ФЕРМЕНТ АЦИЛАМИДАЗА, ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ ЕЕ, И БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ СПОСОБ СИНТЕЗА N-ЗАМЕЩЕННЫХ АКРИЛАМИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АЦИЛАМИДАЗЫ Российский патент 2012 года по МПК C12N9/80 C12P1/04 

Заявляемая группа изобретений относится к биотехнологии и касается фермента с ацилирующей активностью и способа синтеза N-замещенных акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида, с использованием этого фермента как в изолированном состоянии, так и в составе клеток Е.coli.

N-замещенные алифатические акриламиды являются мономерами, широко используемыми для производства водорастворимых полимеров, которые применяют для создания флокулянтов, адсорбентов, и структурообразователей, находящих применение в промышленности и сельском хозяйстве (Полиакриламид. - М., 1992).

Промышленное производство N-замещенных акриламидов основано на химических способах синтеза, наиболее распространенным из которых является ацилирование алифатических аминов хлорангидридами акриловой и метакриловой кислот (Mac Williams D.S. Functional monomers. Their preparation, polymerization, and application. New York: M.Decker, 1973). Недостатком этого способа является использование крайне ядовитых хлорангидридов, а также токсичных органических растворителей.

Альтернативным подходом к синтезу N-замещенных акриламидов является биокаталитический синтез. Известен способ биокаталитического синтеза N-замещенных акриламидов в водной среде при невысокой температуре в присутствии селективного биокатализатора - клеток штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ac-1793, обладающих ацилирующей активностью (RU 2399672). Рассмотрим его в качестве ближайшего аналога заявляемого способа.

Недостатком способа - ближайшего аналога является необходимость использования для выращивания штамма-биокатализатора дорогостоящего компонента среды ацетанилида, снижающего конкурентоспособность процесса.

Отсутствие сведений о ферменте, катализирующем синтез N-замещенных акриламидов, и о гене, кодирующем этот фермент, не позволяет использовать методы генетической инженерии для конструирования более совершенных биокатализаторов этого процесса.

Задачей заявляемой группы изобретений является расширение арсенала биокаталитических способов синтеза в водной среде N-замещенных акриламидов.

Задача решена путем:

- выделения нового фермента, обладающего ацилирующей активностью - ациламидазы АА37 из штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ac-1793 (RU 2399672);

- клонирования фрагмента ДНК DAA37, кодирующего заявляемый фермент, и определения его нуклеотидной последовательности;

- разработки способа синтеза в водной среде N-замещенных акриламидов с использованием фермента ациламидазы АА37 в изолированном состоянии или в составе клеток Е.coli, содержащих фрагмент ДНК DAA37.

Заявляемый фермент ациламидаза АА37 обладает ацилирующей активностью с уникальной субстратной специфичностью и способен ацилировать амины в водной среде. Благодаря таким каталитическим особенностям обнаруженной ациламидазы при смешивании водных растворов акриламида и аминов в присутствии фермента ациламидазы АА37 (аминокислотная последовательность SEQ ID NO 2) происходит синтез N-замещенных акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида.

Фрагмент ДНК DAA37 из Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ac-1793, кодирующий заявляемый фермент, обладает уникальной нуклеотидной последовательностью. Этот фрагмент после введения его в штаммы бактерий Е.coli в составе рекомбинантной плазмиды определяет синтез заявляемой ациламидазы клетками Е.coli. Штаммы бактерий Е.coli, в которые введена плазмида с фрагментом ДНК DAA37 из Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ac-1793, приобретают ацилирующую активность и способность синтезировать N-замещенные алифатические акриламиды.

Способ синтеза N-замещенных алифатических акриламидов в общем виде осуществляют следующим образом.

Получение биокатализатора

Клетки Е.coli, содержащие ациламидазу АА37, получают следующим образом.

Посевной материал, представляющий собой культуру бактерий Е.coli, несущих фрагмент ДНК, кодирующий ациламидазу АА37, выращивают в жидкой среде Лурия Бертани (состав в мас.%: триптон 0,5, дрожжевой экстракт 0,25, NaCl 0,5, вода - остальное) с ампициллином 100 мкг/мл при 30-37°С до достижения оптической плотности 0,5-1 единиц при 600 нм. Затем переносят культуру на 16-25°С и добавляют лактозу до концентрации 0,1-1 мас.%. После инкубации в течение 7-24 часов клетки осаждают, промывают и используют в качестве биокатализатора.

Клетки Е.coli, содержащие заявляемую ациламидазу, хранят и используют в виде водной суспензии, полученной путем отделения клеток от культуральной жидкости центрифугированием при 5-16 тыс. об/мин и последующим суспендированием в 10 мМ фосфатном буфере рН 7,0-8,0 до концентрации 20-40 г сухого веса/л.

Фермент ациламидазу АА37 используют и хранят в виде раствора электрофоретически чистого белка, получаемого после хроматографического выделения из клеток Rhodococcus erythropolis или Е.coli.

Синтез N-замещенных алифатических акриламидов

Получение водного раствора N-замещенных алифатических акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида, осуществляют смешиванием водных растворов акриламида и алифатических первичных аминов, в частности изопропиламина и диметиламинопропиламина, в концентрациях 1-10% с раствором ациламидазы АА37 или с суспензией клеток Е.coli, экспрессирующих ациламидазу АА37, и последующей инкубацией при температуре 20-40°С и значении рН 9,5-11 в течение 1-48 часов. Ациламидазу используют в концентрациях 0,1-1 г белка/л, а клетки Е.coli - в концентрациях 2-16 г сухого веса/л.

Содержание конечного продукта - N-замещенного алифатического акриламида - определяют с помощью газовой хроматографии.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Получение клеток Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ac-1793 и определение их ацилирующей активности

В колбу Эрленмейера (объемом 750 мл), содержащую 100 мл синтетической питательной среды М3 (состав в мас.%: Na₂HPO₄×12H₂O - 0,7; KH₂PO₄ - 0,3; натрий лимоннокислый - 0,05; MgSO₄×7H₂O - 0,01; FeSO₄×7H₂O - 0,0004, ацетанилид - 0,2, NH₄NO₃ - 0,2, вода - остальное, среда имеет рН 7-7,2), добавляют 1 мл культуры (10⁹ кл/мл) штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ac-1793, предварительно выращенного на среде Лурия Бертани в течение 16 ч при 30°C с перемешиванием (300 об/мин). Затем колбу инкубируют с перемешиванием (200 об/мин) при 30°С в течение 36 часов. Биомассу отделяют центрифугированием при 5 тыс. об/мин, ресуспендируют в 10 мМ фосфатном буфере рН 7,0 до концентрации 20 г/л и хранят при +4°С. Полученные таким образом клетки в количестве 20 мг сухого веса обладают ацилирующей активностью 4,4 единицы/г сухого веса клеток.

Ацилирующую активность определяют по скорости синтеза N-изопропилакриламида по следующей методике.

Смешивают 300 мкл 10% водного раствора акриламида, 250 мкл 10% водного раствора изопропиламина (рН 10), 450 мкл суспензии клеток, содержащей 2,4 мг клеток. Инкубируют при 37°С 2 часа, отделяют клетки центрифугированием в течение 1 минуты при 10 тыс. об/мин и определяют содержание N-изопропилакриламида методом газовой хроматографии. Анализ реакционной смеси осуществляют на газовом хроматографе LXM-80 (Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Продукты реакции разделяют с помощью кварцевой колонки длиной 32 м, набитой сорбентом FFAP, при постоянной температуре 180°С. В качестве газа-носителя используют гелий.

За единицу активности принимают количество фермента, необходимое для синтеза 1 мМ N-изопропилакриламида за 1 час.

Пример 2. Выделение заявляемого фермента ациламидазы АА37

Клетки штамма ВКПМ Ас-1793, полученные как в примере 1, но в количестве 200 мг сухого веса, ресуспендируют в 40 мл 10 мМ буфера Трис-HCl рН 7,5, подвергают ультразвуковому разрушению и надосадочную жидкость наносят на колонку с анионообменным сорбентом MonoQ Hitrap, уравновешенную 10 мМ Трис-HCl буфером, рН 7,5. Хроматографию ведут на хроматографе для высокоскоростной хроматографии белков («Pharmacia», Швеция) в 10 мМ буфере Трис-HCl рН 7,5 с градиентом концентрации NaCl (от 0 до 0,5 М) при скорости потока 0,4 мл/мин. Фракции, обладающие активностью гидролиза 4`-нитроацетанилида, собирают и анализируют методом электрофореза в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) по Лэммли (Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. (1970) Nature, 227, 680-685). Фракции, показавшие гомогенность на ЭФ и обладающие ацилирующей активностью, объединяют. Полученный раствор фермента ациламидазы с концентрацией 2,5 мг белка/мл, имеющей молекулярную массу субъединицы 55 кДа, замораживают и хранят при -20°С. Ацилирующая активность выделенного фермента, определенная как в примере 1, составляет 3 ед/мг белка.

Пример 3. Определение N-концевой последовательности заявляемой ациламидазы

Раствор белка (500 мкл), полученный, как в примере 2, хроматографически разделяют на колонке Aqapore RP300 (С8) 4.6×100 мм в градиенте ацетонитрила 15-60% 60 минут, 60-90% 10 минут, 1 мл/мин, AU214×0.2 (А - 0.1% ТФУ, В - 80% CH3CN в 0.1% ТФУ). Материал, выходящий в доминантном пике, используют для определения N-концевой последовательности по методу Эдмана на автоматическом секвенаторе Prosize. Ациламидаза АА37 имеет следующую N-концевую последовательность аминокислот: TEQNLHWLSATE.

Пример 4. Определение N-концевых последовательностей внутренних пептидов заявляемой ациламидазы

Раствор белка, полученный как в примере 2, разделяют электрофоретически методом ЭФ в ПААГ в присутствии 1% додецилсульфата натрия и целевой белок весом 55 кДа выделяют из геля и подвергают трипсинолизу. Хроматографическое разделение продуктов гидролиза проводят на колонке Aqapore RP300 (С8) 4.6×100 мм в градиенте ацетонитрила 0-50% 60 минут, 50-70% 30 минут, 1 мл/мин, AU214×0.2 (А - 0.1% ТФУ, В - 80% CH3CN в 0.1% ТФУ).

Хорошо отделившиеся пептиды подвергают определению N-концевой последовательности по Эдману на секвенаторе Prosize, в результате чего получают следующие последовательности аминокислот:

1. TAANFEAVRPWA

2. TNTPESGYYGGT

Пример 5. Получение хромосомной ДНК для клонирования ациламидазы АА37

Культуру штамма ВКПМ Ас-1793 инкубируют со встряхиванием 250 об/мин и 30°С в течение 24 часов в 15 мл жидкой питательной среды Лурия-Бертани. Полученную биомассу осаждают центрифугированием при 4 тыс. об/мин 10 мин и ресуспендируют в 10 мл 0,01М Tris HCl с рН 8,0. Затем выделяют хромосомную ДНК по методике, описанной в [Манниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М. Мир, 1984]. Для этого обрабатывают биомассу лизоцимом, подвергают ее щелочному лизису и экстрагируют полученную смесь последовательно фенолом, хлороформом и эфиром. ДНК, содержащуюся в полученном растворе, осаждают этанолом в присутствии ацетата натрия с рН 5,5, промывают 70% этанолом и растворяют в 200 мкл деионизованной воды.

В результате получают хромосомную ДНК в количестве 5 мг/мл.

Пример 6. Получение фрагмента ДНК, содержащего ген ациламидазы АА37

Фрагмент ДНК, содержащий ген ациламидазы, получают с помощью ПЦР-амплификации с хромосомной ДНК, полученной, как в примере 5, с использованием праймеров, созданных на основе последовательности пептидов, полученных как в примерах 3 и 4. Амплифицированный фрагмент ДНК вставляют в вектор pTZ57R/T (вектор pTZ57 (Fermentas), разрезанный по сайту Eco32I и снабженный одноцепочечными олиго-Т на обоих концах), с помощью Т4 ДНК лигазы фирмы Fermentas по методике, приведенной производителем. После трансформации лигазной смеси в штамм Е.coli XL1 Blue отбирают колонии, устойчивые к ампициллину 100 мкг/мл и содержащие плазмиду со вставкой целевого фрагмента. Секвенирование вставок из четырех независимо полученных клонов показало, что нуклеотидные последовательности фрагмента ДНК DAA37, кодирующего заявляемую ациламидазу, идентичны и имеют нуклеотидную последовательность, представленную в перечне последовательностей как SEQ ID NO 1.

Пример 7. Конструирование штамма Е.coli Tuner (DE3) pET16b-ami, способного синтезировать ациламидазу АА37

Для конструирования рекомбинантных штаммов Е.coli, способных синтезировать заявляемую ациламидазу, осуществляют клонирование структурного гена ациламидазы АА37 в вектор pET16b производства Novagen (Studier, F.W. and Moffatt, B.A. (1986) J. Mol. Biol. 189, 113-130) и трансформирование полученной конструкции в штаммы-реципиенты Е.coli.

Для этого сначала фрагмент ДНК DAA37, содержащий ген ациламидазы АА37, клонированный как в примере 6, амплифицируют с помощью ПЦР, используя праймеры с внесенными в них последовательностями эндонуклеаз рестрикции NdeI и BamHI. Амплифицированный таким образом фрагмент ДНК вставляют в плазмиду pET16b, разрезанную теми же эндонуклеазами. После трансформации лигазной смеси в штамм Е.coli XL1 Blue отбирают колонии, устойчивые к ампициллину и содержащие плазмиду pET16b-ami со вставкой целевого фрагмента ДНК.

Затем плазмиду pET16b-ami вводят в штамм-реципиент Е.coli Tuner (DE3) производства Novagen методом трансформации и получают штамм Е.coli Tuner (DE3) pET16b-ami, способный синтезировать заявляемую ациламидазу.

Пример 8. Конструирование штамма Е.coli Origami (DE3) pET16b-ami, способного синтезировать ациламидазу АА37

Плазмиду pET16b-ami, полученную как в примере 7, вводят в штамм-реципиент Е.coli Origami В (DE3) производства Novagen методом трансформации и получают штамм Е.coli Origami (DE3) pET16b-ami, способный синтезировать заявляемую ациламидазу.

Пример 9. Синтез N-изопропилакриламида из акриламида и изопропиламина с помощью изолированной ациламидазы АА37

Водные растворы акриламида и изопропиламина (рН 10) смешивают, затем к реакционной смеси добавляют раствор ациламидазы, полученный как в примере 2. Концентрации акриламида и изопропиламина в смеси эквимолярны и составляют 3% (0.42 мМ) и 2.5% (0.42 мМ) соответственно. Концентрация ациламидазы в смеси составляет 0,5 г сухого веса/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 6 часов. Затем количество конечного продукта определяют методом газовой хроматографии. Концентрация полученного раствора N-изопропилакриламида составляет 0,1 г/л.

Пример 10. Синтез N-изопропилакриламида из акриламида и изопропиламина с помощью клеток штамма Е.coli Tuner (DE3) pET16b-ami, синтезирующих ациламидазу АА37

Водные растворы акриламида и изопропиламина (рН 10) смешивают, затем к реакционной смеси добавляют суспензию клеток штамма Е.coli Tuner (DE3) pET16b-ami, полученного как в примере 7. Концентрации акриламида и изопропиламина в смеси эквимолярны и составляют 3% (0.42 мМ) и 2.5% (0.42 мМ) соответственно. Концентрация клеток в смеси составляет 8 г сухого веса/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 6 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин) и количество конечного продукта определяют методом газовой хроматографии. Концентрация полученного раствора N-изопропилакриламида составляет 1 г/л.

Пример 11. Синтез N-изопропилакриламида из акриламида и изопропиламина с помощью клеток штамма Е.coli Origami (DE3) pET16b-ami, синтезирующих ациламидазу АА37

Синтез осуществляют как в примере 10, но используют суспензию клеток штамма Е.coli Origami (DE3) pET16b-ami. Концентрация полученного раствора N-изопропилакриламида составляет 1 г/л.

Пример 12. Синтез N-диметиламинопропилакриламида из акриламида и диметиламинопропиламина с помощью ациламидазы АА37

Водные растворы акриламида и диметиламинопропиламина (рН 10) смешивают затем к реакционной смеси добавляют раствор ациламидазы, полученный как в примере 2. Концентрации акриламида и диметиламинопропиламина в смеси эквимолярны и составляют 1% (0.14 мМ) и 2.5% (0.14 мМ) соответственно. Концентрация ациламидазы в смеси составляет 0,5 г сухого веса/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 24 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин) и количество конечного продукта определяют методом газовой хроматографии.

Концентрация полученного раствора N-диметиламинопропилакриламида составляет 0,1 г/л.

Пример 13. Синтез N-диметиламинопропилакриламида из акриламида и диметиламинопропиламина с помощью клеток штамма Е.coli Tuner (DE3) pET16b-ami, синтезирующих ациламидазу АА37

Водные растворы акриламида и диметиламинопропиламина (рН 10) смешивают, затем к реакционной смеси добавляют суспензию клеток штамма Е.coli Tuner (DE3) pET16b-ami, полученную как в примере 9. Концентрации акриламида и диметиламинопропиламина в смеси эквимолярны и составляют 1% (0.14 мМ) и 2.5% (0.14 мМ) соответственно. Концентрация клеток в смеси составляет 8 г сухого веса/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 24 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин) и количество конечного продукта определяют методом газовой хроматографии. Концентрация полученного раствора N-диметиламинопропилакриламида составляет 0,5 г/л.

Пример 14. Синтез N-диметиламинопропилакриламида из акриламида и диметиламинопропиламина с помощью клеток штамма Е.coli Origami (DE3) pET16b-ami, синтезирующих ациламидазу АА37

Синтез осуществляют как в примере 13, но используют суспензию клеток штамма Е.coli Origami (DE3) pET16b-ami (пример 10). Концентрация полученного раствора N-диметиламинопропилакриламида составляет 0,5 г/л.

Таким образом,

- впервые идентифицирован фермент ациламидаза АА37, обладающий ацилирующей активностью с уникальной субстратной специфичностью, способный синтезировать N-замещенные алифатические акриламиды (N-изопропилакриламид или N-диметиламинопропилакриламид);

- выделен фрагмент ДНК DAA37 и на его основе сконструированы штаммы Е.coli, способные синтезировать ациламидазу АА37;

- разработан способ синтеза N-замещенных акриламидов с использованием ациламидазы АА37;

- осуществленная идентификация фермента ациламидазы АА37 как носителя ацилирующей активности, клонирование и секвенирование кодирующего этот фермент фрагмента ДНК открывают возможности для создания более совершенных вариантов биокатализатора.

Изобретение относится к области биохимии. Представлен фермент ациламидаза АА37 из Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ac-1793, с последовательностью, приведенной в описании. Определена нуклеотидная последовательность, кодирующая этот фермент. Описан способ синтеза в водной среде N-замещенных акриламидов из акриламида и аминов в присутствии биокатализатора ациламидазы в изолированном состоянии или в составе клеток E.coli. Изобретение позволяет получить N-замещенные алифатические акриламиды из акриламида и первичных алифатических аминов в водной среде. 3 н.п. ф-лы.

1. Фермент ациламидаза АА37, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2.

2. Фрагмент ДНК DAA37, кодирующий ациламидазу по п.1 и имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 1, либо другой фрагмент ДНК с нуклеотидной последовательностью, кодирующей ту же аминокислотную последовательность в силу вырожденности генетического кода.

3. Способ синтеза в водной среде N-замещенных алифатических акриламидов из акриламида и аминов в присутствии биокатализатора с ацилирующей активностью, отличающийся тем, что в качестве биокатализатора используют ациламидазу по п.1 в изолированном состоянии или в составе клеток E.coli, содержащих фрагмент ДНК по п.2.