Способ генотипирования полиморфного локуса rs6702742 (A>G) гена SERBP1 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs6702742 (A>G) гена SERPINE1 мРНК-связывающего белка 1 молекулярно-генетическим методом исследования.

Регуляция экспрессии генов в эукариотических клетках представляет собой многоуровневый процесс и классически делится на транскрипционные и посттранскрипционные этапы. РНК-связывающие белки признаны ключевыми игроками на посттранскрипционном этапе [Gerstberger S., Hafner M., Tuschl T. A census of human RNA-binding proteins //Nature Reviews Genetics. - 2014. - Vol. 15. - №. 12. - P. 829-845.]. Одним из РНК-связывающих белков является SERBP1, который регулирует мРНК PAI-1 [Heaton J. H., Dlakic W. M., Gelehrter T. D. Posttranscriptional regulation of PAI-1 gene expression //Thrombosis and haemostasis. - 2003. - V. 89. - №. 06. - P. 959-966.]. Позже было установлено, что SERBP1 млекопитающих участвует в расщеплении и рекомбинации ДНК [Mondal S. et al. Functional requirements of AID’s higher order structures and their interaction with RNA-binding proteins //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2016. - V. 113. - №. 11. - P. E1545-E1554.], ремоделировании хроматина [Lemos T. A. et al. Characterization of a new family of proteins that interact with the C-terminal region of the chromatin-remodeling factor CHD-31 //FEBS letters. - 2003. - V. 533. - №. 1. - P. 14-20.], транскрипции [Mari Y. et al. SERBP1 is a component of the liver receptor homologue-1 transcriptional complex //Journal of proteome research. - 2015. - V. 14. - №. 11. - P. 4571-4580.] и цитоплазматической передаче сигналов прогестерона посредством взаимодействия с рецепторами прогестина клеточной поверхности [Fernandes M. S., Brosens J. J., Gellersen B. Honey, we need to talk about the membrane progestin receptors //Steroids. - 2008. - V. 73. - №. 9-10. - P. 942-952.]. Следовательно, будучи вовлеченным во множество механизмов как внутри, так и за пределами ядра клетки, SERBP1 обладает уникальными регуляторными свойствами, что свидетельствует о его потенциально значимой роли в широком спектре физиологических и патологических процессов, протекающих в клетках. Однако, на сегодняшний день знания о биологической роли SERBP1, как и о его значении в патологии человека являются недостаточными, что требует разработки методов генотипирования функционально значимых полиморфных вариантов в гене SERBP1. SERBP1 локализован в участке 1p31.3 хромосомы 1. Одним из наиболее частных полиморфизмов с потенциально высоким регуляторным потенциалом является однонуклеотидная замена A>G (rs6702742) SERBP1, локализованная в интроне. SNP rs6702742 влияет на уровень экспрессии SERBP1 в различных органах и тканях посредством связи с локусами количественных признаков экспрессии (https://gtexportal.org/home/).

Это создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs6702742 SERBP1.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016 //Nature protocols. - 2017. - Vol. 12. - №. 2. - P. 213-218.]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение многофакторных заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени. Основными недостатками метода являются трудоемкость, высокая стоимость оборудования, высокая стоимость эксперимента, наличие высококвалифицированного персонала [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. - 2022. - Vol. 2. - №. 5. - P. 385-404].

За прототип выбран коммерческий набор по генотипированию rs6702742 SERBP1 (Assay ID C__29828754_10; каталожный номер 4351379) компании ThermoFisher. Однако, генотипирование с использованием коммерческих наборов характеризуется высокой стоимостью, а информация о структуре необходимых для проведения ПЦР праймеров и аллель-специфических зондов является закрытой для исследователей, в связи с чем данный метода не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов.

Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого способа идентификации полиморфизма rs6702742 гена SERBP1, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в ПЦР-лаборатории со стандартным набором оборудования и реактивов.

Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа таргетного генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs6702742 (A>G), локализованного в позиции chr1:67424843 (GRCh38.p14) в гене SERBP1 (Gene ID:26135) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащие флуорофоры FAM и ROX, позволяющие идентифицировать аллели A и G соответственно.

Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs6702742 (A>G) гена SERBP1 осуществляют с использованием прямого общего праймера 5′-CCATCCCATAAGACATTATCTTGTAA-3′ (SEQ ID NO 1), обратного общего праймера 5′-GGGGAACTGTCAAAGACGAA-3′ (SEQ ID NO 2), A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM)TATGGATTAACCTCTAGTTA(RTQ1)-3′(SEQ ID NO 3), G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX)TATGGATTAGCCTCTAGTTA(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).

Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация аллелей по локусу rs6702742 гена SERBP1 при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs6702742-A/A показаны оранжевыми кружками, генотипы rs6702742-A/G показаны зелеными треугольниками, генотипы rs6702742-G/G показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.

Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:

1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран синвенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [A/G], а затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции:

прямой общий праймер 5′-CCATCCCATAAGACATTATCTTGTAA-3′ (SEQ ID NO 1), обратный общий праймер 5′-GGGGAACTGTCAAAGACGAA-3′ (SEQ ID NO 2).

2) Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. - New york : Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2.

На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:

A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5′-(FAM)TATGGATTAACCTCTAGTTA(RTQ1)-3′(SEQ ID NO 3),

G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5′-(ROX)TATGGATTAGCCTCTAGTTA(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).

3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.

4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 15 секунд и 53°C в течение 1 минуты].

5) Разработанный способ был апробирован на 95 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляют по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) зонда с флуоресцентным красителем FAM, соответствующего аллелю A, и зонда с красителем ROX, соответствующего аллелю G. По результатам генотипирования 38 (40,0%) индивидуумов оказались гомозиготами G/G; 42 человека (44,2%) являлись гетерозиготами (генотип A/G), 15 (15,8%) - гомозиготами по аллелю A (генотип A/A).

6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования генотипирования полиморфного локуса rs6702742 (A>G) гена SERBP1 методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs6702742 (A>G) гена SERBP1 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования используют два фланкирующих праймера, прямой 5′- CCATCCCATAAGACATTATCTTGTAA-3′ (SEQ ID NO 1) и обратный 5′- GGGGAACTGTCAAAGACGAA-3′ (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′- (FAM) TATGGATTAACCTCTAGTTA(RTQ1)-3′(SEQ ID NO 3),

G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX)TATGGATTAGCCTCTAGTTA(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).

ПЦР в реальном времени проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей ПЦР в реальном времени проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкМ каждого праймера, по 5 мкМ каждого зонда, 0.03 мМ каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl2; 1xПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50°C в течение 2 минут, затем 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов (95°C в течение 15 секунд и 53°C в течение 1 минуты).

4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (на амплификаторе CFX96) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs6702742 SERBP1 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю A, зонд с красителем ROX - аллелю G (фиг.). На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов - соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот A/A. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот G/G. Кластер зеленых треугольников соответствует накоплению уровня флуоресценции по обоим зондам и позволяет идентифицировать гетерозигот A/G.

Резюме

Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс- идентификации аллельных вариантов A и G гена SERBP1 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфного варианта rs6702742 гена SERBP1, а также в научных целях.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="последовательности

No 2023107761 20(016864) rs6702742.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-05-24">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023107761/20(016864)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-03-30</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования

&quot;Курский государственный медицинский университет&quot;

Министерства здравоохранения Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical

University</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования

полиморфного локуса rs12561767 (G&gt;A) гена SERBP1 у человека

методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением

аллель-специфических флуоресцентных зондов</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q17">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccatcccataagacattatcttgtaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggggaactgtcaaagacgaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q19">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tatggattaacctctagtta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q20">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tatggattagcctctagtta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии, а именно молекулярно-генетической диагностике и медицине, и может быть использовано при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфного варианта rs6702742 (A>G) гена SERPINE1 мРНК-связывающего белка 1. Предложен способ генотипирования полиморфного локуса rs6702742 (A>G) гена SERBP1 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, предусматривающий проведение ПЦР с использованием специально подобранных праймеров (F: 5'-CCATCCCATAAGACATTATCTTGTAA-3' и R: 5'-GGGGAACTGTCAAAGACGAA-3') и зондов c флуорофорами (A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM)TATGGATTAACCTCTAGTTA(RTQ1)-3′ и G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX)TATGGATTAGCCTCTAGTTA(BHQ2)-3′) в амплификаторе с детекцией флуоресценции. Изобретение позволяет расширить арсенал способов генотипирования полиморфных вариантов гена SERBP1, повысить точность и сократить время проведения анализа. 1 ил.

Способ генотипирования полиморфного локуса rs6702742 (A>G) гена SERBP1 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, отличающийся тем, что идентификацию аллельных вариантов rs6702742 (A>G) гена SERBP1 осуществляют с использованием прямого общего праймера 5′-CCATCCCATAAGACATTATCTTGTAA-3′ (SEQ ID NO 1), обратного общего праймера 5′-GGGGAACTGTCAAAGACGAA-3′ (SEQ ID NO 2), A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM)TATGGATTAACCTCTAGTTA(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX)TATGGATTAGCCTCTAGTTA(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).