СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СМЕШАННОГО РАСТВОРА АКРИЛОВЫХ МОНОМЕРОВ И ШТАММ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C12N9/78 C12N9/88 C12P13/02 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous, а также способа прямого биокаталитического получения смешанного раствора акриловых мономеров, содержащего акрилат аммония и N-изопропилакриламид, с использованием клеток этого штамма.

Уровень техники

Широкий спектр выпускаемых акриловых полимеров включает в себя гетерополимеры, в состав которых входит несколько типов акриловых мономеров, например, гидрофильные незаряженные (например, акриламид), гидрофильные отрицательно заряженные (например, акриловая кислота) и гидрофобно-гидрофильные, заряженные как положительно, так и отрицательно (например, N-замещенные акриламиды N-изопропилакриламид, акриламидо-третбутилсульфоновая кислота, N,N-диметиламионопропилакриламид). Каждый из мономеров придает полимеру определенные физико-химические свойства, что существенно расширяет круг применения полимеров. Водорастворимые гетерополимеры, состоящие из трех типов мономеров применяются, в том числе, как адсорбенты и структурообразователи во многих областях промышленности - для очистки загрязненных вод, подготовки питьевой воды, улучшения эффективности нефте- и газолобычи (как компонент буровых растворов, растворов для тампонажа скважин и гидроразрыва пластов), в горно-добывающей промышленности (Полиакриламид. - М., 1992.). Для получения таких полимеров используются, в качестве сырья, смешанные растворы акриловых мономеров, содержащие акриламид, акриловую кислоту, и N-замещенный акриламид, в частности, N-изопропилакриламид.

Акриловую кислоту и N-замещенный акриламид для составления таких растворов получают разными способами, в том числе акриловую кислоту - путем парофазного аммонолиза пропилена или биокаталитической гидратации акрилонитрила (US 5135858, US 6361981 В1, RU 2177034 С1), и N-замещенные акриламиды - путем ацилирования аминов хлорангидридом акриловой кислоты (MacWilliams D.S. Functional monomers. Their preparation, polymerization, and application. New York: M.Decker, 1973) или биокаталитическим ацилированием аминов (RU 2539033 С1). В результате, получение смешанных растворов мономеров технологически усложнено, как из-за разобщенности операций по получению индивидуальных мономеров, так и из-за токсичности реагентов, используемых для их получения.

Альтернативным способом получения акриловой кислоты и N-замещенного акриламида может являться использование клеток бактерий для прямого биокаталитического получения из акриламида смешанного раствора двух указанных акриловых мономеров. Аналоги такого конкретного способа на сегодняшний день неизвестны. Наиболее близким можно считать способ прямого биокаталитического получения смешанных растворов двух акриловых мономеров, акриламида и акрилата аммония, из акрилонитрила или акриламида с помощью штамма Rhodococcus rhodochrous ВКМ Ас-1728 (RU 2304165 С1). Указанный штамм обладает нитрил-трансформирующей активностью, в результате которой из акрилонитрила образуется акриламид, и одним типом акриламид-трансформирующей активности, а именно акриламид-гидролизующей активностью, в результате которой из акриламида получается акрилат аммония. Соответственно, указанный штамм можно считать штаммом - наиболее близким аналогом. Недостатками способа, описанного в RU 2304165 С1, является использование высокотоксичного, летучего и пожароопасного акрилонитрила, и возможность получения только акриламида и акриловой кислоты в смешанном растворе.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа прямого биокаталитического получения смешанного водного раствора двух акриловых мономеров, а именно акрилата аммония и N-изопропилакриламида.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом является получение штамма бактерий, обладающего двумя типами акриламид-трансформирующей активности.

Он достигается тем, что получен рекомбинантный штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас-2194, обладающий акриламид-гидролизующей и акриламид-трансферазной активностями.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение смешанного раствора двух акриловых мономеров, без использования акрилонитрила.

Для достижения технического результата предложен способ получения смешанного раствора акриловых мономеров, заключающийся в том, что получают суспензию клеток штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас-2194, для чего в колбу Эрленмейера объемом 750 мл, содержащую 50 мл синтетической питательной среды MS следующего состава, масс. %: глюкоза - 0,5; мочевина - 0,6; Na2HPO4⋅12H20 - 0,28, KH₂PO₄ безводный - 0,08, MgSO₄⋅7H₂O - 0.05, FeSO₄⋅7H₂O - 0.00027, CoCl₂⋅6H₂O - 0.001, апрамицин 0.01, дрожжевой экстракт 0,1, остальное вода добавляют 0,5 мл культуры 10⁹ кл/мл заявляемого штамма, предварительно выращенной на той же среде, инкубируют колбу с перемешиванием 300 об/мин при 30°С в течение 50 час, полученную биомассу штамма отделяют центрифугированием при 5 тыс.об/мин, затем полученную суспензию смешивают с водным растворами акриламида рН от 7 до 8 и водным раствором изопропиламина рН от 8,5 до 10 в термостатируемом сосуде при температуре от 20 до 40°С, из расчета, на 1 л реакционной смеси, от 1 до 10 г клеток по сухой массе, инкубируют с перемешиванием от 100 до 250 об/мин в при 37°С в течение 7 часов, отделяют клетки центрифугированием, затем смесь концентрируют вакуумным упариванием в три раза на любом роторном испарителе, и получают смешанный раствор акрилата аммония и N-изопропилакриламида.

Характерными особенностями заявляемого способа является использование акриламида, а не акрилонитрила, в качестве стартового соединения, а также прямое получение смешанного раствора двух акриловых мономеров, акрилата аммония и N-изопропилакриламида, с помощью клеток заявляемого штамма. Заявляемый способ позволяет получать растворы, содержащие от 53 до 54 г/л акрилата аммония, и от 10 до 11 г/л N-изопропилакриламида.

Микробиологическая характеристика заявляемого штамма

Морфологические свойства. Клетки штамма неподвижны и окрашиваются по Граму. Спор не образуют, некислотоустойчивы. В возрасте 18-20 ч клетки образуют длинные (до 20 мкм) слабо ветвящиеся нити, которые через 48-72 ч распадаются на палочковидные и кокковидные элементы. В старых культурах наблюдаются плеоморфные клетки в виде колб, груш, булав. Деление клеток происходит по раскалывающемуся и сгибающемуся типам.

Культуральные свойства. На плотных питательных средах (МПА, Хоттингер,) через 48 ч роста штамм образует круглые гладкие колонии диаметром 1 мм, окрашенные от палево-розового до розово-оранжевого цвета. При росте на мясо-пептонном бульоне образуются пленка и осадок. Лакмусовое молоко не изменяется.

Физиологические свойства. Облигатный аэроб. Редуцирует нитраты. Тест с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра отрицательные. Образует сероводород. Штамм оксидазоотрицательный, каталазо- и фосфатазаположительный. Крахмал и целлюлозу не гидролизует, твин 60 и 80 гидролизует.Аденин не утилизирует. Штамм растет при рН 6-9, температуре 5-45°С. Кислоту образует из следующих сахаров и спиртов: глюкозы, фруктозы, мальтозы, сахарозы, сорбита, манита и глицерина. Газообразования ни на одном сахаре не обнаружено. В качестве единственного источника азота используют соединения аммония, нитраты и мочевину. В качестве единственного источника углерода использует мальтозу, манит, сорбит, глюкозу, глицерин, лактат, пируват, бензоат, n- и m-гидроксибензоат, тирозин; не использует рамнозу, галактозу, инозит, а-кетоглутарат. В клеточной стенке заявляемого штамма содержатся мезо-диаминопимелиновая кислота, арабиноза и галактоза, что характерно для коринеподобных бактерий с IV типом клеточной стенки. Клетки также содержат липид A(LCN), характерный для родококков. Последовательность гена 16S рибосомальной РНК (SEQ ID NO: 01) соответствует роду Rhodococcus, виду rhodochrous.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана схема плазмиды pRY3-aam, содержащей ген ациламидазы. На схеме обозначены фрагменты ДНК, из которых состоит плазмида: Phn569 - промоторная область генов нитрилгидратазы, aam - ген ациламидазы, cblA - ген кобальт-зависимого транскрипционного регулятора, Apr - ген устойчивости к апрамицину, rep рМВ1 - репликон для поддержания в Е. coli, oriT - сайт начала конъюгативного переноса, rep pRC4 - репликон для поддержания в Rhodococcus.

На фиг. 2 показана схема получения смешанного раствора двух акриловых мономеров, состоящая из трех этапов, обозначенных текстом на схеме. Детальные пояснения по осуществлению этапов приведены в примерах.

Осуществление изобретения

Изобретение осуществлено путем:

1) конструирования рекомбинантного штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous, обладающего двумя типами акриламид-трансформирующей активности - акриламид-трансферазной и акриламид-гидролизующей;

2) разработки способа прямого биокаталитического получения смешанного раствора двух акриловых мономеров с использованием клеток заявляемого штамма.

Заявляемый штамм получен в три этапа. На первом этапе засевают культуру штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ АС-926 (SU 1731814 А1) на агаризованную питательную среду, содержащую хлороацетамид, и отбирают отдельные колонии, появляющиеся на ней. Штаммы, отобранные таким образом, не обладают акриламид-гидролизующей активностью. На втором этапе один из полученных штаммов засевают на агаризованную питательную среду, не содержащую хлороацетамид, и содержащую ацетамид, как единственный источник углерода. Затем, отбирают отдельные колонии, появляющиеся на ней. Среди них отбирают штаммы, у которых акриламид-гидролизующая активность восстановилась. Среди штаммов, отобранных таким образом, выбирают варианты, акриламид-гидролизующая активность которых повышена, по сравнению со штаммом Rhodococcus rhodochrous ВКПМ АС-926. На третьем этапе в отобранном штамме, с использованием методов генетической инженерии, удаляют гены нитрилгидратазы, и вводят плазмиду, содержащую ген ациламидазы из Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1793 (RU 2399672 С1).

Для получения клеток заявляемого штамма, обладающих необходимыми для осуществления заявляемого способа акриламид-гидролизующей и акриламид-трансферазной активностями, штамм выращивают при 25-30°С в течение 48-72 часов на синтетических средах, содержащих в качестве источника углерода сахара или спирты в концентрациях 0.1-4%, а в качестве источника азота соединения аммония, нитраты или мочевину в концентрациях 0.4-2%, в качестве источника фосфора - растворимые фосфаты натрия и калия в концентрациях 0,01-0,5%, в качестве источника железа и магния - сульфаты железа и магния в концентрациях 0,0001-0,005%. Полученные клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 5-16 тыс.об/мин, ресуспендируют до концентрации 20-40 г по сухой массе/л в фосфатном буфере следующего состава, г/л: KH₂PO₄ безводный 6.8, NaOH 2, рН 7,0-8,0, и хранят при 4°С.

Акриламид-гидролизующую активность клеток штамма определяют по скорости гидролиза акриламида по следующей методике:

Суспензию клеток в культуральной жидкости центрифугируют в течение 1 минуты при 10 тыс.об/мин, отбрасывают надосадочную жидкость, ресуспендируют осадок до концентрации 0,51 г по сухой массе/л в фосфатном буфере. Затем, смешивают 100 мкл 1,42% водного раствора акриламида и 100 мкл суспензии клеток. Инкубируют при 37°С 20 минут, добавляют 2 мкл концентрированной HCl, отделяют клетки центрифугированием в течение 1 минуты при 10 тыс.об/мин при 0°С, и в надосадочной жидкости определяют содержание аммония. Активность клеток выражают в единицах, соответствующих количеству мкМ ионов аммония, образовавшихся за 1 минуту в расчете на 1 мг сухого веса клеток.

Акриламид-трансферазную активность клеток штамма определяют по скорости синтеза N-изопропилакриламида (ИПАА) по следующей методике:

Суспензию клеток в культуральной жидкости центрифугируют в течение 1 минуты при 10 тыс.об/мин, отбрасывают надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в дистиллированной воде до концентрации 20,4 г по сухой массе/л. Затем, смешивают 51,6 мкл 43% (7,3 М) водного раствора изопропиламина (рН 10), 41,7 мкл 64% (9 М) водного раствора акриламида и 250 мкл суспензии клеток, доводя смесь водой до конечного объема 500 мкл. Инкубируют при 30°С 1 ч, отделяют клетки центрифугированием в течение 1 минуты при 10 тыс.об/мин при 0°С, отбирают 200 мкл надосадочной жидкости, добавляют 9,2 мкл концентрированной HCl, и определяют содержание ИПАА. Активность клеток выражают в единицах, соответствующих количеству мкМ ИПАА, синтезированного за 1 мин в расчете на 1 мг сухого веса клеток.

Получение смешанного раствора двух акриловых мономеров, а именно акрилата аммония и N-изопропилакриламида, осуществляют смешиванием водных растворов акриламида и изопропиламина в концентрациях от 1% до 10% с суспензией клеток (от 1 до 10 г клеток по сухой массе на 1 л реакционной смеси) в термостатируемом сосуде (при температуре от 20 до 40°С, предпочтительнее от 25 до 30°С) и с последующим перемешиванием (от 100 до 250 об\мин) в течении 1-48 час. Значение рН варьирует от 8,5 до 11, предпочтительнее от 9 до 11. Из полученной смеси отделяют клетки, затем смесь концентрируют вакуумным упариванием, в ходе которого удаляется непрореагировавший изопропиламин.

Пример 1. Конструирование плазмиды pRY3-aam, содержащей ген ациламидазы.

Плазмида pRY3-aam состоит из фрагментов ДНК Pnh (последовательность SEQ ID NO: 02), aam (последовательность SEQ ID NO: 03), cblA (последовательность SEQ ID NO: 04), и pRY3-Rho-MCS (последовательность SEQ ID NO: 05). Фрагменты ДНК Рнг, aam, cblA и pRY3-Rho-MCS наработаны с помощью полимеразной цепной реакции, с использованием праймеров и ДНК матриц, приведенных в таблице 1, и объединены в плазмиду pRY3-aam с помощью полимеразной цепной реакции.

Пример 2. Получение заявляемого штамма, обладающего акриламид-гидролизующей и акриламид-трансферазной активностями.

Измеряют акриламид-гидролизующую активность клеток штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ АС-926 по стандартной методике (см. выше), активность составляет от 7 до 8 единиц. Затем, суспензию клеток штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ АС-926 засевают шпателем на агаризованную среду следующего состава, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; MgSO₄*7H₂O -0,5; FeSO₄ - 0.05; глюкоза - 10; мочевйна - 6; хлороацетамид - 2, вода - остальное, и инкубируют при температуре 30°С в течение недели. Отбирают наиболее крупные отдельные колонии, пересевают на агаризованную среду такого же состава, и выбирают штамм, акриламид-гидролизующая активность у которого отсутствует. Затем, полученный штамм засевают шпателем на агаризованную на среду такого же состава, за исключением того, что исключают из состава мочевину и хлороацетамид, и включают в состав ацетамид, 8 г/л. На указанной среде инкубируют при температуре 30°С в течение недели. Отбирают отдельные колонии разного размера, и из них выбирают штамм, обладающий акриламид-гидролизующей активностью на уровне от 10 до 15 единиц. В таком штамме проводят удаление генов нитрилгидратазы обычными методами генетической инженерии. Затем, в полученный штамм с помощью электротрансформации вводят плазмиду pRY3-aam, полученную, как в примере 1, и получают заявляемый штамм. Акриламид-гидролизующая активность клеток полученного штамма составляет 10 единиц, акриламид-трансферазная активность клеток полученного штамма составляет 0,2 единицы.

Пример 3. Получение биомассы клеток заявляемого штамма В колбу Эрленмейера объемом 750 мл, содержащую 50 мл синтетической питательной среды MS следующего состава, масс. %: глюкоза - 0,5; мочевина - 0,6; Na₂HPO₄⋅12H₂O - 0,28, KH₂PO₄ безводный - 0,08, MgSO₄⋅7H₂O - 0.05, FeSO₄⋅7H₂O - 0.00027, CoCl₂⋅6H₂O - 0.001, апрамицин 0.01, дрожжевой экстракт 0,1, вода - остальное, добавляют 0,5 мл культуры (10⁹ кл/мл) заявляемого штамма, предварительно выращенной на той же среде. Затем колбу инкубируют с перемешиванием (300 об/мин) при 30°С в течение 50 час. Полученная таким образом культура обладает акриламид-гидролизующей активностью 10 единиц, и акриламид-трансферазной активностью 0,2 единицы. Полученную биомассу штамма отделяют центрифугированием при 5 тыс.об/мин и хранят при +4°С.

Пример 4. Получение смешанного раствора двух акриловых мономеров с использованием клеток заявляемого штамма

В стеклянный сосуд, оборудованный мешалкой, добавляют 250 мл суспензии клеток заявляемого штамма, полученных как в примере 3, с концентрацией 20,4 г по сухой массе/л, затем, при постоянном перемешивании, 52 мл водного раствора изопропиламина (43%, рН10), и 42 мл водного раствора акриламида (64%). Реакционную смесь инкубируют с перемешиванием при 30°С в течение 7 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс.об/мин). В полученном образце концентрация акрилата аммония составляет от 53 до 54 г/л, концентрация N-изопропилакриламида составляет от 10 до 11 г/л.

Таким образом,

- сконструирован штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас-2194, обладающий, по сравнению со штаммом - наиболее близким аналогом Rhodococcus rhodochrous ВКМ Ас-1728, двумя типами акриламид-трансформирующей активности, а именно акриламид-гидролизующей и акриламид-трансферазной;

- разработан способ прямого биокаталитического получения смешанного раствора двух акриловых мономеров, а именно акриловой кислоты и N-изопропилакриламида, с использованием клеток заявляемого штамма, который позволяет получать водные растворы, содержащие от 53 до 54 г/л акрилата аммония, от 10 до 11 г/л N-изопропилакриламида.

Перечень последовательностей

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Патент тройная

смесь.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2022-09-29">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>N</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение &quot;Национальный исследовательский центр

&quot;Курчатовский институт&quot; (НИЦ «Курчатовский

институт»)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>National Research Center &quot;Kurchatov

Institute&quot; (NRC &quot;Kurchatov

Institute&quot;).</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СМЕШАННОГО

РАСТВОРА АКРИЛОВЫХ МОНОМЕРОВ И ШТАММ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ЕГО

ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1522</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1522</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Rhodococcus rhodochrous

</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcaacggagagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgctt

aacacatgcaagtcgaacgatgaagcccagcttgctgggtggattagtggcgaacgggtgagtaacacgt

gggtgatctgccctgcacttcgggataagcctgggaaactgggtctaataccggataggaccggcggccg

catggctgtcggtggaaaggttttccggtgcaggatgggcccgcggcctatcagcttgttggtggggtaa

cggcccaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggc

ccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgc

gtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagtaccgacgaagcgcgagtgacggtaggtaca

gaagaagcaccggccaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttgtccggaatta

ctgggcgtaaagagctcgtaggcggtttgtcgcgtcgtctgtgaaaacccgcagctcaactgcgggcttg

caggcgatacgggcagacttgagtactgcaggggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcag

atatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctctgggcagtaactgacgctgaggagcgaaagcgtg

ggtagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggcgctaggtgtgggtttcctt

ccacgggatccgtgccgtagctaacgcattaagcgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaact

caaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaagaacct

tacctgggtttgacatacaccggaccgccccagagatggggtttcccttgtggtcggtgtacaggtggtg

catggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcctgt

gttgccagcaattcggttggggactcgcaggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacg

tcaagtcatcatgccccttatgtccagggcttcacacatgctacaatggccggtacagagggctgcgata

ccgcgaggtggagcgaatcccttaaagccggtctcagttcggatcggggtctgcaactcgaccccgtgaa

gtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgc

ccgtcacgtcatgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcctaacccctcgtgggagggagccgtcgaa

ggtgggatcggcgattgggacgaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaaggtgcggctggatcacctcc

ttt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>569</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..569</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Rhodococcus

rhodochrous</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttggacgaccacggttgctacgagtgtgcggagccaaccataggcatca

tgcgatcgccggagtcttcatcctgttttgggatgcgcaggattaacacatctacacattgacatccgtt

ccgatgtgaagtaaaaattgtcacgtagggcggcaggcgaagtctgcagctcgaacatcgaagggtggga

gccgagagatcggagacgcagacacccggagggaacctagcctcccggaccgatgcgtgtcctggcaacg

cctcaagattcagcgcaagcgattcaatcttgttacttccagaaccgaatcacgtccccgtagtgtgcgg

ggagagcgcccgaacgcagggatggtatccatgcgccccttctcttttcgaacgagaaccggccgctaca

gccgacccggagacactgtgacgccgttcaacgattgttgtgctgtgaaggattcactcaagccaactga

tatcgccattccgttgccggaacatttgacaccttctccctacgagtagaagccagctggacccctcttt

gagcccagctccgatgaaaggaatgaggcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1434</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1434</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Rhodococcus

rhodochrous</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atggccgaacagaatctgcattggctctccgctaccgagatggcggcgt

cggtcgcgtcgaacaatctctcgcccaacgagattgccgaagcgatgatccagcgcgtcgacgccgtcaa

tccgtcgatcaacgcgatagtgcagttcgatcgcgagcaggtgacgcgcgatgcggccgaactctcacgg

caacaggaagcgggcgagaagctcggcccgctgcacggcgttccgttcacgatcaaagatctgacggcag

tcgacgggctgccgaccacgttcgggatgaagccgatggccgacaacatcgcgacgggaaatgccgtcgt

cgtggacaggctgcgaggcgccggcggactgttcctgggaaagacgaacactcccgaaagtggttactac

ggtggcacggacaaccacctgtacgggccgacgcacaacccgtggaagctcggcaacagcgcgggcgggt

ccagtggcggtgcgtcggctgccgtggctgcaggcctcgggccactcgccgagggcagtgacggcgcggg

atcggtgcgtatcccgtcggcgctctgcggggtcgtcgggttgaagccgaccaccggcgtcatcccgcag

accatcctggccgggcgcttctacaactgggcgtatcacggtccgatcacccggactgttgccgacaacg

cgctgatgctcgacatcatggccgggccggacaatgcggacccgctctcgatcgagcgtgccgagacctc

gtacgtcgaagcctcgaagggcgacgtgaagggccttcgcgtggcgtggtcgccgaatctcggtctcggc

catgttgatccggaggtgctggcagtgtgcctcgacgcgctggcggcattcgaggaattgggtgcccaga

tcaccgaggcgaccccgcagtggggaaatccgtcggagtcgatgtggaacggcatctgggttcccggttt

cgcttccgaatacgacttgctcgactgggagaaccagcgcggcgaggtcgacgacaacctgatcgagatc

atgcacgaggccgagcggctcaccggtgtcgacgtcgggcgggccgacgcattccgcggcgtcatgtggg

acacgtggacgacgttcatgaacgactacgacgtgttggtctcgccgaccctggcttcggccacgttccc

gctcagtcagttcgcgccgtcgtggctcgaaggtgcgtcgctgcgtgagcagttgctcgattggctcttc

acctacccgtacaacatgctcaacaatccggcgatcaccgtgcccgccggattcaccgccgacggtcgac

cggtggggctgcagatcgccgcacgtcaccgccgggacgcactggtcttgcggactgccgcgaacttcga

agcggtgcgtccgtgggcggacaagaagccggccgattcactggtcgtggcctag</INSDSeq_seque

nce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1245</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1245</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Rhodococcus

rhodochrous</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctcacacaattggctagattggtgtgatgacgtctgaatcgagctcgac

tcgatgatcggtggagcgcatggaatcgatggccatcatcgactgacatcccctgcgtttccatccagca

gcagtgcgggcgtaccccgacggggctgagccgacggggtacgcccgcacttcatcaatgacgttctgag

gcacacagcgcagagtcgagctgagtgcctcagaacgtcatgacggtggttcctaattcggctcggtggg

tactgagctcgcggaaggtaacgcggtgacgctgtaggcgttcatggcaagtgggactccggtgcgccga

gcctgaggtgttcgatatggtataccgcttcgtccaacaacgacgcgacatgcgagtcgtagaggctgta

caccacgctacgaccactgcgttcgccgatcaccaaccgcagcgctcgcaacaggcggagctggtgagaa

accgcaggttgttccataccgacagcctcggcgagctcggtgactccgcacggtccttgccgcaacctgg

ccaaaatcaacagtcgattcggtgacgccaatgcctgcaaagtctccgcgactgttgccgccgcagccgg

atccaaagcgaccaccggggtcgctgaacgaacccgcataccgtgtcccatgcaccaattcaatcacacc

tatacacatgtaaatctcaacactcttgcatgcattggcttcaacccccttcctgccgcaataccggtag

ataggcccttggcggatcgacacggataggcgcagcgctcccgcccgccaacctgaacatgaataacggc

agtacgcacccagcacgcaggaacaggcacccgccacaagttttcgcgcggtgaccacgccgccctgctc

ggaaacgaaggaaaatacgtgtctaaccgctcgccccgccgagaacgagagaaccggatcaacccgttcc

acccggtagaagatcaagactgtctaaccgataccgacctcgcaactgtcatcagagccctcaccggcga

agctgcattccgtccttacgaccgaaaagacaagtgatatctgcgtcttcatccatccgggcctcgcggt

gccggtccgcggcatcggcacccggaaacgcctccgacgggtagtgtgggcggcagcggccgttgaagga

ttaatcccgcgggtctcacgtggacaggaccggtccgatccgcacggcgccatttccgtagtcgggcccc

acccaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>3688</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..3688</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Rhodococcus

rhodochrous</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtaccctgcaggaattcgaatgattaatttagctagcgtatttgcagt

accagcctacggcccacagaatgatgtcacgctgaaaatgccggcctttgaatgggttcatgtgcagctc

catcagcaaaaggggatgataagtttatcaccaccgactatttgcaacagtgccgttgatcgtgctatga

tcgactgatgtcatcagcggtggagtgcaatgtcgtgcaatacgaatggcgaaaagccgagctcatcggt

cagcttctcaaccttggggttacccccggcggtgtgctgctggtccacagctccttccgtagcgtccggc

ccctcgaagatgggccacttggactgatcgaggccctgcgtgctgcgctgggtccgggagggacgctcgt

catgccctcgtggtcaggtctggacgacgagccgttcgatcctgccacgtcgcccgttacaccggacctt

ggagttgtctctgacacattctggcgcctgccaaatgtaaagcgcagcgcccatccatttgcctttgcgg

cagcggggccacaggcagagcagatcatctctgatccattgcccctgccacctcactcgcctgcaagccc

ggtcgcccgtgtccatgaactcgatgggcaggtacttctcctcggcgtgggacacgatgccaacacgacg

ctgcatcttgccgagttgatggcaaaggttccctatggggtgccgagacactgcaccattcttcaggatg

gcaagttggtacgcgtcgattatctcgagaatgaccactgctgtgagcgctttgccttggcggacaggtg

gctcaaggagaagagccttcagaaggaaggtccagtcggtcatgcctttgctcggttgatccgctcccgc

gacattgtggcgacagccctgggtcaactgggccgagatccgttgatcttcctgcatccgccagagggcg

ggatgcgaagaatgcgatgccgctcgccagtcgattggctgtcctcataattcgaaagtaagctaggtga

agatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccc

cgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaa

aaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactg

gcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaa

ctctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataag

tcgtgtcttaccgggttggaatgattaatttagctagactcaagacgatagttaccggataaggcgcagc

ggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagata

cctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagc

ggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctg

tcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaa

aaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcct

tggtttcatcagccatccgcttgccctcatctgttacgccggcggtagccggccagcctcgcagagcagg

attcccgttgagcaccgccaggtgcgaataagggacagtgaagaaggaacacccgctcgcgggtgggcct

acttcacctatcctgcccggctgacgccgttggatacaccaaggaaagtctacacgaaccctttggcaaa

atcctgtatatcgtgcgaaaaaggatggatataccgaaaaaatcgctataatgaccccgaagcagggtta

tgcagcggaagctagtgctcaccgaccactctgatcgagaagttctgccgcacccaccagccgtacccgg

ccaaccttccgcagtcccagccgtacgaaacggtctcgtgccactccaccggccctggtgtcgatcgact

acaaaccaagatccccacacacctcatgcactaaagctgcgaccacgaagaacaaggtggtccgggtaag

acggaagggagttttcccaggagggtcgccgaaacatctgacttggttggcgtgtcctacataaaaaaat

tgatcttgcgtgtgagggtgtcacgcatggatatgagcgggggatctctcagtggggactgggagcagtt

gtggctgcctctgtggccgctcgcaacggacgatttgttgcttggggtctaccggatgcctcgccaggat

gcgctcgatcggcgctaccttgaggccaatccgcaggcgctgagcaatctcctcgtcgtcgatgtcgatc

atccagacgcggcactgcgggctctgtctgccgccggcaaccatcccttgccgaacgcgatcgtggaaaa

cccgcgcaatggacacgcacatgcggtgtgggcattgaccgaacctttcacgcgcaccgagtacgccaga

cgtaagccactcgcttatgccgcagcggtaaacgaggggctgcgtcgagctgtcgatggcgatgccgcct

attcggggttgatgacgaagaacccgactcactcagcctgggacacacactggatccacgccgagactcg

atcgctggcagatctcgaacatgacctcggaaagcatatgccgccaccccggtggcgacagagcaaacgt

cgtcgcgaagacccagtcggactcggacgtaattgcatgctcttcgagacggcacgcacttgggcatacc

gcgaattgcgttgccattggggagatcccgaaggtttagggaaagcaattcaggtcgaagccgcagacct

taacgctgccttctctgagcctttgccggtaagcgaagtacgagctatcgcagccagcattcaccgctgg

atcgtcaccaagtcccgcatgtgggccgatggccctgcggtttacgaagccaccttcgtcgctatccaat

ccgctcgcggacgcaagatgacggagaagaagcgcgaggccaatcgtcgccgtgcaacgaagtacgaccg

cgacctcgtgaggaaggaggcgaccgatgggagctgagacgccggcccggcgaacccgcacagctcgcga

agtggcggaacgaatcggtgcgtccccacgcacggtgcggcgcatcatcgcggagcctcgagcttcatac

gaagctcgagcagctgaacgtcgaaagcaagtactcgaactccgtgcgagcgggatgaagctgcgtgaga

tcgcggcggaggtaggtatgtcggtcggtggagtagggacgatcctgcatcacgcccgtaagaccgagca

gtctaaggctgaaggagctatggcatgaacgacgccatatcggcccgcatcactgcaatgcaggcccaac

tgacggctgtacataccgagctacgtgctctagcggagctggtggacatgcttgatgaagctttctaga<

/INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас-2194, обладающий двумя типами акриламид-трансформирующей активности, а именно акриламид-гидролизующей и акриламид-трансферазной активностями. Также предложен способ получения смешанного раствора акрилата аммония и N-изопропилакриламида с использованием указанного штамма. Изобретение обеспечивает эффективное получение смешанного раствора акрилата аммония и N-изопропилакриламида. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Рекомбинантный штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас-2194, обладающий двумя типами акриламид-трансформирующей активности, а именно акриламид-гидролизующей и акриламид-трансферазной активностями.

2. Способ получения смешанного раствора акрилата аммония и N-изопропилакриламида, заключающийся в том, что выращивают клетки штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас-2194 в питательной среде для Rhodococcus rhodochrous, инкубируют с перемешиванием 300 об/мин при 25-30°С в течение 48-72 ч, полученную биомассу штамма отделяют центрифугированием, затем полученную суспензию смешивают с водным раствором акриламида рН от 7 до 8 и водным раствором изопропиламина рН от 8,5 до 10 в термостатируемом сосуде при температуре от 20 до 40°С из расчета на 1 л реакционной смеси от 1 до 10 г клеток по сухой массе, инкубируют с перемешиванием от 100 до 250 об/мин при 20-40°C в течение 1-48 часов, отделяют клетки центрифугированием, затем смесь концентрируют вакуумным упариванием и получают смешанный раствор акрилата аммония и N-изопропилакриламида.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что реакционную смесь инкубируют при 30°С в течение 7 часов.

4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что смесь концентрируют вакуумным упариванием в три раза на любом роторном испарителе.