СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ АСПИРИНОРЕЗИСТЕНТНОСТИ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/86 G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности - к кардиологии и лабораторной диагностике.

Первичная профилактика сердечно-сосудистых осложнений предполагает использование антиагрегантов. Существует несколько классов антиагрегантов, однако наибольшей доказательной базой в первичной профилактике сердечно-сосудистых заболеваний имеет аспирин - препарат ацетилсалициловой кислоты. Основой антиагрегантного действия аспирина, принимаемого в малых дозах (75 мг), является его способность необратимо ингибировать фермент циклооксигеназу-1, блокируя таким образом каскад превращения арахидоновой кислоты в простагландины и тромбоксан А2. Резкое снижение синтеза данных субстанций предотвращает реакцию агрегации тромбоцитов. Действие препарата развивается уже через 30-60 минут после приема.

Отсутствие стандартизации - общий недостаток всех методов определения аспиринорезистентности in vitro, поскольку результаты различаются в разных лабораториях в зависимости от аппаратуры и используемых реактивов и нормативов. Именно поэтому частота выявления аспиринорезистентности по данным агрегометрии колеблется у разных авторов в больших пределах - от 5 до 45% (Weber А.А. et al. Towards а definition of aspirin resistance: a typological approach // Platelets. 2002 Feb; 13 (1): 37-40).

Известен способ выявления аспиринорезистентности, разработанный на результатах, полученных в исследовании HOPE (Eikelboom J. et al. Aspirin-resistant thromboxane biosynthesis and the risk of myocardial infarction, stroke, or cardiovascular death in patients at high risk for cardiovascular events // Circulation 2002, 105: 1650-5). В основу способа легла идея о том, что непосредственной причиной аспиринорезистентности может быть продолжение синтеза тромбоксана А2 на фоне приема аспирина. Биохимически обоснованной альтернативой технически сложному способу непосредственного измерения концентраций тромбоксана А2 в плазме крови стал метод количественного анализа содержания в моче одного из его относительно стабильных метаболитов - 11-дегидротромбоксана В2 (11-ДТхВ2).

Недостатком метода является то, что на уровень тромбоксана А2 и его метаболита 11-дегидротромбоксана В2 оказывают влияние факторы, не связанные с аспирином - ожирение, курение, заболевание периферических сосудов. Этот метод не учитывает генетические факторы, влияющие на развитие аспиринорезистентности.

Известен способ выявления резистентности к антиагрегантам (ЕР 2525229 (A1), 21.11. 2012), основанный на определении времени полного тромбирования отверстия сепаратора при пропускании образца цельной крови через капиллярную трубку, обработанную активаторами свертывания крови. В образец крови предварительно вводят антиагрегант - клопидогрель или аспирин, а в качестве активаторов свертывания выступают АДФ, коллаген, арахидоновая кислота, эпинефрин.

Недостаток метода - не учитывается влияние свертывающих факторов крови, в частности нитей фибрина, которые всегда присутствуют в тромбе и обеспечивают формирование сгустка.

Описан способ выявления резистентности к аспирину, заключающийся в определении способности тромбоцитов к адгезии в образцах крови, обработанными антикоагулянтами - цитратом, гирудином или гепарином (DE 102008022189 (A1), 19.11.2009). Недостатком метода является то, что не обеспечивается полная оценка тромбогенного потенциала тромбоцитов, так как не учитывается влияние аспирина на агрегацию тромбоцитов.

Описан способ определения резистентности тромбоцитов к ацетилсалициловой кислоте (АСК) путем импедансного исследования агрегационной функции тромбоцитов in vitro (RU 2538219 C2, 10.01.2015) при котором исследуют агрегационную активность после инкубации образца биологического материала с АСК с использованием индуктора агрегации, причем агрегацию тромбоцитов индуцируют коллагеном в оптимальной концентрации 2 мг/мл и одновременно с измерением импеданса проводят определение динамики освобождения гранул тромбоцитов люминесцентным методом, где перед проведением агрегации пробы калибруются с помощью стандарта аденозинтрифосфата (АТФ), по полученным агрегатограммам определяют значения амплитуды агрегации в Омах и присваивают полученным значениям баллы.

Данный метод является комплексным и отражает разные механизмы, влияющие на агрегацию тромбоцитов и формирование аспиринорезистентности. Однако основным недостатком метода является отсутствие стандартизации. Импедансный метод - это регистрация электрического сигнала, сила которого зависит от числа заряженных частиц, в данном случае - тромбоцитов. Учитывая, что у разных людей в одном и том же объеме образца крови число тромбоцитов может варьировать в пределах нормальных значений, то электрический сигнал, полученный импедансным методом, также может варьировать.

Наиболее близким к патентуемому является способ диагностики аспиринорезистентности у больных ишемической болезнью сердца (RU 2348041 (C1), 27.02.2009 - прототип). До начала лечения аспирином в тромбоцитах периферической крови больных определяют активность реакций НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ (НАДФ-ГДГ, НАДФН-ГДГ, НАДН-ГДГ, НАД-ЛДГ). Затем рассчитывают коэффициент кофакторного обмена тромбоцитов (ККОТ) НАДН-зависимой реакции глутаматдегидрогеназы к уровню активности НАД-зависимой реакции лактатдегидрогеназы. И при значении ККОТ выше 0,3 диагностируют аспиринорезистентность, равном или меньше 0,3 - чувствительность к аспирину. Недостатком данного метода является то, что активность НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ отражает метаболизм тромбоцитов, но не адгезию или агрегацию. Полученные данные об активности данных ферментных систем являются не прямыми, а косвенными признаками.

Существуют данные, что резистентность к аспирину может формироваться при длительном приеме препарата даже у лиц, имевших удовлетворительные показатели при исследовании агрегометрическими методами. Такое явление получило название клинической аспиринорезистентности и достигает 10-20% у лиц, принимающих препарат. В данной заявке описан способ оценки аспиринорезистентности у лиц, принимающих препарат, который отражает реальное воздействие аспирина на организм in vivo. Генотипирование позволяет определить круг обследуемых лиц, а определение факторов воспаления - реальную степень воздействия аспирина на организм.

Задачей изобретения является прогнозирование аспиринорезистентности у больных артериальной гипертонией с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений, принимающих длительное время аспирин в дозе 75 мг в целях первичной профилактики.

Поставленная задача решается способом, заключающемся в том, что в крови пациента после 6 месяцев профилактического лечения аспирином в дозе 75 мг определяют величины С-реактивного белка, интерлейкина 33, интерлейкина 10 и при величинах СРБ>=0,55 мг/л, ИЛ 33>=0,5 пг/мл и ИЛ 10=0 пг/мл, в сочетании с генотипом ТС гена ITGB3 и GG гена MTRR у больных артериальной гипертонией с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений прогнозируется развитие резистентности к аспирину, недостаточной эффективности превентивных мер аспирина по первичной профилактике атеротромбозов.

Технический результат заключается в повышении достоверности выявления пациентов с артериальной гипертонией, у которых длительный прием более 6 месяцев аспирина в дозе 0,75 мг неэффективен.

Сущность способа состоит в следующем.

Больным артериальной гипертонией с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений в качестве первичной медикаментозной профилактики назначается аспирин в дозе 75 мг один раз в сутки. Через 6 месяцев лечения из локтевой вены проводится забор образцов крови, методом цепной полимеразной реакции выделяют ДНК, производят амплификацию фрагментов ДНК, затем генотипирование по полиморфизмам генов: ген ITGA2 - тромбоцитарный рецептор к коллагену (полиморфизм С807Т ITGA2 (F224F)), ген ITGB3 - тромбоцитарный рецептор фибриногена (полиморфизм Т1565С ITGB3 (L33P)), ген PAI-1 - ингибитор активатора плазминогена типа I (полиморфизм 5G(-675)4G PAI-1), ген FGB - фибриноген, фактор 1 (полиморфизм G(-455)A FGB), ген F2 - коагуляционный фактор 2 (полиморфизм G20210A F2), ген F5 - коагуляционный фактор 5 (полиморфизм G1691A F5 (Arg506Gln)), ген F7 - коагуляционный фактор 7 (полиморфизм G10976A F7 (Arg353Gln)), Ген F13 - коагуляционный фактор 13 (полиморфизм G103T F13 (Val35Leu)), ген MTR-метионинсинтетаза (полиморфизм A2756G MTR (Asp919Gly)), ген MTRR-метионинсинтетазаредуктаза (полиморфизм A66G MTRR (lle22Met)). Определяют уровни значений провоспалительных и противовоспалительных маркеров сердечно-сосудистой системы с использованием стандартной иммуноферментной (ИФА) методики: С - реактивного белка (СРБ), интерлейкина 33 (ИЛ 33), интерлейкина 6 (ИЛ 6), интерлейкина 10 (ИЛ 10). При этом уровень СРБ>=0,55 мг/л, провоспалительного ИЛ 33>=0,5 пг/мл и противовоспалительного ИЛ 10 =0 пг/мл, варианты генотипа ТС ITGB3 (тромбоцитарного рецептора фибриногена) и GG полиморфизма MTRR (метионинсинтетазаредуктазы) у больных артериальной гипертонией с высоким риском сердечнососудистых осложнений свидетельствуют о предрасположенности к аспиринорезистентности и недостаточной эффективности превентивных мер аспирина по первичной профилактике атеротромбозов.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Производится выделение ДНК и генотипирование по полиморфным локусам изучаемых генов при помощи полимеразной цепной реакции в режиме реального времени - одновременно происходит амплификация и детекция (количественное измерение непосредственно количества копий) специфической последовательности ДНК в образце. Определение генетических полиморфизмов проводится автоматически непосредственно в процессе исследования («ДТ-96», ООО «ДНК-Технология», Россия).

2. Определение исследуемых маркеров воспаления в плазме крови с использованием стандартного твердофазного иммуноферментного анализа с соответствующими диагностическими маркерами на приборе "Anthos" 2020.

Обследовано 70 женщин в возрасте от 51 до 68 лет (средний возраст 59,43 (56-62) лет), страдающих артериальной гипертонией (АГ), без ишемической болезни сердца, с суммарным сердечно-сосудистым риском по шкале SCORE от 5% до 10% (высокий риск). Данные представлены в виде Медиана (25-75 процентиль). Все пациенты были обследованы с использованием стандартного алгоритма диагностики АГ. Всем пациентам к стандартной антигипертензивной терапии был добавлен препарат ацетилсалициловой кислоты 75 мг (Кардиомагнил, Nycomed). Продолжительность приема аспирина составила 6 месяцев.

Группа здоровых доноров состояла из 35 человек в возрасте от 29 до 55 лет, средний возраст 42 (37-49) года. Данные представлены в виде Медиана (25-75 процентиль). Мужчины 6 человек (17%), женщины 29 человек (83%).

Генотипирование полиморфизма генов. Для анализа были отобраны следующие однонуклеотидные полиморфизмы: G(-455)A FGB (замена в промоторе), G20210A F2 (замена в 3′-UTR), G1691A F5 (Arg506Gln), G10976A F7 (Arg353Gln), G103T F13 (Val35Leu), С807Т ITGA2 (F224F), T1565C ITGB3 (L33P), 5G (-675)4G PAI-1 (Деления в промоторе), A2756G MTR(Asp919Gly), A66G MTRR (lle22Met). Проведено исследование факторов воспаления: СРБ, ИЛ33, ИЛ6 и ИЛ10.

Для оценки достоверности различий между двумя группами использовались критерии Манна - Уитни. Различия считались достоверными при p<0,05. Результаты математической/статистической обработки выявленных значимых изменений представлены ниже.

1. Оценка связи генотипов полиморфизма генов-модификаторов с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений.

ITGB3 тромбоцитарный рецептор фибриногена. В исследуемой группе пациентов по сравнению со здоровыми донорами выявлено, что отношение шансов (OR) для полиморфизма гена Т1565С ITGB3 равно 3, что говорит о том, что пациенты с наличием в генотипе полиморфного аллеля С гена ITGB3 имеют высокий риск заболеваемости сердечно-сосудистыми заболеваниями.

MTRR метионинсинтетазаредуктаза. При расчете отношения шансов сердечно-сосудистой заболеваемости для полиморфизма гена A66G MTRR (lle22Met) OR был равен 1,7, что свидетельствует о среднем риске заболеваемости (OR=1,5-2).

2. Оценка значений факторов воспаления в динамике до приема аспирина в дозе 75 мг и через 6 месяцев лечения при различных полиморфизмах генов.

При генотипе ТС ITGB3 + GG MTRR (мутантный гетерозиготный ген тромбоцитарного рецептора фибриногена ITGB3 + мутантный гомозиготный ген метионинсинтетазаредуктазы MTRR) профилактическое лечение аспирином не привело к достоверному снижению СРБ и повышению противовоспалительного потенциала, так как значения ИЛ 10 оставались весь период лечения в пределах 0 пг/мл.

Видно, что концентрация ИЛ33 снизилась достоверно, однако сохранила значения более 0 пг/мл, тогда как при всех других сочетаниях генотипов через 6 месяцев уровень ИЛЗЗ был равен 0 пг/мл. Такие изменения свидетельствовали о сохранении высокого противовоспалительного статуса на фоне 6-месячного приема аспирина.

Длительное сохранение активности провоспалительных медиаторов и недостаточность противовоспалительных факторов на фоне 6-месячного приема аспирина свидетельствует о том, что применение аспирина в малых дозах у этих больных имеет недостаточный эффект. Эти данные позволяют прогнозировать в этой группе больных недостаточную эффективность аспирина - аспиринорезистентность.

Клинические примеры.

1. Больная В., 60 лет. Артериальная гипертония выявлена 5 лет назад. Наследственность по сердечно-сосудистым осложнениям отягощена - по материнской линии был инфаркт миокарда. Не курит. Алкоголь не употребляет. Находится в менопаузе более 5 лет. Рост 152, вес 87, ИМТ 37,8 кг/м².

В б/х крови: ОХС 6,72 ммоль/л, ТГ 1,03 ммоль/л, ЛПВП 1,88 ммоль/л, ЛПНП 4,37 ммоль/л, ЛПОНП 0,47 ммоль/л, Индекс атерогенности 2,57, глюкоза 5,4 ммоль/л.

ЭКГ: ЧСС 52-54-55 в мин. Ритм - синусовая брадикардия. Горизонтальное положение ЭОС.

ЭХО-КГ: камеры не расширены, глобальная сократимость ЛЖ сохранена, диастолическая дисфункция ЛЖ по 1 типу (замедление релаксации).

Максимальные цифры АД у больной 190/100 мм рт ст, что соответствует критериям АГ 2 степени.

Имеется гипертоническая ангиопатия сетчатки, что свидетельствует о поражении органов-мишеней и формировании 2 стадии АГ.

У больной проведена стратификация факторов риска сердечно-сосудистых осложнений по шкале SCORE. Выявлено 2 фактора риска:

Величина САД/ДАД до 190/100 мм рт ст - является ФР

Общий холестерин 6,72 ммоль/л - является ФР

Пол женский - не является ФР

Возраст 60 лет у женщин - не является ФР

Нет ФР по курению

Согласно существующей концепции стратификации риска по шкале SCORE у больной имеется высокий риск фатальных сердечно-сосудистых осложнений. Это означает, что больная с вероятностью в 5% может умереть от смертельных сердечно-сосудистых осложнений в последующие 10 лет жизни.

Диагноз: Гипертоническая болезнь 2 стадии, 2 степени, высокий сердечно-сосудистый риск.

С целью антигипертензивного действия был назначен нолипрел - форте А (периндоприл 5 мг/индапамид 1,25 мг) один раз в сутки, в целях первичной профилактики острых сердечно-сосудистых осложнений - кардиомагнил (содержит 75 мг аспирина) один раз в сутки.

Больная была осмотрена через 6 месяцев, достигнутый уровень САД/ДАД 130/80 мм рт ст, что расценено, как достижение целевых уровней АД. Методом цепной полимеразной реакции был установлен генотип ТС ITGB3 тромбоцитарного рецептора фибриногена и GG гена MTRR метионинсинтетазаредуктазы.

Для оценки эффективности аспирина были определены факторы воспаления: СРБ - 1,4 мг/л, ИЛ 33 1,15 пк/мл, ИЛ 10-0 пк/мл. Данные показатели были расценены, как сохранение у больной провоспалительного статуса вследствие недостаточного противовоспалительного эффекта аспирина.

2. Больная Е, 59 лет. Артериальная гипертония выявлена 5 лет назад. Наследственность отягощена по материнской линии (инсульт у матери в 51 год). Курит много лет. Алкоголь не употребляет. Находится в менопаузе более 5 лет. Рост 152, вес 58, ИМТ 25,1 кг/м2. Максимальные цифры АД 160/98 мм рт.ст., что соответствует критериям 1 степени АГ.

В б/х крови: ОХС ммоль/л, 4,99, ТГ 0,78 ммоль/л, ЛПВП 1,56 ммоль/л, ЛПНП 3,08 ммоль/л, ЛПОНП 0,35 ммоль/л, Индекс атерогенности 2,2, глюкоза 5,1 ммоль/л.

ЭКГ: ЧСС 71 в мин. Положение ЭОС - отклонена влево, ритм - синусовая нормокардия. Нарушение проводимости по правой ветви пучка Гиса. Гипертрофия ЛЖ.

ЭХО-КГ: камеры не расширены, глобальная сократимость ЛЖ сохранена, гипертрофия левого желудочка, диастолическая дисфункция ЛЖ по 1 типу (замедление релаксации).

Гипетрофия левого желудочка является признаком поражения органов-мишеней и соответствует 2 стадии АГ.

У больной проведена стратификация факторов риска сердечно-сосудистых осложнений по шкале SCORE. Выявлено 2 фактора риска: Величина САД/ДАД 160/98 мм рт.ст. - является ФР. Курение - является ФР. Общий холестерин 4,99 ммоль/л - не является ФР. Пол женский - не является ФР. Возраст 59 лет у женщин - не является ФР.

Согласно существующей концепции стратификации риска по шкале SCORE у больной имеется высокий риск фатальных сердечно-сосудистых осложнений. Это означает, что больная с вероятностью в 5% может умереть от смертельных сердечно-сосудистых осложнений в последующие 10 лет жизни.

Диагноз: Гипертоническая болезнь 2 стадии, 1 степени, высокий сердечно-сосудистый риск.

С целью антигипертензивного действия был назначен нолипрел - форте А (периндоприл 5 мг/индапамид 1,25 мг) один раз в сутки, в целях первичной профилактики острых сердечно-сосудистых осложнений - кардиомагнил (содержит 75 мг аспирина) - один раз в сутки.

Больная была осмотрена через 6 месяцев, достигнутый уровень САД/ДАД 120/80 мм рт.ст., что расценено, как достижение целевых уровней АД. Методом цепной полимеразной реакции был установлен генотип ТС ITGB3 тромбоцитарного рецептора фибриногена и GG гена MTRR метионинсинтетазаредуктазы.

Для оценки эффективности аспирина были определены факторы воспаления: СРБ - 0,5 мг/л, ИЛ 33 - 2,69 пк/мл, ИЛ 10-0 пк/мл. Данные показатели были расценены как сохранение у больной провоспалительного статуса несмотря на профилактический прием аспирина.

Приведенные примеры показывают достижение технического результата - у больных артериальной гипертонией с генотипом ТС ITGB3 и GG MTRR, имеющих высокий риск сердечно-сосудистых осложнений по шкале SCORE и достигнувших целевых значений АД на фоне антигипертензивной терапии, не был получен ожидаемый противовоспалительный эффект аспирина. Это означает, что недостаточно реализованы и другие свойства аспирина, а именно - антиагрегантный эффект. У этих больных прогнозируется аспиринорезистентность необходимость поиска путей его преодоления.

Изобретение относится к медицине, в частности - к кардиологии и лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования аспиринорезистентности у больных артериальной гипертонией с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений, длительно принимающих аспирин в профилактической дозе. Способ включает отбор крови и проведение анализа, из венозной крови выделяют ДНК, проводят полимеразную цепную реакцию синтеза ДНК, определяют полиморфизм генов Т1565С гена ITGB3 тромбоцитарного рецептора фибриногена и A66G гена MTRR метионинсинтетазаредуктазы; методом твердофазного иммуноферментного анализа определяются величины С-реактивного белка (СРБ), интерлейкина 33 (ИЛ 33), интерлейкина 10 (ИЛ 10). При значениях СРБ, равном или большем 0,55 мг/мл, ИЛ 33, равном или большем 0,5 пг/мл, и отсутствии ИЛ 10 в сочетании с генотипом ТС гена ITGB3 и GG гена MTRR прогнозируют аспиринорезистентность. Технический результат заключается в повышении достоверности выявления пациентов с артериальной гипертонией, у которых длительный прием более 5 месяцев аспирина в дозе 0,75 мг неэффективен. 2 пр.

Способ прогнозирования аспиринорезистентности у больных артериальной гипертонией с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений, длительно принимающих аспирин в профилактической дозе, включающий отбор крови и проведение анализа,
отличающийся тем, что из венозной крови выделяют ДНК, проводят полимеразную цепную реакцию синтеза ДНК, определяют полиморфизм генов Т1565С гена ITGB3 тромбоцитарного рецептора фибриногена и A66G гена MTRR метионинсинтетазаредуктазы; методом твердофазного иммуноферментного анализа определяются величины С-реактивного белка (СРБ), интерлейкина 33 (ИЛ 33), интерлейкина 10 (ИЛ 10), и
при значениях СРБ, равном или большем 0,55 мг/мл, ИЛ 33, равном или большем 0,5 пг/мл, и отсутствии ИЛ 10 в сочетании с генотипом ТС гена ITGB3 и GG гена MTRR прогнозируют аспиринорезистентность.