СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРА АКРИЛАТА АММОНИЯ И ШТАММ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2025 года по МПК C12N1/21 C12P13/02 C12R1/01 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous, а также способа прямого биокаталитического получения раствора, содержащего акриловую кислоту в форме акрилата аммония, с использованием клеток этого штамма.

Уровень техники

Акриловая кислота входит в широкий спектр выпускаемых акриловых полимеров, которые обычно являются гетерополимерами, в состав которых входит несколько типов акриловых мономеров, например, гидрофильные незаряженные (например, акриламид), гидрофильные отрицательно заряженные (например, акриловая кислота) и гидрофобно-гидрофильные, заряженные как положительно, так и отрицательно (например, N-замещенные акриламиды N-изопропилакриламид, акриламидо-третбутилсульфоновая кислота, N,N-диметиламионопропилакриламид). Каждый из мономеров придает полимеру определенные физико-химические свойства, что существенно расширяет круг применения полимеров. Водорастворимые гетерополимеры, состоящие из трех типов мономеров применяются, в том числе, как адсорбенты и структурообразователи во многих областях промышленности - для очистки загрязненных вод, подготовки питьевой воды, улучшения эффективности нефте- и газодобычи (как компонент буровых растворов, растворов для тампонажа скважин и гидроразрыва пластов), в горно-добывающей промышленности (Полиакриламид. - М., 1992.).

Акриловую кислоту для включения в состав таких полимеров получают путем парофазного аммонолиза пропилена (в форме чистой акриловой кислоты), или путем биокаталитической гидратации акрилонитрила, в форме раствора акрилата аммония (RU 2177034 С1). Недостатками обоих способов является использование взрывоопасного (пропилен) или летучего высокотоксичного (акрилонитрил) сырья.

Альтернативным способом получения акриловой кислоты в форме акрилата аммония может являться биокаталитическая гидратация акриламида, с использованием клеток бактерий, обладающих акриламид-гидролизующей активностью. Аналоги такого конкретного способа на сегодняшний день неизвестны.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа получения раствора акрилата аммония путем биокаталитической гидратации акриламида с использованием клеток бактерий.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение раствора акрилата аммония путем биокаталитической гидратации акриламида, без использования акрилонитрила в этом процессе, с помощью клеток заявляемого штамма.

Он достигается тем, предложен штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас-2195, обладающий повышенным уровнем акриламид-гидролизующей активности.

Для достижения технического результата предложен способ получения раствора акрилата аммония заключающийся в том, что получают суспензию клеток штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас-2195, для чего в колбу Эрленмейера объемом 750 мл, содержащую 50 мл синтетической питательной среды MS следующего состава, масс. %: глюкоза - 0,5; мочевина - 0,6; Na₂HPO₄⋅12H₂O - 0,28, KH₂PO₄ безводный - 0,08, MgSO₄⋅7H₂O - 0.05, FeSO₄⋅7H₂O - 0.00027, CoCl₂⋅6H₂O - 0.001, апрамицин 0.01, дрожжевой экстракт 0,1, остальное вода добавляют 0,5 мл культуры 10⁹ кл/мл заявляемого штамма, предварительно выращенной на той же среде, инкубируют колбу с перемешиванием 300 об/мин при 30°С в течение 50 час, полученную биомассу штамма отделяют центрифугированием при 5 тыс.об/мин. затем полученную суспензию смешивают с водным раствором акриламида с рН от 7 до 8, в термостатируемом сосуде при температуре от 20 до 40°С, из расчета, на 1 л реакционной смеси, от 1 до 10 г клеток по сухой массе, инкубируют с перемешиванием от 100 до 250 об/мин в при 37°С в течение 7 часов, отделяют клетки центрифугированием, и таким образом получают раствор акрилата аммония.

Краткое описание чертежей

На фигуре показана схема получения раствора акрилата аммония.

Осуществление изобретения

Сущность способа получения раствора акрилата аммония, заключается в разработке штамма бактерий, обладающего повышенной акриламид-трансформирующей активностью, и разработке способа гидратации акриламида, растворенного в воде, до акрилата аммония, с помощью клеток этого штамма. В результате, получают раствор, содержащий только акрилат аммония.

Характерными особенностями заявляемого способа является использование акриламида, а не акрилонитрила, в качестве стартового соединения, и использование клеток бактерий с повышенной акриламид-гидролизующей активностью. Заявляемый способ позволяет получать растворы, содержащие от 53 по 54 г/л акрилата аммония

Микробиологическая характеристика заявляемого штамма

Морфологические свойства. Клетки штамма неподвижны и окрашиваются по Граму. Спор не образуют, некислотоустойчивы. В возрасте 18-20 ч клетки образуют длинные (до 20 мкм) слабо ветвящиеся нити, которые через 48-72 ч распадаются на палочковидные и кокковидные элементы. В старых культурах наблюдаются плеоморфные клетки в виде колб, груш, булав. Деление клеток происходит по раскалывающемуся и сгибающемуся типам.

Культуральные свойства. На плотных питательных средах (МПА, Хоттингер,) через 48 ч роста штамм образует круглые гладкие колонии диаметром 1 мм, окрашенные от палево-розового до розово-оранжевого цвета. При росте на мясо-пептонном бульоне образуются пленка и осадок. Лакмусовое молоко не изменяется.

Физиологические свойства. Облигатный аэроб. Редуцирует нитраты. Тест с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра отрицательные. Образует сероводород. Штамм оксидазоотрицательный, каталазо- и фосфатазаположительный. Крахмал и целлюлозу не гидролизует, твин 60 и 80 гидролизует.Аденин не утилизирует.Штамм растет при рН 6-9, температуре 5-45°С. Кислоту образует из следующих сахаров и спиртов: глюкозы, фруктозы, мальтозы, сахарозы, сорбита, манита и глицерина. Газообразования ни на одном сахаре не обнаружено. В качестве единственного источника азота используют соединения аммония, нитраты и мочевину. В качестве единственного источника углерода использует мальтозу, манит, сорбит, глюкозу, глицерин, лактат, пируват, бензоат, n- и m-гидроксибензоат, тирозин; не использует рамнозу, галактозу, инозит, а-кетоглутарат.В клеточной стенке заявляемого штамма содержатся мезо-диаминопимелиновая кислота, арабиноза и галактоза, что характерно для коринеподобных бактерий с IV типом клеточной стенки. Клетки также содержат липид A(LCN), характерный для родококков. Последовательность гена 16S рибосомальной РНК (SEQ ID NO:1) соответствует роду Rhodococcus, виду rhodochrous. Изобретение осуществлено путем:

1) селекции штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous, обладающего повышенной акриламид-трансформирующей активностью;

2) разработки способа биокаталитической гидратации акриламида с получением раствора акрилата аммония с использованием клеток заявляемого штамма.

Заявляемый штамм получен в два этапа. На первом этапе засевают культуру штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ АС-926 (SU 1731814 А1) на агаризованную питательную среду, содержащую хлороацетамид, и отбирают отдельные колонии, появляющиеся на ней. Штаммы, отобранные таким образом, не обладают акриламид-гидролизующей активностью. На втором этапе один ил полученных штаммов засевают на агаризованную питательную среду, не содержащую хлороацетамид, и содержащую ацетамид, как единственный источник углерода. Затем, отбирают отдельные колонии, появляющиеся на ней. Среди них отбирают штаммы, у которых акриламид-гидролизующая активность восстановилась. Среди штаммов, отобранных таким образом, выбирают варианты, акриламид-гидролизующая активность которых повышена, по сравнению со штаммом Rhodococcus rhodochrous ВКПМ АС-926.

Для получения клеток заявляемого штамма, обладающих необходимой для осуществления заявляемого способа акриламид-гидролизующей активностью, штамм выращивают при 25-30°С в течение 48-72 часов на синтетических средах, содержащих в качестве источника углерода сахара или спирты в концентрациях 0.1-4%, а в качестве источника азота соединения аммония, нитраты или мочевину в концентрациях 0.4-2%, в качестве источника фосфора - растворимые фосфаты натрия и калия в концентрациях 0,01 - 0.5%, в качестве источника железа и магния - сульфаты железа и магния в концентрациях 0,0001 - 0,005%. Полученные клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 5-16 тыс.об/мин, ресуспендируют до концентрации 20-40 г по сухой массе/л в фосфатном буфере следующего состава, г/л: KH₂PO₄ безводный 6.8, NaOH2, рН 7,0-8,0, и хранят при 4°С.

Акриламид-гидролизующую активность клеток штамма определяют по скорости гидролиза акриламида по следующей методике:

Суспензию клеток в культуральной жидкости центрифугируют в течение 1 минуты при 10 тыс.об/мин, отбрасывают надосадочную жидкость, ресуспендируют осадок до концентрации 0,51 г по сухой массе/л в фосфатном буфере. Затем, смешивают 100 мкл 1,42% водного раствора акриламида и 100 мкл суспензии клеток. Инкубируют при 37°С 20 минут, добавляют 2 мкл концентрированной HCl, отделяют клетки центрифугированием в течение 1 минуты при 10 тыс.об/мин при 0°С, и в надосадочной жидкости определяют содержание аммония. Активность клеток выражают в единицах, соответствующих количеству мкМ ионов аммония, образовавшихся за 1 минуту в расчете на 1 мг сухого веса клеток.

Получение раствора акрилата аммония осуществляют смешиванием водного раствора акриламида в концентрациях от 1% до 10% с суспензией клеток (от 1 до 10 г клеток по сухой массе на 1 л реакционной смеси) в термостатируемом сосуде (при температуре от 20 до 40°С, предпочтительнее от 25 до 30°С) и с последующим перемешиванием (от 100 до 250 об\мин) в течении 1-48 час. Значение рН варьирует от 6,5 до 10, предпочтительнее от 7 до 8. Из полученной смеси отделяют клетки, и получают раствор акрилата аммония.

Пример 1. Получение заявляемого штамма, обладающего повышенной акриламид-гидролизующей активностью.

Измеряют акриламид-гидролизующую активность клеток штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ АС-926 по стандартной методике (см. выше), активность составляет от 7 до 8 единиц. Затем, суспензию клеток штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ АС-926 засевают шпателем на агаризованную среду следующего состава, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; MgSO₄*7H₂O - 0,5; FeSO₄ - 0.05; глюкоза - 10; мочевина - 6; хлороацетамид - 2, вода - остальное, и инкубируют при температуре 30°С в течение недели. Отбирают наиболее крупные отдельные колонии, пересевают на агаризованную среду такого же состава, и выбирают штамм, акриламид-гидролизующая активность у которого отсутствует. Затем, полученный штамм засевают шпателем на агаризованную на среду такого же состава, за исключением того, что исключают из состава мочевину и хлороацетамид, и включают в состав ацетамид, 8 г/л. На указанной среде инкубируют при температуре 30°С в течение недели. Отбирают отдельные колонии разного размера, и из них выбирают штамм, обладающий акриламид-гидролизующей активностью на уровне от 10 до 15 единиц. В таком штамме проводят удаление генов нитрилгидратазы обычными методами генетической инженерии, и получают заявляемый штамм. Акриламид-гидролизующая активность клеток полученного штамма составляет 10 единиц.

Пример 2. Получение биомассы клеток заявляемого штамма

В колбу Эрленмейера объемом 750 мл, содержащую 50 мл синтетической питательной среды MS следующего состава, масс. %: глюкоза - 0,5; NH₄Cl - 2; Na₂HPO₄⋅12H₂O - 0,28, KH₂PO₄ безводный - 0,08, MgSO₄⋅7H₂O - 0,05, FeSO₄⋅7H₂O - 0,00027, вода - остальное, добавляют 0,5 мл культуры (10⁹ кл/мл) заявляемого штамма, предварительно выращенной на той же среде. Затем колбу инкубируют с перемешиванием (300 об/мин) при 30°С в течение 50 час. Полученная таким образом культура обладает акриламид-гидролизующей активностью 10 единицу. Полученную биомассу штамма отделяют центрифугированием при 5 тыс.об/мин и хранят при +4°С.

Пример 3. Получение раствора акрилата аммония с использованием клеток заявляемого штамма

В стеклянный сосуд, оборудованный мешалкой, добавляют 250 мл суспензии клеток заявляемого штамма, полученных как в примере 3, с концентрацией 20,4 г по сухой массе/л, затем, при постоянном перемешивании, 42 мл водного раствора акриламида (64%). Реакционную смесь инкубируют с перемешиванием при 30°С в течение 7 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс.об/мин). В полученном образце концентрация акрилата аммония составляет от 53 до 54 г/л.

Таким образом,

- сконструирован штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас-2195, обладающий, по сравнению с родительским штаммом Rhodococcus rhodochrous ВКМ Ас-926, повышенной акриламид-гидролизующей активностью;

- разработан способ биокаталитического получения раствора акрилата аммония из акриламида, с использованием клеток заявляемого штамма, который позволяет получать водные растворы, содержащие от 53 до 54 г/л акрилата аммония.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="Patent acrylate.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.1.2" productionDate="2022-09-29">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>N</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение &quot;Национальный исследовательский центр

&quot;Курчатовский институт&quot; (НИЦ «Курчатовский

институт»)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>National Research Center &quot;Kurchatov

Institute&quot; (NRC &quot;Kurchatov

Institute&quot;).</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКРИЛАТА АММОНИЯ

И ШТАММ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1522</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1522</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Rhodococcus rhodochrous

</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcaacggagagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgctt

aacacatgcaagtcgaacgatgaagcccagcttgctgggtggattagtggcgaacgggtgagtaacacgt

gggtgatctgccctgcacttcgggataagcctgggaaactgggtctaataccggataggaccggcggccg

catggctgtcggtggaaaggttttccggtgcaggatgggcccgcggcctatcagcttgttggtggggtaa

cggcccaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggc

ccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgc

gtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagtaccgacgaagcgcgagtgacggtaggtaca

gaagaagcaccggccaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttgtccggaatta

ctgggcgtaaagagctcgtaggcggtttgtcgcgtcgtctgtgaaaacccgcagctcaactgcgggcttg

caggcgatacgggcagacttgagtactgcaggggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcag

atatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctctgggcagtaactgacgctgaggagcgaaagcgtg

ggtagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggcgctaggtgtgggtttcctt

ccacgggatccgtgccgtagctaacgcattaagcgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaact

caaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaagaacct

tacctgggtttgacatacaccggaccgccccagagatggggtttcccttgtggtcggtgtacaggtggtg

catggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcctgt

gttgccagcaattcggttggggactcgcaggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacg

tcaagtcatcatgccccttatgtccagggcttcacacatgctacaatggccggtacagagggctgcgata

ccgcgaggtggagcgaatcccttaaagccggtctcagttcggatcggggtctgcaactcgaccccgtgaa

gtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgc

ccgtcacgtcatgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcctaacccctcgtgggagggagccgtcgaa

ggtgggatcggcgattgggacgaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaaggtgcggctggatcacctcc

ttt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас-2195, обладающий акриламид-гидролизующей активностью. Изобретение обеспечивает получение раствора акрилата аммония путем биокаталитической гидратации акриламида без использования акрилонитрила. 1 ил., 3 пр.

Штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас-2195, обладающий акриламид-гидролизующей активностью.