Способ получения биомассы микроводорослей с высоким содержанием водорастворимого белка Российский патент 2023 года по МПК C12N1/12 C12R1/89 

Изобретение относится к области биотехнологических процессов и производств, в частности, к способам культивирования биомассы микроводорослей.

Известен способ культивирования микроводорослей Chlorella (Патент на изобретение РФ №2644261, МПК C12N 1/12 (2006.01), 2016 г). Способ предусматривает перемешивание и аэрацию культуральной жидкости, поддержание заданных значений температуры и рН, освещение импульсным источником света с длительностью импульса 0,00001-0,001 с и длительностью интервала между импульсами 0,01-0,1 с, соответствующими длительностям световой и темновой фаз фотосинтеза для данной микроводоросли, отличающийся тем, что температурные границы, при которых происходит развитие микроводоросли Chlorella 27-29°С, освещение периодическое 3 часа утром и 4 часа вечером, с добавлением минеральной воды со скважины 69 бис железноводского месторождения с содержанием солей 2,5 г/л в культуральную жидкость при соотношении 1:1, перемешивание осуществляют круговыми движениями.

Недостатком данного способа является использованием в качестве освещения импульсного света, воздействие которого будет стрессовым и окажет влияние на процессы роста, развития и метаболизм, в частности возможно снижение количества внутриклеточных водорастворимых белков.

Известен способ культивирования микроводоросли и установка для его осуществления (патент РФ №2450049), который заключается в перемешивании и аэрации культуральной жидкости встряхиванием колб-культиваторов путем возвратно-поступательного перемещения, поддержании заданных значений температуры, рН и освещении источником света, согласно изобретению освещение осуществляется импульсным источником света с длительностью импульса 0,00001-0,001 с и длительностью интервала между импульсами 0,01-0,1 с, соответствующими длительностям световой и темновой фаз фотосинтеза для данной микроводоросли. Установка для осуществления способа включает культиваторы в виде ряда сосудов одинаковой геометрической формы с прозрачными днищами, установленных с возможностью возвратно-поступательного перемещения в горизонтальной плоскости (для аэрации и перемешивания) и снабженных источником освещения, в котором согласно изобретению источники освещения выполнены в виде набора светоизлучающих диодов, расположенных непосредственно под прозрачными днищами сосудов и соединенных с источником питания в виде генератора импульсов.

Недостатком данного способа является использованием в качестве освещения импульсного света, воздействие которого будет стрессовым и окажет влияние на процессы роста, развития и метаболизм, в частности возможно снижение количества внутриклеточных водорастворимых белков.

Наиболее близким к предлагаемому решению является способ культивирования планктонной хлореллы (Патент на изобретение №2685955 РФ, МПК 12N 1/12 (2006.01) А01Н 13/00 (2006.01) (52) СПК C12N 1/12 (2013.01) А01Н 13/00 (2013.01), 2019 год). Изобретение относится к биотехнологии, в частности способу культивирования планктонной хлореллы, используемой в качестве корма для сельскохозяйственных животных. Разработанный способ предусматривает культивирование в течение суток в режиме двух световых и одной темновой фазы, при этом температура суспензии выдерживается в пределах от 28 до 30°С. Используется питательная среда, состоящая из минеральных и органических компонентов. Культивирование проводят в три этапа, которые отличаются по количеству используемых органических компонентов питательной среды. Изобретение позволяет получать продукт, различающийся по содержанию биомассы для дифференцированного использования в качестве корма для сельскохозяйственных животных. Недостатком данного способа является использование в качестве органических компонентов питательной среды фильтрата настоя голозерного овса и фугата зерновой послеспиртовой барды применение которых без предварительной стерилизации может привести к контаминации культуры микроводорослей.

Задачей изобретения является получение биомассы микроводорослей с высоким содержанием внутриклеточного водорастворимого белка.

Решение технической задачи достигается за счет создания миксотрофных условий культивирования микроводорослей рода Chlorella, выращиваемых предварительно в автотрофных условиях.

Между отличительными признаками и достигаемым техническим результатом существует следующая причинно - следственная связь.

Технический результат достигается тем, что создание миксотрофных условий культивирования обеспечивается изменением уровня фотосинтетически активной радиации с 120-180 мкмоль фотонов/(м²⋅с) до 20-40 мкмоль фотонов/(м²⋅с) и пересевом биомассы микроводорослей рода Chlorella на питательную среду с добавлением глюкозы - источника органического углерода в количестве 5±1 г/л, а накопление комплекса внутриклеточных водорастворимых белков в биомассе обеспечивается из-за изменения метаболизма клеток и увеличения количества ферментов, катализирующих реакции усвоения глюкозы (путь Эмбдена-Мейргофа, цикл Кребса).

Питательная среда, используемая на автотрофном этапе культивирования микроводорослей является стерильной и содержит азот в виде нитрата калия 3-5 г/л, фосфор в виде дигидрофосфата калия в концентрации 0,2 - 2 г/л, серу в виде сульфата магния и гептагидрата сульфата железа в концентрации 0,125 - 1,25 г/л и 0,01-0,015 г/л соответственно, а также 0,5-1,5 мл раствора микроэлементов, который содержит катионы марганца (II) в виде тетрагидрата хлорида марганца (И) в концентрации 1,0-2,0 г/л, катионы цинка в виде гептагидрата сульфата цинка- 0,1-0,3 г/л, катионы меди (II) в виде сульфата меди (II) - 0,01-0,2 г/л, оксид молибдена (IV) в концентрации 0,01-0,02 г/л, борная кислота в концентрации 2-3 г/л, ванадат аммония в концентрации 0,01-0,02 г/л. После 4-5 суток культивирования микроводорослей с использованием данной питательной среды при следующих условиях: 1) количество вносимого посевного материала (клеток микроводорослей), выращенного в стерильных условий и отобранного в конце логарифмической стадии роста, составляло -8-12% от общего объема суспензии, таким образом, начальная концентрация биомассы в суспензии составляет 0,05-0,1 г/л; 2) температура 30±2°С; 3) уровень фотосинтетически активной радиации 120-180 мкмоль фотонов/(м²⋅с)); 4) уровень рН. 6.2-8.0; 3) аэрация суспензии (60-100 л/ч) стерильной газовоздушной смесью с содержанием диоксида углерода 0,02-0,5%; концентрация биомассы микроводорослей в суспензии достигает величины 0,5-1 г/л, а содержание внутриклеточного водорастворимого белка - 40-50 мг/л.

Миксотрофное культивирование полученной биомассы микроводорослей для изменения заключается в использовании на втором этапе культивирования питательной среды, которая содержит источник органического углерода в виде глюкозы в концентрации 5±1 г/л г/л, азот в виде нитрат калия 3-5 г/л, фосфор в виде дигидрофосфата калия в концентрации 0,2 - 2 г/л, серу в виде сульфата магния и гептагидрата сульфата железа в концентрации 0,125 - 1,25 г/л и 0,01-0,015 г/л соответственно, а также 0,5-1,5 мл раствора микроэлементов, который содержит катионы марганца (II) в виде тетрагидрата хлорида марганца (II) в концентрации 1,0-2,0 г/л, катионы цинка в виде гептагидрата сульфата цинка- 0,1-0,3 г/л, катионы меди (II) в виде сульфата меди (II) - 0,01-0,02 г/л, оксид молибдена (IV) в концентрации 0,01-0,02 г/л, борная кислота в концентрации 2-3 г/л, ванадат аммония в концентрации 0,01-0,02 г/л. После 4-5 суток культивирования микроводорослей с использованием данной питательной среды при следующих условиях: 1) температура 30±2°С; 3) уровень фотосинтетически активной радиации 20-40 мкмоль фотонов/(м²⋅с)); 4) уровень рН. 6.2-8.0; 3) аэрация суспензии (80-120 л/ч) стерильной газовоздушной смесью с содержанием диоксида углерода 0,02-0,5%; концентрация биомассы микроводорослей в суспензии составит 1,5-2,0 г/л, а содержание внутриклеточного водорастворимого белка - 70-120 мг/л.

Длительность последовательных стадий культивирования в автотрофных и миксотрофных условиях составляют 4-5 суток каждая. В подаваемой для культивирования в автотрофных условиях стерильной питательной среде (табл. 1, 2) присутствуют все макро- и микроэлементы необходимые для роста фотосинтетического микроорганизма (источник неорганического углерода - диоксид углерода подается в составе стериальной газовоздушной смеси). Для культивирования в миксотрофных условиях в полученная биомасса микроводорослей пересевается на новую стерильную питательную среду в составе которой содержится источник органического углерода - глюкоза (табл.3).

В качестве посевного материала для получения биомассы микроводорослей с высоким содержанием белка используются микроорганизмы рода Chlorella. Культивирование микроводорослей сначала осуществляется на стерильной питательной среде (табл.1), содержащей необходимые для осуществления процессов метаболизма неорганические соли, при аэрации стерильной газовоздушной смесью с содержанием диоксида углерода 0,02-0,5% (60-100 л/ч) и уровне фотосинтетически активной радиации 120-180 мкмоль фотонов/(м²⋅с)) в течение 4-5 суток. Это позволяет обеспечить активный прирост биомассы за счет активного процесса фотосинтеза. Создание миксотрофных условий в течение последующих 4-5 суток активирует перестройку метаболизма клеток микроводорослей и позволяет повысить концентрацию внутриклеточных водорастворимых белков.

Использование в качестве посевного материала микроводорослей рода Chlorella и питательной среды приведенного в табл.1-3 состава, позволяет обеспечить получение биомассы микроводорослей концентрацией 1,5-2,0 г/л с содержанием внутриклеточного водорастворимого белка - 70-120 мг/л.

В качестве примера может быть рассмотрен технологический процесс производства пищевой добавки на основе биомассы микроводорослей с высоким содержанием водорастворимого белка (фиг.1). Технологический процесс производства начинается с культивирования микроводорослей на стерильной питательной среде в автотрофных условиях в течение 4-5 суток: 1) количество вносимого посевного материала (клеток микроводорослей), выращенного в стерильных условий и отобранного в конце логарифмической стадии роста, составляло -8-12% от общего объема суспензии, таким образом, начальная концентрация биомассы в суспензии составляет 0,05-0,1 г/л; 2) температура 30±2°С; 3) уровень фотосинтетически активной радиации 120-180 мкмоль фотонов/(м²⋅с)); 4) уровень рН. 6.2-8.0; 3) аэрация суспензии (60-100 л/ч) стерильной газовоздушной смесью с содержанием диоксида углерода 0,02-0,5%. В результате концентрация биомассы микроводорослей в суспензии достигает величины 0,5-1 г/л, а содержание внутриклеточного водорастворимого белка - 40-50 мг/л. Затем полученная биомасса пересевается на новую питательную среду, содержащую источник органического углерода -глюкозу и культивируется в миксотрофных услових в течение 4-5 суток в следующих условиях: 1) температура 30±2°С; 3) уровень фотосинтетически активной радиации 20-40 мкмоль фотонов/(м2⋅c));

4) уровень рН. 6.2-8.0; 3) аэрация суспензии (80-120 л/ч) стерильной газовоздушной смесью с содержанием диоксида углерода 0,02-0,5%. Концентрация биомассы микроводорослей в суспензии достигает величины 1,5-2,0 г/л, а содержание внутриклеточного водорастворимого белка - 70-120 мг/л (стадия 1). Затем центрифугированием от биомассы микроводорослей отделяется большая часть культуральной жидкости (стадия 2), в результате чего получается паста микроводорослей влажностью от 55-98%. Клетки микроводорослей, содержащиеся в полученной пасте микроводорослей, подвергаются дезинтеграции для увеличения биодоступности внутриклеточных белковых компонентов (стадия 3). На следующем этапе производства паста микроводорослей с разрушенными клетками подвергается сушке до остаточной влажности 10% (стадия 4). Подтверждением эффективности предлагаемого метода являются результаты культивирования штаммов Chlorella vulgaris Beijer IPPAS C-l (Chlorella sorokiniana), Chlorella vulgaris Beijer IPPAS C-2, Chlorella kessleri Fott et Nov C-9 (Parachlorella kessleri), приведенные в табл.4-6 и на фиг.2-4.

Полученные данные позволяют заключить, что предлагаемый способ культивирования микроводорослей позволяет получить биомассу с повышенным содержанием водорастворимого белка.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения биомассы микроводорослей, предусматривающий двухэтапное культивирование микроводорослей рода Chlorella последовательно в автотрофных и миксотрофных условиях в течение 8-10 сут на стерильной питательной среде определенного состава, при этом автотрофные условия включают культивирование в течение 4-5 сут при фотосинтетически активной радиации 120-180 мкмоль фотонов/(м²⋅с) и аэрации 60-100 л/ч стерильной газовоздушной смесью с содержанием диоксида углерода 0,02-0,5%; миксотрофные условия включают внесение в питательную среду 5±1 г/л глюкозы при фотосинтетически активной радиации 20-40 мкмоль фотонов/(м²⋅с) и аэрации суспензии 80-120 л/ч стерильной газовоздушной смесью аналогичного состава. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов культивирования микроводорослей с повышенным содержанием водорастворимого белка. 4 ил., 6 табл., 1 пр.

Способ получения биомассы микроводорослей с высоким содержанием внутриклеточных водорастворимых белков, предусматривающий двухэтапное культивирование микроводорослей рода Chlorella последовательно в автотрофных и миксотрофных условиях в течение 8-10 суток на стерильной питательной среде, содержащей азот в виде нитрата калия 3-5 г/л, фосфор в виде дигидрофосфата калия в концентрации 0,2-2 г/л, серу в виде сульфата магния и гептагидрата сульфата железа в концентрации 0,125-1,25 г/л и 0,01-0,015 г/л соответственно, а также 0,5-1,5 мл раствор микроэлементов, который содержит катионы марганца (II) в виде тетрагидрата хлорида марганца (II) в концентрации 1,0-2,0 г/л, катионы цинка в виде гептагидрата сульфата цинка - 0,1-0,3 г/л, катионы меди (II) в виде сульфата меди (II) - 0,01-0,2 г/л, оксид молибдена (IV) в концентрации 0,01-0,02 г/л, борная кислота в концентрации 2-3 г/л, ванадат аммония в концентрации 0,01-0,02 г/л; при этом автотрофные условия предполагают следующие условия культивирования (4-5 суток): 1) количество вносимого посевного материала - клеток микроводорослей, выращенного в стерильных условиях и отобранного в конце логарифмической стадии роста, составляло 8-12% от общего объема суспензии с начальной концентрацией биомассы в суспензии 0,05-0,1 г/л; 2) температура 30±2°С; 3) уровень фотосинтетически активной радиации 120-180 мкмоль фотонов/(м²⋅с); 4) уровень рН 6.2-8.0; 5) аэрация суспензии 60-100 л/ч стерильной газовоздушной смесью с содержанием диоксида углерода 0,02-0,5%; миксотрофные условия предполагают следующие условия: 1) внесение в питательную среду источника органического углерода в виде глюкозы в концентрации 5±1 г/л, 2) температура 30±2°С; 3) уровень фотосинтетически активной радиации 20-40 мкмоль фотонов/(м²⋅с); 4) уровень рН 6.2-8.0; 5) аэрация суспензии 80-120 л/ч стерильной газовоздушной смесью с содержанием диоксида углерода 0,02-0,5%.