Способ получения гибридного препарата папаина и аскорбата хитозана в виде густого раствора Российский патент 2024 года по МПК C12N11/02 C12N9/50 A61K38/46 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицине, косметологии и исследовательских целях.

Аскорбиновая кислота является антиоксидантом, который способен «поглощать» свободные радикалы. Она обеспечивает фотозащиту и повышает иммунитет, все эти свойства делает ее широко применимой в косметической и фармацевтической промышленности. Аскорбиновая кислота нестабильна и очень легко окисляется при воздействии света, кислорода воздуха и повышенных температур. Для повышения ее стабильности синтезируются различные производные полисахаридов с аскорбиновой кислотой [Hafsa J., Charfeddine В., Smach М.А., Limem К., Majdoub H., Sonia. R. Synthesis, characterization, antioxidant and antibacterial proprieties of chitosan ascorbate / International journal of pharmaceutical, chemical and biological sciences. - 2014. V. 4, №4. - P. 1072-1081]. Одним из таких полимеров является хитозан.

Аскорбат хитозана - органическая соль, образующаяся в результате взаимодействия аминополисахарида хитозана с аскорбиновой кислотой в водной среде [Аль-Зубейди А.Ф.А., Малинкина О.Н., Чемодурова А.А., Ксенофонтова О.Ю., Зудина И.В. Оценка антибактериальной активности L- и D-изоформ аскорбиновой кислоты и их солей с хитозаном / Современные проблемы науки и образования. - 2016. №5. - С. 298].

Аскорбат хитозана обладает независимым от рН профилем растворимости, что обеспечивает его высокую перспективность при обработке и изготовлении биоматериалов [Nurgaliev I.N. DFT Study of Chitosan Ascorbate Nanoparticles Structure / Article. - 2011. V. 107, №3. - P. 218-226].

Аскорбат хитозана обладает уникальными свойствами в качестве носителя для различных ферментов, применяемых в медицинской и фармацевтической промышленностях. Материалы на основе аскорбата хитозана хорошо совместимы с живыми тканями человека и животных, биорезорбируемы, проявляют противовоспалительную, антитоксическую и иммунотропную активности, а также способны стимулировать процессы ранозаживления и регенерации тканей, что делает их крайне востребованными при создании различных ранозаживляющих средств [Аль-Зубейди Адавия Фадхел Аббаас. Сравнительная оценка биологического действия L- и D-аскорбатов хитозана в отношении условно-патогенных микроорганизмов: автореф. дис. канд. биол. Наук - Казань, 2018. - 23 с.].

Папаин (КФ 3.4.22.2) - протеолитический фермент класса гидролаз, содержащиеся в папайе вида Carica papaya. Папаин - полипептид, состоящий из 212 аминокислотных остатков. Его молекулярная масса составляет 23 кДа. В активный центр фермента входит Cys и His [Holyavka М., Pankova S., Koroleva V. Vyshkvorkina Y., Lukin A., Kondratyev M, Artyukhov V. Influence of UV radiation on molecular structure and catalytic activity of free and immobilized bromelain, ficin and papain / Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. - 2019. V. 201. - P. 111681].

Папаин активен в широком диапазоне значений рН среды и температуры. Оптимальными условиями функционирования энзима является значение рН 6,0-7,0 и значения температур до 50-60°С. Изоэлектрическая точка фермента составляет 8,75 [Tacias-Pascacioa V.G., Morellon-Sterling R., Castaneda-Valbuena D., Berenguer-Murcia A., Kamli M.R., Tavano O., Fernandez-Lafuente R. Immobilization of papain: A review / International Journal of Biological Macromolecules. - 2021. V. 188. - P. 94-113].

Папаин обладает противовоспалительными, противогрибковыми и антимикробными свойствами. Не действуя напрямую на очаг воспаления, он стимулирует метаболические процессы, что оказывает влияние на ускорение процессов регенерации воспаленных тканей. Папаин увеличивает приток крови и разрушает токсичные вещества в очаге воспаления. Папаин ускоряет заживление ран, некротических язв и пролежней. Он повышает эффективность проникновения других лекарственных средств через кожные покровы без нарушения целостности здоровых тканей. Все эти свойства обуславливают возможность применения папаина медицине и фармацевтике [Ol'shannikova S. S., Red'ko Yu. A., Lavlinskaya М. S., Sorokin A. V., Holyavka M. G., Artyukhov V. G. Preparation of papain complexes with chitosan microparticles and evaluation of their stability using the enzyme activity level / Pharmaceutical Chemistry Journal. -2022. Vol.55, №11.-P. 1240-1244].

Существует способ получения гетерогенного препарата на основе папаина, обладающего регенерационными свойствами [Патент RU 2677873 С2, МПК А61К 38/48, А61К 47/30, А61Р 17/02, опубл. 22.01.2019, Бюл. №3], включающий обработку матрицы ионообменных волокон ВИОН АН-1 или ВИОН КН-1 раствором папаина, инкубирование, отличающийся тем, что для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0,2 М ацетатный буфер (рН 4,5-5,5) или 0,05 М боратный буфер с добавлением KCl (рН 9,0-9,5), а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0,05 М трис-глициновый (рН 9,0) или 0,05 М глициновый (рН 10,0) буфер в расчете 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г волокон, инкубирование проводится в течение 24 ч при комнатной температуре, образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.

Известен способ получения гетерогенного биокатализатора на основе папаина, иммобилизованного на ионообменных смолах [Патент RU 2768742 С1, МПК C12N 11/04, C12N 11/10, опубл. 24.03.2022, Бюл. №9], включающий адсорбционную иммобилизацию папаина в буферном растворе на матрицу ионообменной смолы в соотношении 20 мл раствора папаина в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя, инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку образовавшегося осадка буфером до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу воздушно-сухой ионообменной смолы АВ-16-ГС, а в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М фосфатный буфер, рН 11,0, инкубацию осуществляют в течение 2 часов, промывку образовавшегося осадка проводят 0,05 М трис-HCl буфером, рН7,5.

В обоих способах иммобилизация папаина проводится путем адсорбции на нерастворимых носителях в соотношении 20 мл раствора папаина в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя при периодическом перемешивании, при этом получается нерастворимая форма фермента, которая, безусловно, имеет свои преимущества, но не дает возможность проводить реакции на твердых субстратах.

Известен способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе папаина, гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами [Патент RU 2750378 С1, МПК А61К 8/66, А61К 31/702, А61К 31/728, А61К 31/717, А61К 31/722, А61Р 31/00, А61Р 17/00, C12N 11/04 опубл. 28.06.2021, Бюл. №19], включающий растворение папаина в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (300 кДа) или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты (500 кДа) или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (800 кДа) в соотношении 10 мг папаина на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (300 кДа) или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты (500 кДа) или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (800 кДа) в концентрации 1,5%, при этом осуществляют перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем ведут иммобилизацию папаина путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) при молекулярной массе полисахарида 50-100 кДа в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля.

Недостатком способа является высокая стоимость гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами. Кроме того, модификация полисахаридов виниловыми мономерами - трудозатратный процесс, требующий привлечения высоко квалифицированных кадров. Использование аскорбата хитозана методически существенно упрощает и соответственно удешевляет процесс получения гибридного препарата папаина.

Существует способ иммобилизации папаина в губчатый полиэлектролитный комплекс карбоксиметилхитозан/альгинат натрия [CN 107254460 A]. Недостатком изобретения является использование глутарового альдегида (химическая иммобилизация с использованием сшивающего агента), что ограничивает применение препарата в фармацевтической промышленности и медицине из-за его токсичности. Авторы не отделяли от полученного продукта несвязанный с носителем белок, т.е. получали смесь иммобилизованной и свободной формы папаина, что может отразиться на эксплуатационных свойствах препарата. Кроме того, для достижения губчатой структуры материала авторы предлагают использовать лиофильную сушку, что существенно удорожает производство данного ферментного препарата.

Известен способ стабилизации протеаз для использования в косметологических целях [US 2011/0177052А1]. Авторы стабилизировали 1%-ный раствор папаина 0,1%-ным раствором альгината натрия. Особенностью изобретения является получение препарата протеазы и жидкой фазе. Кроме того, авторы не отделяли от полученного продукта несвязанный с полисахаридом белок, т.е. получали смесь стабилизированной и нестабилизированной формы папаина, что может отразиться на эксплуатационных свойствах препарата.

Предложены способ получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора [Патент RU 2788455 CI, C12N 11/02 (2022.08); C12N 11/04 (2022.08); C12N 11/10 (2022.08), опубл. 19.01.2023, Бюл. №2] и способ получения гибридного препарата папаина и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора [Патент RU 2795425 С1, C12N 11/04 (2022.08); C12N 11/12 (2022.08); А61Р 17/02 (2022.08); A61L 15/38 (2022.08), опубл. 03.05.2023, Бюл. №13]. В обоих способах предусмотрена защита активного центра папаина от окисления путем добавления цистеина в концентрации 0,04 М.

iV-сукциноилхитозан, N-малеоилхитозан [Ацильномодифицированные водорастворимые производные хитозана - носители для адсорбционной иммобилизации папаина / Сорокин А.В., Ольшанникова С.С., Малыхина Н.В., Сакибаев Ф.А., Холявка М.Г., Лавлинская М.С., Артюхов В.Г. // Биоорганическая химия. - 2022. - Т. 48, №3. - С.340-351], карбоксиметилхитозан, N-(2-гидрокси)пропил-3-триметиламмоний хитозан [Разработка биокатализатора на основе папаина, стабилизированного в комплексах с хитозаном и его производными: карбоксиметилхитозаном и N-(2-гидрокси)пропил-3-триметиламмоний хитозаном / Ольшанникова С.С., Малыхина Н.В., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. // Биотехнология. - 2022. - Т. 38. - № 1. - С. 39-46], ацетат хитозана [Разработка биокатализатора на основе папаина, иммобилизованного на ацетате хитозана / Гончарова С.С., Редько Ю.А., Лавлинская М.С., Сорокин A. В., Кондратьев М.С., Юдин Н.Е., Путинцева О.В., Наквасина М.А., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. // Вестник ВГУ. Серия «Химия. Биология. Фармация». -2023. - № 1. - С. 82-88] рассматривались как матрицы для иммобилизации папаина. Однако в данных работах, не была доказана стабильность препаратов.

В случае использования аскорбата хитозана, происходит высвобождение аскорбат-анионов, обладающих мощным восстановительным действием, что приводит к повышению каталитической активности и стабильности папаиноподобных протеаз [Гончарова С.С., Редько Ю. А., Лавлинская М. С., Сорокин А. В., Холявка М. Г., Кондратьев М. С., Артюхов B. Г. Биокатализаторы на основе ассоциатов папаина с наночастицами хитозана. Конденсированные среды и межфазные границы. 2023; 25(2): 173-181]. Аскорбиновая кислота широко используется в медицине, фармации и косметологии, поэтому использование аскорбата хитозана в качестве носителя фермента позволит достигнуть синергетического эффекта практически значимых свойств хитозана, папаина и аскорбиновой кислоты.

Для иммобилизации папаина ранее уже были рассмотрены микро- и наночастицы хитозана, полученные в присутствии аскорбиновой кислоты и без нее [Ольшанникова С.С., Редько Ю.А., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Получение и оценка стабильности по уровню ферментативной активности комплексов папаина с микрочастицами хитозана. Химико-фармацевтический журнал. 2021;55(11): 51-55; Holyavka M.G., Goncharova S.S., Redko Y.A., Lavlinskaya M.S., Sorokin A.V., Artyukhov V.G. Novel biocatalysts based on enzymes in complexes with nano and micromaterials / Biophysical Reviews. - 2023. - https://doi.org/10.1007/s12551-023-01146-61. Однако недостатком предложенного способа является низкая стабильность нано- и микроразмерных носителей фермента: в течение менее чем 180 часов происходит их агрегация, в результате чего ухудшаются эксплуатационные свойства биокатализатора и срок его хранения и использования. В случае же использования макрофазы аскорбата хитозана подобных явлений не наблюдается.

В качестве прототипа служил способ получения гетерогенного препарата папаина в геле на основе пищевого хитозана или сукцината хитозана [Патент RU 2712690 С1, МПК C12N 11/04, C12N 11/10, опубл. 30.01.2020, Бюл. №4], включающий иммобилизацию папаина в буферном растворе на матрицу хитозана в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 1 мг/мл на 1 г носителя; инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; промывку образовавшегося осадка 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу пищевого хитозана с молекулярной массой менее 100 кДа или сукцината хитозана; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 10,0 или 0,05 М ацетатный буфер с рН 5,8; инкубация проводится в течение 2 часов.

В отличие от прототипа наш способ позволяет получить иммобилизованный папаин в другой форме, т.е. не в виде геля, а в форме густого раствора на основе аскорбата хитозана, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) папаин и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы. Препарат не требует защиты активного центра папаина от окисления какими-либо дополнительными агентами (например, путем добавления цистеина), т.к. в качестве восстановителя выступает сам аскорбат. Кроме того, заявляемое изобретение предназначено для расширения числа полисахаридов, используемых для стабилизации препаратов папаина.

Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке способа получения гибридного препарата иммобилизованного папаина и аскорбата хитозана в виде густого раствора с вязкостью в диапазоне 200-250 МПа⋅с, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) папаин, обладающего большей стабильностью при 37°С, и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, не требующего дополнительной защиты активного центра папаина в ходе иммобилизации какими-либо дополнительными реагентами.

Технический результат достигается тем, что в способе получения гибридного препарата папаина и аскорбата хитозана в виде густого раствора, включающем иммобилизацию ферментного препарата папаина в буферном растворе с носителем, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 часов и промывку 50 мМ трис-HCl буфером с рН 7,5, согласно изобретению, иммобилизацию папаина проводят путем комплексообразования в густой раствор аскорбата хитозана в соотношении 10 мл раствора папаина в концентрации 20 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г аскорбата хитозана с молекулярной массой 350 кДа, предварительно растворенного в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 9,0, образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывают с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины с диаметром пор 25 кДа против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, из расчета, что для промывки 21 мл полученного препарата используют 200 мл трис-HCl буфера, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 200 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного папаина.

Фиг. 1. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в гибридных препаратах в виде густого раствора папаина и аскорбата хитозана.

Фиг. 2. Диаграмма значений общей активности (в ед. на 1 мл раствора) гибридных препаратов в виде густого раствора папаина и аскорбата хитозана.

Фиг. 3. Диаграмма значений удельной активности (в ед. на 1 мг белка в пробе) гибридных препаратов в виде густого раствора папаина и аскорбата хитозана.

Фиг. 4. Диаграмма значений остаточной каталитической активности папаина, свободного и иммобилизованного на аскорбатах хитозана после инкубации образцов при 37°С (в % от первоначального уровня, в легенде представлены наименования носителя и его молекулярная масса). Протеолитическую активность образцов, наблюдаемую без их предварительной инкубации и при оптимальных условиях гидролиза, принимали за 100%.

Пример реализации способа

В качестве объекта исследования был выбран папаин фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich».

Для синтеза аскорбата хитозана были использованы хитозаны фирмы «Биопрогресс» со средними молекулярными массами 200, 350 и 600 кДа и степенью деацетилирования 0,85 и аскорбиновую кислоту квалификации «ч.д.а.» производства «Вектон».

Аскорбат хитозана получали по следующей методике: навеску хитозана с определенной молекулярной массой (200, 350 или 600 кДа) массой 1,00 г растворяли в 100 мл 5%-ного мае. раствора аскорбиновой кислоты при постоянном перемешивании со скоростью 200 об/мин, после чего полученный раствор выдерживали в течение суток при температуре 25°С и постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин. По истечении времени продукт реакции выделяли путем осаждения в 500 мл ацетона (ч.д.а.), после чего отделяли на воронке Бюхнера, снабженной бумажным фильтром, трижды промывали порциями по 150 мл изопропилового спирта и сушили в вакуумном сушильном шкафу при 55°С до постоянной массы.

Комплексообразование папаина и аскорбата хитозана осуществляли следующим образом. К 1 г аскорбата хитозана, предварительно растворенного в 10 мл буфера, добавляли 10 мл раствора фермента в концентрации 20 мг/мл; инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; в качестве буферного раствора для иммобилизации использовали 0,05 М глициновый буфер с рН 9,0; образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывали с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 200 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 в течение 8 часов, после чего буфер меняли на 200 мл буфера и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного папаина. Для промывки 21 мл полученного препарата всего использовали 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5. По истечении этого времени осуществляли контроль наличия белка в промывных водах с помощью спектрофотометра СФ-2000 при λ = 280 нм.

Содержание белка в гибридных препаратах папаина определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent / J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275].

При использовании аскорбата хитозана, полученного из хитозана со средней молекулярной массой 200 кДа, получали препарат в виде густого раствора с вязкостью 150-180 МПа⋅с, при использовании аскорбата хитозана, полученного из хитозана со средней молекулярной массой 350 кДа - получали препарат в виде густого раствора с вязкостью 200-250 МПа⋅с, а при применении аскорбата хитозана, полученного из хитозана со средней молекулярной массой 600 кДа, получали препарат в виде густого раствора с вязкостью 590-640 МПа⋅с.

Определение протеазной активности папаина проводили на субстрате азоказеине (Sigma, США) [Sabirova A.R., Rudakova N.L., Balaban N.P., Ilyinskaya O.N., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Rudenskaya G.N., Sharipova M.R. A novel secreted metzincin metalloproteinase from Bacillus itermeius / FEBS Lett. -2010 - V. 584, №21 - P. 4419-4425]. К 50 мг образца добавляли 200 мкл 0,05 М трис-HCl буфера с рН 7,5, 800 мкл азоказеина (0,5% масс. 0,05 М трис-HCl буфере, рН 7,5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5% масс.), инкубировали 10 минут при 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 11700 g для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл раствора NaOH (3% масс.) для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 10 мм кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл буфера (комплексообразованный фермент в контрольную пробу вносили последним, остальные операции для нее делали аналогично опытным пробам).

Единицей протеазной активности служило количество папаина, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ азоказеина за 1 мин.

Удельную протеазную активность рассчитывали по формуле:

A = D*1000/120/200/C,

где А - протеазная активность препарата, мкМ/мин на 1 мг белка,

D - оптическая плотность раствора при 410 нм,

С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,

120 - время инкубации в минутах,

200 - объем пробы, мкл,

1000 - коэффициент для пересчета в мкМ.

Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.

Для получения гибридных препаратов папаина и аскорбата хитозана с разными молекулярными массами в качестве среды для комплексообразования мы использовали 0,05 М глициновый буфер с рН 9,0. Результаты отражены на фиг. 1, 2, 3.

Анализ содержания белка в гибридных препаратах показал, что наибольшее количество папаина (в мг на г носителя) связывается с аскорбатом хитозана с молекулярной массой 350 кДа (фиг. 1). Общая (в ед. на мл раствора) и удельная (в ед. на мг белка) активности папаина также оказались выше при его комплексообразовании с аскорбатом хитозана с молекулярной массой 350 кДа (фиг. 2, 3). Таким образом, оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в ед. на мл раствора) и удельной активности (ед. на мг белка) выявлено при включении папаина в густой раствор аскорбата хитозана с молекулярной массой 350 кДа.

В ходе хранения при 37°С иммобилизованный папаин был более стабилен, чем его форма в растворе, вероятно, за счет присутствия в системе такого мощного восстановителя, как аскорбат-анион (фиг. 4).

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения гибридного препарата папаина и аскорбата хитозана в виде густого раствора, включающий иммобилизацию папаина в густом растворе аскорбата хитозана, в 0,05 М глициновом буферном растворе с рН 9,0 в соотношении 10 мл раствора папаина в концентрации 20 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г аскорбата хитозана с молекулярной массой 350 кДа, предварительно растворенного в 10 мл буфера, с последующим инкубированием при комнатной температуре в течение 2 ч при постоянном перемешивании при 250 об/мин; промывку полученного препарата в виде густого раствора с помощью диализа в течение 8 ч против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, затем буфер меняют и продолжают диализ 16 ч до отсутствия в промывном растворе свободного папаина. Изобретение обеспечивает расширение арсенала стабилизированных препаратов папаина для использования в химико-фармацевтической промышленности и медицине. 4 ил., 1 пр.

Способ получения гибридного препарата папаина и аскорбата хитозана в виде густого раствора, включающий иммобилизацию ферментного препарата папаина в 0,05 М глициновом буферном растворе с носителем, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 ч и промывку, отличающийся тем, что иммобилизацию папаина проводят путем комплексообразования в густом растворе аскорбата хитозана в соотношении 10 мл раствора папаина в концентрации 20 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г аскорбата хитозана с молекулярной массой 350 кДа, предварительно растворенного в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 9,0; образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывают с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины с диаметром пор 25 кДа против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 из расчета, что для промывки 21 мл полученного препарата используют 200 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, диализ ведут в течение 8 ч, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 200 мл и продолжают диализ еще в течение 16 ч до отсутствия в промывном растворе свободного папаина.