ЛЕЧЕНИЕ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ Российский патент 2024 года по МПК A61K35/12 A61K35/34 A61P9/04 

ПРИТЯЗАНИЯ НА ПРИОРИТЕТ

Настоящая заявка испрашивает преимущества по предварительной заявке на патент США 62/806,473, поданной 15 февраля 2019 года. Все содержание указанной выше заявки включено в настоящий документ посредством отсылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к терапевтическому применению митохондрий и комбинации митохондриальных средств.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Митохондрии представляют собой связанные с двойной мембраной органеллы, присутствующие в цитоплазме ядросодержащих эукариотических клеток. Они обнаружены почти в каждой клетке человеческого тела кроме эритроцитов. Они являются основным участком энергетического метаболизма клетки и синтеза аденозинтрифосфата (АТФ) для различных функций клеток. Как правило, больше 90% потребности клетки в АТФ удовлетворяются собственными митохондриями клетки.

Митохондрия состоит из двух концентрических мембран, которые обладают специализированными функциями. Внутренняя митохондриальная мембрана содержит белки для АТФ-синтазы. Внешняя митохондриальная мембрана, которая содержит большие количества мембраносвязанных белков, полностью окружает всю органеллу.

Структура митохондрий имеет поразительное сходство с некоторыми современными прокариотами. Считается, что митохондрии на самом деле произошли в результате древнего симбиоза, когда ядросодержащая клетка захватила аэробного прокариота. В отношении симбиоза клетка-хозяин стала зависеть от поглощенного прокариота для производства энергии, а прокариотическая клетка стала зависеть от защитной среды, обеспечиваемой клеткой-хозяином.

Благодаря основной функции митохондрий в метаболизме клетки митохондрии могут использоваться для лечения различных нарушений. Также существует потребность в применении митохондрий для доставки лекарственных средств и в некоторых других терапевтических и диагностических целях.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложены фармацевтические композиции, содержащие митохондрии, а также способы лечения нарушений с применением таких фармацевтических композиций. В описании также предложены способы диагностики и визуализации с применением таких фармацевтических композиций. Описанные способы основаны, по меньшей мере частично, на открытии того, что сами выделенные митохондрии и выделенные митохондрии, соединенные с терапевтическим средством, диагностическим средством и/или визуализационным средством, могут быть доставлены в ткань пациента путем их введения в кровеносные сосуды пациента. То есть прямая инъекция или нанесение митохондрий на ткань-мишень, что предусмотрено в некоторых способах, описанных в настоящем документе, не всегда является необходимым. Скорее, в некоторых случаях, способы, описанные в настоящем документе, используют преимущество открытия, что после инъекции или инфузии митохондрий, например в артерию, митохондрии могут проходить через стенку артерии и захватываться клетками тканей пациента. Способы, описанные в настоящем документе, могут обеспечивать локализованное и общее распределение митохондрий или митохондрий с терапевтическими, диагностическими и/или визуализационными средствами в тканях или клетках для различных лечебных, диагностических и/или визуализационных целей, с применением относительно простых медицинских процедур.

В настоящем документе, помимо прочего, предложены способы лечения или предупреждения сердечной недостаточности у субъекта, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей выделенные митохондрии или комбинированное митохондриальное средство. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту путем интрамиокардиальной инъекции. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет или подвергается риску развития сердечной недостаточности-гипертрофии правого желудочка (ГПЖ), гипертрофии левого желудочка (ГЛЖ), недостаточности правого желудочка (НПЖ) или недостаточности левого желудочка (НЛЖ). В некоторых вариантах осуществления субъект имеет заболевание легких. В некоторых вариантах осуществления заболевание легких влияет на функцию правого желудочка. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту путем инъекции композиции в кровеносный сосуд субъекта. В некоторых вариантах осуществления митохондрии являются аутогенными. В некоторых вариантах осуществления митохондрии являются аллогенными. В некоторых вариантах осуществления митохондрии являются ксеногенными.

В настоящем документе, помимо прочего, предложены способы поддержания сократимости правого желудочка (ПЖ), поддержания плотности капилляров ПЖ, предотвращения дилатации ПЖ или задержки возникновения НПЖ у субъекта, где способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенные митохондрии или комбинированное митохондриальное средство. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту путем интрамиокардиальной инъекции. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет или подвергается риску развития сердечной недостаточности-гипертрофии правого желудочка (ГПЖ), гипертрофии левого желудочка (ГЛЖ), недостаточности правого желудочка (НПЖ) или недостаточности левого желудочка (НЛЖ). В некоторых вариантах осуществления субъект имеет заболевание легких. В некоторых вариантах осуществления заболевание легких влияет на функцию правого желудочка. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту путем инъекции композиции в кровеносный сосуд субъекта. В некоторых вариантах осуществления митохондрии являются аутогенными. В некоторых вариантах осуществления митохондрии являются аллогенными. В некоторых вариантах осуществления митохондрии являются ксеногенными.

В настоящем документе, помимо прочего, предложены способы поддержания сократимости левого желудочка (ЛЖ), поддержания плотности капилляров ЛЖ, предотвращения дилатации ЛЖ или задержки возникновения недостаточности левого желудочка (НЛЖ) у субъекта, где способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенный митохондрии или комбинированное митохондриальное средство. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту путем интрамиокардиальной инъекции. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет или подвергается риску развития сердечной недостаточности-гипертрофии правого желудочка (ГПЖ), гипертрофии левого желудочка (ГЛЖ), недостаточности правого желудочка (НПЖ) или недостаточности левого желудочка (НЛЖ). В некоторых вариантах осуществления субъект имеет заболевание легких. В некоторых вариантах осуществления заболевание легких влияет на функцию левого желудочка. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту путем инъекции композиции в кровеносный сосуд субъекта. В некоторых вариантах осуществления митохондрии являются аутогенными. В некоторых вариантах осуществления митохондрии являются аллогенными. В некоторых вариантах осуществления митохондрии являются ксеногенными.

В настоящем документе, помимо прочего, предложены способы поддержания сократимости желудочка у субъекта, где способ включает:

идентификацию нуждающегося в этом субъекта; и

введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенные митохондрии или комбинированное митохондриальное средство. В некоторых вариантах осуществления субъекта идентифицируют путем измерения отношения конечно-систолического давления-объема (КСДО).

В настоящем документе, помимо прочего, предложены способы, поддерживающие плотность капилляров желудочка у субъекта, где способ включает:

идентификацию нуждающегося в этом субъекта; и

введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенные митохондрии или комбинированное митохондриальное средство.

В настоящем документе, помимо прочего, предложены способы снижения риска дилатации желудочка у субъекта, где способ включает:

идентификацию нуждающегося в этом субъекта; и

введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенные митохондрии или комбинированное митохондриальное средство.

В некоторых вариантах осуществления у субъекта идентифицируют диабет, ожирение, артериальную гипертензию, злоупотребление алкоголем, применение кокаина и кокаиновую зависимость, бактериальную инфекцию, вирусную инфекцию, грибковую инфекцию, паразитарную инфекцию, воздействие токсинов (например, свинца, ртути или кобальта), аритмии или осложнение на поздней стадии беременности.

В настоящем документе, помимо прочего, предложены способы задержки возникновения сердечной недостаточности у субъекта, где способ включает:

идентификацию нуждающегося в этом субъекта; и

введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенные митохондрии или комбинированное митохондриальное средство. В некоторых вариантах осуществления у субъекта выявляют гипертрофию правого желудочка или гипертрофию левого желудочка.

В настоящем документе, помимо прочего, предложены способы лечения сердечной недостаточности, задержки возникновения сердечной недостаточности, снижения риска сердечной недостаточности у субъекта, где способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенные митохондрии или комбинированное митохондриальное средство. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту путем интрамиокардиальной инъекции. В некоторых вариантах осуществления способ включает идентификацию у субъекта риска сердечной недостаточности. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет заболевание легких. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту путем инъекции композиции в кровеносный сосуд в сердце.

В настоящем документе, помимо прочего, предложены способы лечения гипертрофии сердца, задержки возникновения гипертрофии сердца, снижения риска развития гипертрофии сердца у субъекта, где способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенные митохондрии или комбинированное митохондриальное средство. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту путем интрамиокардиальной инъекции. В некоторых вариантах осуществления способ включает идентификацию у субъекта риска развития сердечной гипертрофии. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет заболевание легких. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту путем инъекции композиции в кровеносный сосуд в сердце.

В некоторых вариантах осуществления кровеносный сосуд является кровеносным сосудом или частью сосудистой системы, которая переносит кровь в целевой участок, целевой орган или целевую область, например, коронарной артерией субъекта, воротной веной печени субъекта, большой панкреатической артерией субъекта или артерией предстательной железы субъекта.

В некоторых вариантах осуществления митохондрии могут происходить из других источников, например, митохондрии могут быть аутогенными, аллогенными или ксеногенными. В некоторых вариантах осуществления аутогенные митохондрии могут содержать экзогенную мтДНК. В некоторых вариантах осуществления митохондрии получены от родственника субъекта первой степени родства.

В некоторых вариантах осуществления описанные способы включают этап сбора выделенных митохондрий из клеток перед введением. Выделенные митохондрии или комбинированное митохондриальное средство могут вводить субъекту непосредственно после сбора выделенных митохондрий из клеток.

В одном аспекте изобретения предложены композиции, включающие выделенные митохондрии и/или комбинированное митохондриальное средство; и носитель. В некоторых вариантах осуществления композиция является фармацевтической композицией. Носитель может быть любым подходящим носителем, например, буфером для дыхания, буфером для митохондрий, стерильным буфером для митохондрий, раствором Висконсинского университета (UW), кровью, сывороткой или контрастным веществом.

Во всех способах и/или композициях, описанных в настоящем документе, комбинированное митохондриальное средство может включать фармацевтическое средство. Фармацевтическое средство может быть терапевтическим средством, визуализационным средством, диагностическим средством или их любой комбинацией. Визуализационное средство может быть радиоактивным. В некоторых вариантах осуществления визуализационным средством является ¹⁸F-родамин 6G или наночастица оксида железа. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство связано с митохондрией ковалентной связью. Альтернативно или дополнительно фармацевтическое средство включено в митохондрии. Комбинированное митохондриальное средство может включать антитело или антигенсвязывающий фрагмент. Кроме того, во всех способах и/или композициях, описанных в настоящем документе, митохондрии могут быть аутогенными, аллогенными или ксеногенными. В некоторых вариантах осуществления митохондрии содержат экзогенную ДНК (например, мтДНК).

При использовании в настоящем документе термин "выделенные митохондрии" означает функциональные и интактные митохондрии, которые не содержат посторонний материал эукариотической клетки.

"Комбинированное митохондриальное средство" представляет собой выделенную митохондрию, которая искусственно комбинирована с фармацевтическим, диагностическим или визуализационным, или любым другим средством. Такое средство комбинировано с митохондрией любым способом, например, связано (например, химически или электростатически связано) с митохондрией, присоединено к митохондрии, интегрировано в митохондриальную мембрану, по существу заключено в митохондрию или полностью включено в митохондрию, с условием, что митохондрия и средство находятся в физическом контакте друг с другом. Комбинированные митохондриальные средства созданы таким образом, что митохондрия выступает в качестве "носителя", который может переносить средство в ткани пациента после инъекции.

Термины "субъект" и "пациент" используются по всему тексту описания изобретения для описания животного, человека или нечеловека, которому предоставляется лечение согласно способам настоящего изобретения. В настоящем изобретении прямо предусмотрены ветеринарные применения. Термин включает, без ограничения, птиц, рептилий, амфибий и млекопитающих, например человека, других приматов, свиней, грызунов, таких как мыши и крысы, кроликов, морских свинок, хомяков, коров, лошадей, кошек, собак, овец и коз. Предпочтительными субъектами являются люди, сельскохозяйственные животные и домашние животные, такие как кошки и собаки.

Термин "лечить (лечение)" используется в настоящем документе для обозначения задержки возникновения, ингибирования, облегчения эффектов, вызванных, или увеличения продолжительности жизни пациента, страдающего, состоянием, например, заболеванием, описанным в настоящем документе.

"Связанное с ишемией заболевание" является заболеванием, которое включает ишемию. Ишемия при использовании в настоящем документе представляет собой снижение тока крови, поступающей в орган и/или ткань. Снижение тока крови может быть вызвано любым соответствующим механизмом, включая, помимо прочего, частичную или полную блокаду (обструкцию), сужение (стеноз) и/или повышение проницаемости/разрыв одного или более кровеносных сосудов, снабжающих кровью орган и/или ткань.

Под "непосредственно после митохондрии собирают из клеток" подразумевается, что митохондрии сразу собирают из клеток, до того как сможет произойти какое-либо существенное снижение жизнеспособности митохондрий.

При использовании в настоящем документе термин "трансплантация" используется по всему тексту описания как общий термин для описания процесса имплантации органа, ткани, массы клеток, отдельных клеток или клеточных органелл реципиенту. Термин "трансплантация клетки" используется по всему тексту описания как общий термин для описания процесса переноса по меньшей мере одной клетки, например островковой клетки или стволовой клетки, реципиенту. Например, такая трансплантация может быть выполнена путем удаления β-клеток (или интактных островков) из поджелудочной железы донора и их помещения пациенту-реципиенту, поджелудочная железа которого не может вырабатывать достаточное количество инсулина. Эти термины включают все категории трансплантатов, известных в данной области, за исключением переливания крови. Трансплантаты классифицируют по локализации и генетическому родству между донором и реципиентом. Термин включает, например, аутотрансплантацию (удаление и перенос клеток или ткани из одного участка локализации в организме пациента в тот же или другой участок локализации у того же субъекта), аллотрансплантацию (трансплантацию между представителями одного биологического вида) и ксенотрансплантацию (трансплантацию между представителями разных видов).

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно известно среднему специалисту в области, к которой относится это изобретение. Несмотря на то, что материалы и методы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут использоваться при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения, подходящие материалы и методы описаны ниже. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие источники, указанные в настоящем документе, включены посредством отсылки во всей своей полноте. В случае противоречий настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, методы и примеры являются лишь иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и формулы изобретения.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ. 1 представляет собой схематическую диаграмму, на которой изображен способ выделения митохондрий.

ФИГ. 2 представляет собой схематическую диаграмму, на которой изображены исходы заболевания, связанные с перегрузкой желудочка.

ФИГ. 3 представляет собой схематическую диаграмму, на которой изображен обзор способа трансплантации митохондрий субъекту.

ФИГ. 4 представляет собой схематическую диаграмму, на которой изображено исследование в модели на животных с использованием суживания легочной артерии (PAB).

ФИГ. 5 представляет собой схематическую диаграмму, на которой изображен временной график измерений и анализа в эксперименте.

ФИГ. 6 представляет собой линейный график, на котором показано функциональное изменение площади (ФИП) в процентах, в исходном состоянии, через 1 месяц после PAB и на момент умерщвления для контрольной группы (C, также называемой "имитационной" группой), групп PAB-V (Растворителя) и PAB-M (Митохондрий).

ФИГ. 7 представляет собой линейный график, на котором показано систолическое смещение трикуспидального кольца (ССТК) в мм, в исходном состоянии, через 1 месяц после PAB и на момент умерщвления для контрольной группы (C, также называемой "имитационной" группой), групп PAB-V (Растворителя) и PAB-M (Митохондрий).

ФИГ. 8 представляет собой линейный график, на котором показана толщина стенок правого желудочка (ПЖ) в см, в исходном состоянии, через 1 месяц после PAB и на момент умерщвления для контрольной группы (C, также называемой "имитационной" группой), групп PAB-V (Растворителя) и PAB-M (Митохондрий).

ФИГ. 9 представляет собой ящичковую диаграмму, на которой показана dP/dt max в мм рт.ст./сек, на момент умерщвления для контрольной группы (C, также называемой "имитационной" группой), групп PAB-V (Растворителя) и PAB-M (Митохондрий).

ФИГ. 10 представляет собой линейный график, на котором показана dP/dt max в мм рт.ст./сек, в исходном состоянии и на момент умерщвления для контрольной группы (C, также называемой "имитационной" группой), групп PAB-V (Растворителя) и PAB-M (Митохондрий).

ФИГ. 11A представляет собой иммунофлуоресцентное изображение, на котором показано окрашивание TUNEL с подсвечиванием апоптотических клеток (белые стрелки) в группе TUNEL-положительного контроля. Кардиомиоциты окрашивали на десмин, а ядра окрашивали DAPI.

ФИГ. 11B представляет собой иммунофлуоресцентное изображение, на котором показано окрашивание TUNEL с подсвечиванием апоптотических клеток (белые стрелки) в контрольной/имитационной группе. Кардиомиоциты окрашивали на десмин, а ядра окрашивали DAPI.

ФИГ. 11C представляет собой иммунофлуоресцентное изображение, на котором показано окрашивание TUNEL с подсвечиванием апоптотических клеток (белые стрелки) в группе PAB-V. Кардиомиоциты окрашивали на десмин, а ядра окрашивали DAPI.

ФИГ. 11D представляет собой иммунофлуоресцентное изображение, на котором показано окрашивание TUNEL с подсвечиванием апоптотических клеток (белые стрелки) в группе PAB-M. Кардиомиоциты окрашивали на десмин, а ядра окрашивали DAPI.

ФИГ. 11E является гистограммой, на которой показано отношение % десмина в поле зрения/количество ядер в поле зрения (P<0,01**).

ФИГ. 12A представляет собой иммунофлуоресцентное изображение, на котором показано окрашивание на CD31 с подсвечиванием плотности капилляров (белые стрелки) в контрольной/имитационной группе. Кардиомиоциты окрашивали на десмин, а ядра окрашивали DAPI.

ФИГ. 12B представляет собой иммунофлуоресцентное изображение, на котором показано окрашивание на CD31 с подсвечиванием плотности капилляров (белые стрелки) в группе PAB-V. Кардиомиоциты окрашивали на десмин, а ядра окрашивали DAPI.

ФИГ. 12C представляет собой иммунофлуоресцентное изображение, на котором показано окрашивание на CD31 с подсвечиванием плотности капилляров (белые стрелки) в группе PAB-M. Кардиомиоциты окрашивали на десмин, а ядра окрашивали DAPI.

ФИГ. 13A представляет собой электронную микроскопию, показывающую количество и форму митохондрий в контрольной/имитационной группе.

ФИГ. 13B представляет собой электронную микроскопию, показывающую количество и форму митохондрий в группе PAB-V.

ФИГ. 13C представляет собой электронную микроскопию, показывающую количество и форму митохондрий в группе PAB-C.

ФИГ. 14 представляет собой схему, на которой показаны результаты и исходы болезни, связанные с лечением митохондриальной трансплантацией.

ФИГ. 15 представляет собой иммунофлуоресцентное изображение, на котором показан контроль, гипертрофия ПЖ (ГПЖ) и ГПЖ с митохондриальной трансплантацией.

ФИГ. 16 представляет собой ящичковую диаграмму, на которой показаны уровни АТФ в кардиомиоцитах в контроле, необработанных гипертрофированных кардиомиоцитах (H no mito) и обработанных митохондриями гипертрофированных кардиомиоцитах (H mito сердце, H mito икроножная мышца и H mito камбаловидная мышца), *p=0,05 в сравнении с контролем, #p=0,001 в сравнении с необработанными гипертрофированными кардиомиоцитами (H no mito).

ФИГ. 17A представляет собой иммунофлуоресцентное изображение, на котором показано окрашивание TUNEL с подсвечиванием апоптотических клеток (белые стрелки) в контрольной/имитационной группе и группах PAB-V и PAB-M. Кардиомиоциты окрашивали на десмин, а ядра окрашивали DAPI.

ФИГ. 17B представляет собой ящичковую диаграмму, на которой показаны TUNEL-положительные ядра на 1000 ядер (*p=0,01 в сравнении с контролем и #p=0,05 для PAB-V в сравнении с PAB-M.

ФИГ. 17C представляет собой микроскопию, на которой показаны репрезентативные гистологические срезы с обнаружением фиброза в контрольной/имитационной группе и группах PAB-V и PAB-M.

ФИГ. 17D представляет собой ящичковую диаграмму, на которой показано отношение % фиброза в поле зрения на момент оценки конечного показателя в исследовании (*p=0,01 в сравнении с контролем и #p=0,05 для PAB-V в сравнении с PAB-M).

ФИГ. 18A представляет собой ящичковую диаграмму, на которой показана толщина стенок ПЖ в см, в исходном состоянии, для контрольной группы (C, также называемой "имитационной") и групп PAB-V и PAB-M.

ФИГ. 18B представляет собой ящичковую диаграмму, на которой показана толщина стенок ПЖ в см, через 1 месяц после PAB, для контрольной группы (C, также называемой "имитационной") и групп PAB-V и PAB-M.

ФИГ. 18C представляет собой ящичковую диаграмму, на которой показана толщина стенок ПЖ в см, на момент умерщвления, для контрольной группы (C, также называемой "имитационной") и групп PAB-V и PAB-M.

ФИГ. 19A представляет собой ящичковую диаграмму, на которой показано функциональное изменение площади (ФИП) в процентах, в исходном состоянии, для контрольной группы (C, также называемой "имитационной") и групп PAB-V и PAB-M.

ФИГ. 19B представляет собой ящичковую диаграмму, на которой показано функциональное изменение площади (ФИП) в процентах, через 1 месяц после PAB, для контрольной группы (C, также называемой "имитационной") и групп PAB-V и PAB-M.

ФИГ. 19C представляет собой ящичковую диаграмму, на которой показано функциональное изменение площади (ФИП) в процентах, на момент умерщвления, для контрольной группы (C, также называемой "имитационной") и групп PAB-V и PAB-M.

ФИГ. 20A представляет собой ящичковую диаграмму, на которой показано систолическое смещение трикуспидального кольца (ССТК) в мм, в исходном состоянии, для контрольной группы (C, также называемой "имитационной") и групп PAB-V и PAB-M.

ФИГ. 20B представляет собой ящичковую диаграмму, на которой показано систолическое смещение трикуспидального кольца (ССТК) в мм, через 1 месяц после PAB, для контрольной группы (C, также называемой "имитационной") и групп PAB-V и PAB-M.

ФИГ. 20C представляет собой ящичковую диаграмму, на которой показано систолическое смещение трикуспидального кольца (ССТК) в мм, на момент умерщвления, для контрольной группы (C, также называемой "имитационной") и групп PAB-V и PAB-M.

ФИГ. 21A представляет собой ящичковую диаграмму, на которой показана dP/dt max в мм рт.ст./сек, в исходном состоянии, для контрольной группы (C, также называемой "имитационной") и групп PAB-V и PAB-M.

ФИГ. 21B представляет собой ящичковую диаграмму, на которой показана dP/dt max в мм рт.ст./сек, на момент умерщвления, для контрольной группы (C, также называемой "имитационной") и групп PAB-V и PAB-M.

ФИГ. 22 является схематической диаграммой, на которой показано исследование в модели на животных с использованием суживания легочной артерии (PAB) и сводка некоторых клинических результатов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Правожелудочковая гипертрофия (ГПЖ) и недостаточность (НПЖ) являются основными причинами сердечной патологии и смертности, влияющими на результаты лечения в долгосрочной перспективе у пациентов, у которых правый желудочек (ПЖ) перегружен из-за легочной гипертензии, обструкции выносящего тракта, или функционирует как системный желудочек. В качестве начального компенсаторного этапа ПЖ приспосабливается к этим гемодинамическим изменениям путем наращивания толщины стенки, чтобы обеспечить более высокую сократительную способность для преодоления увеличения постнагрузки. В конечном итоге эти механизмы недостаточны, и гипертрофия переходит в дилатацию и недостаточность сократительной способности. Клинические наблюдения показывают, что такие компенсаторные изменения сохраняют сократительную функцию более эффективно и в течение более длительного времени на левой стороне, чем на правой стороне, где недостаточность развивается быстрее. Функция митохондрий напрямую влияет на функцию и сократимость сердца. Недостаточная адаптация ПЖ к увеличению давления-нагрузки в долгосрочной перспективе связано с неспособностью митохондриальных механизмов и механизмов регуляции уровней кальция справляться с потребностями, вызванными утолщением мышечной ткани сердца. Футильные циклы кальция с расходованием аденозин-трифосфата (АТФ) и дисфункцией цепи переноса электронов (ETC), еще больше ограничивающие синтез АТФ, приводят к биоэнергетической недостаточности (McCully JD, Rousou AJ, Parker RA, Levitsky S. Age and gender differences in mitochondrial oxygen consumption and free matrix calcium during ischemia/reperfusion and with cardioplegia and diazoxide. Ann Thorac Surg. 2007; 83:1102-1109). Эти события в конечном итоге подавляют клеточные регуляторные механизмы и приводят к более быстрому ухудшению сердечной функции при ГПЖ.

Активность митохондриальных ферментов, как и содержание митохондриальной ДНК (мтДНК), вследствие гипертрофии постепенно снижаются до недостаточности и, следовательно, играют важную роль в дисфункции ПЖ. В соответствии с этим в настоящем изобретении с помощью комбинированного микроматричного и протеомного анализа подобранных образцов продемонстрировало, что функция митохондрий в отношении количества/массы митохондрий так же важна, как и развитие мышечной ткани сердца при адаптации тонкостенного ПЖ к патологической нагрузке. Кроме того, активацию проапоптотических путей, в особенности связанных с митохондриями, и подавление сигнальных путей кальция связывали с прогрессированием до недостаточности. Первоначальное повышение окислительного фосфорилирования и связанная с этим регуляция уровней кальция для стабилизации митохондрий происходят в целях удовлетворения энергетических потребностей при росте сердечной мышцы, адаптируя тонкостенный ПЖ к перегрузке давлением. Однако при длительном воздействии повышенного давления митохондрии не могут адаптироваться, что приводит к быстрому ухудшению со снижением сократительной функции. Развитие сердечной недостаточности связано со снижением резервных запасов энергии, при этом компенсаторные механизмы больше не могут поддерживать дисбаланс уменьшения снабжения энергией и увеличения потребности в результате адаптивного утолщения стенки ПЖ.

Была установлена главная роль митохондрий в прогрессировании гипертрофии с развитием сердечной недостаточности. Современная терапия у пациентов с недостаточностью правого желудочка в основном ограничена лечением, воздействующим на функцию легких, а не прямым вмешательством в представляющий риск энергетический дефицит миокарда, вызванный митохондриальной дисфункцией. Предыдущие исследования продемонстрировали успешный и безопасный метод терапевтической трансплантации аутологичных респираторно-компетентных митохондрий, которые заменяют и/или восполняют пул нативных, поврежденных митохондрий жизнеспособными митохондриями, выделенными из нормальной ткани. Однако терапевтический успех в основном был продемонстрирован в моделях острого ишемического-реперфузионного повреждения, где был установлен положительный эффект трансплантации митохондрий (McCully JD, Cowan DB, Pacak CA, Toumpoulis IK, Dayalan H, Levitsky S. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009; 296(1):H94-105). В меньшей степени известно, можно ли с помощью трансплантации митохондрий достичь долгосрочной митохондриальной дисфункции в дополнение к адаптивному поддержанию митохондриальной функции вследствии прогрессирующей гипертрофии с перегрузкой давлением. Кроме того, при сочетании метаболических адаптивных изменений и митохондриальной дисфункции решающую роль может играть источник митохондрий для трансплантации. Как сообщали, митохондрии приспосабливаются к своей роли в зависимости от потребностей ткани, которую они снабжают (Fernández-Vizarra E, Enríquez JA, Pérez-Martos A, Montoya J, Fernández-Silva P. Tissue-specific differences in mitochondrial activity and biogenesis. Mitochondrion. 2011; 11(1):207-213). Митохондрии быстро сокращающихся скелетных мышц по сравнению с медленно сокращающимися скелетными мышцами приспособлены к клеткам с интенсивным обменом глюкозы, которые могут быстро адаптироваться к повышенным энергетическим потребностям. Было установлено, что гипертрофированный и плохо функционирующий миокард переключается на использование глюкозы в качестве метаболического субстрата (Doenst T, Nguyen TD, Abel ED. Cardiac metabolism in heart failure: Implications beyond ATP production. Circ Res. 2013; 113:709-724). Таким образом, может иметь значение источник митохондрий, используемых для трансплантации, поскольку цель заключается в восстановлении нарушенного производства энергии и митохондриальной динамики при сердечной недостаточности. В случае уже поврежденных митохондрий в сердце при сердечной недостаточности для трансплантации необходимо собирать митохондрии из других клеточных источников.

Настоящее изобретение частично основано на неожиданном открытии того, что митохондрии можно применять для предупреждения, лечения и/или уменьшения одного или более симптомов сердечной недостаточности, даже до возникновения сердечной недостаточности. Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения предложены способы минимизации сердечной недостаточности, снижения риска сердечной недостаточности, облегчения по меньшей мере одного симптома сердечной недостаточности, предотвращения или лечения повреждения клеток, повреждения тканей и/или повреждения органов, связанного с сердечной недостаточностью, у субъекта с риском сердечной недостаточности.

В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе способы лечения или предупреждения сердечной недостаточности у субъекта включают введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей выделенные митохондрии или комбинированное митохондриальное средство. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту путем прямой инъекции, интрамиокардиальной инъекции или инфузии. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет или подвергается риску развития гипертрофии правого желудочка (ГПЖ), гипертрофии левого желудочка (ГЛЖ) или недостаточности правого желудочка (НПЖ) или недостаточности левого желудочка (НЛЖ).

Настоящее изобретение также основано, по меньшей мере частично, на открытии того, что выделенные митохондрии и выделенные митохондрии, связанные с терапевтическим средством, диагностическим средством и/или визуализационным средством, могут быть доставлены в ткань пациента путем инъекции в кровеносные сосуды пациента. Квалифицированные медработники могут локально и/или широко распределить митохондрии в тканях и/или клетках пациента в различных целях при использовании относительно простых медицинских процедур. Кроме того, митохондрии можно применять в качестве средств-носителей, например, для доставки терапевтических, диагностических и/или визуализационных средств в ткани пациента. По сравнению с некоторыми традиционными терапевтическими схемами, в которых используются наночастицы, следует дополнительно отметить, что митохондрии не токсичны и не вызывают какого-либо существенного нежелательного иммунного или аутоиммунного ответа.

Без ограничения какой-либо теорией, считается, что митохондрии после инфузии проходят через стенку капилляров, сначала прикрепляясь к эндотелию. После инъекции или инфузии в артерию митохондрии могут проникать через эндотелий кровеносных сосудов и захватываться клетками тканей посредством процесса эндосомальной актин-зависимой интернализации.

Комбинированные митохондриальные средства

Комбинированные митохондриальные средства включают митохондрии, которые физически связаны с таким средством, как терапевтическое средство, диагностическое средство и/или визуализационное средство.

Терапевтическое средство может быть любым средством, имеющим терапевтическое или профилактическое применение. Примеры терапевтических средств включают, например, терапевтические средства для нарушений, связанных с ишемией, цитотоксические средства для лечения рака, помимо многих других. В некоторых случаях митохондрии могут доставлять терапевтические средства в определенные клетки, например, опухолевые клетки. Терапевтическое средство может быть, например, внутриклеточным ингибитором, деактиватором, токсином, блокирующим веществом и/или цитостатическим/цитотоксическим веществом, которое при попадании в клетку ингибирует, нарушает, блокирует, модифицирует и/или изменяет клетку таким образом, что она не может больше нормально функционировать и/или погибает. Терапевтическое средство может быть средством для восстановления нормальной функции клетки, например, ДНК-вектором для генотерапии. Терапевтическое средство может быть, например, неорганическим или органическим соединением; малой молекулой (меньше 500 дальтон) или большой молекулой; белковой молекулой, такой как пептид, полипептид, белок, посттрансляционно модфицированный белок или антитело; или молекулой нуклеиновой кислоты, такой как двухцепочечная ДНК, одноцепочечная ДНК, двухцепочечная РНК, одноцепочечная РНК или трехспиральная молекула нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство может быть природным продуктом, полученным из любого известного организма (например, из животного, растения, бактерии, гриба, простейшего или вируса) или из библиотеки синтетических молекул. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство может быть мономерным или полимерным соединением. Некоторые примеры терапевтических средств включают цитотоксические средства, ДНК векторы, малые интерферирующие РНК (миРНК), микроРНК (мкРНК), реакционноспособные пептиды, наночастицы, микросферы и флуоресцентные молекулы.

Диагностическое средство является средством, имеющим диагностическое применение. Поскольку митохондрии переносят диагностическое средство в клетку, в некоторых вариантах осуществления диагностическое средство может быть разработано для определения условий в клетке, например, pH и окислительного стресса в клетке.

Визуализационное средство является средством, которое используют для применения в методах визуализации. Такие методы или процедуры включают, без ограничения, рентген, компьютерную томографию (КТ), магнитно-резонансную томографию (МРТ), сцинтиграфию, флуоресценцию, ультразвук и т.д. Визуализационное средство может быть флуоресцентным и/или радиоактивным. В некоторых вариантах осуществления визуализационное средство также может быть диагностическим средством. Примеры визуализационных средств включают, без ограничения, флуорофоры MitoTracker (Thermo Fisher Scientific Inc.), CellLight® RFP, BacMam 2.0 (Thermo Fisher Scientific Inc.), pH-чувствительные флуоресцентные красители pHrodo (Thermo Fisher Scientific Inc.), ¹⁸F-родамин 6G, ¹⁸F-меченный родамин B, магнитные наночастицы оксида железа и наночастицы на основе золота и платины.

Как обсуждалось выше, комбинированное митохондриальное средство включает митохондрии и средство, которые находятся в прямом и/или непрямом физическом контакте друг с другом. Например, средство может быть связано с митохондриями, присоединено к митохондриям, включено в митохондриальную мембрану или полностью или частично заключено в митохондрии. В некоторых случаях фармацевтическое средство может быть связано с митохондриями ковалентно. В некоторых случаях средство связано напрямую с компонентами митохондриальной мембраны ковалентной связью (например, карбоксамидной связью и дисульфидной связью) или опосредованно, через линкер (например, пептидный линкер) или другое ковалентно связанное средство. В других случаях средство может быть связано с митохондриями нековалентно, например, посредством гидрофобного взаимодействия, взаимодействия Ван-дер-Ваальса и/или электростатического взаимодействия и т.д.

В некоторых вариантах осуществления комбинированное митохондриальное средство может включать два или больше средств разных типов, например, два разных вида терапевтических средств, три разных вида визуализационных средств, одно терапевтическое средство и одно визуализационное средство, терапевтическое средство и диагностическое средство, и т.д. Для специалиста в данной области будет очевидно, что возможен любой из вариантов.

Один особенно полезный линкер для связывания митохондрий и средства обеспечивает длительное высвобождение средства после инъекции. Это может быть достигнуто, например, при использовании гидразоновой функциональной группы. Например, гидразон образуется для ковалентного связывания средства с компонентами на митохондриальной мембране. При захвате этого комбинированного митохондриального средства клетками, изменение pH приводит к гидролизу гидразона с высвобождением связанного средства в клетке.

В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство, диагностическое средство и/или визуализационное средство могут быть связаны с внешней митохондриальной мембраной с помощью химии функционализированной поверхности. В некоторых случаях гетеробифункциональные химические соединения могут связывать терапевтическое средство, диагностическое средство и/или визуализационное средство с поверхностью митохондрий, при этом после интернализации эти средства могут высвобождаться в результате взаимодействия с межклеточными эстеразами (например, при взаимодействии с ацетоксиметиловым сложным эфиром) или с применением стратегии активации УФ-излучением или БИК-излучением. Стратегии активации УФ-излучением и БИК-излучением описаны, например, в публикациях Zhou, Fang, Hanjie Wang, and Jin Chang, "Progress in the Field of Constructing Near-Infrared Light-Responsive Drug Delivery Platforms", Journal of Nanoscience and Nanotechnology 16.3 (2016): 2111-2125; Bansal, Akshaya, and Yong Zhang, "Photocontrolled nanoparticle delivery systems for biomedical applications", Accounts of chemical research 47.10 (2014): 3052-3060; Barhoumi, Aoune, Qian Liu, and Daniel S. Kohane, "Ultraviolet light-mediated drug delivery: Principles, applications, and challenges", Journal of Controlled Release 219 (2015): 31-42. Каждая из них включена посредством отсылок во всей своей полноте.

Фармацевтические и другие композиции

В изобретении предложены композиции, включающие выделенные митохондрии, композиции, которые включают комбинированные митохондриальные средства, композиции, которые включают выделенные митохондрии и комбинированные митохондриальные средства, а также способы применения таких композиций.

Фармацевтическая композиция, описанная в настоящем документе, может включать митохондрии и/или комбинированные митохондриальные средства и фармацевтически приемлемый носитель. При использовании в настоящем документе выражение "фармацевтически приемлемый носитель" включает солевой раствор, растворители, дисперсные среды, покрытия, противобактериальные и противогрибковые средства, изотонические вещества и вещества, задерживающие всасывание, и т.п., совместимые с фармацевтическим применением. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель представляет собой фосфатно-солевой буфер, солевой раствор, буфер Кребса, раствор Тироде, контрастные среды или Омнипак, или их смесь. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель является стерильным буфером для митохондрий (300 мМ сахароза; 10 мМ K+-HEPES (забуференная калием (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота, pH 7,2); 1 мМ K+-ЭГТА (забуференная калием этиленгликольтетрауксусная кислота, pH 8,0)). В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель представляет собой буфер для дыхания (250 мМ сахароза, 2 мМ KH₂PO₄, 10 мМ MgCl₂, 20 мМ K-HEPES буфер (pH 7,2) и 0,5 мМ K-ЭГТА (pH 8,0)).

Фармацевтические композиции, как правило, имеют состав, который должен быть совместимым с их предполагаемым путем введения. Примеры путей введения включают парентеральное, например, внутривенное, внутрикожное, подкожное, пероральное (например, ингаляция), подъязычное, чрескожное (например, наружное), чресслизистое и ректальное введение.

Фармацевтическая композиция может быть изготовлена для различных клинических применений, например, для визуализации, лечения ран, лечения травм, консервации органов, улучшения функций митохондрий в органах или тканях и для ухода за кожей. В некоторых случаях фармацевтически приемлемый носитель представляет собой контрастное вещество для визуализации. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может включать антисептические средства, антибактериальные средства (например, антибиотики), противогрибковые средства, дезинфицирующие средства, анальгетики, анестезирующие средства, стероиды, пищевые добавки, эфирные масла и т.д. Анестезирующее средство является лекарственным средством, которое может снимать боль во время операции или лечения. Примеры анальгетиков включают, без ограничения, парацетамол, нестероидные противовоспалительные средства, салицилаты, ибупрофен и лидокаин. Примеры противобактериальных средств включают, без ограничения, дихлорбензиловый спирт, амилметакрезол и антибиотики. Примеры антибиотиков включают пенициллины, карбапенемы, цефалоспорины, аминогликозиды, бацитрацин, грамицидин, мупироцин, хлорамфеникол, тиамфеникол, линкомицин, клиндамицин, макролиды, новобиоцин, полимиксины, рифамицины, спектиномицин, тетрациклины, ванкомицин, тейкопланин, стрептограмины, антагонисты фолата, сульфонамиды, триметоприм, пириметамин, нитрофураны, метенамина манделат, метенамина гиппурат, нитроимидазолы, хинолоны, фторхинолоны, изониазид, этамбутол, пиразинамид, парааминосалициловую кислоту, циклосерин, капреомицин, этионамид, протионамид, тиацетазон и виомицин. Антисептические средства представляют собой противомикробные вещества, которые можно наносить на живую ткань/кожу для уменьшения вероятности инфекции, сепсиса или нагноения. Примеры антисептиков включают, без ограничения, хлоргексидин и его соли, бензалконий и его соли, триклозан и цетилпиридия хлорид. Примеры противогрибковых средств включают, без ограничения, толнафтат, миконазол, флуконазол, клотримазол, эконазол, кетоконазол, итраконазол, тербинафин, амфотерицин, нистатин и натамицин. Примеры стероидов включают, без ограничения, преднизона ацетат, преднизона валерат, преднизолон, алклометазона дипропионат, флуоцинолона ацетонид, дексаметазон, метилпреднизолон, десонид, пиволат, клокортолона пиволат, триамцинолона ацетонид, предникарбат, флутиказона пропионат, флурандренолид, мометазона фуроат, дезоксиметазон, бетаметазон, бетаметазона дипропионат, бетаметазона валерат, бетаметазона пропионат, бетаметазона бензоат, дифлоразона диацетат, флуоцинонид, галцинонид, амцинонид, галобетазола пропионат и клобетазола пропионат. Примеры пищевых добавок включают, без ограничения, витамины, минералы, растительные продукты и аминокислоты. Витамины включают, помимо прочего, витамин A, витамины группы B, витамин C, витамины D, витамин Е и витамин К. Эфирные масла включают, без ограничения, масла, полученные из мяты, шалфея, пихты, лаванды, базилика, лимона, можжевельника, розмарина, эвкалипта, календулы, ромашки, апельсина и т.п. Многие из этих средств описаны, например, в заявке WO 2008152626, которая полностью включена посредством отсылки.

Композиции, включающие митохондрии и/или комбинированные митохондриальные средства, могут быть изготовлены в любой форме, например, в форме жидкостей, полусухих или сухих веществ. Примеры композиций включают, помимо прочего, жидкости, кремы, мази, бальзамы, масла, эмульсии, липосомные составы.

Способы получения композиций, включающих митохондрии и/или комбинированные митохондриальные средства

Выделение митохондрий

Митохондрии для применения в способах, описанных в настоящем документе, могут быть выделены или предоставлены из любого источника, например, выделены из культивируемых клеток или тканей. Примеры клеток включают, без ограничения перечисленными, клетки мышечной ткани, фибробласты сердца, культивируемые клетки, клетки HeLa, клетки рака предстательной железы, дрожжи, помимо прочего, а также их любую смесь. Примеры тканей включают, без ограничения перечисленными, ткань печени, скелетной мышцы, сердца, головного мозга и жировую ткань. Митохондрии могут быть выделены из клеток аутогенного источника, аллогенного источника и/или ксеногенного источника. В некоторых случаях митохондрии выделяют из клеток с генетической модификацией, например, клеток с модифицированной мтДНК или модифицированной ядерной ДНК.

Митохондрии могут быть выделены из клеток или тканей любыми способами, известными специалистам в данной области. В одном примере образцы тканей или образцы клеток собирают, а затем гомогенизируют. После гомогенизации, митохондрии выделяют путем многократного центрифугирования. В альтернативе гомогенат клеток можно фильтровать через нейлоновые сетчатые фильтры. Типичные методы выделения митохондрий описаны, например, в публикациях McCully JD, Cowan DB, Pacak CA, Toumpoulis IK, Dayalan H and Levitsky S, Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection, Am J Physiol 296, H94-H105. PMC2637784 (2009); Frezza, C., Cipolat, S., & Scorrano, L, Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts. Nature protocols, 2(2), 287-295 (2007); и в заявке PCT под названием "Products and Methods to Isolate Mitochondria" (PCT/US2015/035584; WO 2015192020); каждая из которых включена посредством отсылки.

Способы создания комбинированных митохондриальных средств

Специалистам будет известно, что средство может быть связано с митохондриями любым количеством способов, например, путем присоединения к митохондрии, частичного или полного включения в митохондриальную мембрану, заключения в митохондриях или инкапсуляции в митохондриях.

Не предполагая ограничения какой-либо теорией или каким-то конкретным подходом, считается, что наружная мембрана митохондрий является адгерентной и, таким образом, особенно подходит для комбинирования с различными средствами. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические средства могут быть присоединены к наружной мембране митохондрий просто путем инкубирования. Например, эффективное количество фармацевтических средств может быть полностью смешано с выделенными митохондриями в буфере, например буфере для дыхания, при температуре, благоприятной для выделенных митохондрий, например, от 0°C до 26°C, от 0°C до 4°C или приблизительно 0°C, 4°C, 26°C. Эта процедура может применяться для присоединения эффективного количества фармацевтических средств (например, наночастиц, ДНК-векторов, РНК-векторов) к митохондриям.

В некоторых вариантах осуществления органические катионы (например, родамин и тетраметилродамин) легко блокируются функциональными митохондриями из-за электрического потенциала на митохондриальной мембране. В норме митохондриальные мембраны поддерживают разность электрических потенциалов между внутренней и внешней средой этих органелл, называемую трансмембранным потенциалом. Этот трансмембранный потенциал является прямым результатом функциональных процессов в митохондриях и может пропадать, если митохондрии функционируют неправильно. Растворимые в липидах катионы захватываются митохондриями вследствие их положительного заряда и их растворимости как в липидах внутренней мембраны, так и в матриксном водном пространстве. Аналогичным образом, в некоторых других вариантах осуществления анионы могут присоединяться к наружной мембране митохондрий из-за своего отрицательного заряда. Для связывания митохондрий с такими фармацевтическими средствами, эффективное количество фармацевтических средств нужно полностью смешать с выделенными митохондриями в буфере, например, буфере для дыхания, при температуре, благоприятной для выделенных митохондрий, например, приблизительно 0°C или 4°C.

Терапевтическое, диагностическое и/или визуализационное средство может быть связано с фосфолипидами, пептидами или белками на митохондриальной мембране посредством химической связи. Например, молекулы, включающие флуорофоры (pHrodo Red (Thermo Fisher Scientific, Inc.)) и частицы металлов (например, магнитные наночастицы оксида железа 30 нм (Sigma)), могут быть ковалентно связаны с поверхностными аминогруппами на белках и пептидах, экспонированных на внешней мембране интактных митохондрий, при использовании конъюгатов сукцинимидилового эфира. Такие реакционноспособные реагенты взаимодействуют с непротонированными алифатическими аминогруппами, включая N-конец белков и ε-аминогруппу остатков лизина, что приводит к образованию стабильной карбоксамидной связи. В другом примере, когда фармацевтическое средство, например MitoTracker® Orange CMTMRos (Invitrogen, Carlsbad, CA, в настоящее время Thermo-Fisher Scientific, Cambridge, MA), смешивают с функциональными митохондриями, они окисляются, а затем реагируют с тиолами на белках и пептидах на митохондриях с образованием конъюгатов.

Существует множество реакционноспособных химических групп, доступных для присоединения терапевтических, диагностических и/или визуализационных средств к поверхности митохондрий (например, карбоксильные, аминофункционализированные и т.д.).

Средства могут быть присоедины путем белкового связывания, связывания аминов или других методов присоединения к внешней или внутренней митохондриальной мембране. Альтернативно или дополнительно средство может быть присоедино к мембране митохондрии посредством гидрофобного взаимодействия, взаимодействия Ван-дер-Ваальса и/или электростатического взаимодействия.

Во многих случаях терапевтические средства, диагностические средства и визуализационные средства могут просто смешивать с выделенными митохондриями и инкубировать в буфере (например, буфере для дыхания) в течение достаточного времени (например, несколько минут, 5 минут, 10 минут или 1 час), в благоприятных условиях (например, от 0°C до 26°C, от 0°C до 4°C или приблизительно 0°C, 4°C, 26°C, pH 7,2~8,0).

Примеры способов получения комбинированных митохондриальных средств описаны в публикациях McCully et al, Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection, Am J Physiol 296, H94-H105. PMC2637784 (2009); и Masuzawa et al, Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury, Am J Physiol 304, H966-982. PMC3625892 (2013). Каждая из вышеуказанных публикаций полностью включена посредством отсылки.

Способы получения композиций, включающих митохондрии и/или комбинированные митохондриальные средства

Выделенные митохондрии и комбинированные митохондриальные средства могут быть смешаны с фармацевтически приемлемым носителем с получением фармацевтической композиции. Фармацевтически приемлемый носитель включает любое соединение или композицию, которые могут применяться для облегчения хранения, стабильности, введения, направления и/или доставки митохондрий и/или комбинированного митохондриального средства в клетки, в том числе, без ограничения, подходящие носители, разбавители, растворители, наполнители, модификаторы pH, соли, красители, модификаторы текучести, смазывающие вещества, составы для получения покрытия, наполнители, пеногасители, полимеры, гидрогели, поверхностно-активные вещества, эмульгаторы, адъюванты, консерванты, фосфолипиды, жирные кислоты, моно-, ди- и триглицериды и их производные, воски, масла и воду. В некоторых вариантах осуществления выделенные митохондрии и/или комбинированные митохондриальные средства суспендируют в воде, растворе хлорида натрия, буфере для дыхания или стерильном буфере для митохондрий для доставки in vivo. Фармацевтически приемлемые соли, буферы или буферные системы, в том числе, без ограничения, раствор хлорида натрия, фосфатный буфер, фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) или буфер для дыхания, могут быть включены в композицию, описанную в настоящем документе. Носители, способные облегчать доставку в клетку in vivo, такие как липосомы, могут использоватьмя для облегчения доставки комбинированных митохондриальных средств в клетки-мишени.

Способы получения композиций, например жидких, полутвердых и твердых композиций (например, жидкостей, кремов, лосьонов, мазей, масел, помимо прочего), хорошо известны в уровне техники. Специалистам будет очевидно, что такие известные способы могут быть модифицированы путем включения одной или нескольких стадий добавления митохондрий и/или комбинированных митохондриальных средств с получением описанной в настоящем документе композиции. Специалистам будет очевидно, что в некоторых случаях композиция, описанная в настоящем документе, может включать больше одного типа комбинированного митохондриального средства. Например, включены композиции, включающие митохондрии, где по существу каждая митохондрия связана с несколькими типами средств. Также включены композиции, включающие митохондрии, где каждая митохондрия спарена только с одним типом средства, но при этом композиция содержит смесь пар митохондрий/средств.

Лечение сердечно-сосудистого заболевания

Сердце является энергозатратным органом, который требует непрерывного поступления кислорода для поддержания нормальной функции. В аэробных условиях сердце получает энергию, прежде всего, от митохондрий, которые составляют 30% от общего объема миокардиальной клетки. После начала ишемии происходит быстрое снижение уровней богатых энергией фосфатов с изменениями митохондриальной структуры, объема, потребления кислорода и синтеза АТФ.

В настоящем изобретении предложены способы лечения или предупреждения сердечно-сосудистого заболевания (например, сердечной недостаточности). Сердечно-сосудистые заболевания относятся к классу заболеваний, которые поражают сердце или кровеносные сосуды. Сердечно-сосудистые заболевания включают, например, ишемические болезни сердца (ИБС), такие как стенокардию и инфаркт миокарда (широко известный как сердечный приступ), инсульт, сердечную недостаточность, гипертензивную кардиомиопатию, ревматическую болезнь сердца, кардиомиопатию, сердечную аритмию, врожденные пороки сердца, пороки клапанов сердца, кардит, аневризмы аорты, заболевание периферических артерий, тромбоэмболическое заболевание, венозный тромбоз и т.д.

Сердечная недостаточность, также известная как хроническая сердечная недостаточность, относится к заболеванию, при котором сердце не может поддерживать достаточный кровоток для удовлетворения потребностей организма. Признаки и симптомы сердечной недостаточности обычно включают одышку, повышенную утомляемость и отеки ног. Ограниченная способность переносить физическую нагрузку также часто наблюдается у пациентов с сердечной недостаточностью. При использовании в данном контексте "лечить" означает облегчать по меньшей мере один симптом нарушения, связанного с заболеванием. Часто лечение приводит к улучшению кровоснабжения и уменьшению тяжести одного или больше симптомов (например, одышки, повышенной утомляемости и отека ног).

Как правило, способы включают введение композиции, описанной в настоящем документе (например, композиции, включающей выделенные митохондрии, или композиции, включающей комбинированное митохондриальное средство), субъекту, который нуждается, или у которого была определена потребность, в таком лечении.

В некоторых аспектах способы, описанные в настоящем документе, также могут применяться для поддержания сократимости желудочка (например, сократимости правого желудочка (ПЖ)), поддержания плотности капилляров (например, плотности капилляров ПЖ), предотвращения дилатации желудочка (например, дилатации ПЖ), задержки возникновения сердечной недостаточности (например, НПЖ) или снижения риска развития сердечно-сосудистого заболевания (например, сердечной недостаточности).

В настоящем изобретении предложены способы уменьшения сердечной недостаточности, снижения риска возникновения сердечной недостаточности, уменьшения по меньшей мере одного симптома сердечной недостаточности, предотвращения или лечения повреждения клеток, повреждения ткани и/или повреждения органа, связанного с сердечной недостаточностью, у субъекта, подвергающегося риску развития сердечной недостаточности.

При использовании в настоящем документе термин "подвергающийся риску развития сердечной недостаточности" относится к повышенному риску сердечной недостаточности по сравнению с риском сердечной недостаточности у среднестатистического человека в популяции (например, в той же возрастной группе). В некоторых вариантах осуществления риск приблизительно или по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% выше, чем риск сердечной недостаточности у среднестатистического человека в популяции. В некоторых вариантах осуществления риск приблизительно или по меньшей мере в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 раз выше, чем риск сердечной недостаточности у среднестатистического человека в популяции. В некотором варианте осуществления возрастная группа включает лиц возрастом по меньшей мере 40, 50, 60, 70 или 80 лет.

Такой повышенный риск сердечной недостаточности может быть обусловлен различными факторами, например, наследственными факторами (например, генетическими мутациями), факторами окружающей среды (например, профессиональным риском, загрязнением), различными заболеваниями, медицинскими процедурами (например, хирургическим вмешательством, трансплантацией органов/тканей), привычками (например, курением, низкой физической активностью) и т.д. После выявления у субъекта риска развития сердечной недостаточности, субъекту может быть введено терапевтически эффективное количество композиции, описанной в данном документе, для снижения риска сердечной недостаточности. Риск также может возникнуть из-за потенциальной медицинской процедуры. При использовании в настоящем документе термин "медицинская процедура" относится к порядку действий, направленных на достижение результата при оказании медицинской помощи. Медицинская процедура может включать, например, диагностические процедуры, терапевтические процедуры и хирургические процедуры. Некоторые медицинские процедуры включают, например, экстракорпоральную мембранную оксигенацию (ЭКМО), химиотерапию, лучевую терапию, интубацию трахеи, генотерапию, анестезию, абляцию, ампутацию, сердечно-легочную реанимацию (СЛР), криохирургию, эндоскопическую хирургию, гемиламинэктомию, хирургию под визуализационным контролем, земену коленного сустава, ламинэктомию, лапароскопическую хирургию, литотомию, литотриптор, лоботомию, неовагинопластику, радиохирургию, стереотаксическую хирургию, вагинопластику, трансплантацию (например, трансплантацию ткани или органа), ксенотрансплантацию и т.д. Поставщик медицинских услуг может определить, могут ли медицинские процедуры и привычки (например, курение) увеличивать риск сердечной недостаточности. В уровне техники известны многие факторы риска, включающие, например, гипертензию, инфаркт миокарда, пороки сердечных клапанов, кардиомиопатию, случаи сердечных заболеваний у близких родственников и диабет. В этих случаях терапевтически эффективное количество композиции, описанной в настоящем документе, могут вводить субъекту перед проведением этих процедур с целью максимального снижения риска.

В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, могут применяться для лечения или предупреждения сердечной недостаточности у субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет или подвергается риску развития гипертрофии правого желудочка (ГПЖ), гипертрофию левого желудочка (ГЛЖ), недостаточность правого желудочка (НПЖ) или недостаточность левого желудочка (НЛЖ).

Гипертрофия правого желудочка (ГПЖ) Гипертрофия правого желудочка (ГПЖ) является состоянием, определяемым патологическим увеличением сердечной мышцы, окружающей правый желудочек. ГПЖ обычно возникает из-за хронического заболевания легких или структурных дефектов сердца. Одной из наиболее распространенных причин ГПЖ является легочная гипертензия (ЛГ). Легочная гипертензия характеризуется повышенным давлением в сосудах, которые снабжают кровью легкие. Легочная гипертензия может приводить к повышению давления в легочной артерии. Правый желудочек пытается компенсировать такое повышенное давление путем изменения своей формы и размера. Гипертрофия отдельных миоцитов приводит к увеличению толщины стенки правого желудочка. Частые причины легочной гипертензии включают хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), тромбоэмболию легочной артерии и другие рестриктивные заболевания легких. ГПЖ часто возникает в результате этих заболеваний. ГПЖ также возникает в ответ на структурные дефекты сердца. Одной из частых причин является трикуспидальная недостаточность. Трикуспидальная недостаточность или недостаточность трехстворчатого клапана представляет собой заболевание, при котором трехстворчатый клапан не закрывается должным образом, что приводит к обратному току крови. Другие структурные дефекты, которые могут привести к ГПЖ, включая тетраду Фалло, дефекты межжелудочковой перегородки, стеноз легочного клапана и дефекты межпредсердной перегородки. ГПЖ также связана с абдоминальным ожирением, повышенным уровнем глюкозы в крови натощак, высоким систолическим артериальным давлением и фракцией укорочения средней стенки левого желудочка. Другие факторы риска ГПЖ включают курение, синдром апноэ во сне и физическую нагрузку.

Таким образом, в одном аспекте изобретения предложены способы снижения риска развития гипертрофии правого желудочка. Способы включают выявление у субъекта риска развития гипертрофии правого желудочка и введение субъекту композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления способы включают определение у субъекта наличия, например, легочной гипертензии, ХОБЛ, тромбоэмболии легочной артерии, рестриктивных заболеваний легких, трикуспидальной недостаточности, тетрады Фалло, дефектов межжелудочковой перегородки, стеноза легочного клапана, дефектов межпредсердной перегородки, абдоминального ожирения, повышенного уровня глюкозы в крови натощак, высокого систолического артериального давления и/или фракции укорочения средней стенки левого желудочка и т.д.

Гипертрофия левого желудочка (ГЛЖ) - это утолщение мышцы левого желудочка сердца. Хотя сама по себе ГЛЖ не является заболеванием, обычно она является маркером заболевания, поражющего сердце. Заболевания, которые могут вызывать ГЛЖ, включают любое заболевание, которое увеличивает постнагрузку, компенсируя которую сердце вынуждено сокращаться, и некоторые первичные заболевания сердечной мышцы. Причины повышенной постнагрузки, которые могут вызывать ГЛЖ, включают стеноз аорты, аортальную недостаточность и гипертензию. Первичные заболевания сердечной мышцы, вызывающие ГЛЖ, известны как гипертрофические кардиомиопатии, которые могут приводить к сердечной недостаточности. Долговременная недостаточность митрального клапана также может приводить к ГЛЖ в качестве компенсаторного механизма.

Таким образом, в одном аспекте изобретения предложены способы снижения риска развития гипертрофии левого желудочка. Способы включают выявление у субъекта риска развития гипертрофии левого желудочка и введение субъекту композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления способы включают определение у субъекта наличия, например, стеноза аорты, аортальной недостаточности, гипертензии, гипертрофических кардиомиопатий и/или недостаточности митрального клапана и т.д.

Сердечная недостаточность (СН), также известная как хроническая сердечная недостаточность, представляет собой состояние, при котором сердце не может перекачивать кровь в достаточной степени, чтобы поддерживать кровоток для удовлетворения потребностей организма. Признаки и симптомы сердечной недостаточности обычно включают одышку, повышенную утомляемость и отеки ног. Также распространенным признаком является ограниченная способность переносить физические нагрузки. Частые причины сердечной недостаточности включают ишемическую болезнь сердца, в том числе перенесенный инфаркт миокарда (сердечный приступ), высокое артериальное давление, фибрилляцию предсердий, порок клапанов сердца, злоупотребление алкоголем, инфекции и кардиомиопатию. В левую половину сердца поступает богатая кислородом кровь из легких и перекачивается в системный кровоток (остальную часть тела, за исключением малого круга кровообращения). Нарушение работы левой половины сердца приводит к тому, что в легких накапливается кровь, вызывая респираторные симптомы, а также утомляемость из-за недостаточного поступления насыщенной кислородом крови. Правосторонняя сердечная недостаточность часто вызвана легочно-сердечной недостаточностью, которая обычно вызвана нарушением легочного кровообращения, таким как легочная гипертензия или стеноз легочной артерии.

Таким образом, в одном аспекте изобретения предложены способы снижения риска развития сердечной недостаточности. Способы включают выявление у субъекта риска развития сердечной недостаточности и введение субъекту композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет ГЛЖ или ГПЖ и, таким образом, подвергается повышенному риску развития сердечной недостаточности. В другом аспекте способы, описанные в настоящем документе, также могут применяться для лечения или снижения риска развития легочно-сердечной недостаточности или легочных нарушений (например, хронической обструктивной болезни легких, хронического бронхита, эмфиземы, муковисцидоза, плеврального выпота или бронхоэктазии).

Способы диагностики сердечно-сосудистых заболеваний известны в уровне техники. Одним из основных методов диагностики сердечно-сосудистых заболеваний является эхокардиография, с помощью которой можно измерять толщину сердечной мышцы. Например, электрокардиограмму (ЭКГ) часто используют для обнаружения признаков повышения электрических потенциалов сердца у пациентов с ГЛЖ.

В изобретении также предложены способы лечения ишемической болезни сердца и других заболеваний, связанных с ишемией. Попытки уменьшить некроз ткани миокарда и улучшить постишемическую функцию путем введения фармакологических препаратов и/или экзогенных субстратов, отдельно или в комбинации с процедурными методиками, обеспечивали лишь ограниченную кардиопротекцию. Несмотря на такие вмешательства, повреждение и дисфункция митохондрий по-прежнему представляют собой серьезные проблемы после ишемии миокарда и остаются значимыми причинами патологии и смертности. Повреждение митохондрий происходит в основном во время ишемии, а не во время реперфузии, при этом сохранение дыхательной функции митохондрий способствует восстановлению сократимости и уменьшает размер пораженной зоны при инфаркте миокарда.

Способы, описанные в настоящем документе, могут применяться для лечения ишемической болезни сердца. Например, эффективное количество выделенных митохондрий могут вводить в кровеносный сосуд субъекта, например, в сосудистую сеть коронарных артерий субъекта. Например, в сосудистую сеть коронарных артерий субъекта могут вводить приблизительно 1×10⁷ митохондрий. Введенные митохондрии интернализуются кардиомиоцитами после трансплантации и обеспечивают улучшенное потребление кислорода, повышают уровни хемокинов, которые улучшают постинфарктную сердечную функцию, и повышают экспрессию белковых путей, которые важны для сохранения энергетического обмена миокарда. В другом примере эффективное количество митохондрий могут вводить непосредственно в зону риска (регионарную ишемизированную зону). Инъекцию могут повторять несколько раз в разные участки сердца.

Реперфузионное повреждение - это повреждение ткани при поступлении крови, когда кровь снова поступает в ткань после периода ишемии или недостатка кислорода. Отсутствие кислорода и питательных веществ во время ишемического периода приводит к воспалению и окислительному повреждению при восстановлении кровотока. Воспалительная реакция также приводит к реперфузионному повреждению ткани. Поэтому в некоторых случаях лечение также включает введение пациенту иммунодепресантов. Иммунодепресанты могут, например, вводить отдельно, но в качестве одновременного лечения вместе с митохондриальным средством. Альтернативно или дополнительно иммунодепресанты могут быть связаны с митохондриями с получением комбинированного митохондриального средства, которое можно применять для лечения. Особенно полезными иммунодепресантами являются бисфосфонаты.

Ишемическое/реперфузионное повреждение некоторых других органов также часто связано с повреждением и дисфункцией митохондрий. Эти органы включают, без ограничения перечисленными, легкие, почки, печень, скелетные мышцы, мозг и т.д. Эти повреждения или заболевания включают, помимо прочего, ишемический колит, ишемию брыжейки, ишемию головного мозга, инсульт, острую ишемию конечностей, цианоз и гангрену. Описанный способ также может применяться для лечения ишемических повреждений этих органов/тканей. Для такого лечения выделенные митохондрии и/или комбинированное митохондриальное средство могут вводить непосредственно в ткань органа или вводить в кровеносный сосуд, по которому кровь поступает к целевому органу/ткани или пораженному участку у субъекта.

Кардиохирургия

Выделенные митохондрии и/или комбинированные митохондриальные средства могут доставлять в сердце, чтобы уменьшить оглушение миокарда и обеспечить выведение сердца из хирургического процесса (например, кардиоплегия), а также восстановление сердца без увеличения частоты сердечных сокращений или потребности сердца в кислороде. В некоторых вариантах осуществления способы включают прямую инъекцию выделенных митохондрий и/или комбинированных митохондриальных средств в сердце. В некоторых способах выделенные митохондрии и/или комбинированные митохондриальные средства вводят в коронарную артерию.

Визуализация

Визуализационные средства могут присоединять к митохондриям, обычно при совместном инкубировании митохондрий с визуализационными средствами. Такие визуализационные средства включают, без ограничения, флуорофоры MitoTracker и pHrodo производства Thermo Fisher Scientific Inc., ¹⁸F-родамин 6G и наночастицы оксида железа.

Комбинированные митохондриальные средства, которые включают визуализационные средства, могут вводить в ткань, например ткань сердца, или перфузировать через кровеносные сосуды. Ткани, содержащие меченые митохондрии, могут исследовать с помощью таких методов визуализации, как позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), микрокомпьютерная томография (мкКТ) и магнитно-резонансная томография (МРТ), светлопольная микроскопия и 3D-микроскопия сверхвысокого разрешения, и т.д. Для специалистов будет очевидно, что могут использоваться другие методы или методики визуализации. Они включают, без ограничения, рентген, сцинтиграфию, флуоресценцию и ультразвук.

Введение

Выделенные митохондрии и комбинированные митохондриальные средства могут вводить пациенту путем инъекции внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутримышечно и/или путем внутрикостной инфузии. В некоторых вариантах осуществления выделенные митохондрии и комбинированные митохондриальные средства может доставлять путем прямой инъекции или сосудистой инфузии.

После введения митохондрий в ткань, митохондрии захватываются клетками, окружающими участок инъекции. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления участок инъекции является целевым участком. В некоторых других вариантах осуществления митохондрии вводят в кровеносный сосуд, который снабжает кровью целевой участок, например, орган, ткань или поврежденный участок. Без ограничения какой-либо теорией, данные указывают на то, что митохондрии, доставленные путем прямой инъекции, интернализуются клетками посредством актин-зависимого эндоцитоза. Однако захват митохондрий при сосудистой доставке оказывается более затруднительным. Быстрый и обширный захват митохондрий при доставке путем сосудистой инфузии предполагает необходимость участия механизмов, обеспечивающих быстрое прохождение митохондрий через стенку сосудов. Некоторые исследования подтверждают концепцию, согласно которой клетки могут легко покидать циркулирующую кровь. Было показано, что некоторые сердечные и мезенхимальные стволовые клетки, по-видимому, активно выходят из сосудистой сети в процессе, отличном от диапедеза (Cheng, K., Shen, D., Xie, Y., Cingolani, E., Malliaras, K., Marban, E., 2012, Brief report: Mechanism of extravasation of infused stem cells. Stem Cells. 30, 2835-2842; Allen, T.A., Gracieux, D., Talib, M., Tokarz, D.A., Hensley, M.T., Cores, J., Vandergriff, A., Tang, J., de Andrade, J.B., Dinh, P.U., Yoder, J.A., Cheng, K., 2017. Angiopellosis as an Alternative Mechanism of Cell Extravasation. Stem Cells. 35,170-180). Переход стволовых клеток через стенку сосудов требует обширного ремоделирования эндотелия. Митохондрии могут использовать аналогичный механизм ремоделирования, чтобы проходить через стенку сосудов. Другой возможный механизм захвата митохондрий может быть подобен диапедезу. Некоторые клетки часто выходят из циркулирующей крови. Например, экстравазация лейкоцитов (т.е. диапедез) между венозными эндотелиальными клетками является хорошо изученным процессом, в котором участвуют белки клеточной адгезии. Кроме того, также возможно, что инфузированные митохондрии экстравазируют через стенку капилляров в пространство между клетками эндотелия. После того, как митохондрии пересекают эндотелий кровеносных сосудов, митохондрии захватываются клетками тканей посредством эндосомального актин-зависимого процесса интернализации.

Митохондрии или комбинированные митохондриальные средства могут вводить субъекту как однократного, разового лечения или, в альтернативе, многократного лечения, например, курса лечения, которое продолжается периодически или непрерывно в течение приблизительно 1, 2, 5, 8, 10, 20, 30, 50 или 60 дней, одного года, без ограничения сроков, или пока врач не решит, что введение митохондрий или комбинированного митохондриального средства больше не требуется.

В одном способе введения митохондрии или комбинированные митохондриальные средства вводят в ткань органа, например ткань сердца, напрямую. Инъекцию в некоторых случаях могут повторять несколько раз в различные участки органа. В таком способе для инъекции могут использовать стерильный инсулиновый шприц 1 мл с маленькой иглой (например, 28 калибра), при этом в каждый участок инъекции могут вводить, например, приблизительно 1,2×10⁶ митохондрий.

Для специалистов будет очевидно, что количество митохондрий и/или комбинированных митохондриальных средств, например, композиций, включающих митохондрии и/или комбинированные митохондриальные средства, которые требуется ввести пациенту, будут изменяться, например, в зависимости от типа подвергаемого лечению нарушения, пути введения, продолжительности лечения, размера области, подлежащей лечению, и/или локализации участка лечения у пациента, и т.п. Специалисты сумеют определить вводимые дозы в зависимости от этих и других переменных факторов. Например, в общей сложности приблизительно 1×10⁷ митохондрий могут вводить в кровеносный сосуд субъекта, например, для лечения локализованной ишемии в миокарде. В качестве другого примера, в случае более крупных органов или пораженных зон в кровеносный сосуд могут вводить большее количество митохондрий, например, от 1×10¹⁰ до 1×10¹⁴ митохондрий. С другой стороны, в случае малых очаговых поражений пациенту могут вливать от 1×10³ до 1×10⁶ митохондрий. Поэтому эффективное количество митохондрий или комбинированных митохондриальных средств (или включающих их композиций) является общим количеством митохондрий или комбинированных митохондриальных средств, достаточным, чтобы вызвать требуемый терапевтический эффект. Эффективное количество может составлять, например, по меньшей мере или приблизительно 1×10² митохондрий или комбинированных митохондриальных средств, например, от приблизительно 1×10³ до приблизительно 1×10¹⁴, от приблизительно 1×10⁴ до приблизительно 1×10¹³, от приблизительно 1×10⁵ до приблизительно 1×10¹², от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1×10¹¹, от приблизительно 1×10⁷ до приблизительно 1×10¹⁰, от приблизительно 1×10³ до приблизительно 1×10⁷, от приблизительно 1×10⁴ до приблизительно 1×10⁶, от приблизительно 1×10⁷ до приблизительно 1×10¹⁴ или от приблизительно 1×10⁸ до приблизительно 1×10¹³, от приблизительно 1×10⁹ до приблизительно 1×10¹², от приблизительно 1×10⁵ до приблизительно 1×10⁸ или по меньшей мере или приблизительно 1×10³, 1×10⁴, 1×10⁵, 1×10⁶, 1×10⁷, 1×10⁸, 1×10⁹, 1×10¹⁰, 1×10¹¹, 1×10¹², 1×10¹³, или по меньшей мере или приблизительно 1×10¹⁴, или например, количество больше 1×10¹⁴. При использовании в настоящем документе термин "общее количество" в контексте введения пациенту может относиться к общему количеству митохондрий или комбинированных митохондриальных средств в однократном введении (например, одной инъекции, одной дозе, вводимой при инфузии) или в многократных введениях (например, многократных инъекциям), в зависимости от применяемой схемы введения.

Выделенные митохондрии и/или комбинированные митохондриальные средства могут вводить субъекту каждые 12-24 часа различными путями, например, путем прямой инъекции, сосудистой доставки. В некоторых вариантах осуществления выделенные митохондрии или комбинированные митохондриальные средства могут вводить субъекту каждые 5-10 минут (например, каждые 5 минут, каждые 10 минут) различными путями, например, путем прямой инъекции, сосудистой инфузии.

Для лечения сердечно-сосудистых заболеваний или заболеваний легких, выделенные митохондрии и/или комбинированные митохондриальные средства могут вводить в различные кровеносные сосуды, включая, например, аорту, полую вену (например, верхнюю полую вену или нижнюю полую вену), коронарные вены, огибающую артерию, левую коронарную артерию, левую переднюю нисходящую артерию, легочные вены, правую коронарную артерию, легочную вену или легочную артерию.

Выделенные митохондрии и/или комбинированные митохондриальные средства могут вводить субъекту по меньшей мере или приблизительно за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 или 30 дней или по меньшей мере или приблизительно за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев, или по меньшей мере или приблизительно за 1, 2, 3, 4 или 5 лет до начала гипертрофии правого желудочка (ГПЖ), гипертрофии левого желудочка (ГЛЖ), недостаточности правого желудочка (НПЖ) или недостаточности левого желудочка (НЛЖ). В некоторых вариантах осуществления выделенные митохондрии и/или комбинированные митохондриальные средства могут вводить субъекту в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 или 30 дней или в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24 месяцев, или в течение приблизительно 1, 2, 3, 4 или 5 лет после определения, что субъект подвергается риску развития сердечно-сосудистого заболевания, которое может привести к сердечной недостаточности (например, ожирение, гипертрофия правого желудочка и т.п.).

В некоторых вариантах осуществления выделенные митохондрии и/или комбинированные митохондриальные средства могут вводить субъекту в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 или 30 дней или в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24 месяцев, или в течение приблизительно 1, 2, 3, 4 или 5 лет после выявления у субъекта сердечно-сосудистого нарушения или некоторых других нарушений (например, ожирения, гипертрофии правого желудочка и т.п.), которые могут привести к сердечной недостаточности.

В некоторых вариантах осуществления выделенные митохондрии и/или комбинированные митохондриальные средства могут вводить субъекту по меньшей мере или приблизительно через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 или 30 дней или по меньшей мере или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев, или по меньшей мере или приблизительно 1, 2, 3, 4 или 5 лет после начала и/или постановки диагноза гипертрофии правого желудочка (ГПЖ), гипертрофии левого желудочка (ГЛЖ), недостаточности правого желудочка (НПЖ) или недостаточности левого желудочка (НЛЖ).

В некоторых вариантах осуществления выделенные митохондрии или комбинированные митохондриальные средства могут непосредственно вводить в ткани или органы при использовании игл 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 и 34 калибра. В некоторых других случаях выделенные митохондрии или комбинированные митохондриальные средства может доставлять в целевой участок при использовании катетера.

В некоторых случаях митохондрии являются свежевыделенными и жизнеспособными. Митохондрии или комбинированные митохондриальные средства могут вводить субъекту в течение приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 120 минут после выдения митохондрий. В некоторых случаях митохондрии или комбинированные митохондриальные средства вводят субъекту в течение приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно 70 минут, приблизительно 80 минут, приблизительно 90 минут, приблизительно 100 минут, приблизительно 110 минут, приблизительно 120 минут после начала процесса выделения митохондрий. Митохондрии и/или комбинированные митохондриальные средства в некоторых случаях могут хранить в течение небольшого времени (например, приблизительно или по меньшей мере 10 минут, приблизительно или по меньшей мере 20 минут, приблизительно или по меньшей мере 30 минут, приблизительно или по меньшей мере 40 минут, приблизительно или по меньшей мере 50 минут, приблизительно или по меньшей мере 60 минут, приблизительно или по меньшей мере 1 часа, приблизительно или по меньшей мере 2 часов, приблизительно или по меньшей мере 3 часов, приблизительно или по меньшей мере 4 часов, или приблизительно или по меньшей мере 24 часов) перед применением.

Митохондрии для лечения могут быть выделены из клеток или тканей аутогенного источника, аллогенного источника и ксеногенного источника. В некоторых случаях митохондрии собирают из культивируемых клеток или тканей субъекта, и вводят эти митохондрии обратно тому же субъекту. В некоторых других случаях митохондрии собирают из культивируемых клеток или тканей второго субъекта и вводят эти митохондрии первому субъекту. В некоторых случаях митохондрии собирают из культивируемых клеток или тканей из организма другого вида (например, мышей, свиней, дрожжей).

ПРИМЕРЫ

Далее изобретение описано в следующих примерах, не ограничивающих объем изобретения, описанный в формуле изобретения.

Пример 1: Примерные способы выделения митохондрий из образцов ткани или культивируемых клеток

Подготовка

Для выделения интактных, жизнеспособных, респираторно-компетентных митохондрий могут быть приготовлены следующие растворы. Для успешного выделения митохондрий с применением настоящих способов растворы и образцы тканей хранят во льду, чтобы сохранить жизнеспособность митохондрий. Даже при хранении во льду выделенные митохондрии будут демонстрировать постепенное снижение функциональной активности (Olson et al., J Biol Chem 242:325-332, 1967). Эти растворы приготавливают заранее, если это возможно.

1 М стоковый раствор K-HEPES (доводят до pH 7,2 при использовании KOH).

0,5 M K-ЭГТА Основной раствор (доводят до pH 8,0 при использовании KOH).

1 М стоковый раствор KH₂PO₄.

1 М стоковый раствор MgCl₂.

Буфер для гомогенизации (pH 7,2): 300 мМ сахарозы, 10 мМ K-HEPES и 1 мМ K-ЭГТА. Буфер можно хранить при 4°C.

Буфер для дыхания: 250 мМ сахарозы, 2 мМ KH₂PO₄, 10 мМ MgCl₂, 20 мМ K-HEPES буфер (pH 7,2) и 0,5 мМ K-ЭГТА (pH 8,0). Буфер можно хранить при 4°C.

10× стоковый раствор PBS: 80 г NaCl, 2 г KCl, 14,4 г Na₂HPO₄ и 2,4 г KH₂PO₄ растворяют в 1 л бидистиллированной H₂O (pH 7,4).

1× PBS приготавливают путем добавления пипеткой 100 мл 10× PBS в 1 л бидистиллированной H₂O.

Сток субтилизина A приготавливали путем взвешивания 4 мг субтилизина A в микроцентрифужной пробирке на 1,5 мл. Сток можно хранить при -20°C до применения.

Сток BSA приготавливали путем взвешивания 20 мг BSA в микроцентрифужной пробирке на 1,5 мл. Сток можно хранить при -20°C до применения.

Выделение митохондрий из ткани

Фигура, на которой описаны этапы процедуры выделения митохондрий с использованием диссоциации ткани и дифференциальной фильтрации, показана на ФИГ. 1. Два образца столбиковой биопсии диаметром 6 мм переносят в 5 мл буфера для гомогенизации в C-пробирке для диссоциации и гомогенизировали образцы с использованием 1-минутной программы гомогенизации тканевого диссоциатора (A). Исходный раствор субтилизина A (250 мкл) добавляют к гомогенату в C-пробирке для диссоциации и инкубировали во льду в течение 10 минут (B). Гомогенизированный продукт центрифугируют при 750×G в течение 4 минут (в качестве необязательного этапа). Гомогенат фильтруют через предварительно смоченный сетчатый фильтр с ячейками 40 мкм в конической центрифужной пробирке объемом 50 мл во льду, а затем к фильтрату добавляют 250 мкл стокового раствора BSA (C). Фильтрат фильтруют через новый предварительно смоченный сетчатый фильтр с ячейками 40 мкм в конической центрифужной пробирке объемом 50 мл во льду (D). Фильтрат повторно фильтруют через новый предварительно смоченный сетчатый фильтр с ячейками 10 мкм в конической центрифужной пробирке объемом 50 мл во льду (E). Фильтрат повторно фильтруют через новый предварительно смоченный сетчатый фильтр с ячейками 6 мкм в конической центрифужной пробирке объемом 50 мл во льду. Полученный фильтрат можно использовать сразу или концентрировать с помощью центрифугирования. В случае концентрирования фильтрат переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируют при 9000×g в течение 10 минут при 4°C (F). Супернатант удаляют, содержащий митохондрии осадок ресуспендируют и объединяют в 1 мл буфера для дыхания (G).

Непосредственно перед выделением субтилизин A растворяют в 1 мл гомогенизирующего буфера. Непосредственно перед выделением BSA растворяют в 1 мл гомогенизирующего буфера. Два свежих образца ткани собирают с помощью панча для биопсии диаметром 6 мм и хранят в 1× PBS в конической центрифужной пробирке объемом 50 мл во льду. Два 6 мм столбика ткани переносят в C-пробирку для диссоциации, содержащую 5 мл охлажденного во льду буфера для гомогенизации. Ткань гомогенизируют, устанавливая C-пробирку для диссоциации в диссоциатор тканей и выбирая предварительно установленный цикл выделения митохондрий (60-секундная гомогенизация).

С-пробирку для диссоциации переносят в емкость со льдом. К гомогенату добавляют стоковый раствор субтилизина A (250 мкл), перемешивают путем переворачивания и инкубируют гомогенат во льду в течение десяти минут. Сетчатый фильтр с размером ячеек 40 мкм помещают в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл во льду, фильтр предварительно смачивают буфером для гомогенизации и фильтруют гомогенат в конической центрифужной пробирке объемом 50 мл во льду.

Свежеприготовленный стоковый раствор BSA (250 мкл) добавляют к фильтрату и перемешивают переворачиванием (этот этап пропускают, если требуется определить митохондриальные белки). Сетчатый фильтр с ячейками 40 мкм помещают в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл во льду, смачивают фильтр буфером для гомогенизации и фильтруют гомогенат в коническую центрифужную 50 мл пробирку во льду. Фильтр с ячейками 10 мкм помещают в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл во льду, смачивают фильтр буфером для гомогенизации и фильтруют гомогенат в коническую центрифужную 50 мл пробирку во льду. Фильтрат переносят в две предварительно охлажденных микроцентрифужных пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируют при 9000×g в течение 10 минут при 4°C. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют и объединяют в 1 мл охлажденного во льду буфера для дыхания.

Митохондрии, выделенные из тканей, сразу используют для инъекции или для получения комбинированных митохондриальных средств.

Выделение митохондрий из культивируемых клеток

Митохондрии могут выделять из культивируемых клеток. Процедура является по существу такой же, как при выделении митохондрий из образцов тканей, за исключением того, что используются культивируемые клетки, например, человеческие фибробласты, а не образцы биопсии.

Количество митохондрий

Количество жизнеспособных митохондрий определяют путем мечения аликвоты (10 мкл) выделенных митохондрий MitoTracker Orange CMTMRos или MitoTracker Red CMXRos (5 мкмоль/л; Invitrogen, Carlsbad, CA, в настоящее время Thermo-Fisher Scientific, Cambridge, MA). Аликвоты меченых митохондрий наносят на предметные стекла и подсчитывают при использовании конфокального микроскопа с вращающимся диском и 63× C-апохроматным объективом (1,2 W Korr/0.17 NA, Zeiss). Митохондрии контрокрашивают специфическим для митохондрий красителем MitoFluor Green или MitoTracker Deep Red FM (Invitrogen, Carlsbad, CA, в настоящее время Thermo-Fisher Scientific, Cambridge, MA). Соответствующие длины волны выбирают для измерения автофлуоресценции и фоновой флуоресценции с использованием неокрашенных клеток и тканей. Коротко, 1 мкл меченых митохондрий помещают на предметное стекло и накрывают. Количество митохондрий определяют при низком (×10) увеличении, захватывая всю площадь исследуемого образца, при использовании программы MetaMorph Imaging Analysis.

Пример 2: Примерные способы получения комбинированных митохондриальных средств

Объединение митохондрий с ¹⁸F-родамином 6G под воздействием электрического потенциала

¹⁸F-родамин 6G (40-100 мкКи в объеме 20 мкл) разбавляют раствором A для выделения митохондрий (буфер для гомогенизации: 300 мМ сахарозы, 10 мМ K-HEPES и 1 мМ K-ЭГТА, pH 7,2) при 4°C до объема 1,0 мл, после чего полностью смешивают с выделенными митохондриями (0,5 мл, содержащие 1×10⁷-1×10⁸) в растворе A для выделения митохондрий. В смеси ¹⁸F-родамин 6G электрофоретически распределяется в матриксе метохондрий в ответ на разность электрических потенциалов через внутреннюю митохондриальную мембрану, и поэтому поглощается функционирующими митохондриями. Смесь инкубируют во льду в течение 10-30 минут. Смесь промывают 3 раза путем центрифугирования при 9000 об/мин (10000 g) в течение 10 минут, а осадок каждый раз ресуспендируют в растворе A для выделения митохондрий. После заключительной промывки осадок ресуспендируют в буфере для дыхания.

Объединение митохондрий с наночастицами оксида железа на внешней мембране митохондрий

Наночастицы оксида железа, содержащие сукцинимидиловый сложный эфир (10 мг), ресуспендируют в буфере для дыхания при 4°C и затем полностью смешивают с выделенными митохондриями (1,0 мл, ссодержащий 1×10⁷-1×10⁸). Оксид железа связывается с аминогруппами на наружной мембране митохондрий в реакции сукцинимидилового эфира с аминогруппами. Смесь инкубируют во льду в течение 10-30 минут. Смесь 3 раза промывают центрифугированием при 9000 об/мин (10000 g) в течение 10 минут и ресуспендируют осадок каждый раз в растворе A для выделения митохондрий. После заключительной промывки осадок ресуспендируют в буфере для дыхания.

Объединение митохондрий с двумя фармацевтическими средствами

¹⁸F-родамин 6G (40-100 мкКи в объеме 20 мкл) и наночастицы оксида железа, содержащие сукцинимидиловый сложный эфир (10 мг), объединяют и разбавляют раствором A для выделения митохондрий при 4°C до объема 1,0 мл, после чего полностью смешивают с выделенными митохондриями (0,5 мл, содержащими 1×10⁷-1×10⁸) в растворе для выделения митохондрий. Смесь инкубируют во льду в течение 10-30 минут. Смесь 3 раза промывают центрифугированием при 9000 об/мин (10000 g) в течение 10 минут и ресуспендируют осадок каждый раз в растворе A для выделения митохондрий. После заключительной промывки осадок ресуспендируют в буфере для дыхания.

Объединение митохондрий через тиолы

Флуорофор MitoTracker® (5 мкмоль/л; Invitrogen, Carlsbad, CA, в настоящее время Thermo-Fisher Scientific, Cambridge, MA) смешивают с выделенными митохондриями (1,0 мл) в буфере для дыхания. При смешивании зондов с функциональными митохондриями происходит их окисление, после чего они реагируют с тиолами на белках и пептидах на митохондриях с получением конъюгатов. Смесь инкубируют во льду в течение 10 минут при 4°C в темноте. Смесь 3 раза промывают центрифугированием при 9000 об/мин (10000 g) в течение 10 минут и ресуспендируют осадок каждый раз в растворе A для выделения митохондрий. После заключительной промывки осадок ресуспендируют в буфере для дыхания.

Пример 3: Предотвращение сердечной недостаточности при гипертрофии с перегрузкой давлением путем трансплантации аутогенных митохондрий

Цели:

Ключевым событием при прогрессировании гипертрофии правого желудочка (ГПЖ) с развитием недостаточности (НПЖ) является апоптоз кардиомиоцитов вследствии митохондриальной дисфункции. При доступности трансплантации респираторно-компетентных митохондрий цель этих экспериментов состояла в определении, можно ли с помощью инъекции аутогенных митохондрий предотвратить сердечную недостаточность.

Методы:

Модель ГПЖ/НПЖ была создана путем суживания легочной артерии на 50% (градиент=15-20 мм рт.ст.) у не достигших зрелости поросят (n=6/группа). Животные с имитацией операции служили в качестве контроля (Контр). Животных наблюдали в течение 8 недель с помощью эхокардиографии (толщина свободной стенки ПЖ при измерении в M-режиме, ССТК). Через четыре недели после операции суживания животным либо вводили митохондрии (PAB-mito), выделенные из собственной икроножной мышцы поросенка, либо растворитель (PAB-V), путем инъекции в свободную стенку ПЖ. После умерщвления ткань исследовали гистологически на предмет обнаружения гипертрофии кардиомиоцитов, фиброза (Г-Э, трихромная окраска по Массону, десмин) и апоптоза с помощью TUNEL. Инвазивные измерения петли ОД (Vкд, Dp/Dt max, Pdev) получали в исходном состоянии и на момент умерщвления.

Результаты:

Все животные остались в живых до оценки конечного результата исследования. Через один месяц после операции суживания животные демонстрировали признаки гипертрофии со значительно большей толщиной свободной стенки ПЖ по сравнению с контролем (0,27±0,03 см и 0,4±0,02 см; P<0,01; ФИГ. 8). Толщина стенок ПЖ еще больше увеличилась до оценки конечного результата исследования у животных PAB-Mito, тогда как PAB-V сердца уже были сильно расширены (0,5±0,04 см и 0,28±0,08 см; P<0,01; ФИГ. 8). Полный вес сердца (Контр: 100,6±11,4 г, PAB-V: 132,4±31,9 г, PAB-mito: 141,5±31,4 г; P<0,05) и гистологические вычисления гипертрофии (отношение десмина/ядер: Контр: 0,17±0,02, PAB-V: 0,45±0,01, PAB-Mito: 0,42±0.; P<0,05; ФИГ. 11A-11E), соответствовали этим результатам. Апоптотической потери кардиомиоцитов в сердцах Контр и PAB-Mito не наблюдали, но наблюдали 3±1/все ядра в сердцах PAB-V (ФИГ. 12A-12C). Dp/Dt max значительно выросло с 831,9±170,5 во всех группах в исходном состоянии до 1006±178,2 в PAB-Mito по сравнению со снижением в PAB-V (501,2±158,9) и оставалось без изменений в сердцах в группе Контр (843,5±27,6) на момент умерщвления (P<0,05) (ФИГ. 9-10). ССТК в исходном состоянии (10,3±1,7 мм) значительно снизилось в сердцах PAB-V (6,5±0,6 мм) по сравнению со значимым улучшением в сердцах PAB-Mito (12,3±1,1 мм) (P<0,01) (ФИГ. 7).

Выводы:

Митохондриальная трансплантация поддерживала гипертрофическую адаптацию ПЖ и сохраняла сократительную функцию. Лечение миокардиальной дисфункции путем непосредственного воздействия на митохондриальную дисфункцию может применяться для лечения пациентов с заболеванием легких, влияющим на функцию правых отделов сердца.

Пример 4: Трансплантация аутогенных митохондрий для лечения правосторонней сердечной недостаточности

Гипертрофия правого желудочка (ГПЖ) и недостаточность правого желудочка (НПЖ) являются основными причинами сердечной патологии и смертности. Ключевым явлением в прогрессировании с переходом в НПЖ является апоптоз кардиомиоцитов вследствие митохондриальной дисфункции. С доступностью трансплантации респираторно-компетентных митохондрий цель данного исследования состояла в определении, можно ли с помощью локализованной интрамиокардиальной инъекции аутогенных митохондрий лечить сердечную недостаточность.

В культивируемых гипертрофированных кардиомиоцитах определяли благоприятное воздействие трансплантированных митохондрий из разных источников. Модель ГПЖ/НПЖ путем суживания легочной артерии у не достигших зрелости поросят с имитацией операции в качестве контролей (n=6/группа) использовали для лечения аутологичными митохондриями (PAB-M), выделенными из собственной икроножной мышцы поросенка, в сравнении с инъекцией растворителя (PAB-V) в свободную стенку ПЖ. Животных наблюдали в течение 8 недель с помощью эхокардиографии (толщина свободной стенки, сократительная функция) и измеряли Dp/Dt max при оценке конечного результата исследования, когда выполняли гистологический анализ на предмет гипертрофии, фиброза и апоптоза кардиомиоцитов. Не наблюдали значимого различия в том, какой источник митохондрий использовался, ни при интернализации, ни по уровням АТФ. Через 4 недели у животных после суживания обнаруживали ГПЖ (C 0,27±0,03 см в сравнении с толщиной стенки в PAB 0,4±0,02 см; P=0,01), которая еще больше увеличивалась в PAB-M, причем в PAB-V уже наблюдалась сильная дилатация (0,5±0,04 см и 0,28±0,08 см; P=0,01). Сократительная функция в исходном состоянии не отличалась, но была значимо снижена в сердцах PAB-V по сравнению со значимым улучшением в PAB-M, которое также отражалось в Dp/Dtmax в конечной точке исследования. Наблюдали незначительная апоптотическую потерю кардиомиоцитов и фиброз в C, но значимую потерю и фиброз в гипертрофированных сердцах с наибольшими значениями в сердцах PAB-V (C: 1±0,4 по сравнению с PAB-V: 13±1,6; p=0,001 и по сравнению с PAB-M: 8±1,9; р=0,01. PAB-V по сравнению с PAB-M р=0,05). Лечение миокардиальной дисфункции непосредственно путем трансплантации митохондрий поддерживает гипертрофическую адаптацию правого желудочка и сохраняет сократительную функцию.

Методы и результаты:

Модель на животных

Незрелых самцов поросят йоркширской породы (N=18) весом 5-10 кг подвергали суживанию легочной артерии (PAB) или имитационной операции. Поросятам делали общую анестезию телазолом (4,5 мг/кг в/м), ксилазином (2 мг/кг в/м) и атропином (0,04 мг/кг в/м). После оротрахеальной интубации начинали вентиляцию изофлураном (1-3%) и воздухом. Вели контроль ЭКГ, сатурации крови кислородом (поддерживаемой на уровне >97%), температуры тела и концентрации углекислого газа в конце выдоха. Были размещены бедренная артерия и венозные линии. Поросят помещали на правый бок, накрывали простынями и выполняли левую торакотомию в четвертом межреберье. Лидокаин (1%, внутривенно) вводили перед торакотомией для предотвращения фибрилляции желудочков. Легочную артерию (ЛА) отделяли от восходящей аорты и накладывали бандаж, отслеживая давление в ПЖ и дистальной ЛА посредством пункции иглой. ЛА суживали до 50% от исходного диаметра. Ангиографический катетер 4F (Merit Medical Systems, South Jordan, UT) вводили в ЛА и подключали к системе сбора данных PowerLab (DAQ, ADInstruments, Series 16/35) с регистрацией данных для вычислений исходного давления. Эхокардиографию в исходном состоянии получали эпикардиально, до и после наложения бандажа ЛА. Торакотомию закрывали в три слоя и удаляли плевральный воздух через грудную трубку. Бупивакаин (0,25%; <0,03 мг/кг) вводили в качестве местного анальгетика, а послеоперационную системную анальгезию обеспечивали банамином/флуниксина меглумином (1-2 мг/кг в/м) и фентаниловым пластырем (1-4 мкг/кг трансдермально) в течение первых 72 часов. Поросятам позволяли восстановиться в инкубаторе при 37°C и вскоре после этого возвращали в загон. Имитационная операция (C, N=6) заключалась в открытии и закрытии грудной клетки с локальной манипуляцией на участке ЛА. После интраоперационной эхокардиографии прогрессирование гипертрофии правого желудочка определяли раз в две недели. Во время этих процедур животные находились под анестезией изофлураном (1-3%).

Через четыре недели после PAB животным проводили лечение либо прямой инъекцией растворителя (PAB-V, N=6), либо аутологичных митохондрий (PAB-M, N=6), в свободную стенку правого желудочка, согласно такому же протоколу анестезии, как описано выше. В стерильных условиях забирали биопсию икроножной мышцы поросят и выделяли митохондрии, как описано выше. При визуальном контроле методом субксифоидального доступа 1 мл буфера (300 мМ сахарозы, 10 мМ K-HEPES и 1 мМ K-ЭГТА, pH 7,2 при 4°C), содержащего 10×10⁶/мл аутологичных митохондрий (PAB-M, N=6) или только буфер (PAB-V, N=6) вводили в 10 точек в свободную стенку правого желудочка с использованием иглы 30 калибра. Эхокардиографию проводили до инъекции и сразу после инъекции митохондрий/растворителя. Разрез закрывали послойно и оставляли животное для восстановления.

Все животные выживали еще 4 недели (8 недель после первоначальной PAB) и наблюдались с помощью эхокардиографии раз в две недели. В конечной точке исследования поросятам делали анестезию, как описано выше, за исключением того, что анестезию поддерживали через лицевую маску, а не с применением интубации. Делали срединную стернотомию, а также инвазивно измеряли ЛА (проксимально и дистально от бандажа ЛА) и давление в аорте при использовании ангиографического катетера 4F (Merit Medical Systems, South Jordan, UT). Кроме того, кривые давление-объем ЛА и ПЖ вычисляли на основе данных, полученных с использованием петлевого катетера для измерения давления-объема (PV) 7F Scisense (Transonic, Ithaca, NY), который вводили через ВОПЖ. Петлевой катетер PV подключали к Powerlab и автоматически калибровали сигнал при использовании системы регистрации давления-объема ADVantage (ADV500, Transonic, Ithaca, NY). После проведения всех измерений для усыпления вводили Fatal Plus®, вырезали сердце и промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) во льду. Получали образцы биопсии стенки ПЖ, мгновенно замораживали и хранили в жидком азоте до последующего использования. Отдельную ткань свободной стенки ПЖ заливали средой для изготовления срезов при оптимальной температуре (ОКТ), мгновенно замораживали и хранили при -80°C до изготовления срезов. Свежую ткань свободной стенки ПЖ использовали для вычисления влажного/сухого веса.

Модель с использованием клеточной культуры выделенных кардиомиоцитов

Модель на культуре клеток кардиомиоцитов новорожденных крыс использовали для определения интернализации митохондрий в гипертрофированных кардиомиоцитах. Кроме того, на этой модели исследовали функциональные преимущества различных источников митохондрий. Сравнивали образцы с фармакологически индуцированной гипертрофией и негипертрофированные контрольные образцы. Все эксперименты с выделенными клетками проводили в двух повторностях.

Коротко, кардиомиоциты новорожденных крыс выделяли с использованием коммерческого набора для выделения (Worthington) и культивировали, как более подробно описано ранее (Choi YH, Stamm C, Hammer PE, et al. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 2006; 169:72-85). После двух дней культивирования клетки относили либо к контролю, либо к гипертрофии. Для стимуляции гипертрофии сердца in vitro кардиомиоциты обрабатывали ангиотензином II (100 нМ; Sigma-Aldrich) в течение 24 часов после сывороточного голодания в течение 24 часов.

Выделение митохондрий из мышечной ткани

Для определения, играет ли источник митохондрий роль в эффективности восстановления митохондриальной функции, митохондрии из двух разных источников скелетных мышц, быстро сокращающихся и медленно сокращающихся, собирали с помощью Панч-биопсии икроножной мышцы и камбаловидной мышцы, полученной от крысы-матери, и сравнивали с митохондриями мышцы ПЖ сердца. Этот способ дает >99,5% жизнеспособных митохондрий из 100 мг образца ткани. Мышечную ткань гомогенизировали с помощью коммерческого тканевого диссоциатора в буфере для гомогенизации (300 мМ сахарозы, 10 мМ K-HEPES и 1 мМ K-ЭГТА, pH 7,2, при 4°C) с последующим добавлением 250 мкл буферного раствора, содержащего субтилизин A, в 1 мл буфера для гомогенизации. Гомогенат перемешивали путем переворачивания и инкубировали на льду в течение 10 минут с последующей дифференциальной фильтрацией. Фильтрат переносили в две предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки и центрифугировали при 9000 g в течение 10 минут при 4°C. Супернатант удаляли и ресуспендировали объединенные осадки в 1 мл ледяного буфера для дыхания (250 ммоль/л сахарозы, 2 ммоль/л KH₂PO₄, 10 ммоль/л MgCl₂, 20 ммоль/л буфера K+-HEPES, pH 7,2, 0,5 ммоль/л K+-ЭГТА, pH 8,0, 5 ммоль/л глутамата, 5 ммоль/л малата, 8 ммоль/л сукцината, 1 ммоль/л АДФ). Количество митохондрий подсчитывали с помощью счетчика Коултера (Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN).

Определение интернализации трансплантированных митохондрий

Митохондрии предварительно метили красными флуоресцентными частицами pHrodo (ThermoFisher, Waltham, MA) в течение 10 минут при 4°C, а затем 4 раза промывали в буфере для дыхания. Флуоресценция pHrodo обеспечивает положительную индикацию интернализации, поскольку флуоресценция наблюдается только после поглощения жизнеспособными митохондриями. Меченые митохондрии ресуспендировали в свежеприготовленном буфере для дыхания и сохраняли супернатант после последней промывки. Эту промывку использовали для определения неспецифического мечения путем инкубирования контрольных клеток с этим супернатантом (данные не показаны). Меченые митохондрии (1×100 в лунке) инкубировали вместе с кардиомиоцитами (~50000 в лунке). Через 24 часа среду удаляли, клетки 4 раза промывали 1× PBS и в каждую лунку добавляли по 200 мкл свежей среды. Для окрашивания клетки пермеабилизировали в 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 3 минут и инкубировали с первичными антителами, разведенными 1:1000 в 10% фетальной телячьей сыворотке (FBS) в PBS, в течение 1 часа. В качестве первичных антител для кардиомиоцитов использовали антитела к десмину, с вторичным антителом, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (ThermoFisher, Waltham, MA). Ядра одновременно окрашивали с использованием 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (ThermoFisher). Обнаружение интернализации было основано на красной флуоресценции митохондрий в окрашенных на десмин кардиомиоцитах зеленого цвета. Интернализацию оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss.

Определение митохондриальной функции

Содержание АТФ определяли с помощью системы люминесцентного анализа для обнаружения АТФ ATPlite (Perkin Elmer, Waltham, MA). Для этих экспериментов использовали отдельный набор клеток, так как флуоресцентные красители, которыми метят митохондрии, могут нарушать митохондриальную функцию.

Эхокардиографические измерения

Эхокардиографические измерения проводили в исходном состоянии, до лечения (через 4 недели после суживания) и в конечной точке исследования (через 8 недель после суживания). Все исследования проводили с использованием устройства Philips iE33 (Philips Healthcare, Amsterdam, Netherlands), оснащенного датчиком S8-3, и все циклы сохраняли с одновременной регистрацией ЭКГ. Функцию ПЖ по фракционному изменению площади (ФИП) и систолической смещению трикуспидального кольца (ССТК) оценивали по четырехкамерным проекциям. Толщину свободной стенки ПЖ измеряли по записям в М-режиме, полученным в конце диастолы, в парастернальной позиции по длинной оси (ППДО) и парастернальной позиции по короткой оси (PSA).

Инвазивные измерения давления-объема (PV)

Кривые давления-объема ЛА и ПЖ вычисляли на основе данных, полученных при использовании петлевого катетера 7F Scisense для измерения давления-объема (PV) (Transonic Systems Inc, Ithaca, NY), который вводили через правое ушко и фиксировали проленовым швом 4-0 (Ethicon Inc., Somerville, NJ). Петлевой PV катетер подключали и автоматически калибровали при использовании системы регистрации давления-объема ADVantage (ADV500, Transonic, Ithaca, NY). Измерения проводили в исходном состоянии и на момент умерщвления. Данные получали при использованиим системы сбора данных Powerlab (DAQ, ADInstruments, Series 16/35) и анализировали с помощью предоставленной программы LabChart 7 Acquisition Software (AD Instruments, Sidney, Australia). Измеряли пиковое развиваемое давление ПЖ (Pdev, мм рт.ст.), конечное диастолическое давление ПЖ (Ped, мм рт.ст.) и максимальное изменение давления ПЖ в зависимости от времени (dp/dt max, мм рт.ст./с). Максимальные объемы (Vmax) и конечный диастолический объем (Vкд) вычисляли при использовании петлевого PV катетера.

Гистологическое исследование ткани ПЖ

Ткань ПЖ заливали в среде для изготовления срезов при оптимальной температуре (OCT), мгновенно замораживали и хранили при -80°C до последующего использования. Срезы изготавливали и хранили замороженные препараты при -80°C до использования для окраски. Все препараты визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Observer.Z1 с 20× объективом Nikon (NA=20×/0.45). Десять случайно выбранных областей на каждом срезе фотографировали цифровой камерой Leica для цветной съемки и анализировали с использованием ImageJ (версии 2.0.0-rc-43, полученной из Национальных институтов здравоохранения США, Бетесда, Мэриленд).

Определение гипертрофии кардиомиоцитов

В дополнение к эхокардиографическим измерениям гипертрофию ПЖ оценивали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания на десмин для визуализации кардиомиоцитов (1:50, Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX) и DAPI (1:1000, Dako, Carpinteria, CA) для определения количества ядер в поле зрения. При использовании ImageJ вычисляли отношение десмина к количеству ядер в поле зрения.

Определение апоптоза кардиомиоцитов

Без ограничения теорией, было показано, что апоптоз кардиомиоцитов в основном является результатом митохондриальной дисфункции, и, таким образом, определяли апоптоз кардиомиоцитов с помощью окрашивания TUNEL при использовании набора для обнаружения in situ апоптоза ApopTag Plus Fluorescein (MilliporeSigma, Burlington, MA). Кардиомиоциты контрастировали при использовании десмина (1:50, Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX), а ядра при использовании DAPI (1:1000, Dako, Carpinteria, CA). TUNEL-положительные ядра подсчитывали вручную. Общее количество ядер в поле зрения определяли с помощью ImageJ. Данные выражали как отношение апоптозных ядер на 1000 ядер кардиомиоцитов.

Определение миокардиального фиброза

Отдельный набор срезов ткани окрашивали трихромом по Массону, в результате чего фиброзные (обогащенные коллагеном) области становятся синими, тогда как миокард становится красным. Измеряли синюю и красную области (фиброз по отношению к миокарду), и такое отношение служит показателем фиброза. Слайды визуализировали с помощью 10× объектива Nikon. Десять случайно выбранных полей зрения для каждого образца ткани получали и анализировали с помощью ImageJ. Результаты выражены как отношение синих областей к красным.

Статистический анализ

Все результаты представлены как среднее значение±стандартная ошибка среднего (SEM). После подтверждения нормального распределения данных выполняли дисперсионный анализ для множественных сравнений групп и апостериорный анализ Бонферрони для получения расчетов статистической значимости (SPSS 23, IBM Corporation, Armonk, NY). Значения вероятности ≤0,05 считали статистически значимыми.

Модель на клеточной культуре кардиомиоцитов

Размер кардиомиоцитов определяли как показатель гипертрофии (H) после воздействия ангиотензина II. После обработки размер кардиомиоцитов значительно увеличился по сравнению с контрольными кардиомиоцитами при выражении как отношение количества ядер в поле зрения (C: 2,4±0,2 в сравнении с H: 4,2±0,5; p=0,01). Митохондрии интернализировались в гипертрофированные кардиомиоциты ПЖ в той же степени, как и в контрольные кардиомиоциты (ФИГ. 15).

Уровни АТФ, выраженные на количество кардиомиоцитов, снижались в гипертрофированных кардиомиоцитах по сравнению с контролем (C: 404±28 в сравнении с H-no mito: 256±23; p=0,01), но нормализовались до уровней выше нормальных после трансплантации митохондрий. Статистического различия в зависимости от того, какой источник митохондрий использовался, не наблюдали (H-mito сердце: 541±36 в сравнении с H-mito икры: 527±98 в сравнении с H-mito камбаловидная мышца: 531±19; нет значимости). Митохондрии скелетных мышц отвечали так же, как и митохондрии, выделенные из сердечной мышцы (ФИГ. 16).

Модель на животных

Все 18 поросят выживали до оценки конечного результата исследования. Средний градиент, измеренный по бандажу ЛА (мм рт.ст., среднее±стандартная ошибка среднего) в конечной точке исследования, значимо не отличался (P=0,8) между группами PAB-V (12,1±1,6) и PAB-M (9,7±1,9). Масса тела (в кг) не отличалась между тремя группами до какого-либо вмешательства (C: 12,2±1,5, PAB-V: 11,4±1,5, PAB-M: 11,9±0,9; P=0,9), как не отличалась в конечной точке исследования (C: 17,3±3,1, PAB-V: 16,6±1,2, PAB-M: 17,8±0,9; P=0,4). Однако общий вес сердца (в граммах) в конечной точке исследования был значительно выше у животных с бандажом ЛА по сравнению с контрольной группой, подвергшейся имитационной операции (C: 100,6±4,7 в сравнении с PAB-V: 132,4±13 и PAB-M: 141,6%). 12,8; P<0,05). Отношение влажного веса/сухого веса ПЖ (влажный вес/сухой вес) значимо не отличались между тремя группами (C: 4,1±0,05, PAB-V: 5,3±0,09, PAB-M: 4,9±0,3; P=0,5).

Гистологическое исследование

Гипертрофию оценивали гистологически путем вычисления отношения площади миокарда к количеству ядер в поле зрения. Обе группы PAB показали значимое увеличение мышечной массы по сравнению с контрольной группой с имитацией операции в конечной точке исследования (C: 0,2±0,02 в сравнении с PAB-V: 0,36±0,02 и PAB-M: 0,36±0,3; P=0,001). Этот результат коррелировал с присутствием апоптоза кардиомиоцитов, при котором сердца в PAB-V показали наибольшее количество апоптоз-положительных ядер кардиомиоцитов (C: 1±0,4 в сравнении с PAB-V: 13±1,7 в сравнению с PAB-M: 8±1,9; p≤0,05; ФИГ. 11A-11E и 17A-17B). Митохондрии PAB-V также были раздутыми, а кристы уменьшились (ФИГ. 13A-13C). Эти результаты также подтверждаются значительным увеличением фиброза миокарда в обработанных растворителем гипертрофированных сердцах по сравнению с гипертрофированными сердцами, обработанными митохондриями (C: 4±0,55 в сравнении с PAB-V: 15±1,3 в сравнении с PAB-M: 10±1,1; p≤0,05; ФИГ. 17C-17D).

Эхокардиографические измерения

В дополнение к гистологической оценке гипертрофии кардиомиоцитов, толщину стенки правого желудочка в сантиметрах измеряли при регистрации в M-режиме в конце диастолы. Толщина стенки в исходном состоянии значимо не отличалась между группами до какого-либо вмешательства (C: 0,25±0,01, PAB-V: 0,24±0,01, PAB-M: 0,25±0,01; P=0,48), но значительно увеличивалась в группах с бандажом в пределах 4 недель после суживания (C: 0,28±0,01 в сравнении с PAB-V: 0,4±0,02 и PAB-M: 0,38±0,02; P<0,001). В конечной точке исследования сердца, обработанные митохондриями, сохраняли свою толщину стенки, тогда как сердца, обработанные растворителем, вернулись к исходному значению, что указывало на дилатацию (C: 0,28±0,01 в сравнении с PAB-V: 0,34±0,03; P=0,15; в сравнении с PAB-M: 0,47±0,02; P=0,05) (ФИГ. 8 и 18A-18C).

Исходное систолическое смещение трикуспидального кольца (ССТК, в мм) не отличалось между группами (C: 10,6±0,2, PAB-V: 10±0,4, PAB-M: 9,8±0,2; P=0,2), но была значимо более низким в группах с бандажом по сравнению с имитационным контролем через 4 недели после PAB (C: 12,3±0,6 в сравнении с PAB-V: 8,2±0,3 и PAB-M: 8±0,3, P<0,001). Не было различий между двумя группами с гипертрофией до обработки митохондриями (PAB-V в сравнении с PAB-M; P=0,9). Через четыре недели после трансплантации митохондрий обработанные гипертрофированные сердца имели функционально значимо лучшие показатели, чем сердца, обработанные растворителем (PAB-V: 6,7±0,2 в сравнении с PAB-M: 12,2±0,4; P<0,001), при этом не наблюдали различий между сердцами, обработанными митохондриями, и контролями с имитацией операции (C: 13±0,5 в сравнении с PAB-M: 12,2±0,4; P=0,42) (ФИГ. 6 и 19A-19C).

Функциональное изменение площади (ФИП, в %) не отличалось между тремя группами в исходном состоянии (C: 38,2±1,4, PAB-S: 41,2±3,4, PAB-M: 41,3±2,1; P=0,60), но значимо изменялось в группе с гипертрофией через 4 недели после суживания по сравнению с контрольной группой, подвергшейся имитационной операции (C: 43±1,6, PAB-V: 23,7±1,5, PAB-M: 25±2,5, P<0,001). Обе группы гипертрофии не отличались друг от друга до лечения митохондриями, но в конечной точке исследования сократительная функция сердца, обработанного растворителем, значимо ухудшилась по сравнению с обработкой митохондриями и контролями с имитацией операции (C: 46,3±1,9 и PAB-M: 45,7±0,9 в сравнении с PAB-V: 21,5±1,9; P<0,001 (ФИГ. 7 и 20A-20C).

Инвазивные измерения давления-объема (PV)

Vmax (мл/мин) и Vкд (мл/мин) были выше в группе PAB-V по сравнению с группой С и PAB-M в конце исследования, но различия не достигали значимости (C: 83,7±11,8, PAB-V: 122,1±30,3, PAB-M: 94,5±13,8; P=0,42 и C: 73,8±8,3, PAB-V: 99,9±25,3, PAB-M: 84,8±13,6; P=0,57). Pdev (мм рт.ст.) было выше у животных с бандажом в конце исследования по сравнению с контрольными животными с имитацией операции, но не достигало значимости (C: 10±0,9, PAB-V: 18,6±6,2, PAB-M: 20,5±1,9, P=0,16).

До какого-либо вмешательства все животные начали со среднего dP/dt max (мм рт.ст./сек) 831,9±56,8; животные не отличались значимо друг от друга в исходном состоянии (P>0,05). Однако dP/dt max (мм рт.ст./сек) было значительно выше в обработанных митохондриями гипертрофированных сердцах по сравнению с обработанными растворителем сердцами (PAB-V: 506,6±88,1 в сравнении с PAB-M: 894,9±119,23; P<0,05) в конце исследования, тогда как сердца в PAB-M не демонстрировали значимого отличия от контрольных сердец с имитацией операции (C: 777±29,4; P=0,9) (ФИГ. 9-10 и 21A-21B).

Выводы:

Митохондриальная трансплантация поддерживала гипертрофическую адаптацию ПЖ и сохраняла сократительную функцию. Лечение миокардиальной дисфункции путем непосредственного воздействия на митохондриальную дисфункцию может применяться для лечения пациентов с заболеванием легких, влияющим на функцию правых отделов сердца.

Цель данного исследования заключалась в воздействии на нарушение, влияющее на энергетику митохондрий, с целью задержать возникновение сердечной недостаточности. Без ограничения теорией, дисфункция митохондрий сердца имеет определяющее значение при сердечной недостаточности, отчасти из-за повышенных энергетических требований утолщающегося ПЖ; вмешательство было направлено на улучшение функционирования митохондрий с целью максимального повышения выработки энергии посредством трансплантации респираторно-компетентных митохондрий. Авторами настоящего изобретения было установлено, что аутологичные экзогенные митохондрии, получаемые из таких источников, как скелетные мышцы, интернализуются в гипертрофированные кардиомиоциты и усиливают митохондриальную функцию в равной степени, как и митохондрии, получаемые из миокарда ПЖ. Трансплантация аутологичных митохондрий в модели суживания легочной артерии на крупных животных показала, что кардиомиоциты были защищены от апоптотической потери клеток. Кроме того, поддержание гипертрофического роста привело к сохранению сократительной функции в сравнении с необработанными гипертрофированными сердцами, в которых наблюдали признаки дилатации и сократительной недостаточности. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления в настоящем документе описаны способы предотвращения или уменьшения потери кардиомиоцитов при апоптозе и сохранения или улучшения сократительной функции сердца, включающие введение пациенту композиции, включающей митохондрии.

Без ограничения теорией, правый желудочек является основным фактором, определяющим прогноз при сердечной недостаточности, связанной с легочными заболеваниями. Адаптация и недостаточная адаптация ПЖ имеют ключевое значение при течении заболевания. Первоначально сократимость ПЖ увеличивается за счет изменения свойств мышц и компенсаторной мышечной гипертрофии до определенного момента расхождения, когда постнагрузка превышает сократимость, что свидетельствует о недостаточной адаптации, которая является признаком дилатации желудочков. При правосторонней сердечной недостаточности лечение в основном ограничивается воздействием на функцию легких, а не прямым вмешательством в критический энергетический дефицит миокарда ПЖ, который является результатом митохондриальной дисфункции (Hoeper MM, Kramer T, Pan Z, et al. Mortality in pulmonary arterial hypertension: prediction by the 2015 European pulmonary hypertension guidelines risk stratification model. Eur Respir J. 2017; 50(2):pii:1700740; Galie N, Humbert M, Vachiery J-L, et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension. Eur Resp J. 2015; 46:903-975; Tonelli AR, Arelli V, Minai OA, et al. Causes and circumstances of death in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 2013; 188(3):365-369).

Без ограничения теорией, митохондриальная дисфункция, приводящая к снижению способности синтезировать АТФ, как известно, влияет на функцию сердца, поскольку около 90% клеточного АТФ используется для сокращения, расслабления и регуляции кальция (Doenst T, Nguyen TD, Abel ED. Cardiac metabolism in heart failure: Implications beyond ATP production. Circ Res. 2013; 113:709-724). Митохондриальная дисфункция может быть связана с недостаточным контролем качества митохондрий, что приводит к нарушениям передачи метаболических сигналов, биоэнергетики, транспорта кальция, образования активных форм кислорода (АФК) и активации путей гибели клеток. Это приводит к патологическому циклу опережения, который приводит к гибели кардиомиоцитов в результате апоптоза (Brown DA, Perry JB, Allen ME и др. Expert consensus document: mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nat Rev Cardiol. 2016; 14:238-250). Изменения функции митохондрий считаются причиной гипертрофии и недостаточности при перегрузке давлением. В исследованиях терминальной стадии сердечной недостаточности с участием человека было показано, что маркеры энергетического метаболизма при сердечной недостаточности снижены, что привело к мнению, что сердечная недостаточность - как двигатель без топлива (Doenst T, Nguyen TD, Abel ED. Cardiac metabolism in heart failure: Implications beyond ATP production. Circ Res. 2013;113:709-724; Neubauer S. The failing heart-an engine out of fuel. N Engl J Med. 2007; 356:1140-1151). Однако митохондрии играют более сложную роль в регуляции метаболизма и клеточной смерти, нежели оставляют плохо функционирующий миокард в состоянии недостаточностии энергии. Модель правосторонней сердечной недостаточности на поросятах показала, что в митохондриях нарушено окислительное фосфорилирование и присутствуют значительные структурные повреждения, что подчеркивает важность митохондриальной функции и структурного качества при правосторонней сердечной недостаточности, возникающей в результате перегрузки давлением (Noly P-E, Piquereau J, Coblence M, et al. Right ventricular mitochondrial respiratory function in a piglet model of chronic pulmonary hypertension. J Thorac Cardiovasc Surg 2020; 159(1):129-140). Представленные в настоящем документе данные указывают, что кардиомиоциты были лучше защищены от апоптотической потери клеток после обработки митохондриями, тогда как гипертрофированные сердца, обработанные растворителем, демонстрируют более выраженную апоптотическую гибель клеток.

Без огранения теорией, метаболические потребности гипертрофированного ПЖ значительно возрастают, при этом необходимость в увеличении мышечной массы тонкого ПЖ для компенсации повышенного давления требует усиленной митохондриальной поддержки, которая должна обеспечиваться быстро. Однако митохондрии не могут поспевать за быстрым мышечным ростом (Friehs I, Cowan DB, Choi Y-H, et al. Pressure-overload hypertrophy of the developing heart reveals activation of divergent gene and protein pathways in the left and right ventricular myocardium. Am J Physiol Circ Physiol. 2013; 304(5):H697-708; Phillips D, Aponte AM, Covian R, Neufeld E, Yu ZX, Balaban RS. Homogenous protein programming in the mammalian left and right ventricle free walls. Physiol Genomics. 2011; 43(21):1198-1206). В предложенной авторами изобретения модели на животных перегрузка давлением не устраняется, и для поддержания функции необходима митохондриальная адаптация к утолщенной мышце ПЖ. Основываясь на полученных результатах, эта компенсирующая адаптация для приспособления к повышенной нагрузке давлением не присутствует в течение длительного времени, о чем свидетельствует уменьшение толщины стенок гипертрофированных сердец, обработанных растворителем. Напротив, трансплантация митохондрий сохраняет адаптивный гипертрофический рост ПЖ. Кроме того, данные показали, что источник митохондрий для трансплантации не является определяющим фактором для их эффективности. Нет никакой разницы, какой источник митохондрий использовался. Митохондрии скелетных мышц показали такой же результат, как и митохондрии, выделенные из сердечной мышцы. Таким образом, для лечения ГПЖ/НПЖ-опосредованной митохондриальной дисфункции не нужно непременно использовать митохондрии сердечной мышцы. Экзогенные аутологичные митохондрии скелетных мышц сохраняют сократительную функцию плохо функционирующего ПЖ.

Трансплантация митохондрий в качестве терапевтического вмешательства направлена на все аспекты функции и структуры митохондрий. Одной только метаболической манипуляции с митохондриями недостаточно для лечения плохо функционирующего правого желудочка, поскольку также необходимо учитывать структурную целостность митохондрий. Кроме того, трансплантация митохондрий направлена на митохондриальную динамику, которая нарушена в гипертрофированных/плохо функционирующих правых отделах сердца. Рассматриваемым потенциальным механизмом является нарушение митохондриального биогенеза, производство новых митохондрий, как раннее явление в патофизиологии сердечной недостаточности. На ранних стадиях компенсированной гипертрофии сигнализация митохондриального биогенеза сохраняется. Напротив, как только декомпенсированная сердечная недостаточность становится очевидной, сигналы митохондриального биогенеза снижаются.

В заключение следует отметить, что в данном исследовании удалось расширить наше понимание преимуществ митохондриальной трансплантации. В частности, результаты показывают, что экзогенные митохондрии аутологичных скелетных мышц сохраняет сократительную функцию при сердечной недостаточности.

Пример 5: Трансплантация аутологичных митохондрий путем интракоронарной инъекции для защиты миокарда

Проводили эксперименты по исследованию доишемической интракоронарной аутологичной митохондриальной трансплантации (МТ) в качестве терапевтической стратегии для профилактической защиты миокарда в модели на свиньях.

Методы:

Левую коронарную артерию канюлировали у свиней йоркширской породы (n=26). Митохондрии (1×10⁹) или буфер (растворитель [Veh]) вводили однократно в виде болюса (MT_S) или последовательно (10 инъекций в течение 60 минут; MT_SS). Отдельные инъекции вводили антеградно в виде болюса в ствол левой коронарной артерии (1×10⁹ в 6 мл). Последовательные инъекции (10 инъекций по 1×10⁹ в 6 мл буфера для дыхания при каждой инъекции) делали каждые 5 минут. Через 15 минут после инъекции сердце подвергали транзиторной регионарной ишемии (РИ) путем зажима левой передней нисходящей артерии. Через 30 минут РИ петлю снимали и проводили реперфузию сердца в течение 120 минут.

Результаты:

Коронарный кровоток (CBF) и функцию миокарда временно увеличивали до РИ. После 30 минут РИ, в сердцах MT_S и MT_SS значительно увеличивался CBF, который сохранялся на протяжении всей реперфузии (Veh в сравнении с MT_S и MT_SS; P=0,04). MT_S и MT_SS показали значительно увеличенную фракцию выброса (Veh в сравнении с MT_S, P<0,001; Veh в сравнении с MT_SS, P=0,04) и развиваемое давление (Veh в сравнении с MT_S, P<0,001; Veh в сравнении с MT_SS, P=0,03). Регионарная функция, оцениваемая посредством сегментарного укорочения (Veh в сравнении с MT_S, P=0,03; Veh в сравнении с MT_SS, P<0,001), фракционного укорочения (Veh в сравнении с MT_S, P<0,001; Veh в сравнении с MT_SS, P=0,04) и анализа деформации (Veh в сравнении с MT_S, P=0,002; Veh в сравнении с MT_SS, P=0,003), также была значительно улучшена. Хотя различий в области риска между группами лечения не наблюдали, размер инфаркта был значительно уменьшен в обеих группах MT (Veh в сравнении с MT_S и MT_SS, P<0,001).

Выводы:

Доишемическая МТ путем однократных или последовательных внутрикоронарных инъекций обеспечивает профилактическую защиту миокарда, значительно уменьшая размер инфаркта и улучшая глобальную и регионарную функцию сердца.

Пример 6: Защита миокарда путем интракоронарной доставки митохондрий

Аутологичная митохондриальная трансплантация включает снабжение ишемизированной ткани жизнеспособными, респираторно-компетентными митохондриями, выделенными из собственного тела пациента, для облегчения последствий повреждения нативных митохондрий. Были проведены эксперименты для изучения безопасности и эффективности интракоронарной доставки митохондрий в клинически релевантной модели на свиньях.

Методы:

Взрослым свиньям делали анестезию и выделяли аутологичные митохондрии. Животным делали общую анестезию телазолом (2,2-4,4 мг/кг)/ксилазином (1-2 мг/кг) и интубировали. Общую анестезию поддерживали 0,5-2% смесью изофлурана-кислорода. Делали срединную стернотомию, сердце приподнимали в перикардиальной сумке. Затем обеспечивали ангиографический доступ в левую коронарную артерию (ЛКА) путем введения ангиографического катетера 5F JR (Merit Medical Sys, UT) через правую сонную артерию (проводник 5F) в левое коронарное устье под флюороскопией. Захват и биорапределение митохондрий оценивали с помощью ангиографической инъекции в левую коронарную артерию митохондрий, меченных ¹⁸F-родамином-6G, с последующей позитронно-эмиссионной томографией (ПЭТ) (n=3). Профиль безопасности интракоронарной митохондриальной инъекции оценивали в нормальном состоянии, во время коронарной вазоконстрикции и во время тахикардии (n=18). Для оценки терапевтической эффективности интракоронарной трансплантации митохондрий левую переднюю нисходящую артерию обрабатывали в течение 30 минут. В начале реперфузии животным вводили митохондрии (n=8) или раствор растворителя (n=8) с последующей 2-часовой реперфузией.

Результаты:

Интракоронарная доставка митохондрий приводит к быстрому захвату и специфическому биораспределению митохондрий по всему сердцу. Проходимость коронарных артерий и функция миокарда сохранялись во всех протестированных условиях. Интракоронарная инъекция митохондрий приводила к зависимому от концентрации увеличению коронарного кровотока (CBF). Гиперемия, вызванная митохондриями, требует жизнеспособности митохондрий, продукции АТФ и, частично, активации калиевых каналов внутреннего выпрямления (KIR) сосудов. Интракоронарная доставка митохондрий привела к незначительному усилению постишемической функции миокарда, улучшению CBF и уменьшению размера инфаркта по сравнению с контролем.

Внутрикоронарная трансплантация митохондрий представляет собой безопасный и эффективный метод улучшения перфузии миокарда, функции миокарда и выживаемости сердечной ткани.

ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Следует понимать, что хотя изобретение было описано вместе с подробным описанием, представленное выше описание предназначено для иллюстрации, а не ограничения объема изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации входят в объем следующей формулы изобретения.

Изобретение относится к медицине, а именно кардиологии. Способ лечения или предупреждения сердечной недостаточности у субъекта, имеющего заболевание легких, включает введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенные митохондрии или комбинированное митохондриальное средство. Изобретение обеспечивает безопасное и эффективное лечение или профилактику сердечной недостаточности при заболеваниях легких, влияющих на функцию правых отделов сердца, путем доставки митохондрий в ткань пациента. 8 з.п. ф-лы, 22 ил., 6 пр.

1. Способ лечения или предупреждения сердечной недостаточности у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенные митохондрии или комбинированное митохондриальное средство, где субъект имеет заболевание легких.

2. Способ по п.1, где композицию вводят субъекту путем интрамиокардиальной инъекции.

3. Способ по п.1, где субъект имеет или подвергается риску развития сердечной недостаточности-гипертрофии правого желудочка (ГПЖ), гипертрофии левого желудочка (ГЛЖ), недостаточности правого желудочка (НПЖ) или недостаточности левого желудочка (НЛЖ).

4. Способ по п.1, где заболевание легких влияет на функцию правого желудочка.

5. Способ по п.1, где композицию вводят субъекту путем инъекции композиции в кровеносный сосуд субъекта.

6. Способ по п.1, где митохондрии являются аутогенными.

7. Способ по п.1, где митохондрии являются аллогенными.

8. Способ по п.1, где митохондрии являются ксеногенными.

9. Способ по п.1, где композицию вводят субъекту путем инъекции композиции в кровеносный сосуд в сердце.