СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ВАКЦИНЫ ОТ ПОЛИОМИЕЛИТА ПУТЕМ ОБРАБОТКИ ВИРУССОДЕРЖАЩЕЙ ЖИДКОСТИ ВЫСОКОЭНЕРГЕТИЧЕСКИМИ ЭЛЕКТРОНАМИ Российский патент 2025 года по МПК C12N13/00 C12N7/04 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам инактивации вирусов и получения на их основе препаратов вакцин. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения вакцины путем обработки вируса полиомиелита высокоэнергетическими электронами.

Уровень техники

Традиционно вирусы инактивируют посредством их обработки различными химическими реагентами.

Так, например, известен способ получения цельновирионных вакцин путем химической инактивации вирусов, например, посредством обработки формалином, β-пропиолактоном, этиленимином или детергентами (например, полисорбатом-80, тритоном Х-100, β-октилглюзидом) или другими химическими веществами. Однако при химической обработке может происходить модификация белков, изменение или разрушение белковой оболочки вирусов, что приводит к снижению антигенности полученных таким способом вакцин и ограничивает область применения такого способа.

Известен способ инактивации вирусов γ-излучением. При этом источником излучения является радиоактивный изотоп, например, ⁶⁰Со. Недостатком этого способа является необходимость работы с постоянными радиоактивными источниками, тогда как использование β-излучения от ускорителя электронов или рентгеновского излучения (X-Ray) является более безопасным.

Одним из наиболее перспективных способов инактивации вирусов является инактивация значительными дозами β-излучения от ускорителя электронов или рентгеновского излучения (X-Ray). Указанный способ является высокоэффективным, простым и применимым в крупномасштабном производстве.

Наиболее близким аналогом технического решения согласно настоящему изобретению является способ инактивации вирусов и получения вакцины, раскрытый в европейском патенте EP 3024487 В1 (Fraunhofer Ges Forschung [DE], 06.11.2019). В указанном документе раскрыт способ инактивации вирусов и производства вакцины, отличающийся тем, что иммуногенную композицию, содержащую по меньшей мере один вирус, облучают пучками электронов, при этом доза облучения находится в диапазоне от 15 до 110 кГрей (кГр), время облучения находится в диапазоне от 1 до 100 секунд, энергия пучков электронов находится в диапазоне от 150 кэВ до 700 кэВ, а иммуногенная композиция или вакцина, содержащая по меньшей мере один вирус является жидкостью, в частности, представляет собой суспензию. В указанном способе к иммуногенной композиции необязательно добавляют один или несколько адъювантов, необязательно один или несколько фармацевтически приемлемых носителей и/или вспомогательных веществ, и необязательно один или несколько дополнительных иммуногенов, а после указанных стадий вакцину необязательно сушат, лиофилизируют или замораживают. Особенностями указанного способа является необходимость облучения иммуногенной композиции в тонком слое препарата толщиной от 1 до 3 мм, как это следует из другого патента этого же заявителя (см. EP 2135624 В1, Fraunhofer Ges Forschung [DE], 08.08.2012), или необходимость облучения иммуногенной композиции в течение сравнительно продолжительного времени для достижения полной инактивации вирусов, что и определяет основной недостаток указанного решения, как низкая эффективность предложенного способа.

Описание настоящего изобретения

Целью настоящего изобретения является создание простого и высокопродуктивного способа получения препарата высокоэффективной цельновирионной вакцины против вируса полиомиелита.

Указанная цель была достигнута путём разработки нового способа получения препарата цельновирионной вакцины путем обработки вируса полиомиелита высокоэнергетическими электронами, энергия которых находится в диапазоне от 5 до 10 МэВ, а доза облучения вирусов находится в диапазоне от 15 до 50 кГр.

В предлагаемом способе инактивация вируса полиомиелита происходит вследствие получения невосстанавливаемых повреждений нуклеиновых кислот вируса с сохранением белковой структуры оболочки вируса, что и позволяет эффективно получать цельновирионную вакцину с высокой антигенностью вирусных частиц из препарата жидкости, содержащей вирус полиомиелита, когда толщина облучаемого слоя такой жидкости составляет от 1 до 5 см, что позволяет промышленно применять предложенный способ.

Так, настоящее изобретение представляет собой способ получения препарата цельновирионной вакцины путем обработки вирусов высокоэнергетическими электронами, энергия которых находится в диапазоне от 5 до 10 МэВ, включающий следующие стадии:

- получение жидкости, содержащей вирус полиомиелита, с инфекционной активностью не менее 8,0 lg ТЦД50/мл;

- облучение полученной жидкости, содержащей вирус, пучком высокоэнергетических электронов, при этом доза облучения находится в диапазоне от 15 до 50 кГр;

- необязательное добавление к препарату вируса полиомиелита одного или нескольких адъювантов;

- необязательное добавление к препарату вируса полиомиелита одного или нескольких фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.

Жидкость, содержащую вирус полиомиелита, которую подвергают облучению, получают путём наращивания биомассы вируса до инфекционной активности не менее 8,0 lg ТЦД50/мл и последующей очистки от остаточных компонентов питательной среды. По сути, облученная жидкость, содержавшая вирус полиомиелита, содержит только необходимое количество инактивированных, но полностью цельных и высокоэффективных в плане иммуногенности вирусных частиц свободных от каких-либо остаточных компонентов питательной среды, и, при необходимости, один или несколько адъювантов и/или одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ. Это позволяет получать, например, готовый стерильный фасованный препарат вакцины сразу после облучения такой жидкости, содержащей вирус полиомиелита, без необходимости проведения каких-либо дополнительных стадий, таких, например, как очистка от инактивирующего агента и стерилизация препарата, и без необходимости обязательного добавления консервантов.

Инфекционную активность вируссодержащей жидкости определяют, например, по методу Кербера (Kerber G. Arch. Exper. Path. Farmak., 1931. — Vol. 162. — P. 480).

В предпочтительном варианте способа, согласно настоящему изобретению, энергия электронов, которыми облучают жидкость, содержащую вирус полиомиелита, составляет предпочтительно 10 МэВ.

В другом предпочтительном варианте способа, согласно настоящему изобретению, суммарная доза облучения жидкости, содержащей вирус полиомиелита, составляет более 30 кГр.

Также в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение представляет собой способ, в котором источником высокоэнергетических электронов является линейный ускоритель электронов.

В качестве источника высокоэнергетических электронов могут использоваться, например, линейные ускорители электронов, такие как УЭЛР-10-15-С-60-1 (НПП Торий), линейные резонансные ускорители типа ИЛУ (ИЯФ СО РАН), ускорители типа Linacs (Mevex) и другие.

В предпочтительном варианте способа, согласно настоящему изобретению, облучение жидкости, содержащей вирус полиомиелита, проводят непосредственно в таре для хранения и транспортировки препарата вакцины, при этом тара для хранения препарата выбрана из пробирки Эппендорф, виалы, флакона, ампулы.

Также в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение представляет собой способ, в котором облучаемая вируссодержащая жидкость охлаждена до температур -70°С, -20 °С, +5 °С.

Под термином «адъювант» в настоящем описании понимается соединение или группа соединений, используемые для неспецифического усиления иммунного ответа при их введении одновременно с иммуногеном. В отличие от иммуномодуляторов, адъюванты применяются для усиления конкретного иммунного ответа (например, при вакцинации) чаще всего в здоровом организме, а не для нормализации нарушенных функций иммунной системы при патологии. Принцип действия адъювантов заключается в депонировании антигена, активации воспаления, изменении физико‐химических свойств антигена, усилении синтеза белков, активации системы комплемента, изменении процессинга и презентации / транспорта антигена, активации всех стадий иммуногенеза, синтеза и секреции цитокинов и т.д.

Адъювантами могут быть неорганические (фосфаты алюминия и кальция, хлористый кальций и др.) и органические (агар, глицерин, протамины и др.) вещества. В список адъювантов, наиболее широко применяющихся в настоящее время, входят такие адъюванты, как:

- неполный адъювант Фрейнда, представляющий собой водно-жировую эмульсию, содержащую вазелиновое масло, ланолин и эмульгатор. Указанный адъювант депонирует антиген и усиливает его захват фагоцитами;

- полный адъювант Фрейнда, включающий в себя, кроме вышеперечисленных компонентов, БЦЖ или мурамилдипептид. Это позволяет ему дополнительно активировать макрофаги и одновременно стимулировать Т-клетки;

- алюминиевые квасцы или гидроксид алюминия, которые благодаря высокой способности к сорбции выполняют функцию антигенного депо, а также неспецифически усиливает фагоцитоз;

- Bordetella pertussis с квасцами, изготовленный из ослабленного штамма B. pertussis, сорбированного на гидроксиде алюминия. Действие гидроксида алюминия дополняется активацией макрофагов и одновременной стимуляцией Т-клеток.

- иммуностимуляторный комплекс (ISCOM), представляющий собой липидные мицеллы, окружающие белковые или вирусные частицы. Частицы антигена доставляются непосредственно в цитозоль Т-клеток, в результате чего происходит индукция Т-киллеров,

но список адъювантов, используемых в рамках настоящего изобретения, не ограничивается ими.

К вспомогательным веществам, используемым в вакцинах, относятся адсорбенты, консерванты, эмульгаторы, индикаторы рН, стабилизаторы, но не ограничиваются ими.

В качестве адсорбентов используют, например, транспортные белки, которые входят в состав, например, дифтерийного и столбнячного анатоксинов.

Консерванты используют для подавления размножения возможных сопутствующих микроорганизмов. Для этой цели используют тиомерсал (мертиолят), формальдегид, феноксиэтанол, фенол и антибиотики (неомицин, гентамицин, полимиксин), но не ограничиваются ими. Содержание таких консервантов в вакцинах, как правило, крайне низкое, и в таких концентрациях они не представляют какой-либо опасности для субъекта вакцинации.

Небольшие количества эмульгаторов добавляют для улучшения растворения сухих, лиофилизированных вакцин или в случае использования эмульсионных вакцин. Примерами эмульгаторов, которые можно использовать в получении эмульсионных вакцин согласно настоящему изобретению, являются фосфолипиды, сложные эфиры сорбитана, сложные эфиры полиэтоксилированного сорбитана и производные маннита, которые являются обычными эмульгаторами для вакцины. Фосфолипидные эмульгаторы включают лецитин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозит, фосфатидилсерин и лецитин (например, такой как AMPHIGEN^®). Эмульгаторы, представляющие собой сложные эфиры сорбитана, включают монолаурат сорбитана (например, Span^® 20 и Arlacel^® 20), моноолеат сорбитана (например, Span^® 80 и Arlacel^® 80), монопальмитат сорбитана (например, Span^® 40 и Arlacel^® 40) и моностеарат сорбитана (например, Span^® 60 и Arlacel^® 60). Сложные эфиры полиэтоксилированного сорбитана включают монолаурат полиэтоксисорбитана (например, Tween^® 20 и Tween^® 21), моноолеат полиэтоксисорбитана (например, Tween^® 80), монопальмитат полиэтоксисорбитана (например, Tween^® 40) и моностеарат полиэтоксисорбитана (например, Tween^® 60). Эмульгаторы, представляющие собой производное маннита, включают октадекановые эфиры маннита. Span^®, Arlacel^® и Tween^® представляют собой товарные знаки ICI Americas. AMPHIGEN^® представляет собой товарный знак Pfizer, Inc. Обычно эмульсионные вакцины готовят в виде нормальных эмульсий масла в воде, хотя возможно получение обратных эмульсий воды в масле.

В качестве индикатора рН часто используют метиловый красный или аналогичные ему соединения, известные специалисту в данной области техники. Изменение цвета препарата свидетельствует о «сдвиге» показателя кислотности и это является фактором, позволяющим забраковать конкретную дозу вакцины.

Далее приведены примеры вариантов осуществления способа согласно настоящему изобретению. Указанные примеры приведены для целей разъяснения сути настоящего изобретения. В примерах приведены данные об инактивации вируса полиомиелита, полученные с использованием штамма вируса полиомиелита Сэбин 1 типа (LSc 2 ab).

Приведённые в настоящем документе экспериментальные примеры инактивации вируса полиомиелита приведены исключительно в иллюстративных целях.

Примеры

Пример 1

Инактивация вируса полиомиелита с помощью облучения высокоэнергетичными электронами при температуре 25°С и при различных концентрациях вируса полиомиелита и дозах облучения.

В опыте использовали вирус полиомиелита с четырьмя концентрациями инфекционной активности: 4 lg ТЦД50/мл, 6 lg ТЦД50/мл, 8 lg ТЦД50/мл и 10 lg ТЦД50/мл. Общий пул каждой концентрации вируса поделили на 27 пробирок с герметичными крышками (криопробирки Corning объемом 5 мл) для последующей инактивации:

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением дозой 5 кГр;

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением дозой 10 кГр;

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением дозой 15 кГр;

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением дозой 20 кГр;

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением дозой 25 кГр;

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением дозой 30 кГр;

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением дозой 35 кГр;

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением дозой 50 кГр;

- 3 пробирки (повторности) - не инактивировали (контроль).

Облучение высокоэнергетическими электронами проводили с помощью линейного ускорителя электронов УЭЛР-10-15-С-60-1 (НПП Торий) энергией 10 МэВ.

Внешний вид.

Пробы, обработанные ионизирующим излучением, изменили цвет, стали почти прозрачными, с желтым или желтовато-коричневым оттенком.

Оценка эффективности инактивации.

Оценку эффективности инактивации осуществляли путем проведения двух кратных последовательных пассажей в культуре клеток Vero.

Проба Наличие (+) / отсутствие (-) ЦПД вируса полиомиелита в пассаже № 1 2 4 lg ТЦД50/мл 5 кГр - - 4 lg ТЦД50/мл 10 кГр - - 4 lg ТЦД50/мл 15 кГр - - 4 lg ТЦД50/мл 20 кГр - - 4 lg ТЦД50/мл 25 кГр - - 4 lg ТЦД50/мл 30 кГр - - 4 lg ТЦД50/мл 35 кГр - - 4 lg ТЦД50/мл 50 кГр - - 4 lg ТЦД50/мл Контроль + н/и 6 lg ТЦД50/мл 5 кГр - - 6 lg ТЦД50/мл 10 кГр - - 6 lg ТЦД50/мл 15 кГр - - 6 lg ТЦД50/мл 20 кГр - - 6 lg ТЦД50/мл 25 кГр - - 6 lg ТЦД50/мл 30 кГр - - 6 lg ТЦД50/мл 35 кГр - - 6 lg ТЦД50/мл 50 кГр - - 6 lg ТЦД50/мл Контроль + н/и 8 lg ТЦД50/мл 5 кГр - - 8 lg ТЦД50/мл 10 кГр - - 8 lg ТЦД50/мл 15 кГр - - 8 lg ТЦД50/мл 20 кГр - - 8 lg ТЦД50/мл 25 кГр - - 8 lg ТЦД50/мл 30 кГр - - 8 lg ТЦД50/мл 35 кГр - - 8 lg ТЦД50/мл 50 кГр - - 8 lg ТЦД50/мл Контроль + н/и 10 lg ТЦД50/мл 5 кГр + н/и 10 lg ТЦД50/мл 10 кГр + н/и 10 lg ТЦД50/мл 15 кГр - - 10 lg ТЦД50/мл 20 кГр - - 10 lg ТЦД50/мл 25 кГр - - 10 lg ТЦД50/мл 30 кГр - - 10 lg ТЦД50/мл 35 кГр - - 10 lg ТЦД50/мл 50 кГр - - 10 lg ТЦД50/мл Контроль + н/и

* н/и - не исследовали;

Результаты оценки продемонстрировали отсутствие цитопатического действия (ЦПД) штамма вируса полиомиелита Сэбин 1 типа в течение 2 пассажей после облучения дозой выше 15 кГр при любой из концентраций вируса 4, 6, 8 или 10 lg ТЦД50/мл при температуре 25 °С.

Заключение:

1. Дозы облучения 15 - 50 кГр являются достаточными для эффективной инактивации вируса полиомиелита с концентрацией от 4 до 10 lg ТЦД50/мл при температуре 25 °С.

Пример 2

Инактивация вируса полиомиелита с помощью облучения высокоэнергетичными электронами при пониженных температурах, а также при облучении однократными или дробными дозами.

В опыте использовали вирус полиомиелита с двумя концентрациями инфекционной активности: 8 lg ТЦД50/мл и 10 lg ТЦД50/мл. Общий пул каждой концентрации вируса поделили на 27 пробирок с герметичными крышками (криопробирки Corning объемом 5 мл) для последующей инактивации:

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением дозой 10 кГр при температуре 2-8 °С;

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 15 кГр при температуре 2-8 °С;

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 20 кГр при температуре 2-8 °С;

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 25 кГр при температуре 2-8 °С;

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением дозой 3,3+3,3+3,3 кГр (дробный набор дозы) при температуре 2-8 °С;

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 5+5+5 кГр (дробный набор дозы) при температуре 2-8 °С;

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 6,6+6,6+6,6 кГр (дробный набор дозы) при температуре 2-8 °С;

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 8,3+8,3+8,3 кГр (дробный набор дозы) при температуре 2-8 °С;

- 3 пробирки (повторности) – не инактивировали (контроль) при температуре 2-8 °С;

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением дозой 10 кГр при температуре -20±4 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 15 кГр при температуре -20±4 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 20 кГр при температуре -20±4 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 25 кГр при температуре -20±4 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 30 кГр при температуре -20±4 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением дозой 3,3+3,3+3,3 кГр (дробный набор дозы) при температуре -20±4 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 5+5+5 кГр (дробный набор дозы) при температуре -20±4 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 6,6+6,6+6,6 кГр (дробный набор дозы) при температуре -20±4 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 8,3+8,3+8,3 кГр (дробный набор дозы) при температуре -20±4 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 10+10+10 кГр (дробный набор дозы) при температуре -20±4 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) – не инактивировали (контроль) при температуре -20±4 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением дозой 10 кГр при температуре -65±5 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 15 кГр при температуре -65±5 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 20 кГр при температуре -65±5 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 25 кГр при температуре -65±5 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 30 кГр при температуре -65±5 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением дозой 3,3+3,3+3,3 кГр (дробный набор дозы) при температуре -65±5 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 5+5+5 кГр (дробный набор дозы) при температуре -65±5 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 6,6+6,6+6,6 кГр (дробный набор дозы) при температуре -65±5 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 8,3+8,3+8,3 кГр (дробный набор дозы) при температуре -65±5 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) - ионизирующим излучением доза 10+10+10 кГр (дробный набор дозы) при температуре -65±5 °С (заморозка);

- 3 пробирки (повторности) – не инактивировали (контроль) при температуре -65±5 °С (заморозка);

Облучение высокоэнергетическими электронами проводили с помощью линейного ускорителя электронов УЭЛР-10-15-С-60-1 (НПП Торий) энергией 10 МэВ.

Внешний вид.

Пробы, обработанные ионизирующим излучением, изменили цвет, стали почти прозрачными, с желтым или желтовато-коричневым оттенком.

Оценка эффективности инактивации.

Оценку эффективности инактивации осуществляли путем проведения двух кратных последовательных пассажей в культуре клеток Vero.

Проба Наличие (+) / отсутствие (-) ЦПД вируса полиомиелита в пассаже № 1 2 8 lg ТЦД50/мл, 10 кГр, 2-8 °C + + 8 lg ТЦД50/мл, 15 кГр, 2-8 °C +- +- 8 lg ТЦД50/мл, 20 кГр, 2-8 °C - - 8 lg ТЦД50/мл, 25 кГр, 2-8 °C - - 8 lg ТЦД50/мл, 3,3+3,3+3,3 кГр, 2-8 °C + + 8 lg ТЦД50/мл, 5+5+5 кГр, 2-8 °C - +- 8 lg ТЦД50/мл, 6,6+6,6+6,6 кГр, 2-8 °C - - 8 lg ТЦД50/мл, 8,3+8,3+8,3 кГр, 2-8 °C - - 8 lg ТЦД50/мл, 10+10+10 кГр, 2-8 °C - - 8 lg ТЦД50/мл, контроль, 2-8 °C + н/и 8 lg ТЦД50/мл, 10 кГр, -20±4 °С + + 8 lg ТЦД50/мл, 15 кГр, -20±4 °С + + 8 lg ТЦД50/мл, 20 кГр, -20±4 °С - + 8 lg ТЦД50/мл, 25 кГр, -20±4 °С - + 8 lg ТЦД50/мл, 30 кГр, -20±4 °С - - 8 lg ТЦД50/мл, 3,3+3,3+3,3 кГр, -20±4 °С + + 8 lg ТЦД50/мл, 5+5+5 кГр, -20±4 °С +- + 8 lg ТЦД50/мл, 6,6+6,6+6,6 кГр, -20±4 °С - +- 8 lg ТЦД50/мл, 8,3+8,3+8,3 кГр, -20±4 °С - +- 8 lg ТЦД50/мл, 10+10+10 кГр, -20±4 °С - - 8 lg ТЦД50/мл, контроль, -20±4 °С + н/и 8 lg ТЦД50/мл, 10 кГр, -65±5 °С + + 8 lg ТЦД50/мл, 15 кГр, -65±5 °С + + 8 lg ТЦД50/мл, 20 кГр, -65±5 °С - + 8 lg ТЦД50/мл, 25 кГр, -65±5 °С - + 8 lg ТЦД50/мл, 30 кГр, -65±5 °С - + 8 lg ТЦД50/мл, 3,3+3,3+3,3 кГр, -65±5 °С + + 8 lg ТЦД50/мл, 5+5+5 кГр, -65±5 °С +- + 8 lg ТЦД50/мл, 6,6+6,6+6,6 кГр, -65±5 °С - + 8 lg ТЦД50/мл, 8,3+8,3+8,3 кГр, -65±5 °С - +- 8 lg ТЦД50/мл, 10+10+10 кГр, -65±5 °С - - 8 lg ТЦД50/мл, контроль, -65±5 °С + н/и 10 lg ТЦД50/мл, 10 кГр, 2-8 °C + + 10 lg ТЦД50/мл, 15 кГр, 2-8 °C + + 10 lg ТЦД50/мл, 20 кГр, 2-8 °C +- + 10 lg ТЦД50/мл, 25 кГр, 2-8 °C +- + 10 lg ТЦД50/мл, 3,3+3,3+3,3 кГр, 2-8 °C + + 10 lg ТЦД50/мл, 5+5+5 кГр, 2-8 °C + + 10 lg ТЦД50/мл, 6,6+6,6+6,6 кГр, 2-8 °C +- + 10 lg ТЦД50/мл, 8,3+8,3+8,3 кГр, 2-8 °C +- +- 10 lg ТЦД50/мл, 10+10+10 кГр, 2-8 °C - - 10 lg ТЦД50/мл, контроль, 2-8 °C + н/и 10 lg ТЦД50/мл, 10 кГр, -20±4 °С + + 10 lg ТЦД50/мл, 15 кГр, -20±4 °С + + 10 lg ТЦД50/мл, 20 кГр, -20±4 °С + + 10 lg ТЦД50/мл, 25 кГр, -20±4 °С + + 10 lg ТЦД50/мл, 30 кГр, -20±4 °С +- +- 10 lg ТЦД50/мл, 3,3+3,3+3,3 кГр, -20±4 °С + + 10 lg ТЦД50/мл, 5+5+5 кГр, -20±4 °С + + 10 lg ТЦД50/мл, 6,6+6,6+6,6 кГр, -20±4 °С + + 10 lg ТЦД50/мл, 8,3+8,3+8,3 кГр, -20±4 °С +- + 10 lg ТЦД50/мл, 10+10+10 кГр, -20±4 °С - - 10 lg ТЦД50/мл, контроль, -20±4 °С + н/и 10 lg ТЦД50/мл, 10 кГр, -65±5 °С + + 10 lg ТЦД50/мл, 15 кГр, -65±5 °С + + 10 lg ТЦД50/мл, 20 кГр, -65±5 °С + + 10 lg ТЦД50/мл, 25 кГр, -65±5 °С + + 10 lg ТЦД50/мл, 30 кГр, -65±5 °С + + 10 lg ТЦД50/мл, 3,3+3,3+3,3 кГр, -65±5 °С + + 10 lg ТЦД50/мл, 5+5+5 кГр, -65±5 °С + + 10 lg ТЦД50/мл, 6,6+6,6+6,6 кГр, -65±5 °С + + 10 lg ТЦД50/мл, 8,3+8,3+8,3 кГр, -65±5 °С + + 10 lg ТЦД50/мл, 10+10+10 кГр, -65±5 °С +- + 10 lg ТЦД50/мл, контроль, -65±5 °С + н/и

* н/и - не исследовали;

+- - часть образцов вызывало ЦПД, а часть – не вызывала;

Результаты оценки продемонстрировали отсутствие цитопатического действия (ЦПД) в течение 2 пассажей штамма вируса полиомиелита Сэбин 1 типа:

1) с концентрацией 10⁸ ТЦД₅₀/мл при облучении при температуре 2-8 °С и однократной и дробной дозе выше 20 кГр;

2) с концентрацией 10⁸ ТЦД₅₀/мл при облучении при температуре -20±4 °С и однократной и дробной дозе выше 30 кГр;

3) с концентрацией 10⁸ ТЦД₅₀/мл при облучении при температуре -65±5 °С и дробной дозе выше 30 кГр;

4) с концентрацией 10¹⁰ ТЦД₅₀/мл при облучении при температуре 2-8 °С или -20±4 °С и дробной дозе 10+10+10 кГр.

Оценка содержания антигена.

Образцы, в которых вирус полиомиелита был инактивирован проверяли на содержание D-антигена с помощью ИФА-тест системы. Результаты сравнивали с неинактивированными контрольными образцами для определения доли сохраненного D-антигена.

Результаты оценки содержания D-антигена

Образец D-антиген, сохранившей после проведения инактивации высокоэнергетичными электронами, % 10¹⁰ ТЦД₅₀/мл, 2-8 °С, 10+10+10 кГр 27,4 10¹⁰ ТЦД₅₀/мл, -20±4 °С, 10+10+10 кГр 46,3 10⁸ ТЦД₅₀/мл, 2-8 °С, 6.6+6.6+6.6 кГр 66,5 10⁸ ТЦД₅₀/мл, 2-8 °С, 8.3+8.3+8.3 кГр 69,3 10⁸ ТЦД₅₀/мл, 2-8 °С, 10+10+10 кГр 43 10⁸ ТЦД₅₀/мл, 2-8 °С, 20 кГр 68,2 10⁸ ТЦД₅₀/мл, 2-8 °С, 25 кГр 70,9 10⁸ ТЦД₅₀/мл, -20±4 °С, 10+10+10 кГр 66,8 10⁸ ТЦД₅₀/мл, -20±4 °С, 30 кГр 56,5 10⁸ ТЦД₅₀/мл, -65±5 °С, 10+10+10 кГр 55,5

Заключение:

1. При понижении температуры образцов, а также при повышении концентрации вируса полиомиелита наблюдается снижение уровня инактивации вируса полиомиелита при облучении одинаковыми дозами. То есть, при понижении температуры образцов и при повышении их концентрации необходимо увеличивать дозу облучения.

2. Наибольшую степень инактивации и сохранности антигена при облучении можно достичь при дозе облучения от 20 до 30 кГр при дробном или однократном наборе дозы.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения препарата цельновирионной вакцины путем обработки вируса полиомиелита высокоэнергетическими электронами, энергия которых находится в диапазоне от 5 до 10 МэВ. Способ включает стадии получения жидкости, содержащей вирус полиомиелита с инфекционной активностью не менее 8,0 lg ТЦД50/мл, и облучения полученной жидкости, содержащей вирус полиомиелита, пучком высокоэнергетических электронов, при этом доза облучения находится в диапазоне от 15 до 50 кГр. Технический результат, достигаемый при осуществлении заявленного изобретения, заключается в создании простого и высокопродуктивного способа получения препарата высокоэффективной цельновирионной вакцины против вируса полиомиелита. 6 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.

1. Способ получения препарата цельновирионной вакцины путем обработки вируса полиомиелита высокоэнергетическими электронами, энергия которых находится в диапазоне от 5 до 10 МэВ, включающий следующие стадии:

- получение жидкости, содержащей вирус полиомиелита, с инфекционной активностью не менее 8,0 lg ТЦД50/мл;

- облучение полученной жидкости, содержащей вирус полиомиелита, пучком высокоэнергетических электронов, при этом суммарная доза облучения находится в диапазоне от 15 до 50 кГр.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что к полученному препарату вируса полиомиелита добавляют один или несколько адъювантов.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что к полученному препарату вируса полиомиелита добавляют один или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что энергия электронов, которыми облучают вируссодержащую жидкость, составляет предпочтительно 10 МэВ.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что источником высокоэнергетических электронов является линейный ускоритель электронов.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что облучение вируссодержащей жидкости проводят непосредственно в таре для хранения и транспортировки препарата вакцины.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что тара для хранения вакцины выбрана из пробирки Эппендорф, виалы, флакона, ампулы.