СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ГИПОТЕНЗИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2002 года по МПК A61K35/78 A61P9/02 

Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства из растительного сырья, обладающего гипотензивной активностью.

Поиск и разработка новых лекарственных средств, предназначенных для лечения и профилактики гипертонической болезни, обусловлены широким распространением, тяжестью патогенеза данного заболевания. В настоящее время доказана эффективность применения лекарственных препаратов из растительного сырья для лечения гипертонической болезни, при этом фитопрепараты не оказывают побочного действия и безвредны при длительном применении.

В этой связи нами разработан способ получения сухого экстракта из сбора пяти видов лекарственного растительного сырья, включающего в себя: траву сушеницы топяной - 20%, плоды боярышника - 30%, корневища и корни шлемника байкальского - 30%, траву горца птичьего - 10%, плоды шиповника - 10%.

Известен способ получения настоя из сбора, содержащего корневища и корни валерианы лекарственной - 20%, цветки ромашки аптечной - 30%, плоды тмина обыкновенного - 50%. Сбор применяется как гипотензивное средство. Для приготовления настоя сбор заливают водой в соотношении 1:10, настаивают на кипящей водяной бане при частом перемешивании в течение 30 мин, охлаждают при комнатной температуре 10 мин, процеживают (отжимая растительное сырье) и прибавляют воду до требуемого объема [Государственная Фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье /МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989. - 400 с.].

Недостатком данного способа является менее выраженная гипотензивная активность получаемого средства по сравнению со средством, получаемым по заявляемому способу.

Задачей изобретения является повышение гипотензивной активности средства с более высоким содержанием действующих веществ (сумма флавоноидов).

Для решения указанной задачи растительный материал - траву сушеницы топяной - 20%, плоды боярышника - 30%, корневища и корни шлемника байкальского - 30%, траву горца птичьего - 10%, плоды шиповника - 10% экстрагируют 60% этиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент, равном 1:12 с учетом коэффициента водопоглощения, при температуре 60^oС и постоянном перемешивании. Процесс повторяют трижды. Время экстракции при первом, втором, третьем контактах фаз - 60 мин. Извлечения фильтруют через серошинельное сукно, упаривают до 1/5 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до вязкообразного состояния, высушивают в вакуумной сушилке и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Выход готового продукта составляет 27,0±0,5% от массы растительного сырья.

Предложенный способ позволяет получить конечный продукт, представляющий собой аморфный порошок темно-коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вкусом, с содержанием влаги не более 6%.

На основании качественного фитохимического анализа в полученном сухом экстракте установлено наличие:
1. Флавоноидов
1.1. 0,1 г экстракта растворяют в 50 мл 50% этилового спирта. К 5 мл полученного раствора прибавляют 3 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида; появляется желто-зеленое окрашивание (флавоноиды).

1.2. Двумерной восходящей хроматографией на бумаге марки FN-12 в системах растворителей:
А. н-Бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:2)
Б. 15% уксусная кислота.

При просмотре хроматограммы в УФ-свете до и после проявления 5% спиртовым раствором алюминия хлорида обнаружены:
байкалин - R_f = 0,34 (А), 0,34 (Б);
кверцетин - R_f = 0,70 (А), 0,04 (Б);
гиперозид - R_f = 0,61 (А), 0,36 (Б);
лютеолин - R_f = 0,48 (А), 0,10 (Б).

Идентификацию проводили со стандартными образцами.

2. Фенолкарбоновых кислот
Двумерной восходящей хроматографией на бумаге марки FN-12 в системах растворителей:
А. н-Бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:2)
Б. 15% уксусная кислота
При просмотре хроматограммы в УФ-свете после обработки парами аммиака идентифицированы со стандартными образцами:
кофейная кислота - R_f = 0,80 (А), 0,42 (Б);
хлорогеновая кислота - R_f = 0,67 (А), 0,70 (Б).

3. Витаминов
3.1. Одномерной восходящей хроматографией на пластинке "Силуфол" в воде.

При просмотре хроматограммы в УФ-свете после проявления 5% раствором кислоты фосфорномолибденовой обнаружена кислота аскорбиновая, R_f = 0,89.

3.2. Одномерной восходящей хроматографией на пластинке "Силуфол" в системе растворителей:
Диэтиловый эфир - петролейный эфир (4:1).

При просмотре хроматограммы в УФ-свете после обработки 10% спиртовым раствором кислоты фосфорномолибденовой и парами аммиака идентифицирован со стандартным образцом α-токоферола витамин Е, R_f = 0,79.

4. Кумаринов
Восходящей хроматографией на пластинках "Силуфол" в системах растворителей:
А. Этиловый эфир уксусной кислоты - петролейный эфир (1:1)
Б. Бензол - этиловый эфир уксусной кислоты (1:1)
При просмотре хроматограммы в УФ-свете до и после проявления свежеприготовленным диазореактивом и 10% раствором натрия карбоната обнаружены:
скополетин - R_f = 0,20(А), 0,38(Б);
умбеллиферон - R_f = 0,40(А), 0,52(Б).

2. Количественное определение
Около 0,2 г (точная навеска) экстракта растворяют в мерной колбе вместимостью 50 мл в 30 мл 70% спирта этилового, доводят объем раствора 70% спиртом этиловым до метки и тщательно перемешивают (раствор А).

1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 15 мл 96% спирта этилового, 2 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора 96% спиртом этиловым до метки.

Через 30 мин измеряют оптическую плотность испытуемого раствора и раствора государственного стандартного образца рутина на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют следующий раствор: 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 каплю 1% уксусной кислоты и доводят объем раствора 96% спиртом этиловым до метки.

Содержание суммы флавоноидов в % (X) в пересчете на рутин и абсолютно-сухой препарат вычисляют по формуле:

где Д - оптическая плотность испытуемого раствора;
Д_о - оптическая плотность раствора государственного стандартного образца рутина;
м - навеска экстракта, г;
W - потеря в массе при высушивании, %.

Примечание. Приготовление раствора ГСО рутина: около 0,05 г (точная навеска) ГСО рутина, предварительно высушенного при температуре 130-135^oС в течение трех часов, растворяют в 85 мл 95% этилового спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают.

Найдено: 4,58±0,15
0,5 мл раствора А, приготовленного по методике 1, помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора 70% спиртом этиловым до метки (раствор Б).

Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 279 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют 70% спирт этиловый.

Параллельно в тех же условиях измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца байкалина по сравнению с 70% спиртом этиловым.

Содержание суммы флавоноидов в % (X) в пересчете на байкалин и абсолютно-сухой препарат вычисляют по формуле:

где Д - оптическая плотность испытуемого раствора;
Д_о - оптическая плотность раствора стандартного образца байкалина;
м - навеска экстракта, г;
W - потеря в массе при высушивании, %.

Примечание. Приготовление раствора ГСО байкалина: около 0,05 г (точная навеска) байкалина, предварительно высушенного при температуре 100-105^oС до постоянного веса, растворяют в 40 мл 70% этилового спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают.

Найдено: 17,12±0,16
Предложенный способ получения достаточно прост, не требует сложной схемы очистки, позволяет получать продукт постоянного состава. Технология может быть внедрена на предприятиях, выпускающих лекарственные препараты.

Для выявления оптимальных технологических режимов нами были изучены основные факторы, влияющие на процесс экстрагирования растительного сырья: природа экстрагента, его соотношение с сырьем, температурный режим, степень измельчения сырья, продолжительность и кратность экстракций.

Количественная оценка проводилась по выходу сумм флавоноидов и экстрактивных веществ [Государственная Фармакопея СССР: Вып.1. Общие методы анализа /МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1987. - 336 с.; Государственная Фармакопея СССР: Вып.2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье /МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989. - 400 с.] .

В качестве экстрагента был использован спирт этиловый различной концентрации (20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 96%).

Как видно из таблицы 1, 60% спирт является оптимальным экстрагентом, так как позволяет добиться максимального выхода суммы флавоноидов с учетом выхода экстрактивных веществ.

Выявление оптимальной степени измельчения сырья проводили отдельно для каждого вида сырья. Количественную оценку проводили по выходу экстрактивных веществ. На основании полученных данных (таблица 2) и с учетом того, что слишком малое измельчение растительного материала ведет к загрязнению извлечения труднофильтрируемыми высокомолекулярными соединениями, измельчение каждого вида сырья следует проводить отдельно до размера частиц: для травы сушеницы - не более 7 мм, плодов боярышника - не более 1 мм, корневищ и корней шлемника байкальского - не более 3 мм, травы горца птичьего - не более 1 мм, плодов шиповника - не более 1 мм.

В связи с тем, что в исходном растительном сырье содержатся термолабильные вещества (витамины), изучение влияния температуры на процесс экстракции проводили в интервале температур от 20 до 100^oС. Данные представлены в таблице 3, оптимальная температура - 60^oС.

При изучении влияния соотношения сырье - экстрагент на процесс экстракции установлено (таблица 4), что соотношение 1:10 является оптимальным.

Для определения продолжительности необходимого количества экстракций установлено время достижения равновесных концентраций экстрактивных веществ и флавоноидов в системе сырье-экстрагент в ходе трехкратной экстракции. Для этого проводили экстракцию измельченного сырья 60% этиловым спиртом в соотношении 1: 10 на водяной бане при 60^oС и постоянном перемешивании в колбе с обратным холодильником. Извлечения, полученные через определенные промежутки времени (10, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 мин) в процессе трех экстракций, анализировали на содержание экстрактивных веществ и флавоноидов. Установлено, что равновесные концентрации устанавливаются при 1-м, 2-м, 3-м контактах фаз через 60 мин (таблица 5).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1
200 г травы сушеницы топяной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 7 мм (сито 70 ГОСТ 214-83), 300 г плодов боярышника и 100 г плодов шиповника измельчают до размеров частиц диаметром 1 мм (сито 10 ГОСТ 214-83), 300 г корневищ и корней шлемника измельчают до размеров частиц диаметром 3 мм (сито 30 ГОСТ 214-83), 100 г травы горца птичьего измельчают до размеров частиц диаметром 5 мм (сито 50 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 12 л 60% этилового спирта в соотношении сырье-экстрагент, равном 1: 10 с учетом коэффициента водопоглощения сырья 1:2. Экстрагируют при температуре 60^oС и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Проводят еще две экстракции в течение 60 и 60 мин, подавая каждый раз в экстрактор 60% спирт в количестве, равном объему слитого извлечения, 1-ый слив - 9,1 л, 2-ой - 8,9 л, 3-ий слив - 8,0 л. Объединенные извлечения упаривают до 1/5 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до вязкообразного состояния, высушивают в вакуумной сушилке при температуре 60^oС в течение 5-6 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 270 г готового продукта, что составляет 27% от веса исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой аморфный порошок темно-коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вкусом; комкуется, содержание влаги - 1,93%.

Гипотензивную активность полученного продукта, условно названного "фитобазином", определяли на фоне экспериментальной питуитриновой гипертензии [Белоус А. А. Гипотензивное действие дибазола у кроликов с экспериментальной питуитриновой гипертонией //Фармакология и токсикология. - 1954. - 2. - С. 10] . Опыты проводили на 36 белых беспородных крысах с массой 180-200 г. Экспериментальную гипертензию вызывали введением питуитрина один раз в сутки в течение 15 дней, в дозе 5 ЕД/кг массы животного.

Испытуемый экстракт вводили в оптимально-терапевтической дозе 300 мг/кг питуитрина и далее в течение 21 суток. В качестве препарата сравнения использовали фитосбор, состоящий из корневищ и корней валерианы лекарственной, плодов тмина обыкновенного, цветков ромашки аптечной [Соколов С.Я., Замотаев И.П. Справочник по лекарственным растениям (фитотерапия). - М.: Недра, 1987. - 512 с.]. Фитопрепарат сравнения (ФПС) вводили в виде отвара 1:10 (5) в объеме и сроках, аналогичных испытуемому препарату. Животные контрольной группы получали дистиллированную воду в эквиобъемном количестве. Контроль уровня систолического артериального давления (САД) проводили через 1, 7, 14, 21 суток от начала введения исследуемых средств. Из полученных данных, представленных в таблице 6, следует, что испытуемый экстракт обладает выраженной гипотензивной активностью, снижая уровень систолического артериального давления при питуитриновой гипертензии на 31,8% и превосходит по активности фитопрепарат сравнения на 13,7%.

Пример 2
200 г травы сушеницы топяной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 7 мм (сито 70 ГОСТ 214-83), 300 г плодов боярышника и 100 г плодов шиповника измельчают до размеров частиц диаметром 1 мм (сито 10 ГОСТ 214-83), 300 г корневищ и корней шлемника измельчают до размеров частиц диаметром 3 мм (сито 30 ГОСТ 214-83), 100 г травы горца птичьего измельчают до размеров частиц диаметром 5 мм (сито 50 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 3 л 3% этилового спирта в соотношении сырье - экстрагент, равном 1:11 с учетом коэффициента водопоглощения сырья 1:2. Экстрагируют при температуре 60^oС и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Проводят еще две экстракции в течение 60 и 60 мин, подавая каждый раз в экстрактор 60% спирт в количестве, равном объему слитого извлечения. 1-ый слив - 9,25 л, 2-ой - 9,05 л, 3-ий слив - 8,95 л. Объединенные извлечения упаривают до 1/5 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до вязкообразного состояния, высушивают в вакуумной сушилке при температуре 60^oС в течение 5-6 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 263,1 г готового продукта, что составляет 26,31% от веса исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой аморфный порошок темно-коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вкусом; комкуется; содержание влаги - 1,91%.

Во второй серии экспериментов исследовали гипотензивную активность полученного продукта при экспериментальной вазоренальной гипертензии у белых крыс с исходной массой 220-250 г. Экспериментальную вазоренальную гипертензию вызывали с помощью наложения клипс-зажима на левую почечную артерию животных (модель 2К1С) [Iimura О., Ura N., Nakagawa M. Comparative hypertensionology-renal dopaminergic activity in experimental hypertensive rats. //Clin-Exp-Hypertens. - 1997. - V. 19, 1-2. - Р. 117-130]. Испытуемое средство "фитобазин" и препарат сравнения "ФПС" начинали вводить с 21-х суток после операции. Доза и схема введения аналогична вышеописанной. Из полученных данных, представленных в таблице 7, следует, что испытуемый экстракт обладает выраженной гипотензивной активностью, снижая уровень систолического артериального давления при экспериментальной вазоренальной гипертензии на 20,1%, и превосходит по активности фитопрепарат сравнения на 7%, а показатели систолического артериального давления на 28,2%.

Пример 3
200 г травы сушеницы топяной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 7 мм (сито 70 ГОСТ 214-83), 300 г плодов боярышника и 100 г плодов шиповника измельчают до размеров частиц диаметром 1 мм (сито 10 ГОСТ 214-83), 300 г корневищ и корней шлемника измельчают до размеров частиц диаметром 3 мм (сито 30 ГОСТ 214-83), 100 г травы горца птичьего измельчают до размеров частиц диаметром 5 мм (сито 50 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 14 л 65% этилового спирта в соотношении сырье - экстрагент, равном 1: 12 с учетом коэффициента водопоглощения сырья 1:2. Экстрагируют при температуре 60^oС и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Проводят еще две экстракции в течение 60 и 60 мин, подавая каждый раз в экстрактор 60% спирт в количестве, равном объему слитого извлечения. 1-ый слив - 9,2 л, 2-ой - 9,4 л, 3-ий слив - 8,95 л. Объединенные извлечения упаривают до 1/5 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до вязкообразного состояния, высушивают в вакуумной сушилке при температуре 60^oС в течение 5-6 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 256,2 г готового продукта, что составляет 25,62% от веса исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой аморфный порошок темно-коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вкусом; комкуется, содержание влаги - 2,04%.

Полученное гипотензивное растительное средство исследовалось при норадреналиновой гипертензии, вызванной ежедневным введением белым крысам норадреналина гидротартрата в течение 14 суток по схеме, предложенной В.И. Капелько и соавт. [Капелько В.И, Попович М.И. Метаболические и функциональные основы экспериментальных кардиомиопатий. - Кишинев, 1990. - 207 с.]. Изучаемое средство и препарат сравнения начинали вводить с первого дня введения норадреналина гидротартрата. Доза и схема аналогичны описанным выше. Результаты исследования гипотензивной активности изучаемого фитоэкстракта при экспериментальной норадреналиновой гипертензии представлены в таблице 8. Как следует из приведенных данных, исследуемое средство обладает выраженной гипотензивной активностью при экспериментальной норадреналиновой гипертензии и превосходит по своему фармакотерапевтическому эффекту препарат сравнения на 22%, а контрольную группу на 55,3%.

Предлагаемый способ по сравнению с базовым позволяет получить средство постоянного состава с более высокой гипотензивной активностью за счет более высокого содержания действующих веществ (флавоноидов).

Изобретение относится к области фармации. Растительный сбор: траву сушеницы топяной - 20%, измельчают до размера частиц не более 7 мм, плоды боярышника - 30%, измельчают до размера частиц не более 1 мм, корневища и корни шлемника байкальского - 30%, до размера частиц не более 3 мм, траву горца птичьего - 10% и плоды шиповника - 10%, до размера частиц не более 1 мм. Экстрагируют 60-65% этиловым спиртом в соотношении сырье : экстрагент 1: (10-12) три раза по 60 мин при 60^oС. Извлечения фильтруют, упаривают, очищают сепарированием, доупаривают, высушивают в вакуумной сушилке и измельчают. Изобретение позволяет повысить активность продукта. 8 табл.

Способ получения средства, обладающего гипотензивной активностью, путем экстрагирования растительного сырья, отличающийся тем, что сбор лекарственных растений, состоящий из травы сушеницы топяной (20%), измельченной до размера частиц не более 7 мм, плодов боярышника (30%), измельченных до размера частиц не более 1 мм, корневищ и корней шлемника байкальского (30%), измельченных до размера частиц не более 3 мм, травы горца птичьего (10%) и плодов шиповника (10%), измельченных до размера частиц не более 1 мм, экстрагируют 60-65% этиловым спиртом в соотношении сырье : экстрагент 1: (10-12) три раза по 60 мин при 60^oС и постоянном перемешивании, извлечения упаривают, очищают сепарированием, доупаривают, высушивают в вакуумной сушилке и измельчают.