожи и повреждение глаз, может приводить к аллергическим кожным реакциям, при вдыхании может вызывать симптомы астмы или затруднение дыхания, что ограничивает применение препарата в косметологии.

Предложен способ включения фицина в гель на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана [Разработка методики включения фицина в гель на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана / Ольшанникова С.С., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. // Химико-фармацевтический журнал. - 2020. - Т. 54, №10. - С.52-55]. Известен способ получения гетерогенного препарата в виде гелей на основе фицина и карбоксиметилцеллюлозы [Патент RU 2771183 С1, СПК C12N 11/04 (2022.02); C12N 11/12 (2022.02); А61К 38/46 (2022.02), опубл. 28.04.2022, Бюл. №13], включающий иммобилизацию ферментного препарата в буферном растворе в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 3 мг/мл на 1 г носителя, в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М боратный буфер с добавлением 0,1 М KCl с рН 9,0; инкубация проводится в течение 2 часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; образовавшийся осадок промывают 0,05 М трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка. Предлагаемый нами способ позволяет получить иммобилизованный фицин в другой форме, т.е. не в виде геля, а в форме густого раствора, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) фицин и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы. Существует способ получения гибридного препарата фицина и N-малеоилхитозана в виде густого раствора (Патент RU №2792784 С1, СПК C12N 11/02 (2023.01); C12N 9/50 (2023.01); А61К 38/48 (2023.01), опубл. 24.03.2023, Бюл. №9), включающий иммобилизацию ферментного" препарата фицина в буферном растворе с носителем, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 ч и промывку, в котором иммобилизацию фицина проводят путем комплексообразования в густой раствор N-малеоилхитозана с молекулярной массой 200 кДа в соотношении 10 мл раствора фицина в концентрации 2 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г сухого N-малеоилхитозана, предварительно растворенного в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 10,0; образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывают с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3.7 мл на 10 мм длины с диаметром пор 25 кДа против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, из расчета, что для промывки 21 мл полученного препарата используют 200 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, диализ ведут в течение 8 ч, после чего буфер меняют на порцию свежего в объеме 200 мл и продолжают диализ еще в течение 16 ч до отсутствия в промывном растворе свободного фицина.

N-малеоилхитозан - производное хитозана, получаемое путем ацилирования полисахарида ангидридом малеиновой кислоты. Несмотря на то, что в результате этой модификации достигается расширение диапазона значений рН, при которых хитозан растворим в воде, а также появляются новые типы функциональных групп, способных, например, взаимодействовать по ионному механизму, его применение в иммобилизации ферментов для пищевого или биомедицинского назначения ограничено. Малеиновый ангидрид является мощным ирратантом кожи и слизистых оболочек, имеет 2 класс опасности [ГОСТ 11153-75. Ангидрид малеиновый технический. Технические условия]. Синтезируемый iV-малеоилхитозан требует тщательной очистки от непрореагировавшего малеинового ангидрида, например, дорогостоящими хроматографическими методами, что негативно сказывается на рентабельности использования этого полисахарида в качестве матрицы для иммобилизации ферментов.

Предложены способы получения фицина, иммобилизованного на следующих водорастворимых производных хитозана - N-сукциноилхитозане [Разработка биокатализатора на основе фицина, иммобилизованного на N-сукциноилхитозане / Олыианникова С.С, Редько Ю.А., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. // Вестник ВГУ. Серия «Химия. Биология. Фармация». - 2022. - №2. - С.85-90], карбоксиметилхитозане и N-(2-гидрокси)пропил-3-триметиламмоний хитозане [Получение комплексов фицина с карбоксиметилхитозаном и N-(2-гидрокси)пропил-3-триметиламмоний хитозаном и изучение их структурных особенностей / Малыхина Н.В., Олыианникова С.С., Холявка М.Г., Сорокин А.В., Лавлинская М.С., Артюхов В.Г., Файзуллин Д.А., Зуев Ю.Ф. // Биоорганическая химия. -2023. - Т. 49, №1. - С.93-104]. Однако в данных работах не была доказана стабильность препаратов.

Для иммобилизации фицина также были рассмотрены микро- и наночастицы хитозана, полученными в присутствии аскорбиновой кислоты и без нее [Королева В. А., Холявка М. Г., Ольшанникова С.С, Артюхов В. Г. Разработка методики получения комплексов фицина с наночастицами хитозана с высоким уровнем протеолитической активности. Биофармацевтический журнал. 2018; 10(4): 36-40; Исследование протеолитической активности ассоциатов фицина с наночастицами хитозана / Ольшанникова С.С, Редько Ю.А., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Холявка М.Г., Юдин Н.Е., Артюхов В.Г. // Конденсированные среды и межфазные границы. - 2022. - Т. 24, №4. - С.523-528; Holyavka M.G., Goncharova S.S., Redko Y.A., Lavlinskaya M.S., Sorokin A.V., Artyukhov V.G. Novel biocatalysts based on enzymes in complexes with nano and micromaterials / Biophysical Reviews. - 2023. - https://doi.org/10.1007/sl2551-023-01146-6]. Однако недостатком предложенного способа является низкая стабильность наноразмерных носителей фермента: в течение менее чем 180 часов происходит их агрегация, в результате чего ухудшаются эксплуатационные свойства биокатализатора и срок его хранения и использования. В случае же использования макрофазы аскорбата хитозана подобных явлений не наблюдается.

В качестве прототипа был выбран способ получения гибридного препарата фицина и ацетата хитозана в виде густого раствора (Патент RU № 2792783 С1, СПК C12N 11/02 (2023.01); C12N 9/50 (2023.01); А61К 38/48 (2023.01), опубл. 24.03.2023, Бюл. №9), включающий иммобилизацию ферментного препарата фицина в буферном растворе с носителем, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 ч и промывку, в котором иммобилизацию фицина проводят путем комплексообразования в густой раствор ацетата хитозана с молекулярной массой 600 кДа в соотношении 10 мл раствора фицина в концентрации 2 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г сухого ацетата хитозана, предварительно растворенного в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 10,0; образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывают с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, с диаметром пор 25 кДа против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 из расчета, что для промывки 21 мл полученного препарата используют 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, диализ ведут в течение 8 ч, после чего буфер меняют на порцию свежего в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 ч до отсутствия в промывном растворе свободного фицина.

Ацетат хитозана представляет собой ионное соединение, образованное путем протонирования первичной аминогруппы хитозана катионом водорода уксусной кислоты. В условиях оптимума работы фермента (рН ~7,5), происходит частичная нейтрализация и разрушение соединения, сопровождающиеся накоплением ацетат-анионов, не обладающих физиологической активностью или восстановительными свойствами. В случае использования аскорбата хитозана, происходит высвобождение аскорбат-анионов, обладающих мощным восстановительным действием, что приводит к повышению каталитической активности и стабильности папаиноподобных протеаз [Гончарова С.С, Редько Ю. А., Лавлинская М. С, Сорокин А. В., Холявка М. Г., Кондратьев М. С, Артюхов В. Г. Биокатализаторы на основе ассоциатов папаина с наночастицами хитозана. Конденсированные среды и межфазные границы. 2023; 25(2): 173-181]. Аскорбиновая кислота широко используется в медицине, фармации и косметологии, поэтому использование аскорбата хитозана в качестве носителя фермента позволит достигнуть синергетического эффекта практически значимых свойств хитозана, фицина и аскорбиновой кислоты.

Таким образом, в отличие от прототипа, предлагаемый нами способ позволяет получить иммобилизованный фицин с повышенным содержанием фицина- 70 мг на 1 г полисахарида (против 4 мг/г ацетата хитозана), активностью - 175 ед/мл раствора (против 38 ед/мл при иммобилизации на ацетате хитозана) и высокой стабильностью (которая для комплекса фицина с ацетатом хитозана не была изучена). Препарат не требует защиты активного центра фицина от окисления какими-либо дополнительными агентами (например, путем добавления цистеина), т.к. в качестве восстановителя выступает высвобождающийся аскорбат-анион. Кроме того, заявленное изобретение предназначено для расширения числа полисахаридов, используемых для стабилизации препаратов фицина в медицинских целях.

Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке способа получения гибридного препарата иммобилизованного фицина и аскорбата хитозана в виде густого раствора с вязкостью в диапазоне 200-250 МПахс, обладающий большей стабильностью при 37°С, с повышенным содержанием фицина- 70 мг на 1 г полисахарида, активностью - 175 ед/мл раствора, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) фицин и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, не требующего дополнительной защиты активного центра фицина в ходе иммобилизации какими-либо дополнительными реагентами.

Технический результат достигается тем, что в способе получения гибридного препарата фицина и аскорбата хитозана в виде густого раствора, включающем иммобилизацию фицина путем комплексообразования в густом растворе носителя в 0,05 М глициновом буфере с рН 10,0; последующее инкубирование при комнатной температуре в течение 2 часов при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; промывку полученного препарата в виде густого раствора с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3.7 мл на 10 мм длины, с диаметром пор 25 кДа против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, где диализ ведут в течение 8 ч, после чего буфер меняют на порцию буфера и продолжают диализ еще в течение 16 ч до отсутствия в промывном растворе свободного фицина, согласно изобретению, иммобилизацию фицина проводят путем комплексообразования в густой раствор аскорбата хитозана в соотношении 10 мл раствора фицина в концентрации 13 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г аскорбата хитозана с молекулярной массой 350 кДа, предварительно растворенного в 10 мл буфера, при диализе для промывки 21 мл полученного препарата объем одной порции буфера равен 200 мл.

Фиг. 1. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в гибридных препаратах в виде густого раствора фицина и аскорбата хитозана с различными молекулярными массами.

Фиг. 2. Диаграмма значений общей активности (в ед на 1 мл раствора) гибридных препаратов в виде густого раствора фицина и аскорбата хитозана с различными молекулярными массами.

Фиг. 3. Диаграмма значений удельной активности (в ед на 1 мг белка в пробе) гибридных препаратов в виде густого раствора фицина и аскорбата хитозана с различными молекулярными массами.

Фиг. 4. Диаграмма значений остаточной каталитической активности фицина, свободного и иммобилизованного на аскорбатах хитозана после инкубации образцов при 37°С (в % от первоначального уровня, в легенде представлены наименования носителя и его молекулярная масса). Протеолитическую активность образцов, наблюдаемую без их предварительной инкубации и при оптимальных условиях гидролиза, принимали за 100%

Пример реализации способа.

В качестве объекта исследования был выбран фицин фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich». Для синтеза аскорбата хитозана был использован хитозан фирмы «Биопрогресс» со средними молекулярными массами 200, 350 и 600 кДа и степенью деацетилирования 0.85 и аскорбиновую кислоту квалификации «ч.д.а.» производства «Вектон».

Аскорбат хитозана получали по следующей методике: навеску хитозана с определенной молекулярной массой (200, 350 или 600 кДа) массой 1,00 г растворяли в 100 мл 5%-ного мае. раствора аскорбиновой кислоты при постоянном перемешивании со скоростью 400 об/мин, после чего полученный раствор выдерживали в течение суток при температуре 25°С и постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин. По истечении времени продукт реакции выделяли путем осаждения в 500 мл ацетона (ч.д.а.), после чего отделяли на воронке Бюхнера, снабженной бумажным фильтром, трижды промывали порциями по 150 мл изопропилового спирта и сушили в вакуумном сушильном шкафу при 55°С до постоянной массы.

Комплексообразование фицина осуществляли следующим образом. К 1 г аскорбата хитозана, предварительно растворенного в 10 мл 0,05 М глицинового буфера с рН 10,0, добавляли 10 мл раствора фермента в концентрации 13 мг/мл, полученного растворением в 0,05 М глициновом буфере с рН 10,0; инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин. После окончания времени инкубации образовавшийся препарат в виде густого раствора очищали от несвязанного фермента с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 200 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 в течение 8 часов, после чего буфер меняли на 200 мл буфера и продолжали диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного фицина. Для промывки 21 мл полученного препарата всего использовали 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5. По истечении этого времени осуществляли контроль наличия белка в промывных водах с помощью спектрофотометра СФ-2000 при λ = 280 нм.

При использовании аскорбата хитозана, полученного из хитозана со средней молекулярной массой 200 кДа, получали препарат в виде густого раствора с вязкостью 150-180 МПа×с, при использовании аскорбата хитозана, полученного из хитозана со средней молекулярной массой 350 кДа - получали препарат в виде густого раствора с вязкостью 200-250 МПа×с, а при применении аскорбата хитозана, полученного из хитозана со средней молекулярной массой 600 кДа, получали препарат в виде густого раствора с вязкостью 590-640 МПа×с.

Определение протеазной активности фицина проводили на субстрате азоказеине (Sigma, США) [Sabirova A.R., Rudanova N.L., Balaban N.P., Ilyinskaya O.N., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Rudenkaya G.N., Sharipova M.R. A novel secreted metzincin metalloproteinase from Bacillus intermedins / FEBS Lett. - 2010 - V. 584, №21 - P. 4419-1425]. К 50 мг образца добавляли 200 мкл 0.05 М трис-HCl буфера с рН 7.5, 800 мкл азоказеина (0.5% масс, в 0.05 М трис-HCl буфере, рН 7.5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5% масс), инкубировали 10 минут при 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 11700 g для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл раствора NaOH (3% масс.) для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 10 мм кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл буфера (комплексообразованный фермент в контрольную пробу вносили последним, остальные операции для нее делали аналогично опытным пробам).

Единицей протеазной активности служило количество фицина, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ азоказеина за 1 мин.

Протеазную активность рассчитывали по формуле:

A = D* 1000/120/200,

где А - протеазная активность препарата, мкМ/мин на 1 мг белка,

D - оптическая плотность раствора при 410 нм,

120 - время инкубации в минутах,

200 - объем пробы, мкл,

1000 - коэффициент для пересчета в мкМ.

Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.

Для получения гибридных препаратов фицина и аскорбата хитозана с разными молекулярными массами в качестве среды для комплексообразования мы использовали 0.05 М глициновый буфер с рН 10.0. Результаты отражены на фиг.1, 2, 3.

Анализ содержания белка в гибридных препаратах показал, что наибольшее количество фицина (в мг на г носителя) связывается с аскорбатом хитозана с молекулярной массой 600 кДа (фиг.1). Общая активность (в ед на мл раствора) и удельная активности фицина (в ед на мг белка) оказались выше при его комплексообразовании с аскорбатом хитозана с молекулярной массой 350кДа(фиг.2, 3).

Оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в ед на мл раствора) и удельной активности (ед на мг белка) выявлено при включении фицина в густой раствор аскорбата хитозана с молекулярной массой 350 кДа.

В ходе хранения при 37°С иммобилизованный фицин был более стабилен, чем его форма в растворе (фиг.4), вероятно, за счет присутствия в системе такого мощного восстановителя, как аскорбат-анион.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения гибридного препарата фицина и аскорбата хитозана в виде густого раствора, включающий иммобилизацию фицина путем комплексообразования в густом растворе аскорбата хитозана в 0,05М глициновом буфере с рН 10,0 в соотношении 10 мл раствора фицина в концентрации 13 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г аскорбата хитозана с молекулярной массой 350 кДа, предварительно растворенного в 10 мл буфера; последующее инкубирование при комнатной температуре в течение 2 ч с постоянным перемешиванием при 250 об/мин; промывку полученного препарата в виде густого раствора с помощью диализа в течение 8 ч против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, затем буфер меняют и продолжают диализ 16 ч до отсутствия в промывном растворе свободного фицина. Изобретение обеспечивает расширение арсенала стабилизированных препаратов фицина с повышенным содержанием фицина и с повышенной активностью для использования в пищевой и химико-фармацевтической промышленности. 4 ил., 1 пр.

Способ получения гибридного препарата фицина и аскорбата хитозана в виде густого раствора, включающий иммобилизацию фицина путем комплексообразования в густом растворе носителя в 0,05М глициновом буфере с рН 10,0; последующее инкубирование при комнатной температуре в течение 2 ч при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; промывку полученного препарата в виде густого раствора с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3.7 мл на 10 мм длины, с диаметром пор 25 кДа против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, где диализ ведут в течение 8 ч, после чего буфер меняют на порцию буфера и продолжают диализ еще в течение 16 ч до отсутствия в промывном растворе свободного фицина, отличающийся тем, что иммобилизацию фицина проводят путем комплексообразования в густой раствор аскорбата хитозана в соотношении 10 мл раствора фицина в концентрации 13 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г аскорбата хитозана с молекулярной массой 350 кДа, предварительно растворенного в 10 мл буфера, при диализе для промывки 21 мл полученного препарата объем одной порции буфера равен 200 мл.