СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ВАКЦИНЫ ИЗ ЦЕЛЬНЫХ ВИРУСОВ ИЛИ БАКТЕРИЙ Российский патент 2024 года по МПК C12N13/00 C12N7/04 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам инактивации вирусов и бактерий и получения на их основе препаратов вакцин. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения вакцины из цельных вирусов или бактерий путем обработки вирусов или бактерий человека или животных высокоэнергетическими электронами.

Уровень техники

Традиционно вирусы и бактерии инактивируют посредством их обработки различными химическими реагентами.

Так, например, известен способ получения вакцин из цельных вирусов или бактерий путем химической инактивации вирусов и бактерий, например, посредством обработки формалином, β-пропиолактоном, этиленимином или детергентами (например, полисорбатом-80, тритоном Х-100, β-октилглюзидом) или другими химическими веществами. Однако при химической обработке может происходить модификация белков, изменение или разрушение белковой оболочки вирусов и липидной оболочки бактерий и, как следствие, разрушение целостности вирусов и бактерий, что приводит к снижению антигенности полученных таким способом вакцин и ограничивает область применения такого способа.

Известен способ инактивации вирусов γ-излучением. При этом источником излучения является радиоактивный изотоп, например, ⁶⁰Со. Недостатком этого способа является необходимость работы с постоянными радиоактивными источниками, тогда как использование β-излучения от ускорителя электронов или рентгеновского излучения (X-Ray) является более безопасным.

Одним из наиболее перспективных способов инактивации вирусов и бактерий является инактивация значительными дозами β-излучения от ускорителя электронов или рентгеновского излучения (X-Ray). Указанный способ является высокоэффективным, простым и применимым в крупномасштабном производстве.

Наиболее близким аналогом технического решения согласно настоящему изобретению является способ инактивации вирусов и получения вакцины, раскрытый в европейском патенте EP 3024487 В1 (Fraunhofer Ges Forschung [DE], 06.11.2019). В указанном документе раскрыт способ инактивации вирусов и производства вакцины, отличающийся тем, что иммуногенную композицию, содержащую по меньшей мере один вирус, облучают пучками электронов, при этом доза облучения находится в диапазоне от 15 до 110 кГр, время облучения находится в диапазоне от 1 до 100 секунд, энергия пучков электронов находится в диапазоне от 150 кэВ до 700 кэВ, а иммуногенная композиция или вакцина, содержащая по меньшей мере один вирус является жидкостью, в частности, представляет собой суспензию. В указанном способе к иммуногенной композиции необязательно добавляют один или несколько адъювантов, необязательно один или несколько фармацевтически приемлемых носителей и/или вспомогательных веществ, и необязательно один или несколько дополнительных иммуногенов, а после указанных стадий вакцину необязательно сушат, лиофилизируют или замораживают. Особенностями указанного способа является необходимость облучения иммуногенной композиции в тонком слое препарата толщиной от 1 до 3 мм, как это следует из другого патента этого же заявителя (см. EP 2135624 В1, Fraunhofer Ges Forschung [DE], 08.08.2012), или необходимость облучения иммуногенной композиции в течение сравнительно продолжительного времени для достижения полной инактивации вирусов, что и определяет основной недостаток указанного решения, как низкая эффективность предложенного способа.

Описание настоящего изобретения

Целью настоящего изобретения является создание простого, высокопродуктивного и технологичного способа получения препарата высокоэффективной вакцины из цельных вирусов или бактерий.

Указанная цель была достигнута путём разработки нового способа получения препарата вакцины из цельных вирусов или бактерий путем обработки вирусов или бактерий высокоэнергетическими электронами, энергия которых находится в диапазоне от 5 до 10 МэВ, а доза облучения вирусов или бактерий находится в диапазоне от 5 до 50 кГрей.

В предлагаемом способе инактивация вируса или бактерий происходит вследствие получения невосстанавливаемых повреждений нуклеиновых кислот вируса с полным сохранением белковой структуры оболочки вируса и липидной оболочки бактерий, что и позволяет эффективно получать вакцину из цельных вирусов или бактерий с высокой антигенностью вирусных или бактериальных частиц из препарата жидкости, содержащей вирусы или бактерии, когда толщина облучаемого слоя такой жидкости составляет от 1 до 5 см, что позволяет промышленно применять предложенный способ.

Дополнительным преимуществом предлагаемого способа является возможность инактивации вирусов и бактерий непосредственно в таре, в которой в последующем будет храниться препарат вакцины из цельных вирусов или бактерий, что позволяет одновременно с инактивацией вирусов и бактерий проводить стерилизацию тары, в которой будет храниться препарат вакцины из цельных вирусов или бактерий. Таким образом, осуществляется борьба с возможной промышленной контаминацией препаратов, поскольку используемое β-излучение обладает стерилизующим действием. Также не требуется последующая обработка облучённой жидкости, содержащей вирусы или бактерии, такая как, например, очистка от остаточных химических компонентов, используемых при химической инактивации, что существенно упрощает технологический процесс получения вакцины.

Дополнительным преимуществом способа является возможность хранения вакцины при обычной температуре функционирования вируса, т.е. может отсутствовать необходимость заморозки препаратов или транспортировки и хранения при пониженных температурах.

Так, настоящее изобретение представляет собой способ получения препарата вакцины из цельных вирусов или бактерий путем обработки вирусов или бактерий высокоэнергетическими электронами, энергия которых находится в диапазоне от 5 до 10 МэВ, включающий следующие стадии:

- получение жидкости, содержащей вирусы или бактерии, с инфекционной активностью не менее 3,0 lg ТЦИД50/мл;

- облучение полученной жидкости, содержащей вирусы или бактерии, пучком высокоэнергетических электронов, при этом доза облучения находится в диапазоне от 5 до 50 кГрей;

- необязательное добавление к препарату вируса или бактерии одного или нескольких адъювантов;

- необязательное добавление к препарату вируса или бактерии одного или нескольких фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.

Жидкость, содержащую вирусы или бактерии, которую подвергают облучению, получают путём наращивания биомассы вирусов или бактерий до инфекционной активности не менее 3,0 lg ТЦИД50/мл и последующей очистки от остаточных компонентов питательной среды. По сути, облучаемая жидкость, содержащая вирусы или бактерии, содержит только необходимое количество инактивированных, но полностью цельных и высокоэффективных в плане иммуногенности вирусных или бактериальных частиц свободных от каких-либо остаточных компонентов питательной среды, и, при необходимости, один или несколько адъювантов и/или одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ. Это позволяет получать, например, готовый стерильный фасованный препарат вакцины сразу после облучения такой жидкости, содержащей вирусы или бактерии, без необходимости проведения каких-либо дополнительных стадий, таких, например, как очистка от инактивирующего агента и стерилизация препарата, и без необходимости обязательного добавления консервантов.

Инфекционную активность вируссодержащей или бактериальной жидкости определяют, например, по методу Кербера (Kerber G. Arch. Exper. Path. Farmak., 1931. — Vol. 162. — P. 480).

В предпочтительном варианте способа, согласно настоящему изобретению, энергия электронов, которыми облучают жидкость, содержащую вирусы или бактерии, составляет предпочтительно 10 МэВ.

В другом предпочтительном варианте способа, согласно настоящему изобретению, доза облучения жидкости, содержащей вирусы или бактерии, предпочтительно находится в диапазоне от 15 до 40 кГрей.

Также в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение представляет собой способ, в котором источником высокоэнергетических электронов является линейный ускоритель электронов.

В качестве источника высокоэнергетических электронов могут использоваться, например, линейные ускорители электронов, такие как УЭЛР-10-15-С-60-1 (НПП Торий), линейные резонансные ускорители типа ИЛУ (ИЯФ СО РАН), ускорители типа Linacs (Mevex) и другие.

Также в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение представляет собой способ, в котором время облучения составляет от 0,1 до 20 сек.

В предпочтительном варианте способа, согласно настоящему изобретению, облучение жидкости, содержащей вирусы или бактерии, проводят непосредственно в таре для хранения и транспортировки препарата вакцины, при этом тара для хранения вакцины выбрана из пробирки Эппендорф, виалы, флакона, ампулы.

Также в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение представляет собой способ, в котором облучаемая вируссодержащая или бактериальная жидкость охлаждена до температуры в диапазоне от -70 °С до 0 °С.

Также в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вирусы выбраны из вирусов человека и животных.

В предпочтительном варианте способа, согласно настоящему изобретению, вирусы и бактерии выбраны из вирусов и бактерий, за исключением спорулирующих форм, используемых для получения вакцин и диагностикумов для медицины и сельского хозяйства.

Под термином «адъювант» в настоящем описании понимается соединение или группа соединений, используемые для неспецифического усиления иммунного ответа при их введении одновременно с иммуногеном. В отличие от иммуномодуляторов, адъюванты применяются для усиления конкретного иммунного ответа (например, при вакцинации) чаще всего в здоровом организме, а не для нормализации нарушенных функций иммунной системы при патологии. Принцип действия адъювантов заключается в депонировании антигена, активации воспаления, изменении физико-химических свойств антигена, усилении синтеза белков, активации системы комплемента, изменении процессинга и презентации / транспорта антигена, активации всех стадий иммуногенеза, синтеза и секреции цитокинов и т.д.

Адъювантами могут быть неорганические (фосфаты алюминия и кальция, хлористый кальций и др.) и органические (агар, глицерин, протамины и др.) вещества. В список адъювантов, наиболее широко применяющихся в настоящее время, входят такие адъюванты, как:

- неполный адъювант Фрейнда, представляющий собой водно-жировую эмульсию, содержащую вазелиновое масло, ланолин и эмульгатор. Указанный адъювант депонирует антиген и усиливает его захват фагоцитами;

- полный адъювант Фрейнда, включающий в себя, кроме вышеперечисленных компонентов, БЦЖ или мурамилдипептид. Это позволяет ему дополнительно активировать макрофаги и одновременно стимулировать Т-клетки;

- алюминиевые квасцы или гидроксид алюминия, которые благодаря высокой способности к сорбции выполняют функцию антигенного депо, а также неспецифически усиливает фагоцитоз;

- Bordetella pertussis с квасцами, изготовленный из ослабленного штамма B. pertussis, сорбированного на гидроксиде алюминия. Действие гидроксида алюминия дополняется активацией макрофагов и одновременной стимуляцией Т-клеток.

- иммуностимуляторный комплекс (ISCOM), представляющий собой липидные мицеллы, окружающие белковые или вирусные частицы. Частицы антигена доставляются непосредственно в цитозоль Т-клеток, в результате чего происходит индукция Т-киллеров,

но список адъювантов, используемых в рамках настоящего изобретения, не ограничивается ими.

К вспомогательным веществам, используемым в вакцинах, относятся адсорбенты, консерванты, эмульгаторы, индикаторы рН, стабилизаторы, но не ограничиваются ими.

В качестве адсорбентов используют, например, транспортные белки, которые входят в состав, например, дифтерийного и столбнячного анатоксинов.

Консерванты используют для подавления размножения возможных сопутствующих микроорганизмов. Для этой цели используют тиомерсал (мертиолят), формальдегид, феноксиэтанол, фенол и антибиотики (неомицин, гентамицин, полимиксин), но не ограничиваются ими. Содержание таких консервантов в вакцинах, как правило, крайне низкое, и в таких концентрациях они не представляют какой-либо опасности для субъекта вакцинации.

Небольшие количества эмульгаторов добавляют для улучшения растворения сухих, лиофилизированных вакцин или в случае использования эмульсионных вакцин. Примерами эмульгаторов, которые можно использовать в получении эмульсионных вакцин согласно настоящему изобретению, являются фосфолипиды, сложные эфиры сорбитана, сложные эфиры полиэтоксилированного сорбитана и производные маннита, которые являются обычными эмульгаторами для вакцины. Фосфолипидные эмульгаторы включают лецитин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозит, фосфатидилсерин и лецитин (например, такой как AMPHIGEN^®). Эмульгаторы, представляющие собой сложные эфиры сорбитана, включают монолаурат сорбитана (например, Span^® 20 и Arlacel^® 20), моноолеат сорбитана (например, Span^® 80 и Arlacel^® 80), монопальмитат сорбитана (например, Span^® 40 и Arlacel^® 40) и моностеарат сорбитана (например, Span^® 60 и Arlacel^® 60). Сложные эфиры полиэтоксилированного сорбитана включают монолаурат полиэтоксисорбитана (например, Tween^® 20 и Tween^® 21), моноолеат полиэтоксисорбитана (например, Tween^® 80), монопальмитат полиэтоксисорбитана (например, Tween^® 40) и моностеарат полиэтоксисорбитана (например, Tween^® 60). Эмульгаторы, представляющие собой производное маннита, включают октадекановые эфиры маннита. Span^®, Arlacel^® и Tween^® представляют собой товарные знаки ICI Americas. AMPHIGEN^® представляет собой товарный знак Pfizer, Inc. Обычно эмульсионные вакцины готовят в виде нормальных эмульсий масла в воде, хотя возможно получение обратных эмульсий воды в масле.

В качестве индикатора рН часто используют метиловый красный или аналогичные ему соединения, известные специалисту в данной области техники. Изменение цвета препарата свидетельствует о «сдвиге» показателя кислотности и это является фактором, позволяющим забраковать конкретную дозу вакцины.

Далее приведены примеры вариантов осуществления способа согласно настоящему изобретению. Указанные примеры приведены для целей разъяснения сути настоящего изобретения.

Приведённые в настоящем документе экспериментальные примеры инактивации вирусов и бактерий приведены исключительно в иллюстративных целях и никоим образом не ограничивают рамки настоящего изобретения, определяемые приведённой ниже формулой изобретения.

Специалисту в данной области техники понятно, что технический результат при использовании способа согласно настоящему изобретению, заключающийся в полной инактивации вирусов и бактерий при полном сохранении белковой структуры вируса и липидной оболочки бактерий, что позволяет получать высокоэффективный препарат вакцины из цельных вирусов или бактерий без необходимости дальнейших манипуляций с препаратом вакцины, например, очистки, стерилизации и т.п., будет достигаться вне зависимости от вида, рода, семейства вируса или бактерии. Соответственно, специалисту в данной области техники понятно, что применение способа инактивации вирусов и бактерий и получения вакцины из цельных вирусов или бактерий согласно настоящему изобретению возможно для любых видов вирусов и бактерий, за исключением спорулирующих форм.

Примеры

Пример 1. Получение и исследование вакцины против вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ КРС)

Инактивация вируса ИРТ КРС ионизирующим излучением.

В опыте использовали вирус ИРТ КРС с инфекционной активностью 7,5 lg ТЦД50/мл, общий пул поделили на 5 флаконов (культуральные флаконы Corning с невентилируемой крышкой) для последующей инактивации:

- 3 флакона - ионизирующим излучением (доза 5, 10, 15 кГр);

- 1 флакон - формалином, по стандартной методике (3 мл/л, 3 сут при 37°С);

- 1 флакон - не инактивировали (контроль).

Облучение высокоэнергетическими электронами проводили с помощью линейного ускорителя электронов УЭЛР-10-15-С-60-1 (НПП Торий) энергией 10 МэВ.

Оценка стерильности.

Контроль стерильности проводили согласно стандартной методике методом прямого посева. По результатам прямого посева все пробы были стерильными.

Внешний вид и определение рН.

Пробы, обработанные ионизирующим излучением, изменили цвет, стали почти прозрачными, с желтым или желтовато-коричневым оттенком, с незначительным белым осадком на дне. Уровень рН данных проб и не инактивированного вируса составил 7,7.

Постановка ПЦР.

Все пробы исследовали методом ПЦР, для обнаружения ДНК вируса ИРТ КРС стандартным коммерческим набором «РИНОКОР» (АмплиСенс^®; ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) в соответствии с методикой производителя.

Проба 5 МэВ 10 МэВ Результат (+/-) Результат (+/-) ИРТ 5 кГр + + ИРТ 10 кГр + + ИРТ 15 кГр + + ИРТ формалин - - ИРТ не инактивированный + + ДМЕМ - -

Результаты ПЦР подтверждают сохранение целостности ДНК вируса ИРТ КРС по сравнению с обработкой формалином.

Оценка эффективности инактивации.

Оценку эффективности инактивации осуществляли путем проведения кратных последовательных пассажей в культуре клеток MDBK. Предварительно проводили диализ пробы, инактивированной формалином.

Проба Наличие (+) / отсутствие (-) ЦПД вируса ИРТ КРС в пассаже № 1 2 3 4 5 ИРТ 5 кГр (5 МэВ) + + + + н/и ИРТ 5 кГр (10 МэВ) + + н/и* н/и н/и ИРТ 10 кГр (5 МэВ) - - - - - ИРТ 10 кГр (10 МэВ) - - - ?** - ИРТ 15 кГр (5 МэВ) - - - - - ИРТ 15 кГр (10 МэВ) - - - - - ИРТ формалин - - - - -

* н/и - не исследовали;

** - результат сомнительный.

Результаты оценки продемонстрировали отсутствие цитопатического действия (ЦПД) вируса ИРТ КРС в течение 5 пассажей после облучения дозой выше 10 кГр.

Оценка антигенной активности.

Изготавливали 5 образцов моновакцины ИРТ КРС. В состав вакцин входили: антиген - 80%, ГОА – 20 %, сапонин – 5 мл/л, мертиолят – 1 мл/л. Каждым экспериментальным образцом провели двукратную вакцинацию морских свинок (n=5, на каждый образец), подкожно в дозе 1,0 мл. Вторую вакцинацию проводили через 18 суток после первой вакцинации. Постановку реакции нейтрализации проводили через 4 недели после второй вакцинации.

Результаты оценки антигенной активности

Проба в вакцине Титр антител к вирусу ИРТ*, ОЕ/мл до вакцинации после I вакцинации после II вакцинации ИРТ 5 кГр (5 МэВ) 0 16 64 ИРТ 5 кГр (10 МэВ) 0 15 64 ИРТ 10 кГр (5 МэВ) 0 10 64 ИРТ 10 кГр (10 МэВ) 0 11 64 ИРТ 15 кГр (5 МэВ) 0 10 64 ИРТ 15 кГр (10 МэВ) 0 9 64 ИРТ формалин 0 10 32 ИРТ неинактивированный 0 14 64

* - среднее геометрическое значение по группе, выраженное в обратных величинах.

Заключение:

1. Дозы облучения 10 и 15 кГр являются достаточными для инактивации вируса ИРТ КРС.

2. Радиационный способ инактивации вируса является более щадящим по сравнению с использованием формалина и обеспечивает более высокую антигенную активность инактивированного вируса ИРТ КРС.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, специалисту в данной области техники понятно, что могут быть сделаны различные замены и использованы различные эквиваленты, которые не выходят за рамки настоящего изобретения. Все документы, процитированные в настоящем описании, являются частью настоящей заявки, и целиком включены в настоящее описание посредством ссылки.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения препарата вакцины из цельных вирусов или бактерий путем обработки вирусов или бактерий высокоэнергетическими электронами, энергия которых находится в диапазоне от 5 до 10 МэВ. Способ включает стадии получения жидкости, содержащей вирусы или бактерии с инфекционной активностью не менее 3,0 lg ТЦИД50/мл, и облучения полученной жидкости, содержащей вирусы или бактерии, пучком высокоэнергетических электронов, при этом доза облучения находится в диапазоне от 10 до 50 кГр. Технический результат, достигаемый при осуществлении заявленного изобретения, заключается в предоставлении простого, высокопродуктивного и технологичного способа получения препарата высокоэффективной вакцины из цельных вирусов или бактерий. 9 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.

1. Способ получения препарата вакцины из цельных вирусов или бактерий путем обработки вирусов или бактерий высокоэнергетическими электронами, энергия которых находится в диапазоне от 5 до 10 МэВ, включающий следующие стадии:

- получение жидкости, содержащей вирусы или бактерии, с инфекционной активностью не менее 3,0 lg ТЦИД50/мл;

- облучение полученной жидкости, содержащей вирусы или бактерии, пучком высокоэнергетических электронов, при этом доза облучения находится в диапазоне от 10 до 50 кГр.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что к полученному препарату вируса или бактерии добавляют один или несколько адъювантов.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что к полученному препарату вируса или бактерии добавляют один или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что энергия электронов, которыми облучают вируссодержащую или бактериальную жидкость, составляет предпочтительно 10 МэВ.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что доза облучения вируссодержащей или бактериальной жидкости предпочтительно находится в диапазоне от 15 до 40 кГр.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что источником высокоэнергетических электронов является линейный ускоритель электронов.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что облучение вируссодержащей или бактериальной жидкости проводят непосредственно в таре для хранения и транспортировки препарата вакцины.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что тара для хранения вакцины выбрана из пробирки Эппендорф, виалы, флакона, ампулы.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вирусы и бактерии выбраны из вирусов и бактерий, за исключением спорулирующих форм, используемых для получения вакцин и диагностикумов для медицины и сельского хозяйства.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что вирус животных представляет собой вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.