СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ САПОНИНОВ В ПОБЕГАХ БОЯРЫШНИКА ПЕНСИЛЬВАНСКОГО Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/15 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, его использование возможно при анализе количественного содержания сапонинов в побегах боярышника пенсильванского (Crataegus pennsylvanica Ashe) в химических лабораториях, либо в центрах контроля качества лекарств.

На данный момент интерес к препаратам растительного происхождения продолжает расти. Вместе с этим растет и количество используемых в медицине видов растений. Для их стандартизации нужны новые методики качественного и количественного определения [Саканян Е.И., Ковалева Е.Л., Фролова Л.Н., Шелестова В.В. Современные требования к качеству лекарственных средств растительного происхождения // Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2018. №3]. На международном фармацевтическом рынке каждый третий препарат, применяемый в медицине, имеет растительное происхождение, а из средств, используемых для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, 80% составляют препараты растительного происхождения [Химический анализ лекарственных растений: Учеб. пособие для фармацевтических вузов / Ладыгина Е.Я., Сафронич Л.Н., Отряшенкова В.Э. и др. Под ред. Гринкевич Н.И., Сафронич Л.Н. - М.; Высш, школа, 1983. - 176 с].

Боярышник пенсильванский, Crataegus pennsylvanica Ashe - дерево из семейства розоцветные - Rosaceae [Электронный ресурс: http://flower.onego.ru/]. Растения данного рода широко применяются в медицине для профилактики и лечения заболеваний сердечно - сосудистой системы. У боярышников разнообразный химический состав биологически активных веществ [Сулейманова С.В., Абакаров М.Г., Ханахмедова К.Ш., Маллаева P.M. Фармакологические и фармакотерапевтические свойства боярышника (Crataegus oxyacantha) - Успехи современной науки и образования - 2017, Т. 4, №3, С. 28-33]. Одной из малоизученных групп БАВ в составе рода Crataegus являются сапонины, которые обладают широким терапевтическим действием. Они обладают такими фармакологическими свойствами, как кардиотонический, нейротропный, гипотензивный, адаптогенный, гипохолестеринемический, антиатеросклеротический, диуретический, седативный, противовоспалительный, антибактериальный, противоязвенный и антиканцерогенный [Шавва А.Г., Антимонова О.И., Морозкина С.Н. Некоторые биологические свойства урсоловой кислоты // Росс, биотерап.журнал. - 2008. -N 2. -С.65-68, Hostettmarm К., Marston A. Saponins. - Cambridge: Cambridge University Press, 1995. - ISBN 0-521-32970-1.]. Для дальнейшей оценки количественного содержания данной группы БАВ в изучаемом растении необходимо разработать методику, так как на данный момент отсутствуют единые способы определения количественного содержания сапонинов в лекарственном растительном сырье [Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Москва, 2018 г].

Согласно литературным данным, количественное определение сапонинов чаще всего проводят в пересчете на превалирующие сапонины, такие как, например, олеаноловая кислота, урсоловая кислота, эсцин [Эль Мабруки Хаким, Каухова И.Е., Сорокин В.В., Минина С.А. Разработка методики количественного определения сапонинов в траве грыжника голого herniaria glabra L // Актуальные проблемы медицины. 2014. №24 (195); Мироненко, Н. В. УФ-спектрофотометрическое определение тритерпеновых сапонинов - производных олеаноловой кислоты / Н.В.Мироненко, Т.А. Брежнева, В.Ф. Селеменев // Химия растительного сырья. - 2011. - №3. - С. 153-157; Латыпова Г.М., Бубенчикова В.Н., Катаев В.А. Содержание урсоловой кислоты в растениях рода первоцвет // Фармация. 2015. №4 (21); Патент BY 12568, 2009; Патент RU 2790821 С1, 2023]. Во всех данных исследованиях используется спектрофотометрический метод.

За прототип изобретения взята методика количественного определения сапонинов в пересчете на олеаноловую кислоту в корнеплодах сахарной свеклы [Мироненко, Н.В. УФ-спектрофотометрическое определение тритерпеновых сапонинов -производных олеаноловой кислоты / Н.В.Мироненко, Т.А. Брежнева, В.Ф. Селеменев // Химия растительного сырья. - 2011. - №3. - С. 153-157]. Данный способ включает в себя экстракцию измельченного сырья смесью этанол-ацетон 1:4 с последующим переосаждением в десятикратном по отношению к объему полученного извлечения объеме воды, подкисленной хлористоводородной кислотой до рН=1,0. Осадок сапонинов отфильтровывали, подсушивали, растворяли в смеси аммиачный буфер-вода 1:1 и измеряли оптическую плотность при λ=210 нм. Концентрацию суммы сапонинов в пересчете на олеаноловую кислоту определяли по формуле:

,

где А - оптическая плотность исследуемого раствора, А₀ - оптическая плотность раствора стандартного образца олеаноловой кислоты, m - масса навески сырья (г), m₀ - масса навески стандартного образца олеаноловой кислоты в спектрофотометрируемой пробе (г), W - потеря в массе при высушивании (%).

Недостатком данной методики является то, что не был осуществлен подбор оптимальных условий экстракции, использовался пересчет на другой сапонин, что приводит к высокой погрешности при определении в анализируемом сырье суммы сапонинов в пересчете на вещества, специфические для побегов боярышника пенсильванского.

Задачей изобретения стала разработка способа количественного определения сапонинов в побегах боярышника пенсильванского С.pennsylvanica, а объектом исследования стали побеги С.pennsylvanica, собранные в период цветения в 2021-2023 году в ботаническом саду - институте Уфимского научного центра Российской Академии Наук. Сырье сушили воздушно-теневым методом и хранили в сухом проветриваемом помещении при комнатной температуре.

Техническим результатом при использовании изобретения является повышение точности определения.

Предлагаемый способ количественного определения сапонинов в побегах боярышника пенсильванского С.pennsylvanica осуществляется следующим образом. Сначала получают извлечение из растительного сырья путем однократной экстракции 0,1 г точной навески измельченного до размера частиц 2,0 мм растительного сырья смесью 70% спирт этиловый - ацетон 1:3, в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:100, нагревая на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 минут. Затем проводят переосаждение в десятикратном по отношению к объему полученного извлечения объеме воды, подкисленной хлористоводородной кислотой до рН=1,0 и растворение осадка в смеси аммиачный буфер: вода 1:1, разбавление 25 мл полученного раствора в мерной колбе на 50 и доведение до метки смесью аммиачный буфер: вода 1:1. Измерение проводят методом прямой спектрофотомерии при длине волны 214 нм, концентрацию сапонинов в перерасчете на урсоловую кислоту вычисляют по формуле:

,

где:

X - концентрация сапонинов в перерасчете на урсоловую кислоту, %;

А - оптическая плотность анализируемого раствора;

211 - удельный показатель поглощения урсоловой кислоты в смеси 70% этиловый спирт: ацетон 1:3;

m - навеска сырья в граммах;

W - потеря в массе сырья при высушивании, %.

При изучении УФ-спектральных характеристик водно-аммиачных извлечений из побегов С.pennsylvanica выявлено, что именно урсоловая кислота определяет характер кривой поглощения водно-аммиачного извлечения из побегов С.pennsylvanica (фигура 1). Изучение УФ-спектров извлечений из побегов С.pennsylvanica показало, что максимум поглощения сапонинов 214 нм. Раствор стандартного образца урсоловой кислоты так же имеет максимум поглощения при 214 нм. Максимумы поглощения исследуемого извлечения из побегов С.pennsylvanica и раствора стандартного образца урсоловой кислоты совпадают, что делает целесообразным проведение пересчета суммы сапонинов на урсоловую кислоту при использовании метода прямой спектрофотомерии. Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы сапонинов в побегах С.pennsylvanica при длине волны, равной 214 нм.

Одним из важнейших этапов разработки способа количественного определения является выбор условий экстракции. Сюда относится выбор экстрагента, его концентрации, измельченности сырья, времени и количества экстракции, соотношения сырья и экстрагента.

Согласно прототипу [Мироненко, Н.В. УФ-спектрофотометрическое определение тритерпеновых сапонинов - производных олеаноловой кислоты / Н.В.Мироненко, Т.А. Брежнева, В.Ф. Селеменев // Химия растительного сырья. - 2011. - №3. - С. 153-157], экстрагентом является смесь 70% этилового спирта с ацетоном. Проведен подбор оптимального соотношения компонентов экстрагента, результаты которого представлены на фигуре 2. Наибольшая оптическая плотность была при использовании экстрагента: 70% этиловый спирт: ацетон - в соотношении 1:3 (фигура 2).

Извлечение веществ из сырья зависит от измельченности сырья. Чем мельче размеры частиц, тем больше поверхности соприкосновения и тем быстрее происходит процесс, но при этом могут выделяться сопутствующие вещества, которые образуют студенистую массу и замедляют выход действующих компонентов.

Для определения оптимального размера частиц использовали сырье, которое проходит через сито с размерами отверстии 1, 2, 3, 4, 5 мм и определяли оптическую плотность в полученных извлечениях. По результатам, представленным в таблице 1, оптимальным является размер частиц сырья, проходящих через сито с отверстиями диаметром 2 мм.

Переход биологически активных веществ происходит по закону диффузии: из раствора с более высокой концентрацией в раствор с меньшей концентрацией. Был проведен подбор времени экстракции и кратности. От этих двух параметров зависит общее время анализа. Согласно данным таблиц 2-3 минимальное время, при котором осуществляется максимальный выход сапонинов, равно 45 минутам и достаточно однократной экстракции (таблицы 2 и 3).

Далее определяли количество сырья и экстрагента в соотношениях 1:50, 1:100, 1:150. По результатам анализа (таблица 4) наилучшее извлечение сапонинов происходит в соотношении 1:100.

Таким образом, на основании всех проведенных исследований разработан способ количественного определения сапонинов в побегах С.pennsylvanica в пересчете на урсоловую кислоту и абсолютно сухое сырье:

Сначала получают извлечение из побегов С.pennsylvanica путем однократной экстракции 0,1 г точной навески измельченного до размера частиц 2,0 мм растительного сырья смесью 70% спирт этиловый - ацетон 1:3 в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:100, нагревая на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 минут. Затем проводят переосаждение в десятикратном по отношению к объему полученного извлечения объеме воды, подкисленной хлористоводородной кислотой до рН=1,0 и растворение осадка в смеси аммиачный буфер: вода 1:1, разбавление 25 мл полученного раствора в мерной колбе на 50 и доведение до метки смесью аммиачный буфер: вода 1:1. Измерение проводят методом прямой спектрофотомерии при длине волны 214 нм. Содержание суммы сапонинов (X) в пересчете на урсоловую кислоту (в %) вычисляют по формуле:

,

где:

А - оптическая плотность анализируемого раствора;

211 - удельный показатель поглощения урсоловой кислоты в смеси 70% этиловый спирт: ацетон (1:3);

m - навеска сырья в граммах;

W - потеря в массе сырья при высушивании, %.

Пример.

Аналитическую пробу сырья побегов боярышника пенсильванского С.pennsylvanica (заготовлено в Ботаническом саду, г. Уфа 2023 г.) измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2,0 мм. В колбу объемом 50 мл вносят 0,1014 г сырья, добавляют 10 мл смеси 70% этилового спирта с ацетоном в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:100 и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 минут. Экстракт фильтруют в колбу на 150 мл и добавляют к нему 100 мл воды, подкисленной хлористоводородной кислотой до рН=1. Полученный раствор фильтруют и к осадку добавляют 25 мл смеси аммиачный буфер: вода 1:1. Потом 25 мл полученного раствора переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят смесью аммиачный буфер: вода 1:1 до метки. Измерение оптической плотности проводят на спектрофотометре при длине волны 214 нм с использованием стеклянной кюветы 10 мм. В качестве раствора сравнения используется смесь аммиачного буфера с водой в соотношении 1:1.

Содержание суммы сапонинов (X, %) в пересчете на урсоловую кислоту вычисляют по формуле:

,

0,535 - оптическая плотность анализируемого раствора;

211 - удельный показатель поглощения урсоловой кислоты в смеси 70% этиловый спирт: ацетон (1:3);

0,1014 - навеска сырья в граммах;

7,7 - потеря в массе сырья при высушивании, %.

Содержание суммы сапонинов в пересчете на урсоловую кислоту составило 1,3546%.

Было исследовано 5 серий опытов (таблица 5), в каждой серии по 5 навесок сырья, и содержание сапонинов в различных сериях составило от 1,359±0,0341% до 14,170±0,0229%.

Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила от 1,41% до 3,36% (таблица 6).

Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы сапонинов в пересчете на урсоловую кислоту в побегах боярышника пенсильванского с использованием спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:

1. Разработанный способ является специфичным и селективным, а также позволяет проводить экстракцию сырья однократно смесью: 70% этиловый спирт: ацетон (1:3), позволяющим исчерпывающе извлекать сапонины.

2. Пересчет суммы сапонинов идет на специфическое соединение для побегов боярышника пенсильванского - урсоловую кислоту, определяющую характер кривой поглощения в УФ-спектре испытуемого раствора (длина волны 214 нм).

3. Ошибка опыта в серии исследований составила от 1,41% до 3,36%), что свидетельствует об объективности разработанного способа.

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу количественного определения суммы сапонинов в побегах боярышника пенсильванского. Способ количественного определения суммы сапонинов в побегах боярышника пенсильванского включает однократную экстракцию измельченного до размера частиц 2,0 мм растительного сырья смесью 70% спирта этилового с ацетоном в соотношении 1:3 при соотношении навески сырья и объема экстрагента 1:100 на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 минут, взаимодействие с подкисленной водой до pH 1, фильтрацию осадка сапонинов, подсушивание, растворение в смеси аммиачный буфер-вода 1:1, измерение оптической плотности при длине волны 214 нм и расчет содержания суммы сапонинов. Вышеописанный способ обладает высокой точностью определения сапонинов в побегах боярышника пенсильванского. 2 ил., 6 табл., 1 пр.

Способ количественного определения суммы сапонинов в побегах боярышника пенсильванского, включающий однократную экстракцию измельченного растительного сырья смесью 70% спирта этилового с ацетоном, взаимодействие с подкисленной водой до pH 1, фильтрацию осадка сапонинов, подсушивание, растворение в смеси аммиачный буфер-вода 1:1, измерение оптической плотности и расчет содержания суммы сапонинов, отличающийся тем, что проводят экстракцию измельченных до размера частиц 2,0 мм побегов боярышника пенсильванского при соотношении навески сырья и объема экстрагента 1:100 смесью 70% спирта этилового с ацетоном в соотношении 1:3 на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 минут, оптическую плотность полученного раствора измеряют при длине волны 214 нм, содержание суммы сапонинов в побегах боярышника пенсильванского рассчитывают в пересчете на урсоловую кислоту по формуле

,

где Х - концентрация сапонинов в перерасчете на урсоловую кислоту, %;

A - оптическая плотность анализируемого раствора;

211 - удельный показатель поглощения урсоловой кислоты в смеси 70% этиловый спирт:ацетон 1:3;

m - навеска сырья в граммах;

W - потеря в массе сырья при высушивании, %.