Способ прогнозирования риска неблагоприятного исхода для пациентов в хроническом критическом состоянии вследствие мозговых катастроф, осложненном пневмонией Российский патент 2024 года по МПК G01N33/80 G01N33/50 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 G16H50/30 

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам прогнозирования развития инфекционно-воспалительного процесса с использованием нуклеиновых кислот и может быть использовано в клинической практике при прогнозировании риска неблагоприятного исхода для пациентов в хроническом критическом состоянии (ХКС) с последствиями тяжелого повреждения головного мозга (ГМ).

К стойким, персистирующим, длительным, продолжительным, или ХКС относят тяжелые патологические состояния пациентов, нуждающихся в продолжительном применении (не менее 8-21 дня) методов жизнеобеспечения, осуществляемых в отделениях интенсивного лечения и реанимации (ОИЛР). Современные исследования фиксируют нарастающее увеличение количества таких пациентов и высокую частоту внутрибольничных осложнений среди них, сопровождающуюся повышенной летальностью.

К отдельной группе пациентов с ХКС относят пациентов с последствиями тяжелого повреждения ГМ в результате травмы, геморрагического или ишемического инсульта, длительной хирургической операции на ГМ, интоксикации, гипоксического состояния. Такие пациенты пережили острейшую фазу заболевания с исходом в вегетативное состояние или в состояние малого сознания и нуждаются в продолжительном интенсивном и реабилитационном лечении. Последствия тяжелых повреждений ГМ сопровождаются каскадом патологических реакций не только в ГМ (отек мозга, нарушения церебральной гемодинамики, воспалительные осложнения и т.д.). В патологический процесс последовательно и закономерно вовлекается сердечно-сосудистая система, органы дыхания, пищеварения, водного обмена, гормональной регуляции и т.д. Нарушения трофики тканей и функционирования иммунной системы, изменения нутритивного статуса, развитие гипотонии, снижения перфузии тканей с развитием гипоксии и полиорганной недостаточности, присоединение инфекции и гнойно-воспалительных осложнений замыкают круг патологических реакций, увеличивая вероятность летального исхода.

Среди инфекционных осложнений, развивающихся при ХКС, наиболее часто диагностируют пневмонию. Летальность пациентов с пневмонией (этиологически не относящейся к COVID-19), нуждающихся в госпитализации в ОИЛР, приближается к 40%. Такая высокая летальность может быть следствием нередких септических осложнений тяжелой пневмонии у пациентов в ОИЛР в результате стойкой дисфункции систем врожденного и адаптивного иммунитета, развивающейся в условиях длительной бактериальной инфекции и дисбиоза микробиоты. Своевременное и адекватное применение антибиотиков, высокотехнологических методов ранней диагностики и лечения, а также биомаркеров способствует снижению летальности при тяжелой пневмонии [Niederman MS, Torres A. Severe community-acquired pneumonia. Eur Respir Rev 2022; 31: 220123 [DOI: 10.1183/16000617.0123-2022]. Однако, информативная ценность наиболее часто используемых при пневмонии биомаркеров - прокальцитонина и С-реактивного белка проявляется только при лечении - для определения длительности использования антибиотиков [Niederman MS, Torres A. Severe community-acquired pneumonia. Eur Respir Rev 2022; 31: 220123 [DOI: 10.1183/16000617.0123-2022; Méndez R, Menéndez R, Cillóniz C, Amara-Elori I, Amaro R, González P, Posadas T, Gimeno A, Espańa PP, Almirall J, Torres A. Initial Inflammatory Profile in Community-acquired Pneumonia Depends on Time since Onset of Symptoms. Am J Respir Crit Care Med. 2018 Aug l;198(3):370-378. doi: 10.1164/rccm.201709-1908OC]. Вместе с тем, персонифицированные подходы к эффективному лечению критических состояний [Голубев A.M. Персонализированная медицина критических состояний (обзор). Общая реаниматология. 2022;18(4):45-54. https://doi.ors/10.15360/1813-9779-2022-4-45-54. Golubev A.M. Personalized Critical Care Medicine (Review). General Reanimatology. 2022; 18(4):45-54. https://doi.ors/10.15360/1813-9779-2022-4-45-54: Белобородова H.B., Гречко A.B., Гуркова M.M., Зурабов А.Ю., Зурабов Ф.М., Кузовлев А.Н., Меглей А.Ю., Петрова М.В., Попова В.М., Редкий И.В., Сергеев Н.И., Черневская Е.А., Юрьев М.Ю., Яковлев А.А. Адаптивная фаготерапия пациентов с рецидивирующими пневмониями (пилотное исследование). Общая реаниматология. 2021;17(6):4-14. https://doi.org/10.15360/1813-9779-2021-6-4-14] требуют высокоинформативных прогностических маркеров развития заболевания. Для категории пациентов в ХКС такие маркеры неизвестны. Поэтому разработка таких маркеров в области прогноза течения и исходов тяжелой пневмонии у пациентов в ХКС является актуальной проблемой медицины критических состояний.

Уровень техники.

Одним из прогностических маркеров при различных заболеваниях является отношение нейтрофилов к лимфоцитам (ОНЛ). Своеобразие ОНЛ как биомаркера состоит в том, что значение ОНЛ одновременно характеризует и системный воспалительный ответ (количество нейтрофилов в циркуляции), и является интегральным и простым показателем состояния адаптивного иммунитета (общее содержание лимфоцитов). Определение уровня ОНЛ используется для оценки тяжести состояния и прогноза исхода при различных заболеваниях: сердечно-сосудистой системы, бактериальной, грибковой инфекция и сепсиса, инфекции SARS-CoV-2, травм [Song М, Graubard BI, Rabkin CS, Engels ЕА. Neutrophil-to-lymphocyte ratio and mortality in the United States general population. Sci Rep.2021 Jan 11;11(1):464. doi: 10.1038/s41598-020-79431-7; Huang Z, Fu Z, Huang W, Huang K. Prognostic value of neutrophil-to-lymphocyte ratio in sepsis: A metaanalysis. Am J Emerg Med. 2020 Mar;38(3):641-647. doi: 10.1016/j.ajem.2019.10.023; Buonacera A, Stancanelli B, Colaci M, Malatino L. Neutrophil to Lymphocyte Ratio: An Emerging Marker of the Relationships between the Immune System and Diseases. Int J Mol Sci. 2022 Mar 26;23(7):3636. doi: 10.3390/ijms23073636]. Количественные значения ОНЛ рассчитываются на основании общего анализа крови путем деления абсолютного количества нейтрофилов на абсолютное количество лимфоцитов в одной единице объема. Это соотношение является легкодоступным гематологическим биомаркером, удобным для применения в клинической практике. ОНЛ отражает баланс между ответом системы врожденного иммунитета (нейтрофилы) и реакциями адаптивного иммунитета (лимфоциты) [Song М, Graubard BI, Rabkin CS, Engels EA. Neutrophil-to-lymphocyte ratio and mortality in the United States general population. Sci Rep.2021 Jan 11; 11(1):464. doi: 10.1038/s41598-020-79431-7].

Помимо клеточных маркеров, источником прогностических биомаркеров при пневмонии является генетическая вариабельность пациентов. Показано, что однонуклеотидный полиморфизм генов цитокинов - IL10, IL6, TNF, патогенетически значимых для развития сепсиса, ассоциируется с сепсисом, нередко возникающим на фоне тяжелой пневмонии [Feng В, Мао ZR, Pang К, Zhang SL, Li L. Association of tumor necrosis factor a -308G/A and interleukin-6 -174G/C gene polymorphism with pneumonia-induced sepsis. J Crit Care. 2015 Oct; 30(5):920-3. doi: 10.1016/j.jcrc.2015.04.123; Mao ZR, Zhang SL, Feng B. Association of IL-10 (-819T/C, -592A/C and -1082A/G) and IL-6 -174G/C gene polymorphism and the risk of pneumonia-induced sepsis. Biomarkers. 2017 Mar; 22(2): 106-112. doi: 10.1080/1354750X.2016.1210677; Hugo Montes A, Valle-Garay E, Martin G, Collazos J, Alvarez V, Meana A, Pérez-Is L, Carton JA, Taboada F, Asensi V. The TNF-α (-238 G/A) polymorphism could protect against development of severe sepsis. Innate Immun. 2021 Jul; 27(5):409-420. doi: 10.1177/17534259211036186]. При этом факторы коморбидности (сопутствующие заболевания) могут существенно ограничивать прогностическую информативность генетически полиморфных маркеров при инфекционных осложнениях критических состояний [Чумаченко А.Г., Григорьев Е.К., Писарев В.М. Вклад полиморфизма промоторной области гена AGTR1 в течение и исход сепсиса у пациентов с различной коморбидностью. Общая реаниматология. 2021;17(5):35-51. https://doi.org/10.15360/1813-9779-2021-5-35-51; Чумаченко А.Г., Григорьев Е.К., Черпаков Р.А., Тюрин И.Н., Писарев В.М. Зависимость течения и исхода сепсиса от генетического варианта 3-области гена аквапорина 4 (AQP4) и коморбидности. Общая реаниматология. 2023;19(5):4-12. https://doi.org/10.15360/1813-9779-2023-5-2291]. Комбинации различных маркеров для прогноза течения пневмонии у пациентов в ХКС не исследовали.

В то же время известен ряд прогностических биомаркеров, рекомендованных для прогноза неблагоприятного исхода пневмонии. К ним, в частности, относится способ прогнозирования летального исхода у больных внебольничной пневмонией путем выявления и оценки гематологических, биохимических и клинических показателей, заключающийся в том, что проводят исследование иммунного статуса пациента, выявляют органоспецифические компоненты легочной ткани; для оценки риска летальности учитывают показатели: IgM [мг/мл], IgG [мг/мл], ЦИК ед., ААТ к БМ LuM 01-230 [% от индивидуальной иммунореактивности], ААТ к ЦБ LuS 06-300 [% от индивидуальной иммунореактивности], ААТ к ЦБ LuS 06-80 [% от индивидуальной иммунореактивности], эритроцитов [106/мкл], лейкоцитов [109/мкл], палочкоядерных нейтрофилов [%], лимфоцитов [%], моноцитов [%], глюкозы [ммоль/л], ACT [ед./л], частоты дыхательных движений [движений/мин], кашля [ранги], затем находят по формуле значение функции летальности: при этом, если функция оказалась больше нуля, то делают прогноз летального исхода, если меньше нуля - прогноз реконвалесценции (RU 2472155). Известный способ относится к прогнозированию исхода внебольничной пневмонии у пациентов, не находящихся в ХКС, в отличие от заявляемого способа, который прогнозирует исход среди специфической категории пациентов - пациентов с нозокомиальной (внутрибольничной) пневмонией, развившейся на фоне ХКС вследствие мозговых катастроф.

Известен также способ прогнозирования рисков развития осложнений пневмонии, включающий исследование мазков периферической крови, окрашенных толуидиновым синим при рН 5,0, в поляризационном поле, определение площади анизотропного материала в ядре нейтрофильных лейкоцитов, вычисление среднего цитохимического коэффициента (СЦК) и определение показателя активности нейтрофилов (ПАН) по формуле ПАН=3-СЦК, и при значении ПАН от 2,25 и более прогнозируют низкий риск развития возможных осложнений, при значении ПАН 2,24- 1,5 - средний риск развития осложнений, при значении ПАН 1,4-0,75 - высокий риск развития осложнений, при значении ПАН 0,74-0 - крайне высокий риск развития осложнений (RU 2637169). Однако информативность таких маркеров для раннего выявления пациентов с высоким риском летального исхода среди пациентов в ХКС вследствие мозговых катастроф, в отличие от заявляемого метода, неизвестна.

Известен способ прогноза исхода пневмонии, возникшей после геморрагического инсульта (Biomarker, kit and diagnostic equipment for predicting stroke-related pneumonia CN117031044). Известный способ относится к области техники биологического обнаружения, в частности к биомаркеру, набору и диагностическому оборудованию для прогнозирования пневмонии, связанной с инсультом. Данный способ обеспечивает применение вещества для обнаружения белка PD-L1 при получении продукта для прогнозирования пневмонии, связанной с инсультом. Вещество для выявления белка PD-L1 представляет собой реагент для определения содержания белка PD-L1 в экзосомах периферической крови, полученных из ГМ. Однако, информативность данного способа для когорты пациентов, в ХКС с нозокомиальной пневмонией, остается неясной, в отличие от заявляемого способа, который позволяет прогнозировать исход ХКС, осложненных нозокомиальной пневмонией.

Известен способ применения комбинации молекулярных маркеров для прогноза течения пневмонии (CN109001457). Изобретение относится к области иммунодиагностики, в частности к применению комбинации молекулярных маркеров для прогноза течения пневмонии. Комбинация молекулярных маркеров включает прокальцитонин (ПКТ) и С-реактивный белок (СРБ). Содержание ПКТ и СРБ у больных инфекционными пневмониями пожилого возраста на разных стадиях течения заболевания имеет различия, при этом значение AUC для ПКТ составляет 0,868, а значение AUC для СРБ составляет 0,790. В соответствии с данным способом, обнаружение комбинации молекулярных маркеров полезно для вспомогательной диагностики, определения стадии заболевания, выбора лечения с помощью антибиотиков, выявления лечебного эффекта и прогноза исхода. Однако, известный способ относится как к внебольничной, так и к нозокомиальной пневмонии у пациентов, не находящихся в ХКС, что может снижать точность прогноза неблагоприятного исхода пациентов в ХКС. В отличие от данного способа, заявляемый способ позволяет прогнозировать исход нозокомиальной пневмонии у пациентов, находящихся в ХКС вследствие последствия тяжелых повреждений ГМ.

В изученной авторами заявляемого способа научно-медицинской и доступной патентной литературе не обнаружено способа прогнозирования исхода для пациентов в ХКС вследствие мозговых катастроф, осложненных пневмонией.

Раскрытие сущности изобретения.

Заявляемый авторами способ прогноза исхода пневмонии у пациентов в ХКС основан на использовании комбинации двух биомаркеров: клеточного маркера ОНЛ, и молекулярного маркера - однонуклеотидного полиморфизма гена AQP4, кодирующего патогенетически значимые для течения пневмонии молекулы аквапорина.

AQP4 - это белок, который образует водные каналы в мембране клетки, экспрессирующийся в различных тканях организма, включая мозг, почки, легкие и иммунную систему. Экспрессия AQP4 способствует образованию отека мозга, миграции иммунных клеток, поддержанию гематоэнцефалического барьера и миграции Т-лимфоцитов. Генетические варианты AQP4 rs1058427 могут быть прогностическими кандидатными биомаркерами, ассоциированными с исходом, в частности, после черепно-мозговой травмы или при отеке мозга у пациентов с геморрагическим инсультом.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что на основании определения генотипа AQP4 rs1058427 и определения отношения содержания нейтрофилов и лимфоцитов (величины ОНЛ в одной единице объема) для пациентов в ХКС с последствиями тяжелого повреждения ГМ, осложненных пневмонией, становится возможным в первый день госпитализации выявлять пациентов с высоким риском неблагоприятного исхода.

Особенности генома пациентов, а именно - однонуклеотидный полиморфизм AQP4 rs1058427 в сочетании с значением относительного показателя содержания клеток иммунной системы ОНЛ являются высокоинформативным биомаркером риска развития летального исхода для пациентов в ХКС вследствие мозговых катастроф, осложненных пневмонией.

Высокая точность прогнозирования исхода достигается за счет использования сочетания двух комплементарных биомаркеров - а) наличия аллеля гена AQP4, контролирующего миграцию клеток, и б) определения величины ОНЛ в одной единице объема в крови данного пациента. При выявлении у пациента варианта мажорного генотипа AQP4 rs1058427 GG и величины ОНЛ выше 4 прогнозируют высокий риск неблагоприятного исхода пневмонии.

Авторами заявляемого способа проведено в клинических условиях обследование 192-х пациентов в ХКС вследствие мозговых катастроф, осложненных пневмонией. Осуществляли генотипирование всех пациентов по вариантам однонуклеотидной замены AQP4 rs1058427 и рассчитывали величину ОНЛ в первый день госпитализации. Приводимые статистически обработанные результаты исследований подтвердили прогностическую значимость сочетания двух маркеров, AQP4 rs1058427 и ОНЛ в день госпитализации.

В группе пациентов всех генотипов, поступивших с пневмонией, была обнаружена тенденция увеличенной летальности для пациентов с ОНЛ выше 4 в день поступления (Р=0,096, логранговый критерий, n=192, таблица 1). Однако при дальнейшем анализе было обнаружено, что данная тенденция существует только за счет подгруппы пациентов генотипа AQP4 rs1058427 GG (Р=0,026, логранговый критерий, HR=2,9, 95% CI: 1,3-6.6, n=149), в которой эта связь была значимой (таблица 1). В подгруппе носителей минорной аллели Т (пациенты с генотипами AQP4 rs1058427 GT или TT) даже тенденция к увеличению летальности при повышенном значении ОНЛ отсутствовала (Р=0,65, логранговый критерий, n=43 (таблица 1).

Статистически обработанные результаты исследований подтверждают прогностическую значимость указанного бинарного маркера. Наличие бинарного маркера - мажорного генотипа AQP4 rs 105 8427 GG и ОНЛ выше 4 - указывает на высокий риск неблагоприятного исхода пациентов в ХКС, госпитализированных с осложнением -пневмонией (таблица 2).

Примечание. Х²=5,233.

Предложенный авторами заявляемого способа бинарный маркер прогноза исхода неинформативен для пациентов в ХКС, поступивших в лечебное учреждение без пневмонии (таблица 2).

Заявляемый способ позволяет прогнозировать исход ХКС с высокой информативностью благодаря выделению группы генетически предрасположенных пациентов, находящихся в ХКС после тяжелых повреждений ГМ, осложненных пневмонией.

Способ осуществляют следующим образом.

Способ прогнозирования неблагоприятного исхода ХКС, осложненных пневмонией, включает: (а) забор венозной крови при поступлении в лечебное учреждение, (б) определение значения ОНЛ на основании общего анализа крови путем деления абсолютного количества нейтрофилов на абсолютное количество лимфоцитов в одной единице объема и (в) определение генотипов AQP4 rs1058427.

Для выделения геномной ДНК используют 200 мкл цельной крови, аллельные варианты AQP4 rs1058427 определяют с помощью тетрапраймерной полимеразной цепной реакции (или любого другого метода ДНК-генготипирования, известного специалистам в данной области, включая использование флуоресцентных праймеров или чипов, а также секвенирование или иные методы) с последующим электрофоретическим разделением и идентификацией окрашенных продуктов в геле. Для полимеразной цепной реакции используют следующие праймеры:

Клинические примеры.

Пример 1. Пациент, В., 64 года, проходил лечение с основным диагнозом последствия ишемического инсульта (поступил в лечебное учреждение с пневмонией, через 34 дня после случая). Величина ОНЛ в день госпитализации составила 6,2. У пациента был определен генотип AQP4 rs1058427 GG. У пациента развился септический шок и через 30 дней госпитализации наступил летальный исход.

Пример 2. Пациентка, Ф., 69 года, проходила лечение с основным диагнозом последствия геморрагического инсульта (поступила в лечебное учреждение с пневмонией, через 103 дня после случая). Величина ОНЛ в день госпитализации составила 2,3. У пациентки был определен генотип AQP4 rs1058427 GG. Через 60 суток выписана с оценкой по шкале SOFA 2.

Пример 3 Пациентка, Л., 66 лет, проходила лечение с основным диагнозом последствия ишемического инсульта (поступила в лечебное учреждение с пневмонией, развившейся до поступления через 27 дней после случая). Величина ОНЛ в день госпитализации составила 4,5. У пациентки был определен генотип AQP4 rsl058427 GT. Через 67 дней выписана с оценкой по шкале SOFA 0.

Пример 4 Пациентка, Н., 76 лет, проходила лечение с основным диагнозом последствия геморрагического инсульта, (поступила в лечебное учреждение с пневмонией, через 36 дней после случая). Величина ОНЛ в день госпитализации составила 10,1. У пациентки был определен генотип AQP4 rs1058427 ТТ. Через 69 суток выписана с оценкой по шкале SOFA 2.

Таким образом, на основании определения генотипа AQP4 rs1058427 и величины ОНЛ для пациентов в ХКС вследствие мозговых катастроф, осложненных пневмонией, становится возможным еще в первый день госпитализации выявлять пациентов с высоким риском летального исхода. Такие сведения могут быть полезны при назначении врачом персонифицированного лечения, включая использования высокотехнологических методов.

Изобретение относится к медицине, а именно к реаниматологии и реабилитологии, и может быть использовано для прогнозирования риска неблагоприятного исхода при хроническом критическом состоянии, осложненном пневмонией. Определяют величину отношения количества нейтрофилов к количеству лимфоцитов (ОНЛ) в единице объема. Из периферической венозной крови выделяют ДНК. Определяют вариант гена AQP4 rs1058427. При выявлении генотипа GG rs1058427 и величины ОНЛ выше 4 прогнозируют высокий риск неблагоприятного исхода у пациента. Способ обеспечивает возможность прогнозирования риска неблагоприятного исхода при хроническом критическом состоянии, в том числе вследствие мозговых катастроф, осложненном пневмонией, за счет определения клеточного маркера ОНЛ и молекулярного маркера - варианта гена AQP4 rs1058427. 2 табл., 4 пр.

Способ прогнозирования риска неблагоприятного исхода при хроническом критическом состоянии, осложненном пневмонией, включающий определение величины отношения количества нейтрофилов к количеству лимфоцитов (ОНЛ) в единице объема, выделение ДНК из периферической венозной крови, отличающийся тем, что определяют вариант гена AQP4 rs1058427, при выявлении у пациента варианта мажорного генотипа AQP4 rs1058427 GG и величины ОНЛ выше 4 прогнозируют высокий риск неблагоприятного исхода.