ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/744 994, поданной 12 октября 2018 г, и предварительной заявке на патент США № 62/826 461, поданной 29 марта 2019 г; содержание каждой из которых полностью включено в данный документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Различные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к разветвленным полимерам, которые находят свое применение, например, в генной терапии в качестве безопасных и нетоксичных агентов для трансфекции нуклеиновой кислоты.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Доставка функциональных генетических материалов в клетку (например, клетки кожи фибробласты) для управления экспрессией трансгена имеет большое значение в наномедицине. Несмотря на то, что были разработаны многочисленные полимерные системы доставки генов, все еще не достигнута трансфекция генов (например, трансфекция гена в фибробласты), отличающаяся высокой степенью безопасности и эффективности.
[0004] Спустя почти три десятилетия развития генная терапия стала преобладающей частью быстро расширяющегося арсенала наномедицины, обеспечивающего улучшение состояния здоровья и коррекцию генетических нарушений.[1] Несмотря на многочисленные клинические исследования с использованием вирусных векторов доставки генов, остаются неустраненными риски индукции иммуногенных ответов и инсерционного мутагенеза трансгена, ограничения, связанные с крупномасштабным производством и низкой «грузоподъемностью» для генетических материалов, а также непредсказуемость подвижности векторов.[2,3] Исходя из этого, более многообещающими были бы невирусные векторы доставки гена в виду своего потенциала минимальной иммуногенности, неканцерогенности, рентабельности производства, высокой полезной нагрузки нуклеиновых кислот и локализованной экспрессии генов. Начиная с 2010 года заметно возросло количество клинических исследований в области генной терапии с использованием невирусных генных векторов; были составлены по меньшей мере 40 вариантов смесей плазмидных ДНК и малых интерферирующих РНК (миРНК) на основе наночастиц для генной терапии для коррекции генов, терапевтической экспрессии белков и вакцинации антигенами, при этом 12 основных липосомных систем были изучены в 27 клинических исследованиях, а 7 систем на основе полимеров - в 13 клинических исследованиях.[3] Среди клинических исследований по изучению генной терапии на основе полимеров некоторые перспективы показал уже имеющийся на рынке катионный полимер полиэтиленимин (PEI - англ. polyethylenimine). Однако PEI является неразлагающимся, а опасения по поводу безопасности серьезно препятствуют его внедрению.[4] По этой причине были предприняты огромные усилия для повышения эффективности трансфекции генов и безопасности полимерных генных векторов, чтобы варианты генной терапии на основе полимеров могли быть приближены к клиническому применению.
[0005] Среди полимерных векторов доставки генов одним из наиболее многообещающих кандидатов являются поли(β-аминоэфир)ы (PAE - англ. poly(β-amino ester)). PAE были впервые разработаны и синтезированы Лангером и его сотрудниками путем сополимеризации аминов с диакрилатами с помощью одностадийного процесса присоединения по Михаэлю.[5] Третичные амины на остове и первичные амины на концах служат в качестве катионных звеньев для конденсации ДНК в наномерные частицы вследствие электростатических взаимодействий и облегчения выхода полиплекса из эндо/лизосом за счет «эффекта протонной губки», а сложноэфирные связи на остове могут подвергнуться гидролитическому разложению в условиях водной среды для диссоциации полиплексов и высвобождения ДНК, а также для снижения цитотоксичности после трансфекции генов.[6,7] После интенсивной оптимизации структуры/свойств,[8-10] были идентифицированы несколько PAE для трансфекции ДНК, имеющие благоприятный профиль безопасности и высокую эффективность трансфекции как in vitro, так и in vivo.[6,11,12] Однако до 2015 года почти все исследования с использованием PAE были сосредоточены на полимерах с линейной структурой. Разветвленные полимеры могут иметь больший потенциал для трансфекции генов, поскольку их трехмерная (3D) структура и несколько концевых функциональных групп наделяют полимерные генные векторы дополнительными преимуществами. Мы успешно разработали сильноразветвленные поли(β-аминоэфир)ы (HPAE - англ. highly branched poly(β-amino ester)) с помощью гибкой однореакторной стратегии присоединения по Михаэлю «A2+B3+C2».[13-16] По сравнению с соответствующими линейными аналогами, HPAE проявили гораздо более высокую способность к трансфекции генов в широком диапазоне типов клеток, демонстрируя свой больший потенциал в доставке генов. Высокая способность HPAE к трансфекции генов была дополнительно продемонстрирована in vivo с использованием модели кожного заболевания рецессивный дистрофический буллезный эпидермолиз (РДБЭ). РДБЭ представляет собой редкое тяжелое наследственное механобуллезное нарушение, вызванное мутацией гена COL7A1, кодирующего коллаген VII типа (C7), который является ключевым компонентом якорных фибрилл (ЯФ), служащих для обеспечения эпидермально-дермальной связи[17]. Дефицит C7 приводит к уязвимости кожи, широкому распространению волдырей и эрозиям, которые характерным образом заживают с избыточным рубцеванием и образованием милий.[18] На мышиной модели как с нокаутом РДБЭ, так и с трансплантацией, HPAE опосредовали высокий уровень экспрессии C7 и ее восстановление в течение периода до 10 недель,[13,15,19] что подчеркивает их огромный потенциал для клинической доставки генов в кожу. HPAE дополнительно описаны в патентной публикации США № 2017/0216455, которая в полном объеме включена в данный документ для всех целей посредством ссылки.
[0006] Фибробласты играют ключевую роль в поддержании целостности кожной ткани и биологической функции кожи, регуляции клеточной микросреды и связаны с множеством кожных заболеваний, таких как гипертрофическое рубцевание, старение/фотостарение, заживление диабетических ран, рак и пахидермопериостоз. Возможность управлять экспрессией генов в фибробластах является основой для функциональной геномики, анализа путей и применений в биомедицине. Например, первичные фибробласты кожи человека (HPDF - англ. primary human dermal fibroblasts) являются доступным источником фенотипически и кариотипически нормальных клеток кожи человека, биологически более подходящими для применения in vivo, по сравнению с иммортализованными клеточными линиями.[20] Ранее для восстановления C7 при РДБЭ HPDF вводили непосредственно в кожу. Тем не менее, у пациентов с РДБЭ прямое внутрикожное введение HPDF показывает аномальную морфологию ЯФ[21] и временное замещение белка[22]. Напротив, можно предположить, что после генетического конструирования путем трансфекции фибробласты могут быть адаптированы различным образом, и сделаны более пригодными для клинической генной терапии. Усиление HPDF с помощью С7 могло бы оказать значительное влияние на повышение прочности и стабильности реконструированных ЯФ, оптимизацию схемы дозирования и снижение частоты введения при РДЭБ. Однако невирусная генная трансфекция фибробластов всегда была сложной задачей. Наиболее распространенные способы включают дорогостоящую электропорацию, магнитофекцию и относительно неэффективные и токсичные химические составы.[20,23,24] Например, в различных системах электропорации показатели эффективности доставки усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP - англ. enhanced green fluorescence protein) в фибробласт кожи человека[25] и первичные фибробласты человека[26] составили всего лишь 27% и 44%. Максимальная эффективность трансфекции ведущих катионных липидных реагентов TransFectin, Lipofectamine LTX и электропорации в фибробласт эмбриона мыши составила 15,7%, 11,8% и 48,1%, соответственно[24].
[0007] Таким образом, разработка надежной невирусной системы доставки генов для трансфекции фибробластов с высокой эффективностью и безопасностью является настоятельной необходимостью и имеет большое значение
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает разветвленные полимеры, пригодные для формирования полиплексов, применимых при вариантах лечения, осуществляемых путем трансфекции генов, полученные с помощью способа:
(a) введения в реакцию соединения формулы (A)
(A)
с первым амином, имеющим формулу R1-NH2 или R1-N(H)-Z’-N(H)-R1;
(b) введения в реакцию продукта стадии (a) со вторым амином, имеющим формулу R2-NH2 или R2-N(H)-Z’’-N(H)-R2; и
(c) введения в реакцию продукта стадии (b) с соединением формулы (B):
(B);
где
каждый J независимо представляет собой -O- или -NH-;
Z, Z’ и Z’’ являются связывающими фрагментами;
A представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь из от 2 до 30 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, или гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов;
где A необязательно замещен одним или большим количеством галогена, гидроксила, аминогруппы, сульфонильной группы, сульфонамидной группы, тиола, C1-C6 алкила C1-C6 алкокси, C1-C6эфира, C1-C6 тиоэфира, C1-C6 сульфона, C1-C6 сульфоксида, C1-C6 первичного амида, C1-C6 вторичного амида, галоген-C1-C6 алкила, карбоксильной группы, цианогруппы, нитрогруппы, нитрозогруппы, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкила, C3-C6циклоалкила, C3-C6 гетероциклила, C2-C5 гетероарила или C6-C10 арила; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила;
G представляет собой -C-, -S-, -S(O)-, -P(OR1)- или -P(OH)-;
каждый Q представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу C1-C10;
каждый E1 независимо выбран из группы, состоящей из ковалентной связи, -N-, -O-, -S-, алкилена, гетероалкилена, алкенила, гетероалкенилена, алкинила, гетероалкинилена;
R1 и R2 каждый независимо представляет собой C1-C40алкил, C1-C40 гетероалкил, C2-C40алкенил, C2-C40 гетероалкенилен, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C2-C40 гетероалкинилен, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; причем гетероциклил и гетероарил содержат 1-5 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, S, P и O; причем C1-C40алкил, C2-C40алкенил, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещены D, галогеном, C1-C6алкилом, -OH, -O-C1-C6алкилом,-NH2, -NH(C1-C6алкилом), или -N(C1-C6алкилом)2; и R1 является незамещенным или замещенным по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, галоген-C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом и C6-C10) арилом; причем каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила; и
каждое n равно по меньшей мере 1.
[0009] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает способ изготовления полимера, включающий:
(a) введение в реакцию соединения формулы (A)
(A)
с первым амином, имеющим формулу R1-NH2 или R1-N(H)-Z’-N(H)-R1;
(b) введение в реакцию продукта (a) со вторым амином, имеющим формулу R2-NH2 или R1-N(H)-Z’’-N(H)-R2; и
(b) введение в реакцию продукта (b) с соединением формулы (B):
(B);
где
каждый J независимо представляет собой -O- или -NH-;
Z, Z’ и Z’’ являются связывающими фрагментами;
A представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь из от 2 до 30 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, или гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов;
где A необязательно замещен одним или большим количеством галогена, гидроксила, аминогруппы, сульфонильной группы, сульфонамидной группы, тиола, C1-C6 алкила C1-C6 алкокси, C1-C6эфира, C1-C6 тиоэфира, C1-C6 сульфона, C1-C6 сульфоксида, C1-C6 первичного амида, C1-C6 вторичного амида, галоген-C1-C6 алкила, карбоксильной группы, цианогруппы, нитрогруппы, нитрозогруппы, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкила, C3-C6циклоалкила, C3-C6 гетероциклила, C2-C5 гетероарила или C6-C10 арила; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила;
G представляет собой -C-, -S-, -S(O)-, -P(OR1)- или -P(OH)-;
каждый Q представляет собой H или линейную или разветвленную алкильную группу C1-C10;
каждый E1 независимо выбран из группы, состоящей из ковалентной связи, -N-, -O-, -S-, алкилена, гетероалкилена, алкенила, гетероалкенилена, алкинила, гетероалкинилена;
R1 и R2 каждый независимо представляет собой C1-C40алкил, C1-C40 гетероалкил, C2-C40алкенил, C2-C40 гетероалкенилен, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C2-C40 гетероалкинилен, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; причем гетероциклил и гетероарил содержат 1-5 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, S, P и O; в котором C1-C40алкил, C2-C40алкенил, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещены D, галогеном, C1-C6алкилом, -OH, -O-C1-C6алкилом,-NH2, -NH(C1-C6алкилом), или -N(C1-C6алкилом)2; и R1 является незамещенным или замещенным по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, галоген-C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом и C6-C10) арилом; причем каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила; и
каждое n равно по меньшей мере 1.
[0010] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает полиплекс, содержащий компонент нуклеиновой кислоты и либо полимер, полученный способами, описанными в данном документе, либо полимер, содержащий формулу (I)
(I)
где
каждый A независимо представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, или гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов;
где A необязательно замещен одним или большим количеством галогена, гидроксила, аминогруппы, сульфонильной группы, сульфонамидной группы, тиола, C1-C6 алкила C1-C6 алкокси, C1-C6эфира, C1-C6 тиоэфира, C1-C6 сульфона, C1-C6 сульфоксида, C1-C6 первичного амида, C1-C6 вторичного амида, галген-C1-C6 алкила, карбоксильной группы, цианогруппы, нитрогруппы, нитрозогруппы, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкила, C3-C6циклоалкила, C3-C6 гетероциклила, C2-C5 гетероарила или C6-C10 арила; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила;
каждый B независимо представляет собой первый связывающий фрагмент;
каждый X независимо представляет собой 
или 
;
каждый Y независимо представляет собой 
или 
;
каждый L независимо представляет собой второй связывающий фрагмент;
каждый R1, R2 и R3 в каждом случае независимо представляют собой H, C1-C40алкил, C1-C40 гетероалкил, C2-C40алкенил, C2-C40 гетероалкенилен, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C2-C40 гетероалкинилен, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; причем гетероциклил и гетероарил содержат 1-5 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, S, P и O; где C1-C6алкил, C2-C8алкенил, C4-C8циклоалкенил, C2-C6алкинил, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещены D, галогеном, C1-C6алкилом, -OH, -O-C1-C6алкилом,-NH2, -NH(C1-C6алкилом) или -N(C1-C6алкилом)2; или
где R2 и R3 вместе с атомом, к которому они присоединены, могут образовывать гетероциклил или гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из группы, состоящей из N, S, P и O;
a равно 1-1000;
b равно 1-4;
c равно 1-3; и
z равно 1-100;
при условии, что по меньшей мере один из R2 и R3 не является H.
[0011] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество полиплекса в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
[0012] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает способ трансфекции клеток, включающий приведение одной или более клеток-мишеней в контакт с фармацевтической композицией, содержащей по меньшей мере один полиплекс согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, в условиях, пригодных для трансфекции клетки-мишени одним или большим количеством полиплексов.
[0013] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает способ лечения заболевания у нуждающегося в этом пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один полиплекс согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, чтобы одна или большее количество клеток пациента были трансфицированы компонентом нуклеиновой кислоты полиплекса.
[0014] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает способ лечения заболевания у нуждающегося в этом пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один полиплекс согласно определенным вариантам осуществления настоящего изобретения, причем введение такой композиции исправляет дефектную трансляцию гена-мишени у субъекта.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0015] На Фиг. 1 показана оценка эффективности трансфекции и жизнеспособности клеток. На Фиг. 1a показана активность Gluc (люциферазы Gaussia) и жизнеспособности клеток HPDF через 48 ч после трансфекции с помощью полиплексов LBPAE/ДНК, PEI/ДНК и SuperFect/ДНК для ряда соотношений масс./масс. На Фиг. 1b показана активность Gluc и жизнеспособности клеток 3T3. Достоверное отличие в активности Gluc группы *PEI и #SuperFect (p<0,05, двусторонний t-критерий Стьюдента).
[0016] На Фиг. 2 показана оценка LC50 полиплексов LBPAE/ДНК и полиплексов SuperFect/ДНК в HPDF и 3T3. На Фиг. 2a показаны репрезентативные изображения живых/мертвых необработанных клеток или клеток, трансфицированных полиплексами LBPAE/ДНК при концентрации 555 мкг мл−1 или полиплексами SuperFect/ДНК при концентрации 35 мкг мл−1. Масштабные линейки: 50 мкм. На Фиг. 2b показана жизнеспособность клеток в зависимости от концентрации полиплекса LBPAE/ДНК, измеренная с помощью анализа Alamarblue. На Фиг. 2c показана жизнеспособность клеток в зависимости от концентрации полиплекса SuperFect/ДНК, измеренная с помощью анализа Alamarblue.
[0017] На Фиг. 3 показано сравнение экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP - англ. green fluorescent protein) и медианной интенсивности флуоресценции (MFI - англ. median fluorescence intensity) опосредованных различными системами доставки гена. На Фиг. 3a показаны GFP-изображения клеток HPDF после обработки полиплексами LBPAE/ДНК, PEI/ДНК и SuperFect/ДНК. Для отрицательного контроля были использованы необработанные (UT - англ. untreated) клетки. Масштабная линейка: 200 мкм. На Фиг. 3b показана гистограмма распределения популяций HPDF после трансфекции с помощью различных полиплексов. На Фиг. 3c показаны процентные показатели GFP-положительных HPDF и MFI клеток после трансфекции. На Фиг. 3d показаны GFP-изображения 3T3. Масштабная линейка: 200 мкм. На Фиг. 3e показана гистограмма распределения популяций 3T3 после трансфекции с помощью различных полиплексов. На Фиг. 3f показаны процентные показатели GFP-положительных 3T3 и MFI клеток после трансфекции. Достоверное отличие в *процентном показателе GFP-положительных клеток и #MFI от групп коммерческих реагентов (p<0,05, двусторонний t-критерий Стьюдента).
[0018] На Фиг. 4 показаны физико-химические характеристики полиплексов LBPAE/ДНК. На Фиг. 4a показано определение способности к конденсации ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле. На Фиг. 4b показано измерение аффинности связывания ДНК с помощью анализа PicoGreen. На Фиг. 4c показаны измерения размера полиплекса и дзета-потенциала. На Фиг. 4d показано наблюдение морфологии полиплекса с помощью ПЭМ. Масштабная линейка, 200 нм.
[0019] На Фиг. 5 показано клеточное поглощение разнообразных полиплексов. На Фиг. 5a показаны флуоресцентные изображения клеток через 4 часа после трансфекций с помощью разных полиплексов. Ядро было окрашено с помощью DAPI (синий), ДНК была помечена Cy3 (красный). Масштабная линейка: 20 мкм. На Фиг. 5b показана эффективность поглощения полиплекса в HPDF с количественным определением с помощью проточной цитометрии. На Фиг. 5c показана эффективность поглощения полиплекса в 3T3 с количественным определением с помощью проточной цитометрии. На Фиг. 5d показан процентный показатель Cy3-положительных HPDF и нормализованный показатель MFI клеток. На Фиг. 5e показаны процентный показатель Cy3-положительных 3T3 и нормализованный показатель MFI клеток. Достоверное отличие в количественном определении * MFI от SuperFect (p<0,05, двусторонний t-критерий Стьюдента).
[0020] На Фиг. 6 показана протонная буферная емкость, оценка разложения и высвобождения ДНК для LBPAE. На Фиг. 6a показана протонная буферная емкость, определенная путем кислотно-основного титрования. На Фиг. 6b показан профиль разложения, определенный с использованием ГПХ. На Фиг. 6c показана оценка высвобождения ДНК из полиплексов, выполненная с помощью анализа PicoGreen.
[0021] На Фиг. 7 показано иммунофлуоресцентное окрашивание экспрессии C7 в HPDF. На FIG. 7a показаны флуоресцентные изображения HPDF через четыре дня после трансфекции, выполненной с помощью полиплексов LBPAE/MCC7. Ядро было окрашено с помощью красителя DAPI (синий), а C7 был инкубирован с моноклональным первичным антителом к коллагену VII и окрашен вторичным козьим антимышиным антителом - Alexa-568 (красный). Масштабная линейка: 20 мкм. На Фиг. 7b показано количественное определение экспрессии C7 в HPDF с помощью проточной цитометрии. На Фиг. 7c показана степень повышения экспрессии C7 и MFI в HPDF после трансфекции с помощью полиплексов LBPAE/MCC7 и SuperFect/ДНК. Достоверное отличие в *процентном показателе повышения экспрессии C7 и #MFI от SuperFect (p<0,05, двусторонний t-критерий Стьюдента).
[0022] Фиг. 8 представляет собой схематическую иллюстрацию синтеза LBPAE за счет стратегии комбинации линейного олигомера. На стадии 1 амин типа A2 вступает в реакцию с диакрилатом типа C2 с образованием линейного олигомера основания A2-C2, который дополнительно эндкэпирован вторым амином с образованием линейного олигомера A2-C2. На стадии 2, для получения LBPAE путем разветвления, линейный олигомер A2-C2 объединяют с триакрилатом типа B3. В рамке показаны мономеры и эндкэпирующий агент, использованные в этой работе для синтеза LBPAE.
[0023] На Фиг. 9 показаны результаты гель-проникающей хроматографии (ГПХ) для линейного олигомера и LBPAE.
[0024] На Фиг. 10 показаны кривая альфа графика Марка - Хаувинка (MH Alpha) и расчетные значения LBPAE.
[0025] На Фиг. 11 показан анализ химического состава LBPAE с помощью 1H ЯМР.
[0026] На Фиг. 12 показаны результаты в агарозном геле для MCC7 и pcDNA3.1COL7A1.
[0027] На Фиг. 13a показан синтез HPAE с помощью стратегии присоединения по Михаэлю «A2+B3+C2». На Фиг. 13b показаны характеристики гель-проникающей хроматографии и расчетная величина Mw для HPAE по настоящему изобретению. На Фиг. 13c показаны кривые альфа графика Марка - Хаувинка (MH Alpha) и расчетные значения HPAE по настоящему изобретению. (На фигурах 13 и 16-19 для обозначения полимера HPAE по настоящему изобретению используется «HC32-122». HC32-122 представляет собой эквивалент HC32-DATOU, который используется в Примерах).
[0028] На Фиг. 14 показана трансфекция кератиноцитов РДБЭ с использованием полиплексов, содержащих HPAE, имеющих MW 11 кДа, 21 кДа, 34 кДа и 41 кДа, с использованием соотношений HPAE/ДНК 10:1, 30:1 и 50:1 (масс%/масс%).
[0029] На Фиг. 15 показан тест жизнеспособности клеток после генной трансфекции кератиноцитов РДБЭ с использованием полиплексов, содержащих HPAE, имеющих MW 11 кДа, 21 кДа, 34 кДа и 41 кДа, с использованием соотношений полимер/ДНК 10:1, 30:1 и 50:1 (масс%/масс%).
[0030] На Фиг. 16 показаны исследования трансфекции репортерного гена в клетки кератиноцитов РДБЭ с использованием полиплексов HPAE/ДНК. На Фиг. 16a показана относительная активность Gluc клеток кератиноцитов РДБЭ через 48 часов после трансфекции с помощью полиплексов HPAE/ДНК и PEI/ДНК. Данные представлены в процентах и нормализованы к активности Gluc клеток кератиноцитов РДБЭ, трансфицированных полиплексами HPAE/ДНК (30:1 масс. %/масс. %). *Достоверное отличие от группы HPAE (масс./масс. = 30:1) (p<0,05, t-критерий Стьюдента); на Фиг. 16b показана жизнеспособность клеток кератиноцитов РДБЭ после трансфекции полиплексами HPAE/ДНК и PEI/ДНК; на Фиг. 16c показаны GFP-изображения необработанных (UT) клеток и клеток, обработанных полиплексами HPAE/ДНК (масс./масс. = 30:1) или PEI/ДНК (масс./масс. = 1:1). Масштабная линейка, 200 мкм; на Фиг. 16d показана репрезентативная гистограмма распределений популяции необработанных клеток и трансфицированных клеток; на Фиг. 16e показан процентный показатель GFP-положительных клеток кератиноцитов РДБЭ и MFI, определенные количественно с помощью проточной цитометрии. Достоверное отличие в *процентном показателе GFP-положительных клеток и #MFI клеток от PEI (p<0,05, t-критерий Стьюдента).
[0031] На Фиг. 17 показан биосинтез MCC7 и клеточное поглощение полиплексов HPAE/MCC7. На Фиг. 17a показан биосинтез MCC7 с помощью системы расщепления phiC31 plus 1-scel. На Фиг. 17b показан электрофорез в агарозном геле трех COL7A1-кодируюших плазмид ДНК после расщепления EcoR1. Обычная плазмида (RP) pcDNA3.1COL7A1, родительская плазмида (PP) MN511A-1-COL7A1 и MCC7 имеют длины остова 5 т.п.н., 8 т.п.н. и 3 т.п.н., соответственно; на FIG. 17c показаны флуоресцентные изображения клеток кератиноцитов РДБЭ после трансфекции с помощью различных полиплексов. Ядро было окрашено с помощью DAPI (синий), ДНК была помечена Cy3 (красный). Масштабная линейка, 20 мкм; на Фиг. 17d показана эффективность клеточного поглощения полиплекса, определенная количественно с помощью проточной цитометрии; на Фиг. 17e показан процентный показатель Cy3-положительных клеток и MFI. *Достоверное отличие в показателе MFI клетки от группы PEI/MCC7 (p<0,05, t-критерий Стьюдента).
[0032] На Фиг. 18 показана мРНК COL7A1 и экспрессия рекомбинантного C7 после трансфекции с помощью полиплексов HPAE/MCC7. На Фиг. 18a показан график амплификации эндогенного контроля GAPDH, полученный путем обратной транскрипции количественной полимеразной цепной реакции (RT-qPCR); на Фиг. 18b показан график амплификации мРНК COL7A1 клеток кератиноцитов РДБЭ после трансфекции, полученный путем RT-qPCR; на Фиг. 18c показано количественное определение мРНК COL7A1 , *Достоверное отличие в группе PEI (p<0,05, t-критерий Стьюдента); на Фиг. 18d показаны цито-иммунофлуоресцентные изображения окрашивания C7 (красная флуоресценция), масштабная линейка, 20 мкм; на Фиг. 18e показаны результаты вестерн-блоттинга экспрессии C7. Для контроля загрузки был использован β-Актин 42 кДа.
[0033] На Фиг. 19 показаны физико-химические свойства полиплексов HPAE/MCC7 и HPAE/ДНК с масс.%/масс.% соотношением 30:1. На Фиг. 19a показано образование полиплекса HPAE/MCC7; на Фиг. 19b показаны результаты анализа в агарозном геле конденсации ДНК и гепарин-конкурентного анализа через 2 часа после получения полиплекса; на Фиг. 19c показан тест на способность связывания ДНК с помощью анализа PicoGreen в присутствии гепарина или без него через 2 часа после получения полиплекса; на Фиг. 19d показаны размеры полиплексов HPAE /MCC7, измеренные с помощью нитрилотриацетата (NTA); на Фиг. 19e показано распределение дзета-потенциалов полиплексов HPAE/MCC7; на Фиг. 19f показано изображение ПЭМ полиплексов HPAE/MCC7. Масштабная линейка, 500 нм.
[0034] На FIG. 20 показаны характеристики генной трансфекции состава, содержащего полиплекс HPAE по настоящему изобретению. На Фиг. 20a показана лиофилизация полиплекса и последующее изучение трансфекции в клетках кератиноцитов РДБЭ; на Фиг. 20b показаны GFP-изображения клеток после трансфекции с помощью полиплексов от разных способов хранения и условий лиофилизации. FZ: сублимационная сушка; Suc: сахароза. Масштабная линейка, 200 мкм; на Фиг. 20c показаны репрезентативные гистограммы распределения популяции необработанных (UT) и трансфицированных клеток; на Фиг. 20d показана эффективность экспрессии GFP клеток после трансфекции, количественно определенная с помощью проточной цитометрии. *Достоверное отличие от группы свежеприготовленного полиплекса (p<0,05, t-критерий Стьюдента); (e) Нормализованный показатель MFI, количественно определенный с помощью проточной цитометрии. *Достоверное отличие от группы свежеприготовленного полиплекса (p<0,05, t-критерий Стьюдента).
[0035] На Фиг. 21 показана трансфекция полиплексов HPAE по настоящему изобретению в клетки кератиноцитов РДБЭ после долгосрочного хранения
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0036] При использовании выше и во всем этом описании следующие термины, если не указано иное, следует понимать как имеющие следующие значения. Если термин отсутствует, используется общепринятый термин, известный специалистам в данной области техники.
[0037] При использовании в данном документе термины «включающий в себя» и «содержащий» используются в их открытом, неограничивающем смысле.
[0038] Единственное число используется в данном раскрытии для обозначения одного или более одного (т. е., по меньшей мере одного) грамматического объекта. Например, «элемент» означает один элемент или более одного элемента.
[0039] Термин «и/или» используется в данном раскрытии для обозначения как «и», так и «или», если не указано иное.
[0040] Чтобы обеспечить более краткое описание, некоторые из приведенных в данном документе количественных выражений не дополнены термином «около». Понятно, что независимо от того, используется ли термин «около» явным образом или нет, каждое количество, указанное в данном документе, предназначено для ссылки на фактическое заданное значение, а также подразумевается, что оно относится и к приближению к такому заданному значению, которое может быть объективно выведено специалистом в данной области, включая эквиваленты и приближения, обусловленные условиями эксперимента и/или измерения для такого заданного значения. Всякий раз, когда выход задан в процентах, такой выход относится к массе вещества, для которого выход задан по отношению к максимальному количеству того же вещества, которое может быть получено при конкретных стехиометрических условиях. Концентрации, которые заданы в процентах, относятся к массовым отношениям, если не указано иное.
[0041] «Пациент» представляет собой, например, млекопитающее, например, человека, мышь, крысу, морскую свинку, собаку, кошку, лошадь, корову, свинью или отличного от человека примата, такого как обезьяна, шимпанзе, бабуин или макак-резус. Термин «пациент» включает в себя как людей, так и животных.
[0042] Термины «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» при использовании в связи с соединением, относятся к количеству такого соединения, достаточному для обеспечения желаемого результата биологических анализов. Таким результатом может быть уменьшение и/или облегчение проявлений, симптомов или причин заболевания или любое другое желательное изменение биологической системы. Например, «эффективное количество» для терапевтического применения представляет собой количество композиции, содержащей описанное в данном документе соединение, необходимое для обеспечения клинически значимого облегчения заболевания. Соответствующее «эффективное количество» в любом отдельном случае может определить средний специалист в данной области, используя обычные эксперименты. Таким образом, выражение «эффективное количество» обычно относится к количеству, при котором активное вещество имеет терапевтические эффекты.
[0043] При использовании в данном документе термины «лечить» или «лечение» являются синонимами термина «предотвращать» и обозначают отсрочку развития заболеваний, предотвращение развития заболеваний и/или снижение тяжести таких симптомов, которые будут развиваться или развитие которых ожидается. Таким образом, эти термины включают в себя облегчение существующих симптомов заболевания, предотвращение дополнительных симптомов, облегчение или предотвращение основных причин симптомов, подавление нарушения или заболевания, например, прекращение развития нарушения или заболевания, облегчение нарушения или заболевания, обеспечение ремиссии нарушения или заболевания, облегчение состояния, вызванного заболеванием или нарушением, или прекращение или облегчение симптомов заболевания или нарушения. В некоторых вариантах осуществления «лечить» или «лечение» относится к стимулированию фенотипа здоровой кожи.
[0044] В контексте данного описания термин «нарушение» означает и используется взаимозаменяемо с терминами заболевание, патологическое состояние или болезнь, если не указано иное.
[0045] Использование терминов «фармацевтически приемлемый» или «фармакологически приемлемый» предназначено для обозначения материала, который не является биологически, или иным образом, нежелательным - такой материал можно вводить индивидууму, не вызывая каких-либо по существу нежелательных биологических эффектов, или без вредного взаимодействия с любым из компонентов композиции, в которой он содержится.
[0046] В контексте данного раскрытия термин «носитель» охватывает носители, вспомогательные вещества и разбавители, и означает материал, композицию или несущую среду, такие как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, вспомогательное вещество, растворитель или инкапсулирующий материал, участвующие в доставке или транспорте фармацевтического агента из одного органа или участка организма в другой орган или участок организма субъекта. Вспомогательные вещества следует выбирать, исходя из совместимости и характеристик профиля высвобождения желаемой лекарственной формы. Примерные вещества-носители включают в себя, например, связующие вещества, суспендирующие вещества, дезинтегрирующие вещества, наполнители, поверхностно-активные вещества, солюбилизаторы, стабилизаторы, смазывающие вещества, смачивающие вещества, разбавители, высушенные распылением дисперсии и тому подобное.
[0047] Термин «фармацевтически совместимые вещества-носители» может включать в себя, например, гуммиарабик, желатин, коллоидный диоксид кремния, глицерофосфат кальция, лактат кальция, мальтодекстрин, глицерин, силикат магния, казеинат натрия, соевый лецитин, хлорид натрия, трикальцийфосфат, дикальцийфосфат, стеароиллактилат натрия, каррагинан, моноглицерид, диглицерид, прежелатинизированный крахмал и т.п. См., например, Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 1975.
[0048] При использовании в данном документе термин «субъект» охватывает млекопитающих и не млекопитающих. Примеры млекопитающих включают в себя, но не ограничиваются ими, любого члена класса млекопитающих: людей, приматов, таких как шимпанзе, и другие виды обезьян; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, лошадей, овец, коз, свиней; домашних животных, таких как кролики, собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как крысы, мыши и морские свинки, и тому подобное. Примеры не млекопитающих включают в себя, но не ограничиваются ими, птиц, рыб и тому подобное. В одном варианте осуществления по настоящему изобретению млекопитающее является человеком.
[0049] В контексте данного раскрытия термин «вводить» или «введение» относится как к непосредственному введению субъекту раскрытого соединения или фармацевтически приемлемой соли раскрытого соединения, или композиции, так и к введению субъекту производного пролекарства или аналога соединения или фармацевтически приемлемой соли соединения, или композиции, которые могут образовывать эквивалентное количество активного соединения в организме субъекта, включая животное, нуждающегося в лечении, путем приведения такого индивидуума в контакт с этим соединением или обеспечения каким-либо иным образом воздействие этого соединения на такого индивидуума.
[0050] При использовании в данном документе «алкил» означает прямую цепь или насыщенную разветвленную цепь, имеющую от 1 до 40 атомов углерода. Типичные насыщенные алкильные группы включают в себя, но не ограничиваются ими, метил, этил, н-пропил, изопропил, 2-метил-1-пропил, 2-метил-2-пропил, 2-метил-1-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-3-бутил, 2,2-диметил-1-пропил, 2-метил-1-пентил, 3-метил-1-пентил, 4-метил-1-пентил, 2-метил-2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 2,2-диметил-1-бутил, 3,3-диметил-1-бутил, 2-этил-1-бутил, бутил, изобутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил и т. п., а также более длинные алкильные группы, такие как гептил, октил и т. п. Алкильная группа может быть замещенной или незамещенной. Алкильные группы, содержащие три или более атомов углерода, могут быть прямыми или разветвленными. При использовании в данном документе «низший алкил» обозначает алкильную группу, имеющую от 1 до 10 атомов углерода.
[0051] При использовании в данном документе «алкенил» включает в себя неразветвленную или разветвленную углеводородную цепь, содержащую 2-40 атомов углерода. «Алкенильная» группа содержит по меньшей мере одну двойную связь. Двойная связь алкенильной группы может быть неконъюгированной или конъюгированной с другой ненасыщенной группой. Примеры алкенильных групп включают в себя, но не ограничиваются ими, этиленил, винил, аллил, бутенил, пентенил, гексенил, бутадиенил, пентадиенил, гексадиенил, 2-этилгексенил, 2-пропил-2-бутенил, 4-(2-метил-3-бутен)-пентенил и тому подобное. Алкенильная группа может быть замещенной или незамещенной. Алкенил, как указано в настоящем документе, также может быть разветвленным или прямым.
[0052] При использовании в данном документе «алкинил» включает в себя неразветвленную или разветвленную ненасыщенную углеводородную цепь, содержащую 2-40 атомов углерода. «Алкинильная» группа содержит по меньшей мере одну тройную связь. Тройная связь алкинильной группы может быть неконъюгированной или конъюгированной с другой ненасыщенной группой. Примеры алкинильных групп включают в себя, но не ограничиваются ими, этинил, пропинил, бутинил, пентинил, гексинил, метилпропинил, 4-метил-1-бутинил, 4-пропил-2-пентинил, 4-бутил-2-гексинил и т. п. Алкинильная группа может быть замещенной или незамещенной.
[0053] Следует также отметить, что любой атом углерода, а также гетероатом с ненасыщенными валентностями в тексте, схемах, примерах и таблицах данного документа, как предполагается, имеет достаточное количество атомов водорода, чтобы насытить валентности.
[0054] При использовании в данном документе ссылки на водород могут также относиться к замещению дейтерием, если это желательно. Используемый в данном документе термин «дейтерий» означает стабильный изотоп водорода, имеющий нечетное число протонов и нейтронов.
[0055] Термин «галоген» относится к фтору, хлору, брому или йоду.
[0056] В контексте данного документа термин «галогеналкил» относится к алкильной группе по определению данного документа, которая замещена одним или более галогенами. Примеры галогеналкильных групп включают, но не ограничиваются ими, трифторметил, дифторметил, пентафторэтил, трихлорметил и т. д.
[0057] Если специально не указано иное, термин «арил» относится к циклическим, ароматическим углеводородным группам, которые имеют от 1 до 3 ароматических колец, включая моноциклические или бициклические группы, такие как фенил, бифенил или нафтил. В случае наличия двух ароматических колец (бициклические соединения и т. д.), ароматические кольца арильной группы могут быть соединены в одной точке (например, бифенил) или конденсированы (например, нафтил). Арильная группа может быть необязательно замещена одним или более заместителями, например, 1-5 заместителями, в любой точке присоединения. Заместители могут сами быть необязательно замещенными. Кроме того, в случае наличия двух конденсированных колец арильные группы по определению данного документа могут иметь ненасыщенное или частично насыщенное кольцо, конденсированное с полностью насыщенным кольцом. Примеры кольцевых систем этих арильных групп включают, но не ограничиваются ими, фенил, бифенил, нафтил, антраценил, феналенил, фенантренил, инданил, инденил, тетрагидронафталенил, тетрагидробензоаннуленил и т. п.
[0058] Если специально не указано иное, «гетероарил» обозначает одновалентный моноциклический или полициклический ароматический радикал из 5-18 кольцевых атомов или полициклический ароматический радикал, содержащий один или более кольцевых гетероатомов, выбранных из N, O или S, а оставшиеся атомы представляют собой С. Гетероарил по определению данного документа также обозначает бициклическую гетероароматическую группу, в которой гетероатом выбран из N, O или S. Ароматический радикал является независимо необязательно замещенным одним или более заместителями, описанными в данном документе. Заместители могут сами быть необязательно замещенными. Примеры включают в себя, но не ограничиваются ими, бензотиофен, фурил, тиенил, пирролил, пиридил, пиразолил, пиримидинил, имидазолил, изоксазолил, оксазолил, оксадиазолил, пиразинил, индолил, тиофен-2-ил, хинолил, бензопиранил, изотиазолил, тиазолил, тиадиазолил, тиено[3,2-b]тиофен, триазолил, триазинил, имидазо[1,2-b]пиразолил, фуро[2,3-c]пиридинил, имидазо[1,2-a]пиридинил, индазолил, пирроло[2,3-c]пиридинил, пирроло[3,2-c]пиридинил, пиразоло[3,4-c]пиридинил, бензоимидазолил, тиено[3,2-c]пиридинил, тиено[2,3-c]пиридинил, тиено[2,3-b]пиридинил, бензотиазолил, индолил, индолинил, индолинонил, дигидробензотиофенил, дигидробензофуранил, бензофуран, хроманил, тиохроманил, тетрагидрохинолинил, дигидробензотиазин, дигидробензоксанил, хинолинил, изохинолинил, 1,6-нафтиридинил, бензо[де]изохинолинил, пиридо[4,3-b][1,6]нафтиридинил, тиено[2,3-b]пиразинил, хиназолинил, тетразоло[1,5-a]пиридинил, [1,2,4]триазоло[4,3-a]пиридинил, изоиндолил, пирроло[2,3-b]пиридинил, пирроло[3,4-b]пиридинил, пирроло[3,2-b]пиридинил, имидазо[5,4-b]пиридинил, пирроло[1,2-a]пиримидинил, тетрагидропирроло[1,2-a]пиримидинил, 3,4-дигидро-2H-1λ2-пирроло[2,1-b]пиримидин, дибензо[b, d]тиофен, пиридин-2-он, фуро[3,2-c]пиридинил, фуро[2,3-c]пиридинил, 1H-пиридо[3,4-b][1,4]тиазинил, бензоксазолил, бензизоксазолил, фуро[2,3-b]пиридинил, бензотиофенил, 1,5-нафтиридинил, фуро[3,2-b]пиридин, [1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридинил, бензо[1,2,3]триазолил, имидазо[1,2-a]пиримидинил, [1,2,4]триазоло[4,3-b]пиридазинил, бензо[c][1,2,5]тиадиазолил, бензо[c][1,2,5]оксадиазол, 1,3-дигидро-2H-бензо[d]имидазол-2-он, 3,4-дигидро-2H-пиразоло[1,5-b][1,2]оксазинил, 4,5,6,7-тетрагидропиразоло[1,5-a]пиридинил, тиазоло[5,4-d]тиазолил, имидазо[2,1-b][1,3,4]тиадиазолил, тиено[2,3-b]пирролил, 3H-индолил и их производные. Кроме того, в случае наличия двух конденсированных колец гетероарильные группы по определению данного документа могут иметь ненасыщенное или частично насыщенное кольцо, конденсированное с полностью насыщенным кольцом.
[0059] При использовании в данном документе термин «циклоалкил» относится к насыщенному или частично насыщенному, моноциклическому, конденсированному или спирополициклическому карбоциклу, имеющему от 3 до 18 атомов углерода на кольцо. Циклоалкильное кольцо или карбоцикл могут быть необязательно замещены одним или более заместителями, например, 1-5 заместителями, в любой точке присоединения. Заместители могут сами быть необязательно замещенными. Примеры циклоалкильных групп включают, без ограничений, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептанил, циклооктанил, норборанил, норборенил, бицикло[2.2.2]октанил, бицикло[2.2.2]октенил, декагидронафталенил, октагидро-1H-инденил, циклопентенил, циклогексенил, циклогекса-1,4-диенил, циклогекса-1,3-диенил, 1,2,3,4-тетрагидронафталенил, октагидропенталенил, 3a,4,5,6,7,7a-гексагидро-1H-инденил, 1,2,3,3a-тетрагидропенталенил, бицикло[3.1.0]гексанил, бицикло[2.1.0]пентанил, спиро[3.3]гептанил, бицикло[2.2.1]гептанил, бицикло[2.2.1]гепт-2-енил, бицикло[2.2.2]октанил, 6-метилбицикло[3.1.1]гептанил, 2,6,6-триметилбицикло[3.1.1]гептанил и их производные.
[0060] При использовании в данном документе термин «циклоалкенил» относится к частично насыщенному, моноциклическому, конденсированному или спирополициклическому карбоциклу, имеющему от 3 до 18 атомов углерода на кольцо и содержащему по меньшей мере одну двойную связь. Циклоалкенильное кольцо может быть необязательно замещено одним или более заместителями, например, 1-5 заместителями, в любой точке присоединения. Заместители могут сами быть необязательно замещенными.
[0061] При использовании в данном документе термин «гетероциклоалкил» или «гетероциклил» относится к насыщенной или частично ненасыщенной и неароматической моноциклической, конденсированной или спиральной, полициклической, кольцевой структуре из 4-18 атомов, содержащей углерод и гетероатомы, взятые из кислорода, азота или серы, и где между кольцевыми атомом углерода или гетероатомами отсутствуют делокализованные π-электроны (ароматичность). Структура гетероциклоалкильного или гетероциклильного кольца может быть замещенной одним или большим количеством заместителей. Заместители могут сами быть необязательно замещенными. Примеры гетероциклоалкильного или гетероциклильного колец включают в себя, но не ограничиваются ими, оксетанил, азетидинил, тетрагидрофуранил, пирролидинил, оксазолинил, оксазолидинил, тиазолинил, тиазолидинил, пиранил, тиопиранил, тетрагидропиранил, диоксалинил, пиперидинил, морфолинил, тиоморфолинил, тиоморфолинила S-оксид, тиоморфолинила S-диоксид, пиперазинил, азепинил, оксепинил, диазепинил, тропанил, гомотропанил, дигидротиофен-2(3H)-онил, тетрагидротиофена 1,1-диоксид, 2,5-дигидро-1H-пирролил, имидазолидин-2-он, пирролидин-2-он, дигидрофуран-2(3H)-он, 1,3-диоксолан-2-он, изотиазолидина 1,1-диоксид, 4,5-дигидро-1H-имидазолил, 4,5-дигидрооксазолил, оксиранил, пиразолидинил, 4H-1,4-тиазинил, тиоморфолинил, 1,2,3,4-тетрагидропиридинил, 1,2,3,4-тетрагидропиразинил, 1,3-оксазинан-2-он, тетрагидро-2H-тиопирана 1,1-диоксид, 7-оксабицикло[2.2.1]гептанил, 1,2-тиазепана 1,1- диоксид, октагидро-2H-хинолизинил, 1,3-диазабицикло[2.2.2]октанил, 2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин, 3-азабицикло[3.2.1]октанил, 8-азаспиро[4.5]декан, 8-окса-3-азабицикло[3.2.1]октанил, 2-азабицикло[2.2.1]гептан, 2,8-диазаспиро[5.5] ундеканил, 2-азаспиро[5.5]ундеканил, 3-азаспиро[5.5]ундеканил, декагидроизохинолинил, 1-окса-8-азаспиро[4.5]деканил, 8-азабицикло[3.2.1]октанил, 1,4'-бипиперидинил, азепанил, 8-окса-3-азабицикло[3.2.1]октанил, 3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазинил, 5,6,7,8- тетрагидроимидазо[1,2-a]пиридинил, 1,4-диазепанил, феноксатиинил, бензо[d][1,3]диоксолил, 2,3-дигидробензофуранил, 2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксинил, 4-(пиперидин-4-ил)морфолинил, 3-азаспиро[5.5] ундеканил, декагидрохинолинил, пиперазин-2-он, 1-(пирролидин-2-илметил) пирролидинил, 1,3'-бипирролидинил и 6,7,8,9-тетрагидро-1H, 5H-пиразоло[1,2-a][1,2] диазепинил.
[0062] Используемые в данном документе числовые диапазоны предназначены для включения в себя последовательных целых чисел, если не указано иное. Например, диапазон, выраженный как «от 0 до 5», будет включать в себя 0, 1, 2, 3, 4 и 5.
[0063] В контексте данного документа термин «замещенный» означает, что указанные группа или фрагмент несут один или более подходящих заместителей, при этом заместители могут быть соединены с указанными группой или фрагментом в одном или более положений. Например, «арил, замещенный циклоалкилом» может указывать на то, что циклоалкил соединен с одним атомом арила связью или посредством конденсации с арилом, и они имеют два или более общих атомов.
[0064] При использовании в данном документе термин «незамещенный» означает, что указанная группа не несет заместителей.
[0065] Подразумевается, что термин «необязательно замещенный» означает, что данный химический фрагмент (например, алкильная группа) может (но не в обязательном порядке) быть связанным с другими заместителями (например, гетероатомами). Например, необязательно замещенная алкильная группа может представлять собой полностью насыщенную алкильную цепь (т. е. чистый углеводород). В альтернативном варианте такая же необязательно замещенная алкильная группа может иметь заместители, отличные от водорода. Например, она может, в любой точке на протяжении цепи, быть связана с атомом галогена, гидроксильной группой или любым другим заместителем, описанным в данном документе. Таким образом, термин «необязательно замещенный» означает, что данный химический фрагмент потенциально может содержать другие функциональные группы, но необязательно имеет какие-либо дополнительные функциональные группы. Если не указано иное, подходящие заместители, используемые при необязательном замещении описанных групп, включают в себя, без ограничения, оксо, -галоген, C1-C6 алкил, C1-C6 алкокси, C1-C6 галоалкил, C1-C6 галоалкокси, -OC1-C6 алкенил, -OC1-C6 алкинил, -C1-C6 алкенил, -C1-C6 алкинил, -OH, CN (циано), -CH2CN, -OP(O)(OH)2, -C(O)OH, -OC(O)C1-C6 алкил, -C(O)C1-C6 алкил, -C(O)-C0-C6 алкиленил-циклоалкил, -C(O)-C0-C6 алкиленил-гетероциклоалкил, -C(O)-C0-C6 алкиленил-арил, -C(O)-C0-C6 алкиленил-гетероарил,-OC(O)OC1-C6 алкил, NH2, NH(C1-C6 алкил), N(C1-C6 алкил)2, -C(O)NH2, -C(O)NH(C1-C6 алкил), -C(O)N(C1-C6 алкил)2, -C(O)NH циклоалкил, -C(O)N(C1-C6 алкил)циклоалкил, -C(O)NHгетероциклоалкил, -C(O)N(C1-C6 алкил)гетероциклоалкил, -C(O)NHарил, -C(O)N(C1-C6 алкил)арил, -C(O)NHгетероарил, -C(O)N(C1-C6 алкил)гетероарил, -S(O)2-C1-C6 алкил, -S(O)2-C1-C6 галоалкил, -S(O)2- циклоалкил, -S(O)2-гетероциклоалкил, -S(O)2-арил, -S(O)2-гетероарил-C0-C6 алкиленил-S(O)2NH2, -S(O)2NHC1-C6 алкил, -S(O)2N(C1-C6 алкил)2, -S(O)2NHциклоалкил, -S(O)2NHгетероциклоалкил, -S(O)2NHарил, -S(O)2NHгетероарил, -NHS(O)2C1-C6 алкил, -N(C1-C6 алкил)S(O)2(C1-C6 алкил), -NHS(O)2арил, -N(C1-C6 алкил)S(O)2 арил, -NHS(O)2 гетероарил, -N(C1-C6 алкил)S(O)2 гетероарил, -NHS(O)2 циклоалкил, -N(C1-C6 алкил)S(O)2 циклоалкил, -NHS(O)2 гетероциклоалкил, -N(C1-C6 алкил)S(O)2 гетероциклоалкил, -N(C1-C6 алкил)S(O)2 арил,-C0-C6 алкиленил-арил, -C0-C6 алкиленил-гетероарил, -C0-C6 алкиленил-циклоалкил, -C0-C6 алкиленил-гетероциклоалкил, -O-арил, -NH-арил и N(C1-C6 алкил)арил. Заместители могут сами быть необязательно замещенными. Когда показан многофункциональный фрагмент, точку присоединения к ядру указывают линией, например, (циклоалкилокси)алкил- относится к алкилу, который является точкой присоединения к ядру, в то время как циклоалкил присоединен к алкилу через оксигруппу. «Необязательно замещенный» также относится к термину «замещенный» или «незамещенный» со значениями, описанными выше.
[0066] При использовании в данном документе термин «линкер» или «связывающий фрагмент» относится к группе, которая соединяет две группы и имеет остов, состоящий из от 0 до 100 атомов. Линкер или связь может представлять собой ковалентную связь (то есть остов из 0 атомов), которая соединяет две группы или цепь длиной от 1 до 100 атомов, например, длиной около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 , 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 или 100 атомов углерода, где линкер может быть линейным, разветвленным, циклическим или одиночным атомом. В некоторых случаях один или более атомов углерода остова линкера могут быть необязательно замещены гетероатомом серы, азота или кислорода. Связи между атомами остова могут быть насыщенными или ненасыщенными. Линкер может включать в себя одну или большее количество групп заместителя, например, алкильную, арильную или алкенильную группу. Линкер может включать в себя, без ограничений, олиго(этиленгликоль), эфиры, тиоэфиры, третичные амины, алкилы, которые могут быть прямыми или разветвленными, например, метил, этил, н-пропил, 1-метилэтил (изопропил), н-бутил, н-пентил, 1,1-диметилэтил(трет-бутил) и тому подобное. Основная цепь линкера может включать циклическую группу, например, арил, гетероцикл или циклоалкильную группу, где 2 или более атомов, например, 2, 3 или 4 атома циклической группы, включены в остов. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым.
[0067] Если не указано иное, термин «молекулярная масса» относится к средневзвешенной молекулярной массе (MW).
[0068] Термин «гетероалкилен» относится к двухвалентному алкилену, в котором один или большее количество атомов углерода заменены серой, кислородом или NRd , где Rd представляет собой водород или алкил. Гетероалкилен может быть линейным, разветвленным, циклическим или их комбинациями.
[0069] Термин «гетероалкенилен» относится к двухвалентным гидрокарбильным группам с прямой или разветвленной цепью, имеющим по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь и один или большее количество гетероатомов (например, N, S или O) в своем остове.
[0070] Термин «гетероалкинилен» относится к двухвалентным гидрокарбильным группам с прямой или разветвленной цепью, имеющим по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь и один или большее количество гетероатомов (например, N, S или O) в своем остове.
[0071] Используемый в данном документе термин «полиплекс» относится к комплексу между нуклеиновой кислотой и полимером. Нуклеиновая кислота связана с полимером посредством нековалентных связей, в частности, электростатических связей.
[0072] Термин «плазмида» относится к внехромосомному элементу, часто несущему ген, который не является частью центрального метаболизма клетки и обычно имеет форму кольцевых двухцепочечных молекул ДНК. Такие элементы могут быть автономно реплицирующимися последовательностями, интегрирующими геном последовательностями, фаговыми или нуклеотидными последовательностями, линейной, кольцевой или суперспиральной, одноцепочечной или двухцепочечной ДНК или РНК, полученной из любого источника, в которых ряд нуклеотидных последовательностей соединены или рекомбинированы в уникальную конструкцию, которая способна вводить в клетку промоторный фрагмент и последовательность ДНК для продукта выбранного гена вместе с соответствующей 3′-нетранслируемой последовательностью. Используемый в данном документе термин «плазмида» относится к конструкции, состоящей из генетического материала (то есть нуклеиновых кислот). Как правило, плазмида содержит начало репликации, которая является функциональной в бактериальных клетках-хозяевах, например, Escherichia coli, и селектируемые маркеры для выявления бактериальных клеток-хозяев, содержащих такую плазмиду.
[0073] Термин «наноплазмида» относится к кольцевой последовательности ДНК, имеющей сокращенную бактериальную последовательность, которая обеспечивает плазмиду меньшего размера с желаемой генной вставкой. Например, наноплазмиды, полученные с помощью не содержащей антибиотиков селективной системы RNA-OUT, и способы их получения описаны в патенте США № 9 109 012, который в полном объеме включен в настоящий документ посредством ссылки и запатентован Nature Technology.
[0074] Термин «нуклеиновая кислота» относится к биологическому полимеру азотистых оснований и может включать в себя, не ограничиваясь ими, дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), рибонуклеиновую кислоту (РНК), микро РНК (микроРНК) и пептидную нуклеиновую кислоту (ПНК).
[0075] Термин «миникольцо» относится к небольшой кольцевой ДНК минимального размера, полученной из родительской плазмиды путем внутримолекулярной рекомбинации для удаления бактериальных последовательностей репликации.
[0076] Термин «система редактирования генов» относится к системе, способной изменять нуклеиновую кислоту-мишень одним из многих способов репарации ДНК.
[0077] Настоящее изобретение направлено на новый класс разветвленных полимеров, включающий в себя полимеры, синтезированные по стратегии комбинирования линейных олигомеров. В некоторых вариантах осуществления олигомеры линейного поли(β-аминоэфира) соединены элементами разветвления с образованием многофункционального линейно-разветвленного гибридного поли(β-аминоэфира) (LBPAE). Полимеры по настоящему изобретению разработаны и получены для разнообразных применений, включая, но не ограничиваясь только перечисленным, высокоэффективную трансфекцию гена фибробласта. В первичных фибробластах кожи человека (HPDF) и фибробластах эмбриона мыши (3T3) сверхвысокая экспрессия трансгена достигается за счет LBPAE: выявлено до 3292-кратное увеличение экспрессии Gluciferase (Gluc, люцифераза Gaussia) и почти 100% экспрессия зеленого флуоресцентного белка (GFP). Всесторонние исследования механизма действия показывают, что LBPAE может преодолевать множественные внеклеточные и внутриклеточные барьеры, связанные с трансфекцией гена фибробласта. Что более важно, LBPAE может эффективно доставлять различные гены (например, COL7A1) для, по существу, повышения желаемой экспрессии (например, белка коллагена (C7) типа VII в HPDF), демонстрируя свой большой потенциал в лечении заболеваний (например, генодерматоза с дефицитом C7, такого как рецессивный дистрофический буллезный эпидермолиз (РДЭБ)).
Полимеры
[0078] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает полимеры, полученные способом:
(a) введение в реакцию соединения формулы (A)
(A)
с первым амином, имеющим формулу R1-NH2 или R1-N(H)-Z’-N(H)-R1;
(b) введения в реакцию продукта стадии (a) со вторым амином, имеющим формулу R2-NH2 или R2-N(H)-Z’’-N(H)-R2; и
(c) введения в реакцию продукта стадии (b) с соединением формулы (B):
(B);
где
каждый J независимо представляет собой -O- или -NH-;
Z, Z’ и Z’’ являются связывающими фрагментами;
A представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь из от 2 до 30 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, или гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов;
где A необязательно замещен одним или большим количеством галогена, гидроксила, аминогруппы, сульфонильной группы, сульфонамидной группы, тиола, C1-C6 алкила C1-C6 алкокси, C1-C6эфира, C1-C6 тиоэфира, C1-C6 сульфона, C1-C6 сульфоксида, C1-C6 первичного амида, C1-C6 вторичного амида, галоген-C1-C6 алкила, карбоксильной группы, цианогруппы, нитрогруппы, нитрозогруппы, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкила, C3-C6циклоалкила, C3-C6 гетероциклила, C2-C5 гетероарила или C6-C10 арила; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила;
G представляет собой -C-, -S-, -S(O)-, -P(OR1)- или -P(OH)-;
каждый Q представляет собой H или линейную или разветвленную алкильную группу C1-C10;
каждый E1 независимо выбран из группы, состоящей из ковалентной связи, -N-, -O-, -S-, алкилена, гетероалкилена, алкенила, гетероалкенилена, алкинила, гетероалкинилена;
R1 и R2 каждый независимо представляет собой C1-C40алкил, C1-C40 гетероалкил, C2-C40алкенил, C2-C40 гетероалкенилен, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C2-C40 гетероалкинилен, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; причем гетероциклил и гетероарил содержат 1-5 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, S, P и O; в котором C1-C40алкил, C2-C40алкенил, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещены D, галогеном, C1-C6алкилом, -OH, -O-C1-C6алкилом,-NH2, -NH(C1-C6алкилом), или -N(C1-C6алкилом)2; и R1 является незамещенным или замещенным по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, галоген-C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом и C6-C10) арилом; причем каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила; и
каждое n равно по меньшей мере 1.
[0079] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает полимеры, полученные способом:
(a) введение в реакцию соединения формулы (A)
(A)
и соединения формулы (B):
(B);
с первым амином, имеющим формулу R1-NH2 или R1-N(H)-Z’-N(H)-R1;
(b) введения в реакцию продукта стадии (a) со вторым амином, имеющим формулу R2-NH2 или R2-N(H)-Z’’-N(H)-R2;
где
каждый J независимо представляет собой -O- или -NH-;
Z, Z’ и Z’’ являются связывающими фрагментами;
A представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь из от 2 до 30 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, или гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов;
где A необязательно замещен одним или большим количеством галогена, гидроксила, аминогруппы, сульфонильной группы, сульфонамидной группы, тиола, C1-C6 алкила C1-C6 алкокси, C1-C6эфира, C1-C6 тиоэфира, C1-C6 сульфона, C1-C6 сульфоксида, C1-C6 первичного амида, C1-C6 вторичного амида, галоген-C1-C6 алкила, карбоксильной группы, цианогруппы, нитрогруппы, нитрозогруппы, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкила, C3-C6циклоалкила, C3-C6 гетероциклила, C2-C5 гетероарила или C6-C10 арила; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила;
G представляет собой -C-, -S-, -S(O)-, -P(OR1)- или -P(OH)-;
каждый Q представляет собой H или линейную или разветвленную алкильную группу C1-C10;
каждый E1 независимо выбран из группы, состоящей из ковалентной связи, -N-, -O-, -S-, алкилена, гетероалкилена, алкенила, гетероалкенилена, алкинила, гетероалкинилена;
R1 и R2 каждый независимо представляет собой C1-C40алкил, C1-C40 гетероалкил, C2-C40алкенил, C2-C40 гетероалкенилен, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C2-C40 гетероалкинилен, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; причем гетероциклил и гетероарил содержат 1-5 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, S, P и O; в котором C1-C40алкил, C2-C40алкенил, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещены D, галогеном, C1-C6алкилом, -OH, -O-C1-C6алкилом,-NH2, -NH(C1-C6алкилом), или -N(C1-C6алкилом)2; и R1 является незамещенным или замещенным по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, галоген-C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом и C6-C10) арилом; причем каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила; и
каждое n равно по меньшей мере 1.
[0080] В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, алкилен-карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов, или алкилен-гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов. Z может быть незамещен или замещен по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, галоген-C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом или C6-C10 арилом; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила; В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой линейную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов углерода. Например, Z может представлять собой алкиленовую группу, включающую в себя, не ограничиваясь ими, C1-C24 алкилен, C1-C20 алкилен, C1-C16 алкилен, C1-C12 алкилен, C1-C8 алкилен, C1-C6 алкилен, C1-C4 алкилен, C1-C3 алкилен, C1-C2 алкилен, C1 алкилен. Типичные алкиленовые группы включают в себя, но не ограничиваются ими, метилен, этилен, пропилен, н-бутилен, этенилен, пропенилен, н-бутенилен, пропинилен, н-бутинилен и т. п. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов углерода, или содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 10 атомов углерода. Например, в некоторых вариантах осуществления Z представляет собой 
. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой линейную или разветвленную содержащую гетероатом углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов. Например, Z может представлять собой линейную или разветвленную углеродную цепь с одним или большим количеством атомов углерода, замещенных гетероатомом, включающим в себя, не ограничиваясь ими, O, N, S или P. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой алкилен-карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода. Например, в некоторых вариантах осуществления Z представляет собой 
, где x равно 1-1000. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой алкилен-гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов. В некоторых вариантах осуществления Z является незамещенным. В некоторых вариантах осуществления Z является замещенным. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой одно из следующего 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
или 
.
[0081] В некоторых вариантах осуществления Z’ представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, алкилен-карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов, или алкилен-гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов. Z’ может быть незамещен или замещен по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, гало C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом или C6-C10 арилом; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила; В некоторых вариантах осуществления Z’ представляет собой линейную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов углерода. Например, Z’ может представлять собой алкиленовую группу, включающую в себя, не ограничиваясь ими, C1-C24 алкилен, C1-C20 алкилен, C1-C16 алкилен, C1-C12 алкилен, C1-C8 алкилен, C1-C6 алкилен, C1-C4 алкилен, C1-C3 алкилен, C1-C2 алкилен, C1 алкилен. Типичные алкиленовые группы включают в себя, но не ограничиваются ими, метилен, этилен, пропилен, н-бутилен, этенилен, пропенилен, н-бутенилен, пропинилен, н-бутинилен и т. п. В некоторых вариантах осуществления Z’ представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов углерода, или содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов.
[0082] В некоторых вариантах осуществления Z’’ представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, алкилен-карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов, или алкилен-гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов. Z’’ может быть незамещен или замещен по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, галоген-C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом или C6-C10 арилом; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила; В некоторых вариантах осуществления Z’’ представляет собой линейную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов углерода. Например, Z’’ может представлять собой алкиленовую группу, включающую в себя, не ограничиваясь ими, C1-C24 алкилен, C1-C20 алкилен, C1-C16 алкилен, C1-C12 алкилен, C1-C8 алкилен, C1-C6 алкилен, C1-C4 алкилен, C1-C3 алкилен, C1-C2 алкилен, C1 алкилен. Типичные алкиленовые группы включают в себя, но не ограничиваются ими, метилен, этилен, пропилен, н-бутилен, этенилен, пропенилен, н-бутенилен, пропинилен, н-бутинилен и т. п. В некоторых вариантах осуществления Z’’ представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов углерода, или содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов.
[0083] Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения G представляет собой -C-, -S-, -S(O)-, -P(OR1)- или -P(OH)-, тем самым образуя карбонильную, сульфоксидную, сульфонную и фосфоногруппу, соответственно. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления G представляет собой -C-. В некоторых вариантах осуществления G представляет собой -S-. В некоторых вариантах осуществления G представляет собой -S(O) -.
[0084] В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (B) представляет собой
;
где
R представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 10 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 10 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 10 атомов углерода или гетероцикл, содержащий от 3 до 10 атомов, при этом R является незамещенным или замещенным по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, галоген-C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом или C6-C10 арилом; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила; при этом R’’ является незамещенной или замещенной, линейной или разветвленной углеродной цепью, имеющей от 1 до 10 атомов углерода, содержащей гетероатом линейной или разветвленной углеродной цепью, имеющей от 1 до 10 атомов, карбоциклом, содержащим от 3 до 10 атомов углерода или гетероциклом, содержащим от 3 до 10 атомов. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой 1 атом углерода. В некоторых вариантах осуществления R’’ представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь, такую как метил, этил, н-пропил, изопропил, 2-метил-1-пропил, 2-метил-2-пропил, 2-метил-1-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-3-бутил, 2,2-диметил-1-пропил, 2-метил-1-пентил, 3-метил-1-пентил, 4-метил-1-пентил, 2-метил- 2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 2,2-диметил-1-бутил, 3,3-диметил-1-бутил, 2-этил-1-бутил, бутил, изобутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил. Например, в некоторых вариантах осуществления соединение формулы (B) представляет собой 
. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой карбоцикл, содержащий от 3 до 10 атомов углерода. Например, R может представлять собой циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, циклононил, циклодецил, фенил или нафтил. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой гетероцикл, содержащий от 3 до 10 атомов.
[0085] В определенных вариантах осуществления первый амин имеет формулу R1-NH2 или R1-N(H)-Z’-N(H)-R1. В некоторых вариантах осуществления первый амин имеет формулу R1-NH2. В некоторых вариантах осуществления первый амин имеет формулу R1-N(H)-Z’-N(H)-R1. В некоторых вариантах осуществления первый амин, имеющий формулу R1-N(H)-Z’-N(H)-R1, представляет собой 
, 
или 
. В некоторых вариантах осуществления первый амин имеет формулу R1-N(H)-Z’-N-(R1)2. В некоторых вариантах осуществления первый амин, имеющий формулу R1-N(H)-Z’-N-(R1)2, представляет собой .
[0086] В определенных вариантах осуществления первый амин имеет формулу R2-NH2 или R2-N(H)-Z’’-N(H)-R2. В некоторых вариантах осуществления второй амин имеет формулу R2-NH2. В некоторых вариантах осуществления второй амин имеет формулу R2-N(H)-Z’’-N(H)-R2. В некоторых вариантах осуществления второй амин, имеющий формулу R2-N(H)-Z’’-N(H)-R2, представляет собой , , или 
. В некоторых вариантах осуществления первый амин имеет формулу R2-N(H)-Z’’-N-(R2)2. В некоторых вариантах осуществления первый амин, имеющий формулу R2-N(H)-Z’’-N-(R2)2, представляет собой .
[0087] В определенных вариантах осуществления R1 представляет собой C1-C40алкил, C1-C40 гетероалкил, C2-C40алкенил, C2-C40 гетероалкенилен, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C2-C40 гетероалкинилен, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; где гетероциклил и гетероарил содержат 1-5 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, S, P и O; где C1-C40алкил, C2-C40алкенил, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещены D, галогеном, C1-C6алкилом, -OH, -O-C1-C6алкилом,-NH2, -NH(C1-C6алкилом) или -N(C1-C6алкилом)2. R1 может быть незамещен или замещен по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, галоген-C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом или C6-C10 арилом; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила. В некоторых вариантах осуществления R1 представляет собой C1-C20 алкил. Например, R1 может представлять собой C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19 или C20 алкильные группы, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил, 2-метил-1-пропил, 2-метил-2-пропил, 2-метил-1-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-3-бутил, 2,2-диметил-1-пропил, 2-метил-1-пентил, 3-метил-1-пентил, 4-метил-1-пентил, 2-метил-2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 2,2-диметил-1-бутил, 3,3-диметил-1-бутил, 2-этил-1-бутил, бутил, изобутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил, н-гептил, н-октил, н-нонил, н-децил, н-ундецил, н-додецил, н-тридецил, н-тетрадецил, н-пентадецил, н-гексадецил, н-гептадецил, н-октадецил, н-нонадецил или н-икозил. В некоторых вариантах осуществления R1 является незамещенным. В некоторых вариантах осуществления R1 является замещенным. В некоторых вариантах осуществления R1 выбран из группы, состоящей из 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
и 
. В некоторых вариантах осуществления R1 представляет собой . В некоторых вариантах осуществления R1 представляет собой 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, , 
, 
, 
, , 
, 
, 
, 
, 
или 
.
[0088] В определенных вариантах осуществления R2 представляет собой C1-C40алкил, C1-C40 гетероалкил, C2-C40алкенил, C2-C40 гетероалкенилен, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C2-C40 гетероалкинилен, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; где гетероциклил и гетероарил содержат 1-5 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, S, P и O; где C1-C40алкил, C2-C40алкенил, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещены D, галогеном, C1-C6алкилом, -OH, -O-C1-C6алкилом, -NH2, -NH(C1-C6алкилом) или -N(C1-C6алкилом)2. R2 может быть незамещен или замещен по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, галоген-C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом или C6-C10 арилом; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила. В некоторых вариантах осуществления R2 представляет собой C1-C20 алкил. Например, R2 может представлять собой C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19 или C20 алкильные группы, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил, 2-метил-1-пропил, 2-метил-2-пропил, 2-метил-1-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-3-бутил, 2,2-диметил-1-пропил, 2-метил-1-пентил, 3-метил-1-пентил, 4-метил-1-пентил, 2-метил-2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 2,2-диметил-1-бутил, 3,3-диметил-1-бутил, 2-этил-1-бутил, бутил, изобутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил, н-гептил, н-октил, н-нонил, н-децил, н-ундецил, н-додецил, н-тридецил, н-тетрадецил, н-пентадецил, н-гексадецил, н-гептадецил, н-октадецил, н-нонадецил или н-икозил. В некоторых вариантах осуществления R2 является незамещенным. В некоторых вариантах осуществления R2 является замещенным. В некоторых вариантах осуществления R2 выбран из группы, состоящей из , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , и . В некоторых вариантах осуществления R2 представляет собой . В некоторых вариантах осуществления R2 представляет собой , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , или .
[0089] В некоторых вариантах осуществления каждый Q представляет собой H или линейную или разветвленную алкильную группу C1-C10. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления каждый Q представляет собой H. В других вариантах осуществления каждый Q представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу C1-C10. Например, каждый Q может представлять собой метил, этил, н-пропил, изопропил, 2-метил-1-пропил, 2-метил-2-пропил, 2-метил-1-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-3-бутил, 2,2-диметил-1-пропил, 2-метил-1-пентил, 3-метил-1-пентил, 4-метил-1-пентил, 2-метил-2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 2,2-диметил-1-бутил, 3,3-диметил-1-бутил, 2-этил-1-бутил, бутил, изобутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил, н-гептил, н-октил, н-нонил или н-децил. В некоторых вариантах осуществления каждый Q представляет собой метил.
[0090] В некоторых вариантах осуществления каждый J представляет собой -O-. В некоторых вариантах осуществления каждый J представляет собой -NH-.
[0091] В некоторых вариантах осуществления каждый E1 независимо выбран из группы, состоящей из ковалентной связи, -N-, -O-, -S-, алкилена, гетероалкилена, алкенила, гетероалкенилена, алкинила, гетероалкинилена. В некоторых вариантах осуществления каждый E1 представляет собой гетероалкенилен. В некоторых вариантах осуществления каждый E1 представляет собой -CH2-O-. В некоторых вариантах осуществления каждое n равно по меньшей мере 1. Например, n может быть равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В некоторых вариантах осуществления n равно 1.
[0092] В некоторых вариантах осуществления A представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь из от 2 до 30 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, или гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов. Например, в некоторых вариантах осуществления A представляет собой 
.
[0093] В некоторых вариантах осуществления полимер по настоящему изобретению имеет общую структуру 
, в которой волнистая связь 
представляет связь с остальным полимером, и в которой R1, R2 и R4 имеют любое из определений, приведенных в данном документе. По причине в высокой степени контролируемого последовательного роста линейного олигомера и его разветвления, полученные полимеры имеют более равномерное распределение линейных сегментов и элементов ветвления, как показано в приведенной выше структуре. Как описано в последующих разделах и примерах, такие полимеры обладают значительной аффинностью связывания ДНК и могут конденсировать ДНК для формирования наноразмерных полиплексов с почти 100% эффективностью клеточного поглощения. В некоторых вариантах осуществления полимер по настоящему изобретению представляет собой 
, где группы R2 имеют любое из определений, приведенных в настоящем документе.
[0094] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает полимер, содержащий:
(a) 
;
(b) 
; и
(c) 
или
,
где R1, R2, A, E1, G, J, Q, Z, Z” и n имеют любое из определений, приведенных в настоящем документе. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 3 кДа до около 200 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW между около 10 кДа и 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 15 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 10 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 20 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 30 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 40 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, меньшее чем около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, в диапазоне от около 0,3 до около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI - англ., polydispersity index) от около 1,0 до около 8,0. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) около 2,5.
[0095] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает полимер, содержащий:
(a) ;
(b) ; и
(c) ,
где R1, R2, A, E1, G, J, Q, Z и n имеют любое из определений, приведенных в настоящем документе. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 3 кДа до около 200 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW между около 10 кДа и 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 15 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 10 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 20 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 30 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 40 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, меньшее чем около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, в диапазоне от около 0,3 до около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) от около 1,0 до около 8,0. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) около 2,5.
[0096] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает полимер, содержащий:
(a) ;
(b) ; и
(c) ,
где R1, R2, A, E1, G, J, Q, Z, Z” и n имеют любое из определений, приведенных в настоящем документе. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 3 кДа до около 200 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW между около 10 кДа и 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 15 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 10 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 20 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 30 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 40 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, меньшее чем около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, в диапазоне от около 0,3 до около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) от около 1,0 до около 8,0. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) около 2,5.
[0097] В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер содержит:
(a) 
и
(c) 
.
[0098] В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер содержит:
(a) , и
(c) , где
J представляет собой O, а Z представляет собой , где x равно 1-1000.
[0099] В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер содержит:
(b) 
[00100] В некоторых дополнительных вариантах осуществления R1 выбран из и .
[00101] В некоторых дополнительных вариантах осуществления R1 представляет собой .
[00102] В некоторых дополнительных вариантах осуществления R1 представляет собой .
[00103] В некоторых дополнительных вариантах осуществления R2 выбран из и .
[00104] В некоторых дополнительных вариантах осуществления R2 представляет собой .
[00105] В некоторых дополнительных вариантах осуществления R2 представляет собой .
[00106] В некоторых дополнительных вариантах осуществления R1 представляет собой , а R2 представляет собой .
[00107] В некоторых дополнительных вариантах осуществления R1 представляет собой , а R2 представляет собой .
[00108] В некоторых вариантах осуществления полимер содержит:
(a) ;
(b) ; и
(c) , где
R1 представляет собой , а
R2 выбран из . В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 3 кДа до около 200 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW между около 10 кДа и 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 15 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 10 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 20 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 30 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 40 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, меньшее чем около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, в диапазоне от около 0,3 до около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) от около 1,0 до около 8,0. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) около 2,5.
[00109] В некоторых вариантах осуществления полимер содержит:
(a) ;
(b) ; и
(c) , где
J представляет собой O, а Z представляет собой , где x равно 1-1000;
R1 представляет собой , а
R2 представляет собой .
В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 3 кДа до около 200 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW между около 10 кДа и 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 15 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 10 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 20 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 30 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 40 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, меньшее чем около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, в диапазоне от около 0,3 до около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) от около 1,0 до около 8,0. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) около 2,5.
[00110] В некоторых вариантах осуществления определенные полимеры по настоящему изобретению могут быть описаны как линейные полимеры (олигомеры) соединений формулы (A) и первого амина, имеющего формулу R1-NH2 или R1-N(H)-Z’-N(H)-R1 (как описано в настоящем документе), сшитые с соединениями формулы (B) (как описано в настоящем документе). Когда линейные олигомеры получают в условиях, в которых соединения формулы (A) присутствуют в молярном избытке по сравнению с первым амином, имеющим формулу R1-NH2 или R1-N(H)-Z’-N(H)-R1, полученные олигомерные виды имеют на концах акцепторные группы Михаэля (например, акрилатную, метакрилатную, акриламидную или другую подобную группу), и в дальнейшем, в соответствующих условиях, могут быть эндкэпированы вторым амином, имеющим формулу R2-NH2 или R2-N(H)-Z’’-N(H)-R2 (как описано в настоящем документе). Полученные в результате эндкэпированные олигомеры далее могут быть введены в реакцию с трифункциональным акцепторным соединением Михаэля формулы (B) (как описано в настоящем документе), чтобы обеспечить разветвленную структуру. Такие сшитые полимеры альтернативно могут быть определены распределением молекулярной массы олигомерных сегментов (например, величина Mw в диапазоне от около 3 до около 200, как описано в настоящем документе) и молярным или массовым процентом сшивок, полученных от включения акцепторных соединений Михаэля формулы (В).
[00111] В некоторых вариантах осуществления молярный избыток соединения формулы (A) вводят в реакцию с первым амином. Например, стехиометрическое соотношение соединения формулы (A) с первым амином может находиться в диапазоне от около 1,1:1 до около 10:1, включая около 1,1:1, около 1,2:1, около 1,3:1, около 1,4:1, около 1,5:1, около 1,6:1, около 1,7:1, около 1,8:1, около 1,9:1, около 2:1, около 3:1, около 4:1, около 5:1, около 6:1, около 7:1, около 8:1, около 9:1 или около 10:1, включая все диапазоны между ними.
[00112] В некоторых вариантах осуществления стехиометрическое соотношение соединения формулы (A) с первым амином составляет около 1,1:1, около 1,2:1, около 1,3:1, около 1,4:1, около 1,5:1, около 1,6:1, около 1,7:1, около 1,8:1, около 1,9:1, около 2:1, около 3:1, около 4:1, около 5:1, около 6:1, около 7:1, около 8:1, около 9:1 или около 10:1. В некоторых вариантах осуществления стехиометрическое соотношение соединения формулы (A) с первым амином может находиться в диапазоне от около 1,1:1 до около 2:1. В некоторых вариантах осуществления стехиометрическое соотношение соединения формулы (A) с первым амином составляет около 1,2:1. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (A) вводят в реакцию с первым амином в молярном эквиваленте (т.е. около 1:1).
[00113] В некоторых вариантах осуществления стадию (a) выполняют в органическом растворителе. В контексте настоящего изобретения может быть использован широкий спектр органических растворителей, включая, но не ограничиваясь ими, диметилсульфоксид (DMSO), N, N-диметилформамид (DMF), N-метилпирролидон (NMP) и аналогичные; кетоны, такие как ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон и аналогичные; простые эфиры, такие как тетрагидрофуран (THF), диэтиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир и аналогичные; углеводороды, такие как толуол, ксилол, циклогексан и тому подобное. В некоторых вариантах осуществления стадию (a) выполняют в DMSO.
[00114] В некоторых вариантах осуществления стадию (a) выполняют при температуре, находящейся в диапазоне от около 40°C до около 120 °C, включая около 40, около 41, около 42, около 43, около 44, около 45, около 46. около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56 , около 57, около 58, около 59, около 60, около 61, около 62, около 63, около 64, около 65, около 66, около 67, около 68, около 69, около 70, около 71, около 72, около 73, около 74, около 75, около 76, около 77, около 78, около 79, около 80, около 81, около 82, около 83, около 84, около 85, около 86, около 87, около 88, около 89, около 90, около 91, около 92, около 93, около 94, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99, около 100, около 101, около 102, около 103, около 104, около 105, около 106 , около 107, около 108, около 109, около 110, около 111, около 112, около 113, около 114, около 115, около 116, около 117, около 118, около 119 или 120 °C, включая все диапазоны между ними.
[00115] В некоторых вариантах осуществления стадию (a) выполняют при 40, около 41, около 42, около 43, около 44, около 45, около 46 ,. около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60, около 61, около 62, около 63 , около 64, около 65, около 66, около 67, около 68, около 69, около 70, около 71, около 72, около 73, около 74, около 75, около 76, около 77, около 78, около 79, около 80, около 81, около 82, около 83, около 84, около 85, около 86, около 87, около 88, около 89, около 90, около 91, около 92, около 93, около 94, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99, около 100, около 101, около 102, около 103, около 104, около 105, около 106, около 107, около 108, около 109, около 110, около 111, около 112, около 113 , около 114, около 115, около 116, около 117, около 118, около 119 или 120 °C. В некоторых вариантах осуществления стадию (a) выполняют при около 90 °C.
[00116] В некоторых вариантах осуществления продукт стадии (a) не очищают перед стадией (b). В других вариантах осуществления продукт стадии (a) очищают перед стадией (b). Продукт стадии (a) может быть очищен с помощью разнообразных способов и технологий, очевидных для специалиста в данной области техники.
[00117] В некоторых вариантах осуществления молярный избыток второго амина добавляют к продукту стадии (a). Например, стехиометрическое соотношение второго амина с продуктом стадии (a) может находиться в диапазоне от около 1,1:1 до около 10:1, включая около 1,1:1, около 1,2:1, около 1,3:1, около 1,4:1, около 1,5:1, около 1,6:1, около 1,7:1, около 1,8:1, около 1,9:1, около 2:1, около 3:1, около 4:1, около 5:1, около 6:1, около 7:1, около 8:1, около 9:1 или около 10:1, включая все диапазоны между ними.
[00118] В некоторых вариантах осуществления стехиометрическое соотношение второго амина с продуктом стадии (a) составляет около 1,1:1, около 1,2:1, около 1,3:1, около 1,4:1, около 1,5:1, около 1,6:1, около 1,7:1, около 1,8:1, около 1,9:1, около 2:1, около 3:1, около 4:1, около 5:1, около 6:1, около 7:1, около 8:1, около 9:1 или около 10:1. В некоторых вариантах осуществления стехиометрическое соотношение второго амина с продуктом стадии (a) составляет около 5:1. В некоторых вариантах реализации второй амин вводят в реакцию с продуктом стадии (a) в молярном эквиваленте (т.е. около 1:1).
[00119] В некоторых вариантах осуществления стадию (b) выполняют при температуре, находящейся в диапазоне от около 16°C до около 40 °C. Например, стадию (b) выполняют при температуре, находящейся в диапазоне от около 16, около 17, около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33 , около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39 до около 40 °C, включая все диапазоны между ними.
[00120] В некоторых вариантах осуществления стадию (b) выполняют при температуре около 16, около 17, около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33 , около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39 или около 40 °C.
[00121] В некоторых вариантах осуществления продукт стадии (b) не очищают перед стадией (c). В некоторых вариантах осуществления продукт стадии (b) очищают перед стадией (c). Продукт стадии (b) может быть очищен с помощью разнообразных способов и технологий, очевидных для специалиста в данной области техники. Например, продукт стадии (b) может быть очищен путем диализа.
[00122] В некоторых вариантах осуществления стадию (c) выполняют при температуре, более высокой, чем температура стадии (b). Например, стадию (c) выполняют при температуре, находящейся в диапазоне от около 21°C до около 200 °C. Например, стадию (c) выполняют при температуре, находящейся в диапазоне от около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38 , около 39, около 40, около 41, около 42, около 43, около 44, около 45, около 46, около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60, около 61, около 62, около 63, около 64, около 65, около 66, около 67, около 68, около 69, около 70, около 71, около 72, около 73, около 74, около 75, около 76, около 77, около 78, около 79, около 80, около 81, около 82, около 83, около 84, около 85, около 86, около 87, около 88 , около 89, около 90, около 91, около 92, около 93, около 94, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99, около 100, около 101 об, 102, около 103, около 104, около 105, около 106, около 107, около 108, около 109, около 110, около 111, около 112, около 113, около 114, около 115, около 116, около 117, около 118, около 119, около 120, около 121, около 122, около 123, около 124, около 125, около 126, около 127, около 128, около 129, около 130, около 131, около 132, около 133, около 134, около 135, около 136 , около 137, около 138, около 139, около 140, около 141, около 142, около 143, около 144, около 145, около 146, около 147, около 148, около 149, около 150, около 151, около 152, около 153, около 154, около 155, около 156, около 157, около 158, около 159, около 160, около 161, около 162, около 163, около 164, около 165, около 166, около 167, около 168, около 169, около 170, около 171, около 172, около 173, около 174, около 175, около 176, около 177, около 178, около 179, около 180, около 181, около 182, около 183, около 184, около 185, около 186, около 187, около 188, около 189, около 190, около 191, около 192, около 193, около 194, около 195, около 196, около 197, около 198, около 199 до около 200 °C, включая все диапазоны между ними.
[00123] В некоторых вариантах осуществления стадию (c) выполняют при около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38 , около 39, около 40, около 41, около 42, около 43, около 44, около 45, около 46, около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60, около 61, около 62, около 63, около 64, около 65, около 66, около 67, около 68, около 69, около 70, около 71, около 72, около 73, около 74, около 75, около 76, около 77, около 78, около 79, около 80, около 81, около 82, около 83, около 84, около 85, около 86, около 87, около 88 , около 89, около 90, около 91, около 92, около 93, около 94, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99, около 100, около 101 об, 102, около 103, около 104, около 105, около 106, около 107, около 108, около 109, около 110, около 111, около 112, около 113, около 114, около 115, около 116, около 117, около 118, около 119, около 120, около 121, около 122, около 123, около 124, около 125, около 126, около 127, около 128, около 129, около 130, около 131, около 132, около 133, около 134, около 135, около 136 , около 137, около 138, около 139, около 140, около 141, около 142, около 143, около 144, около 145, около 146, около 147, около 148, около 149, около 150, около 151, около 152, около 153, около 154, около 155, около 156, около 157, около 158, около 159, около 160, около 161, около 162, около 163, около 164, около 165, около 166, около 167, около 168, около 169, около 170, около 171, около 172, около 173, около 174, около 175, около 176, около 177, около 178, около 179, около 180, около 181, около 182, около 183, около 184, около 185, около 186, около 187, около 188, около 189, около 190, около 191, около 192, около 193, около 194, около 195, около 196, около 197, около 198, около 199 или около 200 °C. В некоторых вариантах осуществления стадию (c) выполняют при около 90 °C.
[00124] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает полимер формулы (I):
(I)
где
каждый A независимо представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, или гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов;
где A необязательно замещен одним или большим количеством галогена, гидроксила, аминогруппы, сульфонильной группы, сульфонамидной группы, тиола, C1-C6 алкила C1-C6 алкокси, C1-C6эфира, C1-C6 тиоэфира, C1-C6 сульфона, C1-C6 сульфоксида, C1-C6 первичного амида, C1-C6 вторичного амида, галоген-C1-C6 алкила, карбоксильной группы, цианогруппы, нитрогруппы, нитрозогруппы, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкила, C3-C6циклоалкила, C3-C6 гетероциклила, C2-C5 гетероарила или C6-C10 арила; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила;
каждый B независимо представляет собой 
или 
;
G представляет собой -C-, -S-, -S(O)-, -P(OR1)- или -P(OH)-; n равно по меньшей мере 1;
каждый E1 выбран из группы, состоящей из ковалентной связи, -N-, -O-, -S-, алкилена, гетероалкилена, алкенила, гетероалкенилена, алкинила, гетероалкинилена;
каждый E2 выбран из группы, состоящей из ковалентной связи, -N-, -O-, -S-, алкилена, гетероалкилена, алкенила, гетероалкенилена, алкинила, гетероалкинилена
каждый X независимо представляет собой или ;
каждый Y независимо представляет собой или ;
каждый L независимо представляет собой второй связывающий фрагмент;
каждый R1, R2 и R3 в каждом случае независимо представляют собой H, C1-C40алкил, C1-C40 гетероалкил, C2-C40алкенил, C2-C40 гетероалкенилен, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C2-C40 гетероалкинилен, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; причем гетероциклил и гетероарил содержат 1-5 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, S, P и O; где C1-C6алкил, C2-C8алкенил, C4-C8циклоалкенил, C2-C6алкинил, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещены D, галогеном, C1-C6алкилом, -OH, -O-C1-C6алкилом,-NH2, -NH(C1-C6алкилом) или -N(C1-C6алкилом)2; или
где R2 и R3 вместе с атомом, к которому они присоединены, могут образовывать гетероциклил или гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из группы, состоящей из N, S, P и O;
a равно 1-1000;
b равно 3 или 4;
c равно 1-3; и
z равно 1-100;
при условии, что по меньшей мере один из R2 и R3 не является H, а когда G представляет собой C, то E1 не является -CH2-O-.
[00125] В определенных вариантах осуществления данное изобретение предлагает полимер формулы (II):
(II)
где
каждый E1 выбран из группы, состоящей из ковалентной связи, -N-, -O-, -S-, алкилена, гетероалкилена, алкенила, гетероалкенилена, алкинила, гетероалкинилена;
каждый E2 выбран из группы, состоящей из ковалентной связи, -N-, -O-, -S-, алкилена, гетероалкилена, алкенила, гетероалкенилена, алкинила, гетероалкинилена;
G представляет собой -C-, -S-, -S(O)-, -P(OR1)- или -P(OH)-; и
n равно по меньшей мере 1.
при условии, что когда G представляет собой C, то E1 не является -CH2-O-.
[00126] В некоторых вариантах осуществления каждый E1 и E2 независимо выбраны из группы, состоящей из ковалентной связи, -N-, -S-, алкилена, гетероалкилена, алкенила, гетероалкенилена, алкинила, гетероалкинилена. В некоторых вариантах осуществления каждый E1 представляет собой гетероалкенилен. В некоторых вариантах осуществления каждый E1 представляет собой -CH2-N-. В некоторых вариантах осуществления каждый E2 представляет собой алкилен. В некоторых вариантах осуществления каждый E2 представляет собой 
, 
или 
. В некоторых вариантах осуществления каждый E2 представляет собой . В некоторых вариантах осуществления каждое n равно по меньшей мере 1. Например, n может быть равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В некоторых вариантах осуществления n равно 1. В некоторых вариантах осуществления G представляет собой -C-. В некоторых вариантах осуществления каждый B представляет собой 
или 
.
[00127] В некоторых вариантах осуществления каждый L представляет собой 
, где x равно 1-1000. В некоторых вариантах осуществления a равно по меньшей мере 2, b равно 3, а каждый X представляет собой . В некоторых вариантах осуществления каждый A представляет собой . В некоторых вариантах осуществления каждый L представляет собой 
.
[00128] В некоторых вариантах осуществления каждый R2 и/или R3 представляет собой .
[00129] В некоторых вариантах осуществления каждый R1 представляет собой 
.
[00130] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает полимер формул с (III) по (VIIe):
(III);
(IV);
(V);
(Va);
(VI);
(VIb);
(VIc);
(VId);
(VIe);
(VII);
(VIIb);
(VIIc);
(VIId);
(VIIe);
где каждый R5, R6 и R7 в каждом случае независимо представляют собой H, C1-C40алкил, C1-C40 гетероалкил, C2-C40алкенил, C2-C40 гетероалкенилен, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C2-C40 гетероалкинилен, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; причем гетероциклил и гетероарил содержат 1-5 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, S, P и O; где C1-C6алкил, C2-C8алкенил, C4-C8циклоалкенил, C2-C6алкинил, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещены D, галогеном, C1-C6алкилом, -OH, -O-C1-C6алкилом,-NH2, -NH(C1-C6алкилом) или -N(C1-C6алкилом)2; и оставшимися переменными, как описано выше.
[00131] В некоторых вариантах осуществления z равно 1, 2 или 3. В некоторых вариантах осуществления z равно 1.
[00132] Параметр альфа, определенный из уравнения Марка - Хаувинка, относится к графику Марка - Хаувинка. График Марка - Хаувинка представляет собой мощный инструмент для исследования структуры полимера в растворе, поскольку он четко и с высокой чувствительностью показывает взаимосвязь структуры и молекулярной массы. Этот график строят путем нанесения молекулярной массы (MW) в зависимости от характеристической вязкости (IV - англ., intrinsic viscosity) с логарифмическим масштабом на обеих осях. Молекулярная масса, конечно, указывает на длину полимерных цепей (или степень полимеризации), но сама по себе не может каким-либо образом указывать на структуру. Характеристическая вязкость (выраженная в дл/г) представляет собой показатель молекулярной плотности полимерных цепей в растворе. Чем плотнее цепи складываются или свертываются в растворе, тем выше плотность и ниже характеристическая вязкость. Этот показатель не зависит от молекулярной массы, поэтому две разные структуры с одинаковой молекулярной массой могут иметь разные характеристические вязкости, например, линейный (неразветвленный) полимер и разветвленный полимер с одинаковой молекулярной массой будут иметь разные характеристические вязкости. Кроме того, если полимер изменяет структуру в пределах молекулярно-массового распределения (например, становится в большей степени замещенным), изменения характеристической вязкости будут легко обнаружены. По этой причине график Марка - Хаувинка является таким полезным и эффективным средством. Исходные данные для графика Марка - Хаувинка удобно и просто получают из данных высококачественной гель-проникающей хроматографии (ГПХ)/ эксклюзионной хроматографии (SEC) с множественным детектированием путем объединения молекулярной массы, определенной с помощью детектора светорассеяния, с характеристической вязкостью, определенной с помощью вискозиметрического детектора. Оба набора данных измеряют в каждой точке профиля элюирования образца. Полученный график может быть использован разными способами: от простой оценки близости двух структур до выполнения сложных количественных измерений разветвления полимера. В целом: α<0,5: Компактные/сферические цепи; 0,5<α<0,8: Случайно спиральные/гибкие цепи; 0,5<α<0,8: Жесткостержневые/жесткие цепи.
[00133] В некоторых вариантах осуществления полимеры по настоящему изобретению имеют значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, меньшее чем около 0,5. Например, полимер по настоящему изобретению имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, в диапазоне от около 0,01 до около 0,49. Например, полимеры по настоящему изобретению имеют значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, в диапазоне от около 0,01, около 0,02, около 0,03, около 0,04, около 0,05, около 0,06, около 0,07, около 0,08, около 0,09, около 0,10, около 0,11, около 0,12, около 0,13, около 0,14, около 0,15, около 0,16, около 0,17, около 0,18 , около 0,19, около 0,20, около 0,21, около 0,22, около 0,23, около 0,24, около 0,25, около 0,26, около 0,27, около 0,28, около 0,29, около 0,30, около 0,31, около 0,32, около 0,33, около 0,34, около 0,35, около 0,36, около 0,37, около 0,38, около 0,39, около 0,40, около 0,41, около 0,42, около 0,43, около 0,44, около 0,45, около 0,46, около 0,47, около 0,48 до около 0,49, включая все диапазоны между ними. В некоторых вариантах осуществления полимеры по настоящему изобретению имеют значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, от около 0,2 до около 0,5.
[00134] В некоторых вариантах осуществления полимеры по настоящему изобретению имеют значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, около 0,01, около 0,02, около 0,03, около 0,04, около 0,05, около 0,06, около 0,07, около 0,08, около 0,09, около 0,10, около 0,11, около 0,12, около 0,13, около 0,14, около 0,15, около 0,16, около 0,17, около 0,18 , около 0,19, около 0,20, около 0,21, около 0,22, около 0,23, около 0,24, около 0,25, около 0,26, около 0,27, около 0,28, около 0,29, около 0,30, около 0,31, около 0,32, около 0,33, около 0,34, около 0,35, около 0,36, около 0,37, около 0,38, около 0,39, около 0,40, около 0,41, около 0,42, около 0,43, около 0,44, около 0,45, около 0,46, около 0,47, около 0,48 или около 0,49.
[00135] Термин «индекс полидисперсности» (PDI - англ., polydispersity index) относится к измерению распределения молекулярной массы в образце данного полимера. Индекс полидисперсности рассчитывают делением средневзвешенной молекулярной массы (Mw) на среднечисловую молекулярную массу (Mn). При использовании в данном документе термин «средневзвешенная молекулярная масса» обычно относится к показателю молекулярной массы, который зависит от распределения молекул полимера в соответствии с их размерами. При использовании в данном документе термин «среднечисловая молекулярная масса» обычно относится к показателю молекулярной массы, который рассчитывается путем деления общей массы всех молекул полимера в образце на общее количество молекул полимера в образце. Эти термины хорошо известны специалистам в данной области техники.
[00136] В некоторых вариантах осуществления полимеры по настоящему изобретению имеют индекс полидисперсности (PDI) от около 1,01 до около 8,0. Например, значение PDI может находится в диапазоне от около 1,01, около 1,02, около 1,03, около 1,04, около 1,05, около 1,06, около 1,07. около 1,08, около 1,09, около 1,1, около 1,2, около 1,3, около 1,4, около 1,5, около 1,6, около 1,7, около 1,8 , около 1,9, около 2,0, около 2,1, около 2,2, около 2,3, около 2,4, около 2,5, около 2,6, около 2,7, около 2,8, около 2,9, около 3,0, около 3,1, около 3,2, около 3,3, около 3,4, около 3,5, около 3,6, около 3,7, около 3,8, около 3,9, около 4,0, около 4,1, около 4,2, около 4,3, около 4,4, около 4,5, около 4,6, около 4,7, около 4,8, около 4,9, около 5,0, около 5,1, около 5,2, около 5,3, около 5,4, около 5,5, около 5,6, около 5,7, около 5,8, около 5,9, около 6,0, около 6,1, около 6,2, около 6,3, около 6,4, около 6,5, около 6,6, около 6,7, около 6,8 , около 6,9, около 7,0, около 7,1, около 7,2, около 7,3, около 7,4, около 7,5, около 7,6, около 7,7, около 7,8, около 7,9 до около 8,0, включая все диапазоны между ними.
[00137] В некоторых вариантах осуществления полимеры по настоящему изобретению имеют значение PDI около 1,01, около 1,02, около 1,03, около 1,04, около 1,05, около 1,06, около 1,07, около 1,08, около 1,09, около 1,1, около 1,2, около 1,3, около 1,4, около 1,5, около 1,6, около 1,7, около 1,8 , около 1,9, около 2,0, около 2,1, около 2,2, около 2,3, около 2,4, около 2,5, около 2,6, около 2,7, около 2,8, около 2,9, около 3,0, около 3,1, около 3,2, около 3,3, около 3,4, около 3,5, около 3,6, около 3,7, около 3,8, около 3,9, около 4,0, около 4,1, около 4,2, около 4,3, около 4,4, около 4,5, около 4,6, около 4,7, около 4,8, около 4,9, около 5,0, около 5,1, около 5,2, около 5,3, около 5,4, около 5,5, около 5,6, около 5,7, около 5,8, около 5,9, около 6,0, около 6,1, около 6,2, около 6,3, около 6,4, около 6,5, около 6,6, около 6,7, около 6,8 , около 6,9, около 7,0, около 7,1, около 7,2, около 7,3, около 7,4, около 7,5, около 7,6, около 7,7, около 7,8, около 7,9 или около 8,0. В некоторых вариантах осуществления полимеры по настоящему изобретению имеют PDI около 2,5.
[00138] В некоторых вариантах осуществления полимеры по настоящему изобретению имеют MW, по меньшей мере, 3 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимеры по настоящему изобретению имеют MW от около 3 кДа до около 200 кДа. Соответственно, полимеры по настоящему изобретению имеют MW в диапазоне от около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17, около 18, около 19, около 20 , около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39, около 40, около 41, около 42, около 43, около 44, около 45, около 46, около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60, около 61, около 62, около 63, около 64, около 65, около 66, около 67, около 68, около 69, около 70 , около 71, около 72, около 73, около 74, около 75, около 76, около 77, около 78, около 79, около 80, около 81, около 82, около 83, около 84, около 85, около 86, около 87, около 88, около 89, около 90, около 91, около 92, около 93, около 94, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99, около 100 об, 101, около 102, около 103, около 104, около 105, около 106, около 107, около 108, около 109, около 110, около 111, около 112, около 113, около 114, около 115, около 116, около 117, около 118, около 119, около 120 , около 121, около 122, около 123, около 124, около 125, около 126, около 127, около 128, около 129, около 130, около 131, около 132, около 133, около 134, около 135, около 136, около 137, около 138, около 139, около 140, около 141, около 142, около 143, около 144, около 145, около 146, около 147, около 148, около 149, около 150, около 151, около 152, около 153, около 154, около 155, около 156, около 157, около 158, около 159, около 160, около 161, около 162, около 163, около 164, около 165, около 166, около 167 около 168, около 169, около 170, около 171, около 172, около 173, около 174, около 175, около 176, около 177, около 178, около 179, около 180, около 181, около 182, около 183, около 184, около 185, около 186, около 187 , около 188, около 189, около 190, около 191, около 192, около 193, около 194, около 195, около 196, около 197, около 198, около 199 до около 200 кДа, включая все диапазоны между ними. В некоторых вариантах осуществления данный полимер имеет MW между около 5 кДа и 50 кДа. В некоторых вариантах осуществления данный полимер имеет MW между около 10 кДа и 50 кДа.
[00139] В некоторых вариантах осуществления полимеры по настоящему изобретению имеют MW около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17, около 18, около 19, около 20 , около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39, около 40, около 41, около 42, около 43, около 44, около 45, около 46, около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60, около 61, около 62, около 63, около 64, около 65, около 66, около 67, около 68, около 69, около 70 , около 71, около 72, около 73, около 74, около 75, около 76, около 77, около 78, около 79, около 80, около 81, около 82, около 83, около 84, около 85, около 86, около 87, около 88, около 89, около 90, около 91, около 92, около 93, около 94, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99, около 100 об, 101, около 102, около 103, около 104, около 105, около 106, около 107, около 108, около 109, около 110, около 111, около 112, около 113, около 114, около 115, около 116, около 117, около 118, около 119, около 120 , около 121, около 122, около 123, около 124, около 125, около 126, около 127, около 128, около 129, около 130, около 131, около 132, около 133, около 134, около 135, около 136, около 137, около 138, около 139, около 140, около 141, около 142, около 143, около 144, около 145, около 146, около 147, около 148, около 149, около 150, около 151, около 152, около 153, около 154, около 155, около 156, около 157, около 158, около 159, около 160, около 161, около 162, около 163, около 164, около 165, около 166, около 167 около 168, около 169, около 170, около 171, около 172, около 173, около 174, около 175, около 176, около 177, около 178, около 179, около 180, около 181, около 182, около 183, около 184, около 185, около 186, около 187 , около 188, около 189, около 190, около 191, около 192, около 193, около 194, около 195, около 196, около 197, около 198, около 199 до около 200 кДа. В некоторых вариантах осуществления данный полимер имеет MW между около 5 кДа и 50 кДа. В некоторых вариантах осуществления данный полимер имеет MW между около 10 кДа и 50 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет MW около 10 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет MW около 20 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет MW около 30 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет MW около 40 кДа.
[00140] В некоторых вариантах осуществления продукт после стадии (b) имеет MW около 3 кДа. В некоторых вариантах осуществления продукт после стадии (b) имеет MW около 10 кДа. В некоторых вариантах осуществления продукт после стадии (b) имеет MW около 20 кДа. В некоторых вариантах осуществления продукт после стадии (b) имеет MW около 30 кДа. В некоторых вариантах осуществления продукт после стадии (b) имеет MW около 40 кДа.
Способы изготовления
[00141] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает способ изготовления полимеров, включающий:
(a) введение в реакцию соединения формулы (A)
(A)
с первым амином, имеющим формулу R1-NH2 или R1-N(H)-Z’-N(H)-R1;
(b) введение в реакцию продукта стадии (a) со вторым амином, имеющим формулу R2-NH2 или R2-N(H)-Z’’-N(H)-R2; и
(c) введение в реакцию продукта стадии (b) с соединением формулы (B):
(B);
где
каждый J независимо представляет собой -O- или -NH-;
Z, Z’ и Z’’ являются связывающими фрагментами;
A представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь из от 2 до 30 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, или гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов;
где A необязательно замещен одним или большим количеством галогена, гидроксила, аминогруппы, сульфонильной группы, сульфонамидной группы, тиола, C1-C6 алкила C1-C6 алкокси, C1-C6эфира, C1-C6 тиоэфира, C1-C6 сульфона, C1-C6 сульфоксида, C1-C6 первичного амида, C1-C6 вторичного амида, галоген-C1-C6 алкила, карбоксильной группы, цианогруппы, нитрогруппы, нитрозогруппы, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкила, C3-C6циклоалкила, C3-C6 гетероциклила, C2-C5 гетероарила или C6-C10 арила; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила;
G представляет собой -C-, -S-, -S(O)-, -P(OR1)- или -P(OH)-;
каждый Q представляет собой H или линейную или разветвленную алкильную группу C1-C10;
каждый E1 независимо выбран из группы, состоящей из ковалентной связи, -N-, -O-, -S-, алкилена, гетероалкилена, алкенила, гетероалкенилена, алкинила, гетероалкинилена;
R1 и R2 каждый независимо представляет собой C1-C40алкил, C1-C40 гетероалкил, C2-C40алкенил, C2-C40 гетероалкенилен, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C2-C40 гетероалкинилен, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; причем гетероциклил и гетероарил содержат 1-5 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, S, P и O; в котором C1-C40алкил, C2-C40алкенил, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещены D, галогеном, C1-C6алкилом, -OH, -O-C1-C6алкилом,-NH2, -NH(C1-C6алкилом), или -N(C1-C6алкилом)2; и R1 является незамещенным или замещенным по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, галоген-C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом и C6-C10) арилом; причем каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила; и
каждое n равно по меньшей мере 1.
[00142] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает способ изготовления полимеров, включающий:
(a) введение в реакцию соединения формулы (A)
(A)
и соединения формулы (B):
(B);
с первым амином, имеющим формулу R1-NH2 или R1-N(H)-Z’-N(H)-R1;
(b) введения в реакцию продукта стадии (a) со вторым амином, имеющим формулу R2-NH2 или R2-N(H)-Z’’-N(H)-R2;
где
каждый J независимо представляет собой -O- или -NH-;
Z, Z’ и Z’’ являются связывающими фрагментами;
A представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь из от 2 до 30 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, или гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов;
где A необязательно замещен одним или большим количеством галогена, гидроксила, аминогруппы, сульфонильной группы, сульфонамидной группы, тиола, C1-C6 алкила C1-C6 алкокси, C1-C6эфира, C1-C6 тиоэфира, C1-C6 сульфона, C1-C6 сульфоксида, C1-C6 первичного амида, C1-C6 вторичного амида, галоген-C1-C6 алкила, карбоксильной группы, цианогруппы, нитрогруппы, нитрозогруппы, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкила, C3-C6циклоалкила, C3-C6 гетероциклила, C2-C5 гетероарила или C6-C10 арила; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила;
G представляет собой -C-, -S-, -S(O)-, -P(OR1)- или -P(OH)-;
каждый Q представляет собой H или линейную или разветвленную алкильную группу C1-C10;
каждый E1 независимо выбран из группы, состоящей из ковалентной связи, -N-, -O-, -S-, алкилена, гетероалкилена, алкенила, гетероалкенилена, алкинила, гетероалкинилена;
R1 и R2 каждый независимо представляет собой C1-C40алкил, C1-C40 гетероалкил, C2-C40алкенил, C2-C40 гетероалкенилен, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C2-C40 гетероалкинилен, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; причем гетероциклил и гетероарил содержат 1-5 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, S, P и O; в котором C1-C40алкил, C2-C40алкенил, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещены D, галогеном, C1-C6алкилом, -OH, -O-C1-C6алкилом,-NH2, -NH(C1-C6алкилом), или -N(C1-C6алкилом)2; и R1 является незамещенным или замещенным по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6 эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, галоген-C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом и C6-C10) арилом; причем каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила; и
каждое n равно по меньшей мере 1.
[00143] В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, алкилен-карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов, или алкилен-гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов. Z может быть незамещен или замещен по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, галоген-C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом или C6-C10 арилом; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила; В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой линейную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов углерода. Например, Z может представлять собой алкиленовую группу, включающую в себя, не ограничиваясь ими, C1-C24 алкилен, C1-C20 алкилен, C1-C16 алкилен, C1-C12 алкилен, C1-C8 алкилен, C1-C6 алкилен, C1-C4 алкилен, C1-C3 алкилен, C1-C2 алкилен, C1 алкилен. Типичные алкиленовые группы включают в себя, но не ограничиваются ими, метилен, этилен, пропилен, н-бутилен, этенилен, пропенилен, н-бутенилен, пропинилен, н-бутинилен и т. п. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов углерода, или содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 10 атомов углерода. Например, в некоторых вариантах осуществления Z представляет собой . В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой линейную или разветвленную содержащую гетероатом углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов. Например, Z может представлять собой линейную или разветвленную углеродную цепь с одним или большим количеством атомов углерода, замещенных гетероатомом, включающим в себя, не ограничиваясь ими, O, N, S или P. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой алкилен-карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода. Например, в некоторых вариантах осуществления Z представляет собой , где x равно 1-1000. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой алкилен-гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов. В некоторых вариантах осуществления Z является незамещенным. В некоторых вариантах осуществления Z является замещенным. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой одно из следующего , , , , , , , , , или .
[00144] В некоторых вариантах осуществления Z’ представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, алкилен-карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов, или алкилен-гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов. Z’ может быть незамещен или замещен по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, гало C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом или C6-C10 арилом; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила; В некоторых вариантах осуществления Z’ представляет собой линейную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов углерода. Например, Z’ может представлять собой алкиленовую группу, включающую в себя, не ограничиваясь ими, C1-C24 алкилен, C1-C20 алкилен, C1-C16 алкилен, C1-C12 алкилен, C1-C8 алкилен, C1-C6 алкилен, C1-C4 алкилен, C1-C3 алкилен, C1-C2 алкилен, C1 алкилен. Типичные алкиленовые группы включают в себя, но не ограничиваются ими, метилен, этилен, пропилен, н-бутилен, этенилен, пропенилен, н-бутенилен, пропинилен, н-бутинилен и т. п. В некоторых вариантах осуществления Z’ представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов углерода, или содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов.
[00145] В некоторых вариантах осуществления Z’’ представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, алкилен-карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов, или алкилен-гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов. Z’’ может быть незамещен или замещен по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, галоген-C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом или C6-C10 арилом; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила; В некоторых вариантах осуществления Z’’ представляет собой линейную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов углерода. Например, Z’’ может представлять собой алкиленовую группу, включающую в себя, не ограничиваясь ими, C1-C24 алкилен, C1-C20 алкилен, C1-C16 алкилен, C1-C12 алкилен, C1-C8 алкилен, C1-C6 алкилен, C1-C4 алкилен, C1-C3 алкилен, C1-C2 алкилен, C1 алкилен. Типичные алкиленовые группы включают в себя, но не ограничиваются ими, метилен, этилен, пропилен, н-бутилен, этенилен, пропенилен, н-бутенилен, пропинилен, н-бутинилен и т. п. В некоторых вариантах осуществления Z’’ представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов углерода, или содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 30 атомов.
[00146] Согласно определенным вариантам осуществления настоящего изобретения, G может представлять собой -C-, -S-, -S(O)-, -P(OR1)- или -P(OH)-, тем самым образуя карбонильную, сульфоксидную, сульфонную и фосфоногруппу, соответственно. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления G представляет собой -C-. В некоторых вариантах осуществления G представляет собой -S-. В некоторых вариантах осуществления G представляет собой -S(O) -.
[00147] В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (B) представляет собой
;
где
R представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 10 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 10 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 10 атомов углерода или гетероцикл, содержащий от 3 до 10 атомов, при этом R является незамещенным или замещенным по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, галоген-C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом или C6-C10 арилом; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила; при этом R’’ является незамещенной или замещенной, линейной или разветвленной углеродной цепью, имеющей от 1 до 10 атомов углерода, содержащей гетероатом линейной или разветвленной углеродной цепью, имеющей от 1 до 10 атомов, карбоциклом, содержащим от 3 до 10 атомов углерода или гетероциклом, содержащим от 3 до 10 атомов. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой 1 атом углерода. В некоторых вариантах осуществления R’’ представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь, такую как метил, этил, н-пропил, изопропил, 2-метил-1-пропил, 2-метил-2-пропил, 2-метил-1-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-3-бутил, 2,2-диметил-1-пропил, 2-метил-1-пентил, 3-метил-1-пентил, 4-метил-1-пентил, 2-метил- 2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 2,2-диметил-1-бутил, 3,3-диметил-1-бутил, 2-этил-1-бутил, бутил, изобутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил. Например, в некоторых вариантах осуществления соединение формулы (B) представляет собой . В некоторых вариантах осуществления R представляет собой карбоцикл, содержащий от 3 до 10 атомов углерода. Например, R может представлять собой циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, циклононил, циклодецил, фенил или нафтил. В некоторых вариантах осуществления R представляет собой гетероцикл, содержащий от 3 до 10 атомов.
[00148] В определенных вариантах осуществления первый амин имеет формулу R1-NH2 или R1-N(H)-Z’-N(H)-R1. В некоторых вариантах осуществления первый амин имеет формулу R1-NH2. В некоторых вариантах осуществления первый амин имеет формулу R1-N(H)-Z’-N(H)-R1. В некоторых вариантах осуществления первый амин, имеющий формулу R1-N(H)-Z’-N(H)-R1, представляет собой , или . В некоторых вариантах осуществления первый амин имеет формулу R1-N(H)-Z’-N-(R1)2. В некоторых вариантах осуществления первый амин, имеющий формулу R1-N(H)-Z’-N-(R1)2, представляет собой .
[00149] В определенных вариантах осуществления первый амин имеет формулу R2-NH2 или R2-N(H)-Z’’-N(H)-R2. В некоторых вариантах осуществления второй амин имеет формулу R2-NH2. В некоторых вариантах осуществления второй амин имеет формулу R2-N(H)-Z’’-N(H)-R2. В некоторых вариантах осуществления второй амин, имеющий формулу R2-N(H)-Z’’-N(H)-R2, представляет собой , , или . В некоторых вариантах осуществления первый амин имеет формулу R2-N(H)-Z’’-N-(R2)2. В некоторых вариантах осуществления первый амин, имеющий формулу R2-N(H)-Z’’-N-(R2)2, представляет собой .
[00150] В определенных вариантах осуществления R1 представляет собой C1-C40алкил, C1-C40 гетероалкил, C2-C40алкенил, C2-C40 гетероалкенилен, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C2-C40 гетероалкинилен, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; где гетероциклил и гетероарил содержат 1-5 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, S, P и O; где C1-C40алкил, C2-C40алкенил, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещены D, галогеном, C1-C6алкилом, -OH, -O-C1-C6алкилом,-NH2, -NH(C1-C6алкилом) или -N(C1-C6алкилом)2. R1 может быть незамещен или замещен по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, галоген-C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом или C6-C10 арилом; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила. В некоторых вариантах осуществления R1 представляет собой C1-C20 алкил. Например, R1 может представлять собой C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19 или C20 алкильные группы, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил, 2-метил-1-пропил, 2-метил-2-пропил, 2-метил-1-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-3-бутил, 2,2-диметил-1-пропил, 2-метил-1-пентил, 3-метил-1-пентил, 4-метил-1-пентил, 2-метил-2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 2,2-диметил-1-бутил, 3,3-диметил-1-бутил, 2-этил-1-бутил, бутил, изобутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил, н-гептил, н-октил, н-нонил, н-децил, н-ундецил, н-додецил, н-тридецил, н-тетрадецил, н-пентадецил, н-гексадецил, н-гептадецил, н-октадецил, н-нонадецил или н-икозил. В некоторых вариантах осуществления R1 является незамещенным. В некоторых вариантах осуществления R1 является замещенным. В некоторых вариантах осуществления R1 выбран из группы, состоящей из , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , и . В некоторых вариантах осуществления R1 представляет собой . В некоторых вариантах осуществления R1 представляет собой , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , или .
[00151] В определенных вариантах осуществления R2 представляет собой C1-C40алкил, C1-C40 гетероалкил, C2-C40алкенил, C2-C40 гетероалкенилен, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C2-C40 гетероалкинилен, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; где гетероциклил и гетероарил содержат 1-5 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, S, P и O; где C1-C40алкил, C2-C40алкенил, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещены D, галогеном, C1-C6алкилом, -OH, -O-C1-C6алкилом, -NH2, -NH(C1-C6алкилом) или -N(C1-C6алкилом)2. R2 может быть незамещен или замещен по меньшей мере одним из следующего: галогеном, гидроксилом, аминогруппой, сульфонильной группой, сульфонамидной группой, тиолом, C1-C6 алкилом, C1-C6 алкокси, C1-C6эфиром, C1-C6 тиоэфиром, C1-C6 сульфоном, C1-C6 сульфоксидом, C1-C6 первичным амидом, C1-C6 вторичным амидом, галоген-C1-C6 алкилом, карбоксильной группой, цианогруппой, нитрогруппой, нитрозогруппой, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкилом, C3-C6циклоалкилом, C3-C6 гетероциклилом, C2-C5 гетероарилом или C6-C10 арилом; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила. В некоторых вариантах осуществления R2 представляет собой C1-C20 алкил. Например, R2 может представлять собой C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19 или C20 алкильные группы, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил, 2-метил-1-пропил, 2-метил-2-пропил, 2-метил-1-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-3-бутил, 2,2-диметил-1-пропил, 2-метил-1-пентил, 3-метил-1-пентил, 4-метил-1-пентил, 2-метил-2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 2,2-диметил-1-бутил, 3,3-диметил-1-бутил, 2-этил-1-бутил, бутил, изобутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил, н-гептил, н-октил, н-нонил, н-децил, н-ундецил, н-додецил, н-тридецил, н-тетрадецил, н-пентадецил, н-гексадецил, н-гептадецил, н-октадецил, н-нонадецил или н-икозил. В некоторых вариантах осуществления R2 является незамещенным. В некоторых вариантах осуществления R2 является замещенным. В некоторых вариантах осуществления R2 выбран из группы, состоящей из , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , и . В некоторых вариантах осуществления R2 представляет собой . В некоторых вариантах осуществления R2 представляет собой , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , или .
[00152] В некоторых вариантах осуществления каждый Q представляет собой H или линейную или разветвленную алкильную группу C1-C10. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления каждый Q представляет собой H. В других вариантах осуществления каждый Q представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу C1-C10. Например, каждый Q может представлять собой метил, этил, н-пропил, изопропил, 2-метил-1-пропил, 2-метил-2-пропил, 2-метил-1-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-3-бутил, 2,2-диметил-1-пропил, 2-метил-1-пентил, 3-метил-1-пентил, 4-метил-1-пентил, 2-метил-2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 2,2-диметил-1-бутил, 3,3-диметил-1-бутил, 2-этил-1-бутил, бутил, изобутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил, н-гептил, н-октил, н-нонил или н-децил. В некоторых вариантах осуществления каждый Q представляет собой метил.
[00153] В некоторых вариантах осуществления каждый J представляет собой -O-. В некоторых вариантах осуществления каждый J представляет собой -NH-.
[00154] В некоторых вариантах осуществления каждый E1 независимо выбран из группы, состоящей из ковалентной связи, -N-, -O-, -S-, алкилена, гетероалкилена, алкенила, гетероалкенилена, алкинила, гетероалкинилена. В некоторых вариантах осуществления каждый E1 представляет собой гетероалкенилен. В некоторых вариантах осуществления каждый E1 представляет собой -CH2-O-. В некоторых вариантах осуществления каждое n равно по меньшей мере 1. Например, n может быть равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В некоторых вариантах осуществления n равно 1.
[00155] В некоторых вариантах осуществления A представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь из от 2 до 30 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, или гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов. Например, в некоторых вариантах осуществления A представляет собой .
[00156] В некоторых вариантах осуществления полимер по настоящему изобретению имеет общую структуру , в которой волнистая связь представляет связь с остальным полимером. По причине в высокой степени контролируемого последовательного роста линейного олигомера и его разветвления, полученные полимеры имеют более равномерное распределение линейных сегментов и элементов ветвления, как показано в приведенной выше структуре. Как описано в последующих разделах и примерах, такие полимеры обладают значительной аффинностью связывания ДНК и могут конденсировать ДНК для формирования наноразмерных полиплексов с почти 100% эффективностью клеточного поглощения. В некоторых вариантах осуществления полимер по настоящему изобретению представляет собой .
[00157] В некоторых вариантах осуществления молярный избыток соединения формулы (A) вводят в реакцию с первым амином. Например, стехиометрическое соотношение соединения формулы (A) с первым амином может находиться в диапазоне от около 1,1:1 до около 10:1, включая около 1,1:1, около 1,2:1, около 1,3:1, около 1,4:1, около 1,5:1, около 1,6:1, около 1,7:1, около 1,8:1, около 1,9:1, около 2:1, около 3:1, около 4:1, около 5:1, около 6:1, около 7:1, около 8:1, около 9:1 или около 10:1, включая все диапазоны между ними.
[00158] В некоторых вариантах осуществления стехиометрическое соотношение соединения формулы (A) с первым амином составляет около 1,1:1, около 1,2:1, около 1,3:1, около 1,4:1, около 1,5:1, около 1,6:1, около 1,7:1, около 1,8:1, около 1,9:1, около 2:1, около 3:1, около 4:1, около 5:1, около 6:1, около 7:1, около 8:1, около 9:1 или около 10:1. В некоторых вариантах осуществления стехиометрическое соотношение соединения формулы (A) с первым амином может находиться в диапазоне от около 1,1:1 до около 2:1. В некоторых вариантах осуществления стехиометрическое соотношение соединения формулы (A) с первым амином составляет около 1,2:1. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (A) вводят в реакцию с первым амином в молярном эквиваленте (т.е. около 1:1).
[00159] В некоторых вариантах осуществления стадию (a) выполняют в органическом растворителе. В контексте настоящего изобретения может быть использован широкий спектр органических растворителей, включая, но не ограничиваясь ими, диметилсульфоксид (DMSO), N, N-диметилформамид (DMF), N-метилпирролидон (NMP) и аналогичные; кетоны, такие как ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон и аналогичные; простые эфиры, такие как тетрагидрофуран (THF), диэтиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир и аналогичные; углеводороды, такие как толуол, ксилол, циклогексан и тому подобное. В некоторых вариантах осуществления стадию (a) выполняют в DMSO.
[00160] В некоторых вариантах осуществления стадию (a) выполняют при температуре, находящейся в диапазоне от около 40°C до около 120 °C, включая около 40, около 41, около 42, около 43, около 44, около 45, около 46. около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56 , около 57, около 58, около 59, около 60, около 61, около 62, около 63, около 64, около 65, около 66, около 67, около 68, около 69, около 70, около 71, около 72, около 73, около 74, около 75, около 76, около 77, около 78, около 79, около 80, около 81, около 82, около 83, около 84, около 85, около 86, около 87, около 88, около 89, около 90, около 91, около 92, около 93, около 94, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99, около 100, около 101, около 102, около 103, около 104, около 105, около 106 , около 107, около 108, около 109, около 110, около 111, около 112, около 113, около 114, около 115, около 116, около 117, около 118, около 119 или 120 °C, включая все диапазоны между ними.
[00161] В некоторых вариантах осуществления стадию (a) выполняют при 40, около 41, около 42, около 43, около 44, около 45, около 46 ,. около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60, около 61, около 62, около 63 , около 64, около 65, около 66, около 67, около 68, около 69, около 70, около 71, около 72, около 73, около 74, около 75, около 76, около 77, около 78, около 79, около 80, около 81, около 82, около 83, около 84, около 85, около 86, около 87, около 88, около 89, около 90, около 91, около 92, около 93, около 94, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99, около 100, около 101, около 102, около 103, около 104, около 105, около 106, около 107, около 108, около 109, около 110, около 111, около 112, около 113 , около 114, около 115, около 116, около 117, около 118, около 119 или 120 °C. В некоторых вариантах осуществления стадию (a) выполняют при около 90 °C.
[00162] В некоторых вариантах осуществления продукт стадии (a) не очищают перед стадией (b). В других вариантах осуществления продукт стадии (a) очищают перед стадией (b). Продукт стадии (a) может быть очищен с помощью разнообразных способов и технологий, очевидных для специалиста в данной области техники.
[00163] В некоторых вариантах осуществления молярный избыток второго амина добавляют к продукту стадии (a). Например, стехиометрическое соотношение второго амина с продуктом стадии (a) может находиться в диапазоне от около 1,1:1 до около 10:1, включая около 1,1:1, около 1,2:1, около 1,3:1, около 1,4:1, около 1,5:1, около 1,6:1, около 1,7:1, около 1,8:1, около 1,9:1, около 2:1, около 3:1, около 4:1, около 5:1, около 6:1, около 7:1, около 8:1, около 9:1 или около 10:1, включая все диапазоны между ними.
[00164] В некоторых вариантах осуществления стехиометрическое соотношение второго амина с продуктом стадии (a) составляет около 1,1:1, около 1,2:1, около 1,3:1, около 1,4:1, около 1,5:1, около 1,6:1, около 1,7:1, около 1,8:1, около 1,9:1, около 2:1, около 3:1, около 4:1, около 5:1, около 6:1, около 7:1, около 8:1, около 9:1 или около 10:1. В некоторых вариантах осуществления стехиометрическое соотношение второго амина с продуктом стадии (a) составляет около 5:1. В некоторых вариантах реализации второй амин вводят в реакцию с продуктом стадии (a) в молярном эквиваленте (т.е. около 1:1).
[00165] В некоторых вариантах осуществления стадию (b) выполняют при температуре, находящейся в диапазоне от около 16°C до около 40 °C. Например, стадию (b) выполняют при температуре, находящейся в диапазоне от около 16, около 17, около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33 , около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39 до около 40 °C, включая все диапазоны между ними.
[00166] В некоторых вариантах осуществления стадию (b) выполняют при температуре около 16, около 17, около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33 , около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39 или около 40 °C.
[00167] В некоторых вариантах осуществления продукт стадии (b) не очищают перед стадией (c). В некоторых вариантах осуществления продукт стадии (b) очищают перед стадией (c). Продукт стадии (b) может быть очищен с помощью разнообразных способов и технологий, очевидных для специалиста в данной области техники. Например, продукт стадии (b) может быть очищен путем диализа.
[00168] В некоторых вариантах осуществления стадию (c) выполняют при температуре, более высокой, чем температура стадии (b). Например, стадию (c) выполняют при температуре, находящейся в диапазоне от около 21°C до около 200 °C. Например, стадию (c) выполняют при температуре, находящейся в диапазоне от около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38 , около 39, около 40, около 41, около 42, около 43, около 44, около 45, около 46, около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60, около 61, около 62, около 63, около 64, около 65, около 66, около 67, около 68, около 69, около 70, около 71, около 72, около 73, около 74, около 75, около 76, около 77, около 78, около 79, около 80, около 81, около 82, около 83, около 84, около 85, около 86, около 87, около 88 , около 89, около 90, около 91, около 92, около 93, около 94, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99, около 100, около 101 об, 102, около 103, около 104, около 105, около 106, около 107, около 108, около 109, около 110, около 111, около 112, около 113, около 114, около 115, около 116, около 117, около 118, около 119, около 120, около 121, около 122, около 123, около 124, около 125, около 126, около 127, около 128, около 129, около 130, около 131, около 132, около 133, около 134, около 135, около 136 , около 137, около 138, около 139, около 140, около 141, около 142, около 143, около 144, около 145, около 146, около 147, около 148, около 149, около 150, около 151, около 152, около 153, около 154, около 155, около 156, около 157, около 158, около 159, около 160, около 161, около 162, около 163, около 164, около 165, около 166, около 167, около 168, около 169, около 170, около 171, около 172, около 173, около 174, около 175, около 176, около 177, около 178, около 179, около 180, около 181, около 182, около 183, около 184, около 185, около 186, около 187, около 188, около 189, около 190, около 191, около 192, около 193, около 194, около 195, около 196, около 197, около 198, около 199 до около 200 °C, включая все диапазоны между ними.
[00169] В некоторых вариантах осуществления стадию (c) выполняют при около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38 , около 39, около 40, около 41, около 42, около 43, около 44, около 45, около 46, около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60, около 61, около 62, около 63, около 64, около 65, около 66, около 67, около 68, около 69, около 70, около 71, около 72, около 73, около 74, около 75, около 76, около 77, около 78, около 79, около 80, около 81, около 82, около 83, около 84, около 85, около 86, около 87, около 88 , около 89, около 90, около 91, около 92, около 93, около 94, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99, около 100, около 101 об, 102, около 103, около 104, около 105, около 106, около 107, около 108, около 109, около 110, около 111, около 112, около 113, около 114, около 115, около 116, около 117, около 118, около 119, около 120, около 121, около 122, около 123, около 124, около 125, около 126, около 127, около 128, около 129, около 130, около 131, около 132, около 133, около 134, около 135, около 136 , около 137, около 138, около 139, около 140, около 141, около 142, около 143, около 144, около 145, около 146, около 147, около 148, около 149, около 150, около 151, около 152, около 153, около 154, около 155, около 156, около 157, около 158, около 159, около 160, около 161, около 162, около 163, около 164, около 165, около 166, около 167, около 168, около 169, около 170, около 171, около 172, около 173, около 174, около 175, около 176, около 177, около 178, около 179, около 180, около 181, около 182, около 183, около 184, около 185, около 186, около 187, около 188, около 189, около 190, около 191, около 192, около 193, около 194, около 195, около 196, около 197, около 198, около 199 или около 200 °C. В некоторых вариантах осуществления стадию (c) выполняют при около 90 °C.
[00170] В некоторых вариантах осуществления полимеры, изготовленные способами по настоящему изобретению, имеют значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, меньшее чем около 0,5. Например, полимеры по настоящему изобретению имеют значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, в диапазоне от около 0,01, около 0,02, около 0,03, около 0,04, около 0,05, около 0,06, около 0,07, около 0,08, около 0,09, около 0,10, около 0,11, около 0,12, около 0,13, около 0,14, около 0,15, около 0,16, около 0,17, около 0,18 , около 0,19, около 0,20, около 0,21, около 0,22, около 0,23, около 0,24, около 0,25, около 0,26, около 0,27, около 0,28, около 0,29, около 0,30, около 0,31, около 0,32, около 0,33, около 0,34, около 0,35, около 0,36, около 0,37, около 0,38, около 0,39, около 0,40, около 0,41, около 0,42, около 0,43, около 0,44, около 0,45, около 0,46, около 0,47, около 0,48 до около 0,49, включая все диапазоны между ними. В некоторых вариантах осуществления полимеры, изготовленные способами по настоящему изобретению, имеют значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, от около 0,2 до около 0,5.
[00171] В некоторых вариантах осуществления полимеры, изготовленные способами по настоящему изобретению, имеют значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, около 0,01, около 0,02, около 0,03, около 0,04, около 0,05, около 0,06, около 0,07, около 0,08, около 0,09, около 0,10, около 0,11, около 0,12, около 0,13, около 0,14, около 0,15, около 0,16, около 0,17, около 0,18 , около 0,19, около 0,20, около 0,21, около 0,22, около 0,23, около 0,24, около 0,25, около 0,26, около 0,27, около 0,28, около 0,29, около 0,30, около 0,31, около 0,32, около 0,33, около 0,34, около 0,35, около 0,36, около 0,37, около 0,38, около 0,39, около 0,40, около 0,41, около 0,42, около 0,43, около 0,44, около 0,45, около 0,46, около 0,47, около 0,48 или около 0,49.
[00172] В некоторых вариантах осуществления полимеры, изготовленные способами по настоящему изобретению, имеют индекс полидисперсности (PDI) от около 1,01 до около 8,0. Например, значение PDI может находится в диапазоне от около 1,01, около 1,02, около 1,03, около 1,04, около 1,05, около 1,06, около 1,07. около 1,08, около 1,09, около 1,1, около 1,2, около 1,3, около 1,4, около 1,5, около 1,6, около 1,7, около 1,8 , около 1,9, около 2,0, около 2,1, около 2,2, около 2,3, около 2,4, около 2,5, около 2,6, около 2,7, около 2,8, около 2,9, около 3,0, около 3,1, около 3,2, около 3,3, около 3,4, около 3,5, около 3,6, около 3,7, около 3,8, около 3,9, около 4,0, около 4,1, около 4,2, около 4,3, около 4,4, около 4,5, около 4,6, около 4,7, около 4,8, около 4,9, около 5,0, около 5,1, около 5,2, около 5,3, около 5,4, около 5,5, около 5,6, около 5,7, около 5,8, около 5,9, около 6,0, около 6,1, около 6,2, около 6,3, около 6,4, около 6,5, около 6,6, около 6,7, около 6,8 , около 6,9, около 7,0, около 7,1, около 7,2, около 7,3, около 7,4, около 7,5, около 7,6, около 7,7, около 7,8, около 7,9 до около 8,0, включая все диапазоны между ними.
[00173] В некоторых вариантах осуществления полимеры, изготовленные способами по настоящему изобретению, имеют значение PDI около 1,01, около 1,02, около 1,03, около 1,04, около 1,05, около 1,06, около 1,07, около 1,08, около 1,09, около 1,1, около 1,2, около 1,3, около 1,4, около 1,5, около 1,6, около 1,7, около 1,8 , около 1,9, около 2,0, около 2,1, около 2,2, около 2,3, около 2,4, около 2,5, около 2,6, около 2,7, около 2,8, около 2,9, около 3,0, около 3,1, около 3,2, около 3,3, около 3,4, около 3,5, около 3,6, около 3,7, около 3,8, около 3,9, около 4,0, около 4,1, около 4,2, около 4,3, около 4,4, около 4,5, около 4,6, около 4,7, около 4,8, около 4,9, около 5,0, около 5,1, около 5,2, около 5,3, около 5,4, около 5,5, около 5,6, около 5,7, около 5,8, около 5,9, около 6,0, около 6,1, около 6,2, около 6,3, около 6,4, около 6,5, около 6,6, около 6,7, около 6,8 , около 6,9, около 7,0, около 7,1, около 7,2, около 7,3, около 7,4, около 7,5, около 7,6, около 7,7, около 7,8, около 7,9 или около 8,0. В некоторых вариантах осуществления полимеры по настоящему изобретению имеют PDI около 2,5. В некоторых вариантах осуществления полимеры по настоящему изобретению имеют PDI около 3,5. В некоторых вариантах осуществления полимеры по настоящему изобретению имеют PDI около 6,5. В некоторых вариантах осуществления полимеры по настоящему изобретению имеют PDI около 8,5.
[00174] В некоторых вариантах осуществления полимеры, изготовленные способами по настоящему изобретению, имеют MW по меньшей мере 3 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимеры, изготовленные способами по настоящему изобретению, имеют MW от около 3 кДа до около 200 кДа. Соответственно, полимеры по настоящему изобретению имеют MW в диапазоне от около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17, около 18, около 19, около 20 , около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39, около 40, около 41, около 42, около 43, около 44, около 45, около 46, около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60, около 61, около 62, около 63, около 64, около 65, около 66, около 67, около 68, около 69, около 70 , около 71, около 72, около 73, около 74, около 75, около 76, около 77, около 78, около 79, около 80, около 81, около 82, около 83, около 84, около 85, около 86, около 87, около 88, около 89, около 90, около 91, около 92, около 93, около 94, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99, около 100 об, 101, около 102, около 103, около 104, около 105, около 106, около 107, около 108, около 109, около 110, около 111, около 112, около 113, около 114, около 115, около 116, около 117, около 118, около 119, около 120 , около 121, около 122, около 123, около 124, около 125, около 126, около 127, около 128, около 129, около 130, около 131, около 132, около 133, около 134, около 135, около 136, около 137, около 138, около 139, около 140, около 141, около 142, около 143, около 144, около 145, около 146, около 147, около 148, около 149, около 150, около 151, около 152, около 153, около 154, около 155, около 156, около 157, около 158, около 159, около 160, около 161, около 162, около 163, около 164, около 165, около 166, около 167 около 168, около 169, около 170, около 171, около 172, около 173, около 174, около 175, около 176, около 177, около 178, около 179, около 180, около 181, около 182, около 183, около 184, около 185, около 186, около 187 , около 188, около 189, около 190, около 191, около 192, около 193, около 194, около 195, около 196, около 197, около 198, около 199 до около 200 кДа. В некоторых вариантах осуществления данный полимер имеет MW между около 5 кДа и 50 кДа. В некоторых вариантах осуществления данный полимер имеет MW между около 10 кДа и 50 кДа.
[00175] В некоторых вариантах осуществления полимеры, изготовленные способами по настоящему изобретению, имеют MW около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17, около 18, около 19, около 20 , около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39, около 40, около 41, около 42, около 43, около 44, около 45, около 46, около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60, около 61, около 62, около 63, около 64, около 65, около 66, около 67, около 68, около 69, около 70 , около 71, около 72, около 73, около 74, около 75, около 76, около 77, около 78, около 79, около 80, около 81, около 82, около 83, около 84, около 85, около 86, около 87, около 88, около 89, около 90, около 91, около 92, около 93, около 94, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99, около 100 об, 101, около 102, около 103, около 104, около 105, около 106, около 107, около 108, около 109, около 110, около 111, около 112, около 113, около 114, около 115, около 116, около 117, около 118, около 119, около 120 , около 121, около 122, около 123, около 124, около 125, около 126, около 127, около 128, около 129, около 130, около 131, около 132, около 133, около 134, около 135, около 136, около 137, около 138, около 139, около 140, около 141, около 142, около 143, около 144, около 145, около 146, около 147, около 148, около 149, около 150, около 151, около 152, около 153, около 154, около 155, около 156, около 157, около 158, около 159, около 160, около 161, около 162, около 163, около 164, около 165, около 166, около 167 около 168, около 169, около 170, около 171, около 172, около 173, около 174, около 175, около 176, около 177, около 178, около 179, около 180, около 181, около 182, около 183, около 184, около 185, около 186, около 187 , около 188, около 189, около 190, около 191, около 192, около 193, около 194, около 195, около 196, около 197, около 198, около 199 до около 200 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимер, изготовленный способом по настоящему изобретению, имеет MW между около 5 кДа и 50 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимер, изготовленный способом по настоящему изобретению, имеет MW около 10 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимер, изготовленный способом по настоящему изобретению, имеет MW около 20 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимер, изготовленный способом по настоящему изобретению, имеет MW около 30 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимер, изготовленный способом по настоящему изобретению, имеет MW около 40 кДа.
[00176] В некоторых вариантах осуществления продукт после стадии (b) имеет MW около 3 кДа.
Полиплексы
[00177] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает полиплекс, содержащий компонент нуклеиновой кислоты, как описано в настоящем документе, и любой из разветвленных полимеров, описанных в данном документе, например, полимер, изготовленный любым из способов, описанных в данном документе, или полимер формулы (I):
(I)
где
каждый A независимо представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, содержащую гетероатом линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов, карбоцикл, содержащий от 3 до 30 атомов углерода, или гетероцикл, содержащий от 3 до 30 атомов;
где A необязательно замещен одним или большим количеством галогена, гидроксила, аминогруппы, сульфонильной группы, сульфонамидной группы, тиола, C1-C6 алкила C1-C6 алкокси, C1-C6эфира, C1-C6 тиоэфира, C1-C6 сульфона, C1-C6 сульфоксида, C1-C6 первичного амида, C1-C6 вторичного амида, галоген-C1-C6 алкила, карбоксильной группы, цианогруппы, нитрогруппы, нитрозогруппы, -OC(O)NR′R′, -N(R′)C(O)NR′R′, -N(R′)C(O)O-C1-C6 алкила, C3-C6циклоалкила, C3-C6 гетероциклила, C2-C5 гетероарила или C6-C10 арила; где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C6 алкила;
каждый B независимо представляет собой первый связывающий фрагмент;
каждый X независимо представляет собой или ;
каждый Y независимо представляет собой или ;
каждый L независимо представляет собой второй связывающий фрагмент;
каждый R1, R2 и R3 в каждом случае независимо представляют собой H, C1-C40алкил, C1-C40 гетероалкил, C2-C40алкенил, C2-C40 гетероалкенилен, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C2-C40 гетероалкинилен, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; причем гетероциклил и гетероарил содержат 1-5 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, S, P и O; где C1-C6алкил, C2-C8алкенил, C4-C8циклоалкенил, C2-C6алкинил, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещены D, галогеном, C1-C6алкилом, -OH, -O-C1-C6алкилом,-NH2, -NH(C1-C6алкилом) или -N(C1-C6алкилом)2; или
где R2 и R3 вместе с атомом, к которому они присоединены, могут образовывать гетероциклил или гетероарил, содержащий 1-3 гетероатома, выбранные из группы, состоящей из N, S, P и O;
a равно 1-1000;
b равно 1-4;
c равно 1-3; и
z равно 1-100;
при условии, что по меньшей мере один из R2 и R3 не является H.
[00178] В определенных вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер формулы (II):
(II)
где
каждый E1 выбран из группы, состоящей из ковалентной связи, -N-, -O-, -S-, алкилена, гетероалкилена, алкенила, гетероалкенилена, алкинила, гетероалкинилена;
каждый E2 выбран из группы, состоящей из ковалентной связи, -N-, -O-, -S-, алкилена, гетероалкилена, алкенила, гетероалкенилена, алкинила, гетероалкинилена;
G представляет собой -C-, -S-, -S(O)-, -P(OR1)- или -P(OH)-; и
n равно по меньшей мере 1.
[00179] В некоторых вариантах осуществления каждый B независимо представляет собой или . В некоторых вариантах осуществления каждый E1 и E2 независимо выбраны из группы, состоящей из ковалентной связи, -N-, -O-, -S-, алкилена, гетероалкилена, алкенила, гетероалкенилена, алкинила, гетероалкинилена. В некоторых вариантах осуществления каждый E1 представляет собой гетероалкенилен. В некоторых вариантах осуществления каждый E1 представляет собой -CH2-O-. В некоторых вариантах осуществления каждый E2 представляет собой алкилен. В некоторых вариантах осуществления каждый E2 представляет собой , или . В некоторых вариантах осуществления каждый E2 представляет собой . В некоторых вариантах осуществления каждое n равно по меньшей мере 1. Например, n может быть равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В некоторых вариантах осуществления n равно 1. В некоторых вариантах осуществления G представляет собой -C-. В некоторых вариантах осуществления каждый B представляет собой или .
[00180] В некоторых вариантах осуществления B и A объединяют с получением 
.
[00181] В некоторых вариантах осуществления каждый L представляет собой , где x равно 1-1000. В некоторых вариантах осуществления a равно по меньшей мере 2, b равно 3, а каждый X представляет собой . В некоторых вариантах осуществления каждый A представляет собой . В некоторых вариантах осуществления каждый L представляет собой .
[00182] В некоторых вариантах осуществления Y представляет собой .
[00183] В некоторых вариантах осуществления каждый R2 и/или R3 представляет собой .
[00184] В некоторых вариантах осуществления каждый R1 представляет собой .
[00185] В некоторых вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер формул с (III) по (VIIe):
(III);
(IV);
(V);
(Va);
(VI);
(VIa);
(VIb);
(VIc);
(VId);
(VIe);
(VII);
(VIIa);
(VIIb);
(VIIc);
(VIId);
(VIIe);
где каждый R5, R6 и R7 в каждом случае независимо представляют собой H, C1-C40алкил, C1-C40 гетероалкил, C2-C40алкенил, C2-C40 гетероалкенилен, C4-C8циклоалкенил, C2-C40алкинил, C2-C40 гетероалкинилен, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; причем гетероциклил и гетероарил содержат 1-5 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, S, P и O; где C1-C6алкил, C2-C8алкенил, C4-C8циклоалкенил, C2-C6алкинил, C3-C8циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещены D, галогеном, C1-C6алкилом, -OH, -O-C1-C6алкилом,-NH2, -NH(C1-C6алкилом) или -N(C1-C6алкилом)2; и оставшимися переменными, как описано выше.
[00186] В некоторых вариантах осуществления z равно 1, 2 или 3. В некоторых вариантах осуществления z равно 1.
[00187] В некоторых вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер, содержащий:
(a) ;
(b) ; и
(c) или
,
[00188] где R1, R2, A, E1, G, J, Q, Z, Z” и n имеют любое из определений, приведенных в настоящем документе. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 3 кДа до около 200 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW между около 10 кДа и 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 15 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 10 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 20 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 30 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 40 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, меньшее чем около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, в диапазоне от около 0,3 до около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) от около 1,0 до около 8,0. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) около 2,5.
[00189] В некоторых вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер, содержащий:
(a) ;
(b) ; и
(c) ,
где R1, R2, A, E1, G, J, Q, Z и n имеют любое из определений, приведенных в настоящем документе. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 3 кДа до около 200 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW между около 10 кДа и 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 15 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 10 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 20 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 30 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 40 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, меньшее чем около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, в диапазоне от около 0,3 до около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) от около 1,0 до около 8,0. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) около 2,5.
[00190] В некоторых вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер, содержащий:
(a) ;
(b) ; и
(c) ,
где R1, R2, A, E1, G, J, Q, Z, Z” и n имеют любое из определений, приведенных в настоящем документе. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 3 кДа до около 200 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW между около 10 кДа и 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 15 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 10 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 20 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 30 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 40 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, меньшее чем около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, в диапазоне от около 0,3 до около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) от около 1,0 до около 8,0. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) около 2,5.
[00191] В некоторых дополнительных вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер, содержащий:
(a) и
(c) .
[00192] В некоторых дополнительных вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер, содержащий:
(a) , и
(c) , где
J представляет собой O, а Z представляет собой , где x равно 1-1000.
[00193] В некоторых дополнительных вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер, содержащий:
(b)
[00194] В некоторых дополнительных вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер, где R1 выбран из и .
[00195] В некоторых дополнительных вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер, где R1 представляет собой .
[00196] В некоторых дополнительных вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер, где R1 представляет собой .
[00197] В некоторых дополнительных вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер, где R2 выбран из и .
[00198] В некоторых дополнительных вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер, где R2 представляет собой .
[00199] В некоторых дополнительных вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер, где R2 представляет собой .
[00200] В некоторых дополнительных вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер, где R1 представляет собой и R2 представляет собой .
[00201] В некоторых дополнительных вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер, где R1 представляет собой и R2 представляет собой .
[00202] В некоторых вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер, содержащий:
(a) ;
(b) ; и
(c) , где
R1 представляет собой , а
R2 выбран из . В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 3 кДа до около 200 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW между около 10 кДа и 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 15 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 10 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 20 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 30 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 40 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, меньшее чем около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, в диапазоне от около 0,3 до около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) от около 1,0 до около 8,0. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) около 2,5.
[00203] В некоторых вариантах осуществления такой полиплекс содержит компонент нуклеиновой кислоты и полимер, содержащий:
(a) ;
(b) ; и
(c) , где
J представляет собой O, а Z представляет собой , где x равно 1-1000;
R1 представляет собой , а
R2 представляет собой .
В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 3 кДа до около 200 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW между около 10 кДа и 50 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW от около 5 кДа до около 15 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 10 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 20 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 30 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет MW около 40 кДа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, меньшее чем около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет значение параметра альфа, определенное из уравнения Марка - Хаувинка, в диапазоне от около 0,3 до около 0,5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) от около 1,0 до около 8,0. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полимер имеет индекс полидисперсности (PDI) около 2,5.
[00204] В некоторых вариантах осуществления полимер и компонент нуклеиновой кислоты представлены в соотношении от около 0,1:1 до около 200:1 (масс./масс.). Например, полимер и компонент нуклеиновой кислоты представлены в соотношении в диапазоне от около 0,1:1, около 0,2:1, около 0,3:1, около 0,4:1, около 0,5:1, около 0,6:1, около 0,7:1, около 0,8:1, около 0,9:1, около 1:1, около 2:1, около 3:1, около 4:1, около 5:1, около 6:1, около 7:1, около 8:1, около 9:1, около 10:1 около 11:1, около 12:1, около 13:1, около 14:1, около 15:1, около 16:1, около 17:1, около 18:1, около 19:1, около 20:1, около 21:1, около 22:1, около 23:1, около 24:1, около 25:1, около 26:1, около 27:1, около 28:1, около 29:1, около 30:1, около 31:1, около 32:1, около 33:1, около 34:1, около 35:1, около 36:1, около 37:1, около 38:1, около 39:1, около 40:1, около 41:1, около 42:1, около 43:1, около 44:1, около 45:1, около 46:1, около 47:1, около 48:1, около 49:1, около 50:1, около 51:1, около 52:1, около 53:1, около 54:1, около 55:1, около 56:1, около 57:1, около 58:1, около 59:1, около 60:1, около 61:1, около 62:1, около 63:1, около 64:1, около 65:1, около 66:1, около 67:1, около 68:1, около 69:1, около 70:1, около 71:1, около 72:1, около 73:1, около 74:1, около 75:1, около 76:1, около 77:1, около 78:1, около 79:1, около 80:1, около 81:1, около 82:1, около 83:1, около 84:1, около 85:1, около 86:1, около 87:1, около 88:1, около 89:1, около 90:1, около 91:1, около 92:1, около 93:1, около 94:1, около 95:1, около 96:1, около 97:1, около 98:1, около 99:1, около 100:1, около 101:1, около 102:1, около 103:1, около 104:1, около 105:1, около 106:1, около 107:1, около 108:1, около 109:1, около 110:1, около 111:1, около 112:1, около 113:1, около 114:1, около 115:1, около 116:1, около 117:1, около 118:1, около 119:1, около 120:1, около 121:1, около 122:1, около 123:1, около 124:1, около 125:1, около 126:1, около 127:1, около 128:1, около 129:1, около 130:1, около 131:1, около 132:1, около 133:1, около 134:1, около 135:1, около 136:1, около 137:1, около 138:1, около 139:1, около 140:1, около 141:1, около 142:1, около 143:1, около 144:1, около 145:1, около 146:1, около 147:1, около 148:1, около 149:1, около 150:1, около 151:1, около 152:1, около 153:1, около 154:1, около 155:1, около 156:1, около 157:1, около 158:1, около 159:1, около 160:1, около 161:1, около 162:1, около 163:1, около 164:1, около 165:1, около 166:1, около 167:1, около 168:1, около 169:1, около 170:1, около 171:1, около 172:1, около 173:1, около 174:1, около 175:1, около 176:1, около 177:1, около 178:1, около 179:1, около 180:1, около 181:1, около 182:1, около 183:1, около 184:1, около 185:1, около 186:1, около 187:1, около 188:1, около 189:1, около 190:1, около 191:1, около 192:1, около 193:1, около 194:1, около 195:1, около 196:1, около 197:1, около 198:1, около 199:1 до около 200:1, включая все диапазоны между ними. В некоторых вариантах осуществления полимер и компонент нуклеиновой кислоты представлены в соотношении от около 20:1 до около 80:1 (масс./масс.).
[00205] В некоторых вариантах осуществления полимер и компонент нуклеиновой кислоты представлены в соотношении около 0,1:1, около 0,2:1, около 0,3:1, около 0,4:1, около 0,5:1, около 0,6:1, около 0,7:1, около 0,8:1, около 0,9:1, около 1:1, около 2:1, около 3:1, около 4:1, около 5:1, около 6:1, около 7:1, около 8:1, около 9:1, около 10:1 около 11:1, около 12:1, около 13:1, около 14:1, около 15:1, около 16:1, около 17:1, около 18:1, около 19:1, около 20:1, около 21:1, около 22:1, около 23:1, около 24:1, около 25:1, около 26:1, около 27:1, около 28:1, около 29:1, около 30:1, около 31:1, около 32:1, около 33:1, около 34:1, около 35:1, около 36:1, около 37:1, около 38:1, около 39:1, около 40:1, около 41:1, около 42:1, около 43:1, около 44:1, около 45:1, около 46:1, около 47:1, около 48:1, около 49:1, около 50:1, около 51:1, около 52:1, около 53:1, около 54:1, около 55:1, около 56:1, около 57:1, около 58:1, около 59:1, около 60:1, около 61:1, около 62:1, около 63:1, около 64:1, около 65:1, около 66:1, около 67:1, около 68:1, около 69:1, около 70:1, около 71:1, около 72:1, около 73:1, около 74:1, около 75:1, около 76:1, около 77:1, около 78:1, около 79:1, около 80:1, около 81:1, около 82:1, около 83:1, около 84:1, около 85:1, около 86:1, около 87:1, около 88:1, около 89:1, около 90:1, около 91:1, около 92:1, около 93:1, около 94:1, около 95:1, около 96:1, около 97:1, около 98:1, около 99:1, около 100:1, около 101:1, около 102:1, около 103:1, около 104:1, около 105:1, около 106:1, около 107:1, около 108:1, около 109:1, около 110:1, около 111:1, около 112:1, около 113:1, около 114:1, около 115:1, около 116:1, около 117:1, около 118:1, около 119:1, около 120:1, около 121:1, около 122:1, около 123:1, около 124:1, около 125:1, около 126:1, около 127:1, около 128:1, около 129:1, около 130:1, около 131:1, около 132:1, около 133:1, около 134:1, около 135:1, около 136:1, около 137:1, около 138:1, около 139:1, около 140:1, около 141:1, около 142:1, около 143:1, около 144:1, около 145:1, около 146:1, около 147:1, около 148:1, около 149:1, около 150:1, около 151:1, около 152:1, около 153:1, около 154:1, около 155:1, около 156:1, около 157:1, около 158:1, около 159:1, около 160:1, около 161:1, около 162:1, около 163:1, около 164:1, около 165:1, около 166:1, около 167:1, около 168:1, около 169:1, около 170:1, около 171:1, около 172:1, около 173:1, около 174:1, около 175:1, около 176:1, около 177:1, около 178:1, около 179:1, около 180:1, около 181:1, около 182:1, около 183:1, около 184:1, около 185:1, около 186:1, около 187:1, около 188:1, около 189:1, около 190:1, около 191:1, около 192:1, около 193:1, около 194:1, около 195:1, около 196:1, около 197:1, около 198:1, около 199:1 или около 200:1. В некоторых вариантах осуществления полимер и компонент нуклеиновой кислоты представлены в соотношении около 30:1 (масс./масс.).
[00206] В некоторых вариантах осуществления размер частицы составляет менее 2 мкм. В некоторых вариантах осуществления размер частицы полиплекса составляет менее, чем около 300 нм. Например, размер частицы полиплекса может составлять около 50, 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60, около 61, около 62, около 63, около 64, около 65, около 66, около 67, около 68, около 69, около 70, около 71, около 72, около 73, около 74, около 75, около 76, около 77, около 78, около 79, около 80, около 81, около 82, около 83 , около 84, около 85, около 86, около 87, около 88, около 89, около 90, около 91, около 92, около 93, около 94, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99, около 100, около 101, около 102, около 103, около 104, около 105, около 106, около 107, около 108, около 109, около 110, около 111, около 112, около 113, около 114, около 115, около 116, около 117, около 118, около 119, около 120, около 121, около 122, около 123, около 124, около 125, около 126, около 127, около 128, около 129, около 130, около 131, около 132, около 133 , около 134, около 135, около 136, около 137, около 138, около 139, около 140, около 141, около 142, около 143, около 144, около 145, около 146, около 147, около 148, около 149, около 150, около 151, около 152, около 153, около 154, около 155, около 156, около 157, около 158, около 159, около 160, около 161, около 162 , около 163, около 164, около 165, около 166, около 167, около 168, около 169, около 170, около 171, около 172, около 173, около 174, около 175, около 176, около 177, около 178, около 179, около 180, около 181, около 182, около 183, около 184, около 185, около 186, около 187, около 188, около 189, около 190, около 191, около 192, около 193, около 194, около 195, около 196, около 197, около 198, около 199, около 200, около 201, около 202, около 203, около 204, около 205, около 206, около 207, около 208, около 209, около 210, около 211, около 212 , около 213, около 214, около 215, около 216, около 217, около 218, около 219, около 220, около 221, около 222, около 223, около 224, около 225, около 226, около 227, около 228, около 229, около 230, около 231, около 232, около 233, около 234, около 235, около 236, около 237, около 238, около 239, около 240, около 241, около 242, около 243, около 244, около 245, около 246, около 247, около 248, около 249, около 250, около 251, около 252, около 253 , около 254, около 255, около 256, около 257, около 258, около 259, около 260, около 261, около 262, около 263, около 264, около 265, около 266, около 267, около 268, около 269, около 270, около 271, около 272, около 273, около 274, около 275, около 276, около 277, около 278, около 279, около 280, около 281, около 282, около 283, около 284, около 285, около 286, около 287, около 288, около 289, около 290, около 291, около 292, около 293, около 294, около 295, около 296, около 297, около 298, около 299 или около 300 нм. В некоторых вариантах осуществления полиплексы по настоящему изобретению имеют размер частицы от около 60 нм до около 250 нм. В некоторых вариантах осуществления полиплексы по настоящему изобретению имеют размер частицы от около 175 нм до около 250 нм.
[00207] В некоторых вариантах осуществления полиплексы по настоящему изобретению имеют дзета-потенциал от около 0 мВ до около 100 мВ. Например, полиплексы по настоящему изобретению могут иметь дзета-потенциал в диапазоне от около 0, около 1, около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17 , около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39, около 40, около 41, около 42, около 43, около 44, около 45, около 46, около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60, около 61, около 62, около 63, около 64, около 65, около 66, около 67, около 68, около 69, около 70, около 71, около 72, около 73, около 74, около 75, около 76, около 77, около 78, около 78, около 79, около 80, около 81, около 82, около 83 , около 84, около 85, около 86, около 87, около 88, около 89, около 90, около 91, около 92, около 93, около 94, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99 до около 100 мВ. В некоторых вариантах осуществления дзета-потенциал составляет от около 30 мВ до около 34 мВ.
[00208] В некоторых вариантах осуществления полиплексы по настоящему изобретению имеют дзета-потенциал около 0, около 1, около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17 , около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39, около 40, около 41, около 42, около 43, около 44, около 45, около 46, около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60, около 61, около 62, около 63, около 64, около 65, около 66, около 67, около 68, около 69, около 70, около 71, около 72, около 73, около 74, около 75, около 76, около 77, около 78, около 78, около 79, около 80, около 81, около 82, около 83 , около 84, около 85, около 86, около 87, около 88, около 89, около 90, около 91, около 92, около 93, около 94, около 95, около 96, около 97, около 98, около 99 или около 100 мВ.
[00209] В некоторых вариантах осуществления компонент нуклеиновой кислоты полиплекса представляет собой плазмиду, наноплазмиду, нуклеиновую кислоту, миникольцо или систему редактирования гена. В некоторых вариантах осуществления компонент нуклеиновой кислоты полиплекса представляет собой плазмиду. В некоторых вариантах осуществления компонент нуклеиновой кислоты полиплекса представляет собой наноплазмиду. В некоторых вариантах осуществления наноплазмида содержит эукариотический трансген и бактериальный остов размером менее 0,5 т.п.н. В некоторых вариантах осуществления плазмида или наноплазмида представляют собой не имеющую маркера устойчивости к антибиотику плазмиду или не имеющую маркера устойчивости к антибиотику наноплазмиду. В некоторых вариантах осуществления плазмида или наноплазмида содержат маркер селекции сахарозы или маркер нонсенс-супрессора.
[00210] В некоторых вариантах осуществления компонент нуклеиновой кислоты полиплекса представляет собой систему редактирования генов. В некоторых вариантах осуществления такая система редактирования генов представляет собой (i) систему (Cas), ассоциированную с кластерными палиндромными повторами (CRISPR), разделенными регулярными промежутками; (ii) систему эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции (TALEN - англ., transcription activator-like effector nuclease); или (iii) систему нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN - англ., zinc finger nuclease).
[00211] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой РНКи-индуцирующую молекулу. РНКи-индуцирующая молекула может быть выбрана из группы, состоящей из малой интерферирующей РНК (миРНК), длинной двухцепочечной РНК (дцРНК), короткой шпилечной РНК (кшРНК) и микроРНК.
[00212] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит тканеспецифичный промотор.
[00213] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит ген, ассоциированный с генетическим нарушением или заболеванием. Такое генетическое нарушение или заболевание могут быть вызваны мутацией одного или большего количества генов, которая приводит к пониженной, отсутствующей или дисфункциональной экспрессии белка. Такой ген может быть выбран из группы, состоящей из COL7A1, LAMB3, ADA, SERPINA1, CFTR, HTT, NF1, PHA, HBS, FERMT1, KRT14, DSP, SPINK5 и FLG. В некоторых вариантах осуществления таким геном является COL7A1, а генетическим нарушением или заболеванием является какая-либо форма буллезного эпидермолиза. Буллезный эпидермолиз включает в себя дистрофический буллезный эпидермолиз (аутосомно-рецессивный), дистрофический буллезный эпидермолиз (локализованная форма), пруригинозный буллезный эпидермолиз, буллезный эпидермолиз (претибиальный), простой буллезный эпидермолиз (тип Доулинга - Меара), простой буллезный эпидермолиз (тип Кебнера), простой буллезный эпидермолиз (рецессивный 1), простой буллезный эпидермолиз (тип Вебера - Кокейна), буллезный эпидермолиз (летальный акантолитический). В некоторых вариантах осуществления такое генетическое нарушение или генетическое заболевание представляет собой дефицит аденозиндезаминазы (ADA), дефицит альфа-1-антитрипсина, муковисцидоз, болезнь Хантингтона, нейрофиброматоз типа 1, фенилкетонурию, серповидно-клеточную анемию, спорадический миозит с тельцами включения, мышечную дистрофию Дюшенна, синдром Киндлера, пограничный буллезный эпидермолиз, пигментную ретикулярную дерматопатию, синдром Негели - Франческетти - Ядассона, синдром Нетертона, обыкновенный ихтиоз, атопический дерматит, синдром Ушера, синдром Элерса - Данлоса, гомозиготную семейную гиперхолестеринемию (HoFH) или болезнь Крона.
[00214] В некоторых вариантах осуществления последовательность гена оптимизирована для максимальной экспрессии белка при доставке полиплекса в клетку.
Фармацевтические композиции
[00215] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество одного или большего количества полиплексов в соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
[00216] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество одного или большего количества полиплексов, описанных в настоящем документе, в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем. В некоторых вариантах осуществления такой фармацевтически приемлемый наполнитель выбран из группы, состоящей из одного или большего количества объемообразующих агентов, буферных агентов, агентов, регулирующих тоничность, и криопротекторов. В некоторых вариантах осуществления такой объемообразующий агент выбран из группы, состоящей из гидроксиэтилового крахмала, трегалозы, маннита, лактозы и глицина. В некоторых вариантах осуществления такой буферный агент выбран из группы, состоящей из фосфатного буфера, трис-HCl буфера, цитратного буфера и гистидина. В некоторых вариантах осуществления такой агент, регулирующий тоничность, выбран из группы, состоящей из маннита, сахарозы, глицина, глицерина и хлорида натрия.
[00217] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество одного или большего количества полиплексов, описанных в настоящем документе, в комбинации с криопротектором. В некоторых вариантах осуществления такой криопротектор выбран из группы, состоящей из глюкозы, сахарозы, трегалозы, лактозы, маннита, сорбита, аэросила (коллоидного диоксида кремния), мальтозы, поливинилпирролидона, фруктозы, декстрана, глицерина, поливинилового спирта, глицина, гидроксипропил-β-циклодекстрина и желатина. В определенных вариантах осуществления такой криопротектор выбран из группы, состоящей из трегалозы, сахарозы, глюкозы и маннита. В некоторых вариантах осуществления такой криопротектор представляет собой сахарозу.
[00218] В некоторых вариантах осуществления такой фармацевтически приемлемый носитель пригоден для перорального, парентерального, ингаляционного, местного, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутриглазного или внутрикожного введения. В некоторых вариантах осуществления такая фармацевтическая композиция составлена в виде лосьона, выбранного из группы, состоящей из неводного лосьона, лосьона типа «вода в масле» и лосьона типа «масло в воде». В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию лиофилизируют для использования в будущем. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция является замороженной в водном растворе.
[00219] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция является лиофилом. В некоторых вариантах осуществления такой лиофил содержит эффективное количество одного или большего количества полиплексов, описанных в настоящем документе, в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем. В определенных вариантах осуществления такой фармацевтически приемлемый наполнитель содержит криопротектор. В определенных вариантах осуществления такой криопротектор выбран из группы, состоящей из трегалозы, сахарозы, глюкозы и маннита. В некоторых вариантах осуществления такой криопротектор представляет собой сахарозу.
[00220] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает способы изготовления фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество одного или большего количества полиплексов, описанных в настоящем документе, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых вариантах осуществления такой способ включает объединение одного или большего количества полиплексов, описанных в настоящем документе, в подходящем растворителе. В некоторых вариантах осуществления такой подходящий растворитель выбран из группы, состоящей из воды, диметилсульфоксида и их смесей. В определенных вариантах осуществления такой подходящий растворитель содержит воду.
[00221] В некоторых вариантах осуществления такой способ включает:
(a) объединение одного или большего количества полиплексов, описанных в настоящем документе, с подходящим растворителем;
(b) добавление одного или большего количества фармацевтически приемлемых наполнителей к смеси стадии (а) и
(c) лиофилизацию смеси стадии (b) для получения лиофила.
[00222] В некоторых вариантах осуществления такой один или большее количество фармацевтически приемлемых наполнителей стадии (b) содержит криопротектор. В определенных вариантах осуществления концентрация криопротекторов составляет от около 1% до около 20%, включая около 2%, около 3%, около 4%, около 5%, около 6%, около 7%, около 8%, около 9%, около 10%, около 11%, около 12%, около 13%, около 14%, около 15%, около 16%, около 17%, около 18% и около 19%, включая все диапазоны между ними, от массы смеси стадии (b). В определенных вариантах осуществления концентрация криопротекторов составляет около 1%, около 2%, около 3%, около 4%, около 5%, около 6%, около 7%, около 8%, около 9%, около 10%, около 11%, около 12%, около 13%, около 14%, около 15%, около 16%, около 17%, около 18%, около 19%, или около 20% от массы смеси стадии (b). В конкретных вариантах осуществления концентрация криопротекторов составляет около 1% от массы смеси стадии (b). В конкретных вариантах осуществления концентрация криопротекторов составляет около 3% от массы смеси стадии (b). В конкретных вариантах осуществления концентрация криопротекторов составляет около 5% от массы смеси стадии (b).
[00223] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает фармацевтическую композицию, изготовленную в соответствии со способами, описанными в настоящем документе.
[00224] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает фармацевтическую композицию, изготовленную способом, включающим:
(a) объединение одного или большего количества полиплексов, описанных в настоящем документе, с подходящим растворителем;
(b) добавление одного или большего количества фармацевтически приемлемых наполнителей к смеси стадии (а) и
(c) лиофилизацию смеси стадии (b) для получения лиофила.
[00225] В некоторых вариантах осуществления такой один или большее количество фармацевтически приемлемых наполнителей стадии (b) содержит криопротектор. В определенных вариантах осуществления концентрация криопротекторов составляет от около 1% до около 20%, включая около 2%, около 3%, около 4%, около 5%, около 6%, около 7%, около 8%, около 9%, около 10%, около 11%, около 12%, около 13%, около 14% , около 15%, около 16%, около 17%, около 18% и около 19%, включая все диапазоны между ними, от массы смеси стадии (b). В определенных вариантах осуществления концентрация криопротекторов составляет около 1%, около 2%, около 3%, около 4%, около 5%, около 6%, около 7%, около 8%, около 9%, около 10%, около 11%, около 12%, около 13%, около 14%, около 15%, около 16%, около 17%, около 18%, около 19%, или около 20% от массы смеси стадии (b). В конкретных вариантах осуществления концентрация криопротекторов составляет около 1% от массы смеси стадии (b). В конкретных вариантах осуществления концентрация криопротекторов составляет около 3% от массы смеси стадии (b). В конкретных вариантах осуществления концентрация криопротекторов составляет около 5% от массы смеси стадии (b).
Способы трансфекции клетки
[00226] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает способ трансфекции клеток, включающий приведение одной или более клеток-мишеней в контакт с фармацевтической композицией согласно определенным вариантам осуществления настоящего изобретения, в условиях, пригодных для трансфекции клетки-мишени полиплексом. В некоторых вариантах осуществления такой одной или большим количеством клеток-мишеней являются эукариотические клетки. В некоторых вариантах осуществления такой одной или большим количеством клеток-мишеней являются одна или большее количество Т-клеток, В-клеток, клеток крови, альвеолярных клеток, пневмоцитов, нейронов головного мозга, нейронов кожи, эпителиальных клеток, кератиноцитов, iPS-клеток, фибробластов и клеток потовых желез.
Способы лечения
[00227] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает способ лечения заболевания у нуждающегося в этом пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции согласно определенным вариантам осуществления настоящего изобретения, чтобы одна или большее количество клеток пациента были трансфицированы компонентом нуклеиновой кислоты полиплекса.
[00228] В некоторых вариантах осуществления данное изобретение предлагает способ лечения заболевания у нуждающегося в этом пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции согласно определенным вариантам осуществления настоящего изобретения, в котором введение такой композиции исправляет дефектную трансляцию гена-мишени у субъекта.
[00229] В некоторых вариантах осуществления такой ген-мишень выбран из группы, состоящей из COL7A1, LAMB3, ADA, SERPINA1, CFTR, HTT, NF1, PHA, HBS, FERMT1, KRT14, DSP, SPINK5 и FLG. В некоторых вариантах осуществления таким геном является COL7A1, а генетическим нарушением или заболеванием является какая-либо форма буллезного эпидермолиза. Буллезный эпидермолиз включает в себя дистрофический буллезный эпидермолиз (аутосомно-рецессивный), дистрофический буллезный эпидермолиз (локализованная форма), пруригинозный буллезный эпидермолиз, буллезный эпидермолиз (претибиальный), простой буллезный эпидермолиз (тип Доулинга - Меара), простой буллезный эпидермолиз (тип Кебнера), простой буллезный эпидермолиз (рецессивный 1), простой буллезный эпидермолиз (тип Вебера - Кокейна), буллезный эпидермолиз (летальный акантолитический). В некоторых вариантах осуществления такое генетическое нарушение или генетическое заболевание представляет собой дефицит аденозиндезаминазы (ADA), дефицит альфа-1-антитрипсина, муковисцидоз, болезнь Хантингтона, нейрофиброматоз типа 1, фенилкетонурию, серповидно-клеточную анемию, спорадический миозит с тельцами включения, мышечную дистрофию Дюшенна, синдром Киндлера, пограничный буллезный эпидермолиз, пигментную ретикулярную дерматопатию, синдром Негели - Франческетти - Ядассона, синдром Нетертона, обыкновенный ихтиоз, атопический дерматит, синдром Ушера, синдром Элерса - Данлоса, гомозиготную семейную гиперхолестеринемию (HoFH) или болезнь Крона.
Примеры
[00230] Далее приведены примеры, иллюстрирующие настоящее изобретение, и не следует рассматривать их, как ограничивающие его объем. В этих примерах все части и процентные доли являются массовыми, если не указано иное. Сокращения в примерах разъяснены ниже.
Пример 1: LBPAE, изготовленный путем объединения линейного олигомера
[00231] Доставка гена фибробластов еще не продемонстрировала той эффективности, которая требуется для терапевтического применения. Как описано в настоящем документе, для преодоления этого ограничения за счет новой стратегии объединения линейных олигомеров был получен новый многофункциональный материал для доставки генов с помощью LBPAE согласно определенным вариантам осуществления настоящего изобретения. Такой LBPAE согласно определенным вариантам осуществления настоящего изобретения обеспечивает превосходную эффективность трансфекции и сниженную цитотоксичность в сложных для трансфекции фибробластах HPDF и широко используемых 3T3, по существу превосходя имеющиеся в коммерческом доступе реагенты разветвленный PEI и SuperFect. Высокие показатели LC50 полиплексов LBPAE демонстрируют их положительную биосовместимость при трансфекции фибробластов. Исследования механизма показывают, что LBPAE, снабженный адекватными количествами первичных, вторичных и третичных аминов, способен конденсировать ДНК до наноразмерных частиц с однородной сферической морфологией, облегчая клеточное поглощение и опосредуя сильную буферную емкость для обеспечения эффективного эндосомального высвобождения. Гидролиз сложноэфирных связей в LBPAE облегчает высвобождение ДНК и значительно повышает биосовместимость, что позволяет гибко конструировать и корректировать массовые соотношения полимер/ДНК. Наряду с высокой эффективностью LBPAE в доставке репортерного гена, LBPAE способен эффективно доставлять ген миникольца COL7A1 в HPDF и значительно повышать экспрессию C7, что имеет решающее значение для обеспечения целостности кожи. Эти результаты показывают LBPAE как высокоэффективный невирусный вектор для доставки генов в фибробласты, подчеркивая его огромный потенциал в сфере лечения генодерматоза и восстановительных лекарственных средств.
[00232] Последовательный рост и разветвление линейного олигомера придает полученному LBPAE более равномерное распределение линейных сегментов и элементов разветвления. Удивительно, но в трудно поддающихся трансфекции HPDF и обычно используемом фибробласте эмбриона мыши (3T3) недавно разработанный LBPAE демонстрирует устойчивую способность к трансфекции генов, экспрессия G-люциферазы (Gluc) намного, до трех порядков, превосходит коммерческие реагенты PEI и SuperFect для трансфекции генов, при этом была достигнута почти 100% экспрессия зеленого флуоресцентного белка (GFP) без индукции явной цитотоксичности. Чтобы расшифровать возможные механизмы, лежащие в основе сверхрезультативной способности LBPAE к трансфекции генов в фибробластах, было исследовано множество внеклеточных и внутриклеточных барьеров, связанных с процессом трансфекции генов. Результаты показывают, что LBPAE демонстрирует значительную аффинность связывания ДНК и способен конденсировать ДНК для формирования наноразмерных полиплексов с почти 100% эффективностью клеточного поглощения. Значительная протонная буферная емкость наряду с биоразлагаемостью LBPAE также будет способствовать выходу полиплекса LBPAE/ДНК из эндо/лизосом и высвобождению ДНК в цитоплазму. Кроме того, LBPAE использовался для доставки в HPDF миникольцевой плазмиды, кодирующей ген COL7A1 (MCC7), при этом была обнаружено значительное повышение экспрессии C7, что показывает большие перспективы LBPAE для лечения генодерматоза с дефицитом C7, такого как тяжелое и изнурительное генетическое нарушение кожи - рецессивный дистрофический буллезный эпидермолиз (РДБЭ).
[00233] В этом примере описывается стратегия объединения линейных олигомеров для синтеза LBPAE. Как показано на Фиг. 8, эта стратегия предусматривает два последовательных стадии: образование линейного олигомера и разветвление. На первой стадии амин типа A2 вступает в реакцию с диакрилатом типа C2 для формирования базового олигомера с концевыми группами акрилата, который дополнительно эндкэпирован вторым амином. После очистки, обеспечивающей удаление не вступивших в реакцию мономеров и избыточного эндкэпирующего агента, образуется линейный олигомер А2-С2. На втором стадии вводят триакрилат типа B3 для объединения линейного олигомера A2-C2 и получения на выходе LBPAE. LBPAE обладают двойным преимуществом: 1) длина линейных сегментов в полученных LBPAE может быть заранее определена и, соответственно, легко может быть адаптирована; 2) Элементы разветвления в LBPAE будут более равномерно распределены между линейными сегментами.
[00234] Для подтверждения этой гипотезы в качестве мономеров типов A2, B3, C2 и эндкэпирующего агента для синтеза LBPAE были использованы, соответственно, 5-амино-1-пентанол (AP), триметилолпропантриакрилат (TMPTA), 1,4-бутандиолдиакрилат (BDA) и 1,11-диамино-3,6,9-триоксаундекан (DATOU), которые, как было продемонстрировано, являются эффективными мономерами в синтезе PAE для трансфекции генов. AP и BDA со стехиометрическим соотношением 1.2:1 вводили в реакцию в диметилсульфоксиде (DMSO) при 90°C, а средневзвешенную молекулярную массу (Mw) контролировали путем гель-проникающей хроматографии (ГПХ). Через 24 часа, когда Mw реакционной смеси приближалось к 3000 Да, реакцию останавливали путем охлаждения до комнатной температуры и разбавляли смесь DMSO, после чего добавляли избыточное количество DATOU для эндкэпирования базовых олигомеров с концевыми группами акрилата в течение 48 часов при температуре 25 °C. После удаления мономеров, не вступивших в реакцию, и эндкэпирующего агента вместе с олигомерами с Mw < 3000 Да путем диализа в ацетоне, был получен линейный олигомер A2-C2 с Mw около 3500 Да и индексом полидисперсности (PDI) 1,69 (Фиг. 10). Для образования LBPAE, линейный олигомер A2-C2 и TMPTA растворяли в DMSO (молярное соотношение A2-C2 : TMPTA составляло 3 : 1) и вводили в реакцию при 90 °C. Когда Mw составила около 10 кДа, реакцию остановили и добавили избыточное количество DATOU для поглощения всех не вступивших в реакцию винильных групп. Затем полимер осаждали в диэтиловом эфире и сушили в вакуумной печи для получения конечного продукта LBPAE. Измерение с помощью ГПХ показывает, что LBPAE имеет Mw 9,4 кДа с PDI 2,5 (Фиг. 19). Значение 0,36 параметра альфа графика Марка - Хаувинка (MH) подтверждает его сильноразветвленную структуру (Фиг. 10). Химический состав LBPAE подтвержден с помощью 1H ЯМР (Фиг. 11).
Пример 2: LBPAE обеспечивает устойчивую эффективность трансфекции генов и превосходную жизнеспособность клеток в фибробластах
[00235] Жизнеспособный вектор доставки генов может не только обеспечивать высокую эффективность трансфекции генов, но также индуцирует минимальную цитотоксичность. Тем не менее, на практике улучшение эффективности трансфекции генного вектора обычно происходит за счет его биосовместимости, или наоборот. Для оценки способности синтезированного LBPAE к трансфекции генов и определения наиболее оптимальных параметров для трансфекции фибробластов, сначала выполнили оценку ряда полиплексов LBPAE/ДНК с различными массовыми соотношениями при трансфекции HPDF и 3T3. В качестве репортерного гена использовали ДНК Gluc, а эффективность трансфекции гена количественно определяли путем измерения активности Gluc после трансфекции. Для измерения цитотоксичности и токсикологического профиля фибробластов после трансфекции использовали анализы Alamarblue и оценки летальной концентрации 50 (LC50). Затем специфическая активность трансфекции LBPAE была дополнительно подтверждена с помощью проточной цитометрии с использованием ДНК GFP в качестве репортерного гена.
[00236] Экспрессия Gluc и жизнеспособность клеток фибробластов после трансфекции с помощью LBPAE
[00237] Для вектора доставки генов на основе катионного полимера массовое соотношение полимер/ДНК (масс./масс.) является удобным параметром для определения как эффективности трансфекции, так и цитотоксичности [5,11], поэтому сначала мы систематически оптимизировали массовое соотношение. Учитывая, что первичные клетки (например, HPDF) обычно являются ломкими относительно катионных полимеров, массовое соотношение LBPAE/ДНК, используемое для трансфекции HPDF, постепенно было увеличено от 10:1 до 50:1. Чтобы установить надежный контрольный показатель для сравнения, массовые соотношения, используемые для двух коммерческих дендритных реагентов трансфекции генов PEI и SuperFect, также были оптимизированы в соответствии с протоколами производителей и предыдущими публикациями. [6,13] На Фиг. 1a показаны активность Gluc и жизнеспособность клеток HPDF после трансфекции. Четко показано, что оптимальные массовые соотношения для трансфекции генов с помощью PEI и SuperFect составляют 1:1 и 3:1, соответственно. Дальнейшее увеличение массового соотношения не только явно снижает активность Gluc, но также существенно повышает цитотоксичность. Например, при сравнении с аналогичными показателями массового соотношения 3:1, активность Gluc HPDF после трансфекции полиплексами SuperFect/ДНК при массовом соотношении 9:1 была ниже в 3,4 раза, а жизнеспособность клеток была снижена от более 89% до менее 44%. Резко отличаясь, в диапазоне тестируемых массовых соотношений, даже при самом низком массовом соотношении 10:1, экспрессия Gluc HPDF после трансфекции полиплексами LBPAE/ДНК все еще более выражена, чем экспрессия, опосредованная полиплексами PEI/ДНК и полиплексами SuperFect/ДНК при их оптимальном массовом соотношении. В частности, активность Gluc HPDF, трансфицированного полиплексами LBPAE/ДНК при массовом соотношении 40:1, до 103 раз выше, чем эта активность, опосредованная полиплексами PEI/ДНК. Важно отметить, что LBPAE не индуцирует очевидную цитотоксичность. Даже при самом высоком массовом соотношении 50:1 показатель жизнеспособности клеток сохранялся на уровне более 95%. В 3T3 полиплексы PEI/ДНК демонстрируют тенденцию эффективности трансфекции генов и цитотоксичности, аналогичную этим показателям для HPDF. Хотя при массовом соотношении 6:1 и 9:1 полиплексы SuperFect/ДНК демонстрируют более высокую эффективность трансфекции генов, жизнеспособность клеток сохраняется только на уровне 62% и 49% (Фиг. 1b). И вновь, во всех протестированных массовых соотношениях полиплексы LBPAE/ДНК демонстрируют как сильную способность к трансфекции генов, так и высокую жизнеспособность клеток. Активность Gluc 3T3 после трансфекции полиплексами LBPAE/ДНК на порядки превосходит эту же активность, опосредованную полиплексами PEI/ДНК и SuperFect/ДНК при их оптимальном массовом соотношении. Оказалось неожиданностью, что при массовом соотношении 70:1 полиплексы LBPAE/ДНК опосредовали активность Gluc, повышенную до 3292 раз по сравнению с полиплексами PEI/ДНК, в то время как жизнеспособность клеток оставалась на уровне более 90%. Следует отметить, что в группах использовали одинаковое количество ДНК. Намного более высокие массовые соотношения, используемые для полиплексов LBPAE/ДНК, означают, что было использовано значительно больше LBPAE, чем PEI или SuperFect. Это дополнительно демонстрирует превосходную биосовместимость LBPAE.
[00238] Токсикологический профиль LBPAE
[00239] Хотя было разработано и исследовано более 2500 кандидатов для трансфекции генов [28] , до сих пор не проводили никаких токсикологических исследований с каким-либо полимером PAE в фибробластах. Для дополнительного подтверждения биосовместимости LBPAE при трансфекции генов был определен токсикологический профиль LBPAE и рассчитано значение LC50 . С этой целью для трансфекции HPDF и 3T3 были использованы полиплексы LBPAE/ДНК с таким же массовым соотношением 40:1 и концентрацией полиплекса, повышенной от 355 мкг мл −1 до 755 мкг мл−1. Для сравнения использовали полиплексы SuperFect/ДНК, при этом концентрация была повышена от 15 мкг мл−1 to 55 мкг мл−1. Через 24 часа после трансфекции, клетки одновременно окрашивали зеленым флуоресцентным Calcein-AM (C-AM, для живых клеток) и красным флуоресцентным гомодимером этидия-1 (EthD-1, для мертвых клеток). На Фиг. 2a показаны репрезентативные флуоресцентные изображения необработанных клеток и клеток, обработанных полиплексами LBPAE/ДНК при концентрации 555 мкг мл−1 и полиплексами SuperFect/ДНК при концентрации 35 мкг мл−1. Можно увидеть, что хотя обработка полиплексами LBPAE/ДНК осуществлялась при концентрации, повышенной на порядок, HPDF и 3T3 продемонстрировали жизнеспособность клеток, аналогичную той, которая имела место при обработке полиплексами SuperFect/ДНК. Жизнеспособность клеток в зависимости от концентрации полиплекса была определена с помощью анализа Alamarblue, результаты которого показаны на Фиг. 2b и Фиг. 2c, из которых рассчитали, что значения LC50 для полиплексов SuperFect/ДНК в HPDF и 3T3 составляют 35,2 мкг мл−1 и 39,5 мкг мл−1, соответственно. В противоположность, значения LC50 для полиплексов LBPAE/ДНК составили 538,4 мкг мл−1 и 552,3 мкг мл−1, что соответствует 14- и 13-кратному увеличению по сравнению с аналогичными показателями SuperFect/ДНК. SuperFect широко используется для трансфекции генов из-за своей выдающейся биосовместимости, [29,30] тогда как LBPAE, демонстрирующий гораздо более низкий эффект уничтожения клеток, обладает чрезвычайно высокой биосовместимостью, что имеет большое значение при трансфекции генов, особенно для клеток тех типов, которые трудно поддаются трансфекции, поскольку для повышения эффективности трансфекции можно использовать значительно увеличенные дозы полиплекса или множественные повторные трансфекции.
[00240] Количественная оценка экспрессии GFP с помощью проточной цитометрии
[00241] Для количественной оценки общего уровня экспрессии трансгена, опосредованного LBPAE, использовали ДНК Gluc, а для количественной оценки процентной доли трансфицированных клеток дополнительно использовали ДНК GFP. HPDF и 3T3 трансфицировали полиплексами LBPAE/ДНК в тех же массовых соотношениях, которые указаны выше. Как свидетельствуют флуоресцентные изображения, показанные на Фиг. 3a, при всех массовых соотношениях полиплексами LBPAE/ДНК было трансфицировано гораздо больше HPDF по сравнению с полиплексами PEI/ДНК и SuperFect/ДНК в их оптимальных массовых соотношениях. Измерения, выполненные способом проточной цитометрии, показывают, что процент GFP-положительного HPDF, достигаемый с помощью полиплексов PEI/ДНК и SuperFect/ДНК, составляет только 50% и 44%, соответственно. Напротив, полиплексы LBPAE/ДНК достигли гораздо более высокого уровня GFP-положительной популяции, что отражено значительным сдвигом популяций клеток, реагирующих на канал спектра GFP, в гистограмме распределений (Фиг. 3b). Самая низкая GFP-положительная популяция, опосредованная полиплексами LBPAE/ДНК, составляет 68% при массовом соотношении 10:1. Когда массовое соотношение превышает 40:1, более 93% HPDF являются GFP-положительными. Кроме того, медианная интенсивность флуоресценции (MFI) HPDF, трансфицированных полиплексами LBPAE/ДНК, до 140 раз выше, чем аналогичные показатели PEI/ДНК и SuperFect/ДНК (Фиг. 3c). В 3T3 процент GFP-положительных клеток, достигаемый полиплексами LBPAE/ДНК, увеличен с 35% при массовом соотношении 30:1 до более 91% при массовом соотношении 70:1, в отличие от показателей в 5% и 11%, достигаемых, соответственно, полиплексами PEI/ДНК и SuperFect/ДНК (Фиг. 3d и 3e). Кроме того, при массовом соотношении 70:1 показатель MFI у 3T3, опосредованный полиплексами LBPAE/ДНК, был в 272 и 230 раз выше по сравнению с аналогичными показателями PEI/ДНК и SuperFect/ДНК (Фиг. 3f). Эти результаты показывают, что LBPAE не только трансфицирует большее количество клеток, но также значительно способствует повышению уровня экспрессии белка в индивидуально трансфицированных клетках. Первичные фибробласты относятся к клеткам того типа, которые трудно поддаются трансфекции, и тот факт, что LBPAE может опосредовать более чем 90% эффективность трансфекции генов в HPDF, демонстрирует его сверхвысокую способность к трансфекции генов. Учитывая, что LBPAE подтвердил свою высокую биосовместимость в широком диапазоне массовых соотношений и превосходную способность к трансфекции генов, можно предположить, что LBPAE будет иметь широкое применение при трансфекции генов фибробластов.
Пример 3: Возможные механизмы LBPAE, обеспечивающие сверхвысокую эффективность трансфекции генов и превосходную биосовместимость
[00242] Чтобы расшифровать возможные механизмы, лежащие в основе высокой эффективности LBPAE при трансфекции фибробластов, был проведен ряд исследований, связанных с многочисленными внеклеточными и внутриклеточными барьерами для доставки генов, включая конденсацию ДНК и аффинность связывания, размер полиплекса, дзета-потенциал, морфологию, протонную буферную емкость, скорость разложения и высвобождения ДНК из полиплексов.
[00243] Конденсация ДНК и аффинность связывания LBPAE
[00244] Эффективная конденсация ДНК, которая способна не только защитить ДНК от разложения эндонуклеазой, но также способствует клеточному поглощению полиплекса, является предпосылкой для успешной трансфекции гена.[30] В катионных полимерах конденсация ДНК происходит, в основном, за счет электростатических взаимодействий. Существует множество аминов, которые способны частично или полностью присоединять протоны для образования положительных зарядов. Например, амины, которые могут частично или полностью присоединять протоны, представляют собой множественные концевые первичные амины, полученные из эндкэпирующего агента DATOU, или множественные третичные амины остова, полученные из AP. Способность LBPAE к конденсации ДНК определяли путем электрофореза в агарозном геле. Как показано на Фиг. 4a, при всех массовых соотношениях полосы сдвига ДНК не наблюдались, что указывает на то, что отрицательно заряженная ДНК эффективно экранируется положительно заряженным LBPAE и, таким образом, удерживается в лунках с агарозой без миграции. Оба коммерческих реагента для трансфекции генов - PEI и SuperFect, демонстрируют высокую способность к конденсации ДНК, особенно это касается SuperFect, который конденсирует ДНК настолько плотно, что красителю, окрашивающему ДНК, затруднен доступ к ДНК, и, таким образом, полоса ДНК является более светлой. Аффинность связывания между ДНК и LBPAE получила дополнительную количественную оценку с помощью анализа PicoGreen. Как показано на Фиг. 4b, LBPAE проявляет сильную аффинность связывания ДНК при всех массовых соотношениях. В целом, аффинность связывания ДНК увеличивается вместе с массовым соотношением, например, от 86% при массовом соотношении 10:1 до 96% при массовом соотношении 70:1, демонстрируя, что большее количество LBPAE приводит к более сильному электростатическому взаимодействию между LBPAE и ДНК. Для сравнения, как PEI, так и SuperFect демонстрируют еще более сильную аффинность связывания ДНК, которая составляет почти 100%, при этом аффинность связывания ДНК у LBPAE, PEI и SuperFect очень хорошо коррелирует с их способностью к конденсации ДНК. Однако следует отметить, что умеренная аффинность связывания ДНК более благоприятна для трансфекции генов, поскольку чрезмерно сильное взаимодействие может нарушить высвобождение ДНК из полиплексов.[31,32]
[00245] Размер полиплекса LBPAE/ДНК, дзета-потенциал и морфология
[00246] Наномасштабный размер и положительный поверхностный заряд могут способствовать клеточному поглощению частиц посредством пути эндоцитоза. [33,34] Как показано на Фиг. 4c, в физиологическом растворе при всех протестированных массовых соотношениях, все средние размеры полиплексов LBPAE/ДНК, измеренные с помощью динамического рассеяния света (ДРС), составили менее 250 нм. В диапазоне массовых соотношений от 10:1 до 60:1 полиплексы имеют размер частиц между 228 нм и 188 нм. Однако, при дальнейшем увеличении массового соотношения до 70:1 размер полиплекса уменьшается до 97 нм. Соответственно, все полиплексы обладают положительным дзета-потенциалом. При самом низком массовом соотношении 10:1 полиплексы LBPAE/ДНК имеют очень низкий дзета-потенциал в 6 мВ. Когда массовое соотношение превышает 10:1, дзета-потенциал значительно увеличивается до более 30 мВ, при этом максимальное значение в 34 мВ достигается при массовом соотношении 40:1. При тех же условиях тестирования полиплексы SuperFect/ДНК имеют очень маленький размер - около 92 нм и высокий дзета-потенциал около 37 мВ. Эти наблюдения согласуются со способностью полимеров к конденсации ДНК и аффинностью связывания. Напротив, несмотря на высокие способность к конденсации ДНК и аффинность связывания, полиплексы PEI/ДНК имеют существенно больший размер, который составляет более 500 нм. Далее для наблюдения за размером и морфологией полиплекса использовали просвечивающую электронную микроскопию (ПЭМ). Как показано на Фиг. 4d, все полиплексы LBPAE/ДНК и SuperFect/ДНК проявляют однородную сферическую морфологию и имеют размеры от 60 до 250 нм, аналогично тем, которые измерены с помощью ДРС. Важно отметить, что отсутствует явная агрегация полиплексов, что свидетельствует об их высокой стабильности. Напротив, полиплексы PEI/ДНК имеют эллипсоидную морфологию, а их размер намного больше, чем у других полиплексов. Широко признано, что полиплексы размером менее 250 нм и умеренным положительным поверхностным зарядом более благоприятны для клеточного поглощения, избегая при этом индукции потенциальной цитотоксичности, вызванной избыточными положительными зарядами.[7,9] Упомянутые выше исследования трансфекции генов показали, что наилучшими массовыми соотношениями для трансфекции HPDF и 3T3 являются 40:1 и 70:1, соответственно. Это указывает на то, что наиболее благоприятный размер полиплекса и поверхностный заряд для эффективной трансфекции генов фибробласта могут существенно различаться в соответствии с типом клеток. В нашем случае, полиплексы LBPAE/ДНК всегда имеют средний размер <250 нм и умеренный дзета-потенциал в широком диапазоне массовых соотношений, что демонстрирует их широкую применимость для трансфекции клеток различных типов и достижения высокой эффективности.
Пример 4: Клеточное поглощение полиплексов LBPAE/ДНК
[00247] Далее было исследовано клеточное поглощение полиплексов. Как показано на FIG. 5a, при той же плотности клеток через 4 часа после трансфекции все полиплексы демонстрируют высокую эффективность клеточного поглощения. Для сравнения, количество полиплексов LBPAE/ДНК, захваченных HPDF и 3T3, было гораздо большим, чем для полиплексов PEI/ДНК и SuperFect/ДНК, о чем свидетельствует гораздо более сильная красная флуоресценция, наблюдаемая у Cy3-меченной ДНК. Количественная оценка, выполненная способом проточной цитометрии, показывает, что эффективность клеточного поглощения HPDF полиплексов PEI/ ДНК и SuperFect/ДНК достигает 96,5% и 98,4% (Фиг. 5b). Даже в этом случае эффективность поглощения полиплексов LBPAE/ДНК все еще немного выше, и составляет почти 100% (99,3%). В 3T3 также наблюдалась аналогичная тенденция (Фиг. 5c). Кроме того, в HPDF нормализованный MFI полиплексов LBPAE/ДНК в 3,05 и 1,39 раза выше, чем аналогичные показатели у полиплексов PEI/ДНК и SuperFect/ДНК (Фиг. 5d). Для 3T3 это превосходство составило 1,98 и 1,68 раза, соответственно (Фиг. 5e). Все эти результаты показывают, что полиплексы PEI/ДНК имеют самую низкую эффективность клеточного поглощения, в то время как полиплексы LBPAE/ДНК значительно превосходят аналогичные показатели полиплексов PEI/ДНК и SuperFect/ДНК. В совокупности такие результаты поглощения очень хорошо коррелируют с упомянутыми выше размером полиплекса, дзета-потенциалом и эффективностью трансфекции генов различными полиплексами.
Пример 5: Измерение протонной буферной емкости
[00248] Полиплексы на основе катионных полимеров обычно захватываются клетками через путь эндоцитоза, а после интернализации они захватываются, главным образом, эндо/лизосомами. Если полиплексы не способны своевременно покинуть эндо/лизосомальные компартменты, то ДНК, конденсированная в полиплексах, будет разрушаться пищеварительными ферментами в кислотных компартментах. Следовательно, эндо/лизосомное ускользание - это еще одно серьезное препятствие, которое необходимо преодолеть для эффективной невирусной доставки генов. «Эффект протонной губки» является общепризнанным основным механизмом катионных полимеров, который облегчает выход полиплексов из эндо/лизосом. Учитывая механизм «эффекта протонной губки», катионные полимеры с высоким содержанием протонируемых вторичных и третичных аминов с показателями pKa, близкими к эндосомальному/лизосомному pH, более благоприятны для выхода полиплекса из эндо/лизосом, а PEI и SuperFect являются наиболее типичными их представителями.[29] Чтобы проверить протонную буферную емкость LBPAE, было выполнено кислотно-основное титрование. Как показано на Фиг. 6a, для данного количества полимеров, растворенных в растворе NaCl, неудивительно, что PEI демонстрирует самую сильную протонную буферную емкость с относительно более пологим наклоном характеристики кислотно-основного титрования между pH 7,4 и 5,1. Это связано с тем, что PEI имеет очень высокое содержание первичных, вторичных и третичных аминов, причем каждый третий атом в остове является атомом азота. После нормализации оказалось, что протонная буферная емкость PEI, SuperFect и LBPAE составляет 5,1 ммоль H+ g−1, 4,6 ммоль H+ g−1 и 1,6 ммоль H+ g−1, соответственно (Таблица 1). В действительности LBPAE демонстрирует более низкую протонную буферную емкость, чем у PEI и SuperFect. Однако из-за гораздо меньшей цитотоксичности, чтобы эффективно способствовать эндо/лизосомальному ускользанию полиплексов LBPAE/ДНК, массовое соотношение при практическом применении может быть значительно увеличено. Например, для генной трансфекции HPDF и 3T3 полиплексы LBPAE/ДНК использовали при массовом соотношении 40:1 и 70:1, соответственно. При таких условиях протонная буферная емкость всего используемого LBPAE в 12 и 21 раз выше, чем у PEI при массовом соотношении 1:1, в 5 и 8 раз выше, чем у SuperFect при массовом соотношении 3:1. Основываясь на гипотезе «эффекта протонной губки», высокая протонная буферная емкость LBPAE может вызвать повышение осмотического давления, что приведет к набуханию и разрыву эндо/лизосом и, таким образом, к своевременному и эффективному высвобождению полиплексов LBPAE/ДНК в цитоплазму.
Таблица 1. Буферная емкость LBPAE и коммерческих реагентов.
Пример 6: Оценка разложения LBPAE и высвобождения ДНК
[00249] Универсальный вектор доставки генов способен не только эффективно конденсировать ДНК и защищать ее от разложения ферментами, но также может высвобождать конденсированную ДНК из полиплексов после импорта в ядро. Для катионных полимеров был предложен ряд стратегий, активирующих разложение полимера в цитоплазме и, таким образом, облегчающих высвобождение ДНК и снижение кумулятивной цитотоксичности после трансфекции генов. Однако для эффективной трансфекции генов требуется умеренно длительный период полужизни генных векторов, поскольку слишком короткий период полужизни приведет к недостаточной защите ДНК и высвобождению незрелой ДНК, в то время как слишком длительный период полужизни приведет к затруднениям в диссоциации полиплексов и высвобождении ДНК. В остове PAE имеются несколько сложноэфирных связей. В физиологических условиях сложноэфирные связи могут быть расщеплены путем гидролиза с образованием биосовместимых низкомолекулярных β-аминокислот и диолов. Согласно полученной информации, в водной среде LPAE имеют период полужизни от 1,5 часов до более 6 часов, в зависимости от химического состава.[7] Для LBPAE согласно некоторым вариантам осуществления и примерам настоящего изобретения, после 2 часов инкубации при 37°C наблюдалось разложение на уровне 43%. После 6-часовой и 8-часовой инкубации разложение непрерывно повышалось до уровней 81% и 85%, соответственно (Фиг. 6b). Соответствующее высвобождение ДНК из полиплексов определяют с помощью анализа PicoGreen. Как показано на Фиг. 6c, при самом низком массовом соотношении 10:1 полиплексы LBPAE/ДНК имеют самую высокую скорость высвобождения ДНК - после 2 часов инкубации высвобождается более 60% ДНК. Для сравнения, при умеренном и высоком массовом соотношении 40:1 и 70:1 конденсированная ДНК высвобождалась из полиплексов более медленно, но с сопоставимой скоростью. Однако через 6 часов было высвобождено более 60% ДНК. Профиль высвобождения ДНК соответствует профилю разложения LBPAE, демонстрируя, что в физиологических условиях LBPAE способен спонтанно высвобождать конденсированную ДНК путем гидролиза, без необходимости каких-либо дополнительных внешних триггеров. Все показатели конденсации ДНК, аффинности связывания, размера полиплекса, дзета-потенциала, клеточного поглощения, разложения и высвобождения ДНК очень хорошо коррелируют с эффективностью трансфекции генов и биосовместимостью полиплексов LBPAE/ДНК, что выдвигает на первый план манипулирование составом, структурой и функциональностью LBPAE для достижения таких свойств полиплекса, которые будут благоприятными для высокоэффективной трансфекции генов в фибробластах.
Пример 7: LBPAE доставляет функциональный ген COL7A1 для управления экспрессией C7 в HPDF
[00250] Многофункциональные LBPAE согласно определенным вариантам осуществления и примерам настоящего изобретения способны доставлять ДНК Gluc и ДНК GFP для трансфекции HPDF и 3T3 со сверхвысокой эффективностью и превосходной биосовместимостью. Однако многие векторы для доставки генов показывают высокий уровень экспрессии репортерного гена, перенос этого успеха для получения экспрессии функционального белка является гораздо более сложной задачей. Следовательно, эффективность LBPAE дополнительно оценивали путем доставки функционального гена COL7A1 для активирования экспрессии C7 в HPDF. В настоящее время эффективного лечения РДБЭ не существует, кроме паллиативной помощи. Хотя и кератиноциты, и дермальные фибробласты способны продуцировать и секретировать C7,[35] последние, по сравнению с первыми, являются более устойчивыми в качестве типов клеток-мишеней в генной терапии генодерматоза.[21,36] Миникольцевые кассеты (MC - англ., minicircle) ДНК показали повышение экспрессии неинтегративного трансгена в 10-1000 раз и большую стабильность по сравнению с нормальными плазмидами, без риска иммуногенных ответов со стороны бактериального остова в стандартных плазмидах.[37,38] Учитывая, что ген COL7A1 является довольно большим, с транскриптом кДНК/мРНК размером около 9 т.п.н., для трансфекции HPDF использовали MCC7, кодирующую полноразмерную кДНК COL7A1 размером 8,9 т.п.н., с промотором цитомегаловируса. Как показано на Фиг. 12, MCC7 содержит кДНК COL7A1 размером 8,9 т.п.н. и остов размером 3 т.п.н., что на 2 т.п.н. меньше, чем родительская плазмида pcDNA3.1COL7A1. Следует отметить, что максимальный размер груза векторов ретровируса и аденоассоциированного вируса (AAV) обычно составляет менее 8 т.п.н.[39] , при этом размер и pcDNA3.1COL7A1, и MCC7 превышает емкость упаковки генов большинства вирусных векторов, поэтому эффективная трансфекция гена COL7A1 с помощью LBPAE будет иметь большое значение для генной терапии РДБЭ. Путем объединения LBPAE и миникольцевой ДНК, согласно настоящему документу, MCC7 доставляют для управления экспрессией C7 в HPDF в ожидании повышения его применимости при генной терапии РДБЭ. На Фиг. 7a показаны изображения HPDF с цитоиммунофлуоресцентным окрашиванием через четыре дня после трансфекции, выполненной с помощью полиплексов LBPAE/MCC7. Как и ожидалось, не наблюдалось никакой явной экспрессии C7 (красная флуоресценция) в необработанной группе и в группе, инкубированной только с вторичным антителом к C7. HPDF дикого типа и группа, обработанная SuperFect, проявляют умеренную флуоресценцию, что указывает на выработку C7. В противоположность этому, HPDF, трансфицированный полиплексами LBPAE/MCC7, показал самую сильную флуоресценцию, демонстрируя более высокую экспрессию рекомбинантного C7, полученную с помощью LBPAE. Далее для количественной оценки эффективности экспрессии C7 была использована проточная цитометрия. Согласно более ранним сообщениям,[40] HPDF дикого типа показал экспрессию C7 на уровне около 41%. После трансфекции полиплексами LBPAE/MCC7 эффективность экспрессии C7 была значительно увеличена до 74,4% по сравнению с 44,9%, достигнутыми с помощью полиплексов SuperFect/MCC7 (Фиг. 7b). Более того, полиплексами LBPAE/MCC7 было также реализовано 40% повышение MFI, в отличие от 10%, достигнутых соответствующими аналогами SuperFect/MCC7 (Фиг. 7c). Все эти результаты демонстрируют, что LBPAE способен не только эффективно доставлять MCC7 для увеличения общей популяции HPDF, экспрессирующих C7, но также повышать уровень C7 в отдельных HPDF. Кроме того, наше предварительное исследование показало, что в фибробластах РДБЭ (РДБЭФ) с нулевым C7 после трансфекции LBPAE/MCC7 эффективность экспрессии C7 восстанавливалась примерно до 40%. В настоящее время продолжаются дальнейшая оптимизация трансфекции и количественная оценка экспрессии C7 в РДБЭФ. Эти результаты показывают, что LBPAE обладает высокой нагрузочной способностью, чтобы доставлять большую кДНК в первичные клетки кожи. С помощью этого полимерного вектора могут быть дополнительно сконструированы первичные дермальные фибробласты для секретирования мощного клеточного C7, который играет ключевую роль в укреплении дермально-эпидермального перехода. Хотя невирусная генная терапия требует повторных применений для кожных заболеваний с генетической дисфункцией C7, принимая во внимание очевидные места ран и хорошую доступность для лекарственных средств, многократное местное введение намного безопаснее, чем системная доставка генов, поэтому LBPAE имеет большие перспективы для генной терапии фибробластов для восстановления или усиления экспрессии C7 и, таким образом, обращения патологического фенотипа РДБЭ.
Пример 8: Экспериментальный
[00251] Материалы: Триметилолпропан триакрилат (TMPTA), 5-амино-1-пентанол (AP), 1,11-диамино-3,6,9-триоксаундекан (DATOU), хлорид натрия (NaCl), гидроксид натрия (NaOH), разветвленный полиэтиленимин (PEI, Mw=25 кДа), бромид лития (LiBr), диметилсульфоксид (DMSO), диэтиловый эфир, дейтерированный хлороформ (CDCl3), раствор соляной кислоты (HCl), сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS), буфер трисацетат-EDTA (TAE), раствор трипсин-EDTA (0,25%), среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM), пенициллин-стрептомицин (P/S), агароза, параформальдегид (PFA), 0,1% Triton X-100, моноклональное антитело к коллагену VII, продуцируемое в сыворотке мышей и коз, были приобретены у компании Sigma-Aldrich. Ацетат натрия (3,0 М, Sigma-Aldrich) перед использованием разбавляли до 0,025 M. 1,4-бутандиолдиакрилат (BDA) был приобретен у компании VWR и использован в том виде, в каком был получен. Диметилформамид (DMF) был приобретен у Fisher Scientific. Фетальная бычья сыворотка (FBS), приобретенная у компании Gibco, перед использованием была отфильтрована через фильтр 0,2 мкм. Клетки HPDF и 3T3 были приобретены у Lonza и ATCC, соответственно. Для культивирования и субкультивирования HPDF у компании Lonza были приобретены базальная среда фибробластов, продукты FGM-2 SingleQuots, Clonetics Reagent Pack, содержащие забуференный солевой раствор HEPES, раствор трипсина-EDTA (0,25%) и раствор, нейтрализующий трипсин. Плазмида секретируемой клетками люциферазы Gaussia princeps (GLuc ДНК) и набор BioLuxTM для анализа активности люциферазы Gaussia были приобретены у компании New England Biolabs UK. Экспансию и очистку ДНК Gluc проводили с использованием набора Giga-Prep kit (Qiagen) согласно протоколам. Плазмида с зеленым флуоресцентным белком (ДНК GFP) была приобретена у компании Aldevron. Плазмида pcDNA3.1COL7A1 была любезно предоставлена доктором Эндрю Саутом из Университета Данди (Великобритания). MCC7 сконструировали путем встраивания последовательности COL7A1, происходящей из pcDNA3.1COL7A1, в кассету MN511A-1, предлагаемую компанией System Biosciences, при этом получение миникольцевой ДНК осуществлялось в соответствии с руководством от System Bioscience. Реагент SuperFect для трансфекции гена был приобретен у компании Qiagen. Набор LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity, вторичные козьи антимышиные антитела класса IgG (H+L) с высокой перекрестной адсорбцией - Alexa Fluor 568 и Alexa Fluor 647 были приобретены у компании Thermo Fisher Scientific. Набор для анализа Alamarblue, гель для окрашивания ДНК SYBR safe, буфер внутриклеточной фиксации и 10× биологический буфер пермеабилизации были приобретены у компании Invitrogen. Комплект для Cy3-мечения ДНК был приобретен у компании Mirus и использован в соответствии с протоколами. 4’,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и набор для анализа PicoGreen были приобретены у компании Life Technologies и использовались в соответствии с протоколами производителей. 1× фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко (PBS) был приобретен у компании Life Technologies. Среда для заливки с DAPI была приобретена у компании Abcam.
[00252] Синтез и характеристика LBPAE: LBPAE был синтезирован посредством стратегии объединения линейного олигомера. Сначала BDA и AP со стехиометрическим соотношением 1,2:1 были растворены в DMSO при 100 мг мл−1 , а затем вводили в реакцию при 90 °C. Гель-проникающий хроматограф модели Agilent 1260 Infinite, оснащенный тройным детектором ((рефрактометрический (RI) детектор, вискозиметрический (VS DP) детектор и двухугловой детектор рассеяния света (LS 15° и LS 90°)) использовали для отслеживания роста средневзвешенной молекулярной массы (Mw), среднечисловой молекулярной массы (Mn) и индекса полидисперсности (PDI). Для измерения способом ГПХ взяли 20 мкл реакционной смеси, развели ее в 1 мл DMF, а затем отфильтровали через фильтр 0,45 мкм. Для элюирования колонок ГПХ (Polar Gel-M, 7,5 × 300 мм, две в серии) использовали DMF с 0,1% LiBr с расходом 1 мл мин−1 при 60 °C. Для калибровки колонок ГПХ были использованы стандарты линейного полиметилметакрилата(PMMA). Когда Mw приближалась к 3000 Да, реакцию останавливали путем охлаждения до комнатной температуры и разбавляли DMSO, после чего добавляли избыточное количество эндкэпирующего агента DATOU и реакция продолжалась еще 48 часов для получения эндкэпированного DATOU линейного олигомера A2-C2, который затем в течение трех суток очищали путем диализа с применением ацетона, после чего высушивали в вакуумной печи для удаления растворителя. Далее линейный олигомер A2-C2 растворяли в DMSO и вводили в реакцию с разветвленным мономером TMPTA при 90 °C. Когда Mw составляла около 10 кДа, реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и добавляли избыточное количество DATOU для поглощения всех не вступивших в реакцию винильных групп в течение следующих 48 часов. Затем полимер очистили трехкратным осаждением с помощью диэтилового эфира, высушили вымораживанием в течение двух суток и поместили на хранение при −20°C для дальнейших исследований. Для измерения молекулярной массы (Mw), PDI и параметра альфа (α) графика Марка - Хаувинка (MH) конечного продукта, 10 мг LBPAE растворили в 2 мл DMF и провели измерение способом ГПХ, как упоминалось выше. Химический состав и чистоту LBPAE определяли с помощью 1H ЯМР при частоте 400 МГц с помощью спектрометра Varian Inova. Образец был представлен в частях на миллион (ч/млн) относительно растворителя CDCl3 (7,24 ч/млн) или внутреннего контроля (тетраметилсилан 0,00 ч/млн).
[00253] Определение альфа-параметра Марка - Хаувинка: определение альфа-параметров Марка - Хаувинка для полимеров проводилось на системе гель-проникающей хроматографии 1260 Infinite, оснащенной рефрактометрическим (RI) детектором, вискозиметрическим (VS DP) детектором и двухугловой детектор рассеяния света (LS 15° и LS 90°). При подготовке полимеров для анализа 10,0 мг образцов растворили в 2 мл DMF, а затем отфильтровали через фильтр 0,45 мкм. Колонки ГПХ (30 см PLgel Mixed-C, две в серии) элюировали DMF и 0,1% LiBr с расходом 1 мл/мин при 60° C. Колонки калибровали стандартами линейного полиметилметакрилата (PMMA). Данные ГПХ анализировали с использованием универсальной калибровки.
[00254] Получение полиплекса LBPAE/ДНК: Для получения полиплекса LBPAE сначала растворили в DMSO для получения исходного раствора 100 мг мл−1 . Согласно массовому соотношению (масс./масс.) LBPAE/ДНК, требуемое количество исходного раствора LBPAE и раствора ДНК были разбавлены буфером ацетата натрия (0,025 M, pH=5,2) до равного объема, соответственно. Затем раствор LBPAE добавляли к раствору ДНК, перемешивали на вихревой мешалке в течение 10 секунд, после чего его оставили отстояться в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить образование полиплекса.
[00255] Конденсация ДНК с помощью LBPAE: для определения способности LBPAE к конденсации ДНК использовали электрофорез в агарозном геле. Для приготовления каждого образца использовали 1 мкг ДНК, при этом полиплексы с рядом массовых соотношений получали, как описано выше. После этого 20 мкл раствора полиплекса загружали в лунки в агарозном геле (1% в буфере 1x TAE), содержащие 10 мкл геля-красителя ДНК SYBR safe, а для контроля использовали оголенную ДНК. Гель-электрофорез выполняли в буфере 1x TAE при 120 В в течение 40 минут, а снимки были получены с помощью Syngene G:BOX.
[00256] Аффинность связывания ДНК LBPAE: для количественной оценки аффинности связывания ДНК LBPAE был использован анализ PicoGreen. Для приготовления каждого образца использовали 0,25 мкг ДНК. Полиплексы с различными массовыми соотношениями готовили в 15 мкл буфера ацетата натрия, а затем смешивали с 15 мкл рабочего раствора PicoGreen и инкубировали в течение пяти минут. Далее добавили 220 мкл буфера 1x PBS для разбавления полиплексов в 96-луночном планшете черного цвета. Интенсивность флуоресценции (F) раствора полиплекса измерили с помощью считывающего устройства SpectraMax M3 для планшетов с длиной волны при возбуждении 490 нм и 535 нм при испускании в четырех повторностях. Аффинность связывания ДНК для LBPAE определяли по следующему уравнению:
(1)
[00257] Протонная буферная емкость LBPAE: Протонная буферная емкость LBPAE была определена путем кислотно-основного титрования. В качестве фонового контроля использовали 0,1 M раствор NaCl, а для положительного контроля использовали PEI и SuperFect. Для измерения значений pH использовали pH-метр Mettler Toledo S20. 10 мг LBPAE, 5 мг PEI или 0,8 мг SuperFect растворили в 20 мл 0,1 М раствора NaCl. Значение pH раствора довели до 3,0 с помощью 1,0 М раствора HCl, а затем титровали до 10,5 с помощью 0,1 М раствора NaOH. Протонная буферная емкость LBPAE (ммоль г-1) была рассчитана с использованием следующего уравнения:
[00258] 
(2)
[00259] Профиль разложения LBPAE: Для измерения профиля разложения LBPAE растворили в PBS при концентрации 10 мг мл−1 продолжали встряхивать при 180 об/мин при температуре 37 °C. В моменты времени 0, 2, 4, 6 и 8 часов извлекали 1 мл раствора и немедленно его замораживали. После сублимационной сушки образец растворили в 1 мл DMF. Mw образца измеряли способом ГПХ, как упоминалось выше, в трех повторностях. Процентный показатель разложения LBPAE был определен следующим способом:
(3)
[00260] Определение размера и дзета-потенциала полиплекса: Размеры и дзета-потенциалы полиплексов измеряли с использованием прибора Malvern Instruments Zetasizer (Nano-ZS90, угол рассеяния 173°, лазер 633 нм). Для приготовления каждого образца использовали 4 мкг ДНК, при этом были изготовлены полиплексы с рядом массовых соотношений, как описано выше, которые затем разбавляли 800 мкл деионизированной воды и переносили в ячейки или кюветы Zetasizer. Измерение размера и дзета-потенциала полиплекса осуществляли при температуре 25°C в четырех повторностях.
[00261] Характеристика морфологии полиплекса с помощью просвечивающей электронной микроскопии: (ПЭМ): Морфологии полиплексов LBPAE/ДНК, PEI/ДНК и SuperFect/ДНК были охарактеризованы с помощью ПЭМ. 80 мкл раствора полиплекса, содержащего 2 мкг ДНК, приготовили, как описаны выше, дважды промыли деионизированной водой для удаления солей, а затем повторно суспендировали в 10 мкл деионизированной воды. 2,5 мкл ресуспендированного раствора полиплекса залили на несущую пленку Formvar на медной сетке 200 меш и немедленно сублимировали. Изображения ПЭМ были получены с помощью прибора FEI Tecnai 120 TEM при 120 кВ в исследовательском центре UCD Conway Imaging Core Centre.
[00262] Высвобождение ДНК из полиплексов: Высвобождение ДНК из полиплексов можно определить путем измерения снижения аффинности связывания LBPAE с использованием анализа PicoGreen. Полиплексы LBPAE/ДНК с массовыми соотношениями 10:1, 40:1 и 70:1 получали, как описано выше, и продолжали встряхивать при 180 об/мин и температуре 37 °C. В моменты времени 0, 2, 4, 6 и 8 часов отбирали 100 мкл раствора полиплекса и сразу же измеряли аффинность связывания ДНК, как и ранее, в четырех повторностях. Скорость высвобождения ДНК из полиплексов определяли следующим образом:
[00263] 
(4)
[00264] Клеточная культура: HPDF культивировали в базальной среде фибробластов с добавлением FGM-2 SingleQuots, содержащей 2% FBS. 3T3 культивировали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина (P/S). Оба типа клеток культивировали при температуре 37 °C, 5% CO2 во влажном инкубаторе и в стандартных условиях культивирования клеток.
[00265] Способность LBPAE к трансфекции генов, определяемая количественно по экспрессии Gluc: Способность LBPAE к трансфекции генов в HPDF и 3T3 сначала оценивали с помощью экспрессии Gluc с использованием ДНК Gluc в качестве репортерного гена. Клетки высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 1 × 104 клеток на лунку для 3T3 и 2 × 104 клеток на лунку для HPDF в 100 мкл среды и инкубировали в течение одного дня перед трансфекцией. Коммерческие реагенты PEI и SuperFect для трансфекции генов были оптимизированы в соответствии с протоколами производителей. С этой целью для каждой лунки использовали 0,5 мкг ДНК, при этом массовое соотношение для полиплексов PEI/ДНК изменяли от 1:1, 2:1 до 3:1, а массовое соотношение для полиплексов SuperFect/ДНК изменяли от 3:1, 6:1 до 9:1. Для трансфекции гена с помощью LBPAE для каждой лунки использовали то же количество в 0,5 мкг ДНК Gluc, полиплексы LBPAE/ДНК с разными массовыми соотношениями подготовили в 20 мкл буферного раствора ацетата натрия, как упоминалось выше, а затем разбавили 80 мкл среды для культивирования клеток. Среду для культивирования клеток из 96-луночных планшетов удалили и добавили 100 мкл среды, содержащей полиплексы. Через 4 часа среду, содержащую полиплексы, в планшетах заменили на 100 мкл свежей среды, и клетки инкубировали еще 44 часа. Активность Gluc в клетках после трансфекции измеряли с помощью анализа Gluc согласно стандартным протоколам в четырех повторностях. Вкратце, из 96-луночных планшетов отбирали 20 мкл супернатанта и добавляли 50 мкл раствора для анализа Gluc. Интенсивность люминесценции измеряли с использованием устройства SpectraMax M3 для считывания планшетов, а активность Gluc откладывали непосредственно на графике в относительных световых единицах (RLU).
[00266] Способность LBPAE к трансфекции генов, определяемая количественно по экспрессии GFP: Способность LBPAE к трансфекции генов дополнительно оценивали по экспрессии GFP. Клетки HPDF и 3T3 высевали в 24-луночные планшеты с плотностью 5 × 104 клеток на лунку в 500 мкл среды и инкубировали в течение одного дня перед трансфекцией. Для каждой лунки использовали 2 мкг ДНК GFP, а полиплексы с разными массовыми соотношениями готовили в 100 мкл буферного раствора ацетата натрия, после чего смешивали с 400 мкл среды для культивирования клеток. Среду в клетках удалили и добавили среду, содержащую полиплексы. Через 4 часа среду, содержащую полиплексы, заменили на 500 мкл свежей среды, и продолжили инкубирование клеток еще 44 часа. После этого клетки промыли HBSS и получили изображения с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus IX81). Для количественной оценки экспрессии GFP с помощью проточной цитометрии трансфицированные клетки расщепляли трипсином EDTA и дважды промывали HBSS, а затем повторно суспендировали в PBS с 2% содержанием FBS. Измерения способом проточной цитометрии проводили в системе Accuri C6 в трех повторностях, для каждого образца подсчитывали не менее 10 000 клеток. Медианная интенсивность флуоресценции (MFI) клеток была определена количественно с помощью программного обеспечения Flowjo. В качестве положительного контроля использовали клетки, трансфицированные PEI и SuperFect, а для отрицательного контроля служили необработанные клетки.
[00267] Жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа Alamarblue: Жизнеспособность клеток HPDF и 3T3 после трансфекции измеряли с помощью анализа Alamarblue. Для этого через 48 часов после трансфекции удаляли клеточные супернатанты, а клетки дважды промывали HBSS. Затем в HBSS добавляли 10% раствора Almarblue и инкубировали клетки еще 1~3 часа. После этого раствор Alamarblue в лунках переносили в 96-луночный планшет с плоским дном и измеряли интенсивность флуоресценции при 590 нм с использованием считывающего устройства SpectraMax M3 для планшетов в четырех повторностях. Клетки без какой-либо обработки полиплексом использовали в качестве положительного контроля, а интенсивность флуоресценции была нормализована как 100% жизнеспособность клеток.
[00268] Токсикологический профиль LBPAE: Токсикологический профиль LBPAE определяли путем оценок летальной концентрации 50 (LC50). Для окрашивания живых и мертвых клеток был использован набор LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity. Клетки высевали в 96-луночные планшеты с плотностю 2 × 104 клеток на лунку для HPDF и 1 × 104 клеток на лунку для 3T3 в 100 мкл среды. На следующий день были приготовлены полиплексы LBPAE/ДНК и полиплексы SuperFect/ДНК, при этом для трансфекции клеток, как было описано выше, использовали пять различных доз полиплексов. Через 24 часа после трансфекции среду для культивирования клеток удаляли, и заменяли ее HBSS, содержащим кальцеин-AM (C-AM) (1: 5000) и гомодимер этидия-1 (EthD-1) (1: 500), затем клетки инкубировали в течение еще 20 минут. После этого клетки промыли HBSS и получили изображения с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus IX81). Для расчета LC50 использовали количественную оценку жизнеспособности клеток, полученную с помощью анализа Alamarblue, в четырех повторностях.
[00269] Клеточное поглощение полиплекса: Для исследований клеточного поглощения полиплекса ДНК Gluc была помечена набором для маркировки Cy3 (красный флуоресцентный краситель) в соответствии с рекомендованным протоколом. Фибробласты высевали в 24-луночный планшет с плотностью 5 × 104 клеток на лунку. Для каждой лунки использовали 0,5 мкг меченой ДНК, трансфекцию генов проводили на следующий день, как упоминалось ранее. Через 4 часа после трансфекции клетки промывали HBSS, фиксировали 4% PFA, пермеабилизировали с помощью 0,1% тритон-100, окрасили DAPI, а затем получали изображения с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus IX81). Для количественной оценки эффективности клеточного поглощения с помощью проточной цитометрии после трансфекции клетки подвергали расщеплению трипсином EDTA и дважды промывали HBSS, а затем повторно суспендировали в PBS с 2% FBS, при этом процент Cy3-положительных клеток и MFI определяли количественно с помощью системы проточной цитометрии Accuri C6 в трех повторностях.
[00270] Выявление экспрессии C7 в HPDF путем цитоиммунофлуоресцентного окрашивания: Чтобы выявить экспрессию C7 с помощью цитоиммунофлуоресцентного окрашивания, HPDF высеивали в 8-луночные камеры (Ibidi) с плотностью 1,5 × 104 клеток на лунку. На следующий день для каждой лунки использовали 1 мкг MCC7, трансфекцию генов осуществляли, как описано выше, с использованием полиплексов LBPAE/ДНК при массовом соотношении 40:1 и полиплексов SuperFect/ДНК при массовом соотношении 3:1. Через 48 часов после трансфекции клетки фиксировали 4% PFA, пермеабилизировали 0,1% тритон-100, в течение 1 часа блокировали 5% козьей сывороткой в 1x PBS при комнатной температуре, а затем инкубировали в течение ночи с первичным моноклональным антителом к коллагену и антителом к типу VII, продуцируемым у мышей (с разведением антител 1:200) в блокирующем буфере при 4 °C. На следующий день в течение 1 часа клетки инкубировали с Alexa-568 - вторичным козьим антимышиным антителом класса IgG (H+L) с высокой перекрестной адсорбцией, в разведении 1: 800 в темноте и DAPI при комнатной температуре. Иммунофлуоресцентные изображения были получены с помощью микроскопа (Olympus IX81). Клетки без обработки антителами и обработанные только вторичным антителом использовали в качестве контрольных групп.
[00271] Экспрессия C7 в HPDF, количественно определенная методом проточной цитометрии: Для количественной оценки экспрессии C7 с помощью проточной цитометрии HPDF высевали в 24-луночный планшет при плотностью 5 × 104 клеток на лунку и трансфицировали через 24 часа. Для каждой лунки использовали 2 мкг MCC7, трансфекцию проводили, как описано выше, с использованием полиплексов LBPAE/ДНК с массовым соотношением 40:1 и полиплексами SuperFect/ДНК с массовым соотношением 3:1. Через четыре дня после трансфекции клетки расщепляли с помощью трипсин-EDTA, фиксировали с помощью буфера IC фиксации (2% PFA), пермеабилизировали буфером для пермеабилизации (1× PBS/1% BSA/0,1% Сапонин) и блокировали в козьей сыворотке (10% в растворе для усиления проницаемости), а затем инкубировали в течение 1 часа с первичным моноклональным антителом к коллагену и антителом к типу VII, продуцируемым у мышей, в блокирующем буфере с разведением 1:50 при комнатной температуре. После этого клетки дополнительно инкубировали с Alexa-647 - вторичным козьим антимышиным антителом класса IgG (H+L) с высокой перекрестной адсорбцией с разведением 1:3000 в буфере для усиления проницаемости, в темноте. Наконец, клетки повторно суспендировали в PBS и осуществляли анализ способом проточной цитометрии в трех повторностях. Клетки без обработки антителами и обработанные только вторичным антителом использовали в качестве контрольных групп.
[00272] Статистические данные: Для статистического анализа использовали ПО SPSS Statistics для Windows версии 24 (IBM Corp., Armonk, N.Y., USA). Для анализа всех данных по трансфекции генов использовали t-критерий Стьюдента, при этом данные представляли в виде среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. Значения LC50 рассчитывали методом анализа линейной регрессии. Значение P < 0,05 считалось статистически значимым.
[00273] Пример 9: Полиплексы HPAE, содержащие COL7A1 для доставки гена в кератиноциты рецессивного дистрофического буллезного эпидермолиза
[00274] В следующем примере описаны результаты трансфекции для полиплексов, содержащих миникольцевой COL7A1 и четыре сильноразветвленных поли(β-амино эфир)а (HPAE) по настоящему изобретению, имеющие молекулярные массы (Mw) около 10 кДа, 20 кДа, 30 кДа и 40 кДа и с использованием HPAE: COL7A1 ДНК с массовыми соотношениями 10:1, 30:1 и 50:1.
[00275] Синтез и характеристика HPAE: Изготовление HPAE осуществляли в две стадии. На первой стадии мономеры 5-амино-1-пентанол, триметилолпропантриакрилат, 1,4-бутандиолдиакрилат вступали в реакцию с образованием сильноразветвленного C32 (поли(5-амино-1-пентанол-ко-1,4-бутандиолдиакрилата)) («HC32»). На второй стадии HC32 вводили в реакцию с 1,11-диамино-3,6,9-триоксаундеканом (DATOU) с получением HPAE («HC32-DATOU»).
[00276] Четыре полимера HC32-DATOU с разной молекулярной массой (MW) были синтезированы с помощью стратегии присоединения по Михаэлю «A2+B3+C2». Первыми синтезировали базовые полимеры HC32. Вкратце, мономер A2 AP (9,0 ммоль, 0,923 г), мономер B3 TMPTA (0,5 ммоль, 0,148 г) и мономер C2 C (10,0 ммоль, 1,98 г) растворяли в 3,1 мл DMSO, а затем осуществляли реакцию при 90 °C. Для мониторинга роста MW и индекса полидисперсности (PDI) использовали гель-проникающую хроматографию (ГПХ). В разные моменты времени отбирали 20 мкл реакционной пробы, затем разбавляли ее 1 мл DMF и фильтровали через фильтр 0,2 мкм перед измерением ГПХ на гель-проникающем хроматографе Agilent 1260 Infinite, оснащенном тройным детектором: рефрактометрический (RI) детектор, вискозиметрический (VS DP) детектор и двухугловой детектор рассеяния света (LS 15° и LS 90 °). Для элюирования колонки ГПХ (Polar Gel-M, 7,5 × 300 мм, две в серии) использовали DMF и 0,1% LiBr с расходом 1 мл мин−1 при 60 °C. Колонки для ГПХ калибровали с помощью стандартов линейного полиметилметакрилата (PMMA).
[00277] Когда средневзвешенная молекулярная масса (Mw) базового полимера приближалась к целевым значениям (около 10, 20, 30 и 40 кДа, соответственно), реакцию останавливали путем разбавления реакционного раствора в DMSO до 100 мг/мл. После этого, эндкэпирующий агент DATOU (10,0 ммоль, 1,92 г), растворенный в DMSO (100 мг/мл), использовали для эндкэпирования концов базовых полимеров HC32 путем присоединения по Михаэлю при комнатной температуре (RT) в течение 48 часов для получения полимеров HC32-DATOU, которые дважды очищали осаждением диэтилом для удаления избыточных мономеров, олигомеров и эндкэпирующего агента.
[00278] Конечные продукты HC32-DATOU высушили в вакуумной печи в течение 24 часов, а затем лиофилизировали в течение еще 24 часов для удаления остатков растворителей. Для измерения MW и PDI конечного продукта, 10 мг образца растворяли в 1 мл DMF и проводили измерение способом ГПХ, как упоминалось выше. Для подтверждения химического состава и чистоты полимеров HC32-DATOU, которые были растворены в CDCl3, использовали протонный ядерный магнитный резонанс (1H NMR), а спектр 1H ЯМР был получен с помощью спектрометра Varian Inova 400 МГц. Образец был представлен в частях на миллион (ч/млн) относительно растворителя (7,24 ч/млн) или внутреннего контроля (тетраметилсилан 0,00 ч/млн).
[00279] На Фиг. 13 показано, что за счет увеличения времени полимеризации базовых полимеров были получены четыре полимера HC32-DATOU с разными Mw. Mw полимеров HC32-DATOU увеличивалась от 11 кДа до 41 кДа без гелеобразования, что демонстрирует демонстрируя высокую гибкость стратегии присоединения по Михаэлю «A2+B3+C2» при управлении молекулярной массой HPAE. Значения параметра альфа (α) графика Марка - Хаувинка (MH) всех полимеров HC32-DATOU ниже 0,5 (Фиг. 13c), что указывает на их сильноразветвленные структуры. В следующей таблице показаны значения PDI и параметра альфа (α) графика Марка - Хаувинка для полимеров HC32-DATOU
[00280] Биосинтез MCC7.
[00281] Была получена обычная плазмида pcDNA3.1COL7A1. MCC7 биосинтезировали путем вставки последовательности COL7A1, происходящей из pcDNA3.1COL7A1 в кассету MN511A-1, предлагаемую компанией System Biosciences, с промотором цитомегаловируса, при этом индукция и получение миникольцевой ДНК осуществлялось в соответствии с руководством System Bioscience и опубликованной миникольцевой технологией с системой расщепления phiC31 plus 1-Scel (Gaspar, V.; de Melo-Diogo, D.; Costa, E.; Moreira, A.; Queiroz, J.; Pichon, C.; Correia, I.; Sousa, F. Minicircle DNA Vectors for Gene Therapy: Advances and Applications. Expert Opin. Biol. Ther. 2015, 15 (3), 353-379. https://doi.org/10.1517/14712598.2015.996544.). Для подтверждения биосинтеза MCC7 было проведено исследование с расщеплением ДНК. С этой целью 0,5 мкг pcDNA3.1COL7A1, родительской плазмиды (MN511A-1-COL7A1) и MCC7 расщепляли с помощью 1 мкл EcoRI, а затем подвергали электрофорезу в агарозном геле при 100 В в течение 40 минут. Затем изображения были визуализированы с помощью устройства G:BOX компании Syngene.
[00282] Образование и получение полиплекса
[00283] HC32-DATOU растворяли в DMSO до 100 мкг/мл исходного раствора, который поместили на хранение при -20°С для дальнейших исследований. ДНК растворяли в буфере TE и также поместили на хранение при -20°С. Перед использованием буфер SA разводили до 0,025 M.
[00284] Для получения стандартного полиплекса в соответствии с массовым соотношением полимер/ДНК (масс./масс.), ДНК и полимер растворяли в буфере SA до равного объема, соответственно. Раствор полимера добавляли к раствору ДНК, перемешивали в течение 10 секунд с использованием вихревой мешалки и инкубировали еще 10 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить образование полиплекса. Для исследования образования, как правило, 5 мкг ДНК плазмиды GFP и 150 мкг HC32-DATOU растворяли в 200 мкл SA, соответственно, чтобы образовать полиплексы HC32-DATOU/DNA (масс./масс. = 30:1). Такие полиплексы либо использовали сразу свежими, либо хранили при комнатной температуре, 4°С, -20°С и -80°С, либо лиофилизировали перед трансфекцией.
[00285] Для лиофилизации к раствору полиплекса добавляли сахарозу до конечных концентраций сахарозы 0%, 1%, 3% и 5%, соответственно. Все образцы замораживали при -80°C в течение 1 часа, а затем немедленно подвергали сублимационной сушке с помощью сублимационной сушилки Christ Alpha 1-2 LDplus при -55°C в течение 24 часов. В дальнейшем эти полиплексы восстанавливали исходным объемом SA и использовали для трансфекции.
[00286] После оптимизации процедуры образования полиплексов (см. Пример 10 ниже), HC32-DATOU в комплексе с Gluc-кодирующей ДНК помещали на хранение при различных условиях с целью оценки реализуемости длительного хранения полиплексов перед их применением для трансфекции. В данном случае для каждой лунки 96-луночных планшетов использовали 0,5 мкг ДНК с массовым соотношением полимер/ДНК 30:1.
[00287] Исследования конденсации ДНК и высвобождения гепарина
[00288] Для оценки способности HC32-DATOU к конденсации ДНК и физической стабильности полиплексов HC32-DATOU/ДНК проводили анализ конденсации ДНК и анализ высвобождения гепарина с использованием электрофореза в агарозном геле. Для каждого образца использовали 0,5 мкг ДНК (MCC7), а полиплексы получали с массовым соотношением 30:1. К раствору полиплекса добавляли водный раствор гепарина с увеличением концентрации от 0,1 до 6 МЕ/мкл. В качестве контроля использовали оголенную ДНК и полиплексы HC32-DATOU/MCC7 без гепарина. Все образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем наносили на 1% агарозный гель, окрашенный 10 мкл красителя для ДНК SYBR safe . Электрофорез проводили в буфере 1 × TAE при 100 В в течение 1 ч.
[00289] Анализ PicoGreen
[00290] Для количественной оценки аффинности связывания ДНК полимером HC32-DATOU и высвобождения ДНК в присутствии гепарина использовали анализ PicoGreen. Полиплексы HC32-DATOU/MCC7 получали с помощью 0,2 мкг ДНК при массовом соотношении 30:1, а затем в раствор полиплекса вводили гепарин в концентрации 0,3 МЕ/мкл, 3 МЕ/мкл и 6 МЕ/мкл, соответственно. Оголенную ДНК и полиплекс HC32-DATOU/MCC7 без обработки гепарином использовали в качестве контроля. После 2 ч инкубации все образцы смешивали с 10 мкл рабочего раствора PicoGreen и инкубировали еще 5 минут. Затем раствор смеси разбавляли деионизированной водой до конечной концентрации 1 мкг/мл в 96-луночном планшете черного цвета. Измерения флуоресценции осуществляли с помощью считывающего устройства SpectraMax M3 для планшетов с длиной волны при возбуждении 490 нм и 535 нм при испускании в четырех повторностях. Эффективность высвобождения ДНК определяли путем нормализации интенсивности флуоресценции образцов по отношению к контролю с оголенной ДНК.
[00291] Измерения размера и дзета-потенциала полиплексов
[00292] Размер полиплекса определяли с помощью анализа слежения за наночастицами (NTA) с использованием устройства Nanosight NS300. Полиплексы получали с использованием 0,5 мкг ДНК с массовым соотношением 30:1 в 10 мкл SA. Затем раствор полиплекса разбавляли до 1 мл дистиллированной водой и затем подвергали NTA-анализу. 60-секундный фильм, содержащий отслеживание броуновского движения частиц, был записан с использованием программного обеспечения NTA (версия 3.2). Для каждой выборки оценивали по 10 треков. Измерения дзета-потенциала полиплексов проводили с использованием прибора Malvern Instruments Zetasizer (Nano-ZS90) при угле детектора рассеяния 90°.
[00293] Наблюдения с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)
[00294] Морфологию полиплексов характеризовали с помощью ПЭМ. 80 мкл раствора полиплекса с 2 мкг MCC7 при массовом соотношении 30:1 центрифугировали с удалением супернатанта, а затем полиплексы дважды промывали 80 мкл дистиллированной воды для удаления избытка солей. После этого полиплексы ресуспендировали дистиллированной водой до конечного объема 10 мкл. Затем 2,5 мкл раствора полиплекса наносили на несущие пленки Formvar на медной сетке 200 меш и немедленно лиофилизировали. Изображения были получены с помощью прибора FEI Tecnai 120 TEM при 120 кВ в исследовательском центре UCD Conway Imaging Core Centre.
[00295] Культивирование клеток
[00296] Клетки кератиноцитов РДБЭ и кератиноцитов человека (NHK) культивировали в базальной среде для клеток кератиноцитов (KBM-Gold) с добавкой (KGM-Gold SingleQuots) и 1% PS во влажном инкубаторе с 5% CO2 при 37°С, в стандартных условиях культивирования клеток.
[00297] Экспрессия GFP и жизнеспособность клеток
[00298] Трансфекцию репортерного гена GFP сначала проводили для оценки эффективности трансфекции генов четырех полимеров HC32-DATOU и отбора кандидата с наилучшими показателями. Кератиноциты РДБЭ высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 2 × 104 клеток на лунку. На следующий день для каждой лунки использовали 0,5 мкг ДНК плазмиды, кодирующей GFP. Полиплексы HC32-DATOU с различными Mws получали при массовых соотношениях полимер/ДНК в 10:1, 30:1 и 50:1 в 20 мкл SA, которые смешивали с 80 мкл свежей культуральной среды, используемой в качестве среды для трансфекции. Через 4 часа после трансфекции среду для трансфекции заменяли свежей. Через 48 часов после трансфекции экспрессию GFP клеток визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus IX81). Жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа Alamarblue. После удаления супернатантов клеток клетки инкубировали с 10% реагентом Alamarblue в HBSS еще в течение 1 часа при 37 °C. Затем раствор Alamarblue переносили в 96-луночный планшет с плоским дном. Интенсивность флуоресценции считывали с помощью считывающего устройства SpectraMax M3 для планшетов с длиной волны при возбуждении 570 нм и 590 нм при испускании. Интенсивность флуоресценции необработанной группы клеток была принята как 100% жизнеспособность. Жизнеспособность клеток измеряли в четырех повторностях и рассчитывали путем нормализации интенсивности флуоресценции образца к интенсивности флуоресценции необработанной группы. Полимер HC32-DATOU, показавший наивысшую экспрессию GFP и жизнеспособность клеток, был использован для следующих исследований.
[00299] В исследованиях образования (см. Пример 10 ниже), полиплексы SuperFect/ДНК получали с массовым соотношением 3:1 согласно публикации (Zeng, M.; Zhou, D.; Alshehri, F.; Lara-Sáez, I.; Lyu, Y.; Creagh-Flynn, J.; Xu, Q.; A, S.; Zhang, J.; Wang, W. Manipulation of Transgene Expression in Fibroblast Cells by a Multifunctional Linear-Branched Hybrid Poly(β-Amino Ester) Synthesized through an Oligomer Combination Approach. Nano Lett. 2019, 19 (1), 381-391. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.8b04098. Theoharis, S.; Krueger, U.; Tan, P. H.; Haskard, D. O.; Weber, M.; George, A. J. T. Targeting Gene Delivery to Activated Vascular Endothelium Using Anti E/P-Selectin Antibody Linked to PAMAM Dendrimers. J. Immunol. Methods 2009, 343 (2), 79-90. https://doi.org/10.1016/j.jim.2008.12.005.). Полиплексы Lipofectamine 2000/ДНК получали согласно протоколу производителя (2:1 соотношение объем/масса). Медианная интенсивность флуоресценции (MFI) и GFP-положительные клетки были количественно оценены способом проточной цитометрии в системе Accuri C6 в трех повторностях, а дальнейший анализ был выполнен с помощью ПО Flowjo V10. Для каждого прогона подсчитывали 1 × 104 клеток.
[00300] Трансфекция репортерного гена Gluc и жизнеспособность клеток
[00301] Далее оценку HC32-DATOU проводили в ходе исследований трансфекции репортерного гена Gluc. Для каждой лунки использовали 0,5 мкг плазмиды ДНК, кодирующей Gluc, а полиплексы HC32-DATOU/ДНК получали с массовым соотношением 20:1, 30:1 и 40:1, соответственно. Согласно предыдущим публикациям (Green, J. J.; Zugates, G. T.; Tedford, N. C.; Huang, Y.-H.; Griffith, L. G.; Lauffenburger, D. A.; Sawicki, J. A.; Langer, R.; Anderson, D. G. Combinatorial Modification of Degradable Polymers Enables Transfection of Human Cells Comparable to Adenovirus. Adv. Mater. 2007, 19 (19), 2836-2842. https://doi.org/10.1002/adma.200700371.Huang, J.-Y.; Gao, Y.; Cutlar, L.; O’Keeffe-Ahern, J.; Zhao, T.; Lin, F.-H.; Zhou, D.; McMahon, S.; Greiser, U.; Wang, W.; et al. Tailoring Highly Branched Poly(Beta-Amino Ester)s: A Synthetic Platform for Epidermal Gene Therapy. Chem. Commun. (Camb). 2015, 51 (40), 8473-8476. https://doi.org/10.1039/c5cc02193f. Zeng, M.; Zhou, D.; Ng, S.; Ahern, J. O.; Alshehri, F.; Gao, Y.; Pierucci, L.; Greiser, U.; Wang, W. Highly Branched Poly(5-Amino-1-Pentanol-Co-1,4-Butanediol Diacrylate) for High Performance Gene Transfection. Polymers (Basel). 2017, 9 (12), 161. https://doi.org/10.3390/polym9050161.), полиплексы PEI/ДНК были изготовлены в массовых соотношениях 1:1, 2:1 и 3:1, соответственно.
[00302] Кератиноциты РДБЭ высевали, и осуществляли трансфекцию генов, как упоминалось выше. Для количественного определения эффективности трансфекции через 48 часов после трансфекции 50 мкл клеточного супернатанта смешали с равным объемом рабочего раствора для анализа Gluc. Интенсивность флуоресценции меси измерили с помощью считывающего устройства SpectraMax M3 для планшетов с длиной волны при возбуждении 485 нм и 525 нм при испускании. Результаты активности глюкозы были нанесены на график в виде относительных световых единиц (RLU). Жизнеспособность клеток измеряли, как указано выше. Оба эксперимента - по активности Gluc и жизнеспособности клеток, проводили в четырех повторностях.
[00303] Клеточное поглощение полиплексов
[00304] Для маркировки MCC7 использовали комплекты для Cy3-мечения ДНК в соответствии со стандартным протоколом. Кератиноциты РДБЭ высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 1 × 104 клеток на лунку. На следующий день, используя 0,25 мкг MCC7 для каждой лунки, клетки трансфицировали полиплексами HC32-DATOU/MCC7 (масс./масс. = 30:1) и PEI/MCC7 (масс./масс. = 1:1) в течение 4 часов, а затем зафиксировали с помощью 4% PFA, пермеабилизировали с помощью 0,1% тритон-100 и инкубировали в HBSS с использованием DAPI в рабочей концентрации 1 мкг/мл. Флуоресцентные изображения были получены с помощью микроскопа (Olympus IX81). Соотношение MFI-положительных и Cy3-положительных клеток было оценено количественно с помощью системы Accuri C6 в трех повторностях. Результаты были дополнительно проанализированы с помощью программного обеспечения Flowjo V10 с подсчетом 1 × 104 клеток для каждого измерения.
[00305] Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-qPCR)
[00306] RT-qPCR была выполнена для количественной оценки экспрессии мРНК COL7A1. Кератиноциты РДБЭ высеяли в 6-луночные планшеты с плотностью 2,5 × 105 клеток на лунку за одни сутки до трансфекции. Клетки трансфицировали полиплексами HC32-DATOU/MCC7 и PEI/MCC7 в комплексе с 5 мкг ДНК в массовых соотношениях 30:1 и 1:1. Через три дня после обработки как обработанные, так и необработанные клетки собрали и очистили от общей РНК. Работа по экстракции РНК была выполнена согласно протоколу RNeasy Mini Kit. Затем 0,5 мкг общей РНК из каждой группы использовали для синтеза первой цепи кДНК. Обратную транскрипцию выполнили с праймером 50 мкМ олиго(dT)20 согласно протоколу SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix. Далее, 1 мкл конечного продукта комплементарной ДНК (кДНК) добавили к 9 мкл реакционной смеси (0,5 мкл праймера TaqMan, 5 мкл смеси TaqMan PCR, 3,5 мкл воды, свободной от РНКазы), которую загружали в одну лунку 384-луночных планшетов. Каждый образец измеряли в трех повторностях. В качестве эндогенного контроля для количественной экспрессии гена COL7A1 использовали GAPDH. Для экспериментов были установлены сравнительные значения порогового цикла (CT) и реагенты TaqMan, а также система QuantStudio 7 Flex. Результаты были проанализированы с помощью программного обеспечения QuantStudio Real-Time PCR.
[00307] Цитоиммунофлуоресцентное окрашивание C7
[00308] Для определения восстановления C7 кератиноцитов РДБЭ после обработки полиплексами HC32-DATOU/MCC7 и PEI/MCC7 использовали цитоиммунофлуоресцентное окрашивание. 1,5 × 104 клеток были высеяны на каждое покровное стекло в 8-луночной камере (Ibidi). Для каждой лунки использовали 1 мкг MCC7, полиплексы HC32-DATOU/MCC7 и PEI/MCC7 были получены с весовым соотношением 30:1 и 1:1, соответственно. Через 3 дня после трансфекции клетки фиксировали 4% PFA, пропитывали 0,1% Triton X-100 и блокировали 5% козьей сывороткой в 1 × DPBS в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем инкубировали с первичным антителом (моноклональным антителом к коллагену типа VII, продуцируемым у мышей) при 4°C в течение ночи с разведением антител 1:200 в блокирующем буфере. После этого клетки инкубировали со вторичным антителом (Alexa-568 - козьим антимышиным антителом класса IgG (H+L) с разведением в блокирующем буфере 1:800). После окончательной промывки покровные стекла заливали средой для заливки Fluoroshield с DAPI. Наконец, флуоресцентные изображения были получены с помощью микроскопа (Olympus IX81).
[00309] Вестерн-блоттинг
[00310] За одни сутки до трансфекции кератиноциты РДБЭ высеяли в колбах T-75 с плотностью 1,5 × 106 клеток на колбу. Для трансфекции 39 мкг MCC7 в каждой колбе использовали полиплексы HC32-DATOU/MCC7 и PEI/MCC7 с массовым соотношением 30:1 и 1:1, соответственно. Через четыре дня после трансфекции клетки собрали и обработали буфером RIPA для лизиса, который обеспечивает эффективный лизис клеток и солюбилизацию клеточных белков. Для лизиса клеток добавили 1 мкл PIC до окончательного объема 50 мкл и поместили на хранение при -80 °C. Для количественной оценки концентрации белка путем нормализации концентраций в образцах до известной концентрации BSA использовали анализ Брэдфорда. Образцы денатурированного белка по 40 мкг загружали в гель SDS-Page (4-10%), а затем проводили электрофорез при 75 В в течение 20 минут, а затем при 120 В в течение 1 часа. Затем образцы белка перенесли на нитроцеллюлозную мембрану при 80 В в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем при 90 В в течение 30 минут при температуре 4 °C. Блокировку мембраны проводили в блокирующем буфере (5% BSA в буфере TBST) при комнатной температуре в течение 1 часа. В качестве эндогенного контроля использовали β-Актин. Затем к мембране добавляли первичные антитела (поликлональное кроличье антитело к C7 и мышиное антитело к актину с разведением 2500 в блокирующем буфере) и инкубировали при 4°C в течение ночи. После стадий промывки к мембране добавляли вторичные антитела (анти-кроличьи HRP и анти-мышиные HRP с разведением 5000 в блокирующем буфере) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратной промывки TBST мембрану визуализировали с помощью субстрата Pierce ECL Plus.
[00311] Статистические данные
[00312] Для работы со статистическими данными использовали ПО SPSS Statistics for Windows версии 24 (IBM Corp., Armonk, N.Y., USA) Для анализа всех данных по трансфекции генов использовали t-критерий Стьюдента, а выражали их в виде среднее значение ± среднеквадратичное отклонение (SD). Для всех анализов значение p < 0,05 считалось статистически значимым.
[00313] Результаты:
[00314] Трансфекция репортерного гена в кератиноцит РДБЭ с использованием HPAE разной молекулярной массы
[00315] Чтобы определить наиболее подходящую молекулярную массу для доставки гена, для трансфекции клеток кератиноцитов РДБЭ с использованием ДНК, кодирующей GFP, в качестве репортерного гена, были использованы четыре полимера HC32-DATOU с разными Mw. Как показано на Фиг. 14 и Фиг. 15, хотя при массовом соотношении полимер/ДНК 10:1 очевидной цитотоксичности не наблюдается, эффективность трансфекции всеми полимерами HC32-DATOU является относительно низкой. Когда массовое соотношение увеличивали до 30:1 или выше, среди всех полимеров наивысшей эффективности трансфекции с самой сильной экспрессией GFP, сохраняя при этом жизнеспособность клеток на высоком уровне 98%, достигает полимер HC32-DATOU 11 кДа с массовым соотношением 30:1. Как правило, экспрессия GFP снижалась с увеличением Mw полимеров HC32-DATOU.
[00316] С другой стороны, цитотоксичность очень хорошо коррелирует с увеличением Mw полимера. Например, при массовом соотношении 50:1, поскольку Mw увеличивается, жизнеспособность клеток снижается от 91% до 58%, 42% и 15%, соответственно. Эффективность трансфекции ухудшена из-за увеличения цитотоксичности, которую можно отнести на счет увеличивающейся основной цепи полимера. Эти результаты демонстрируют, что MW оказывает значительное влияние на эффективность трансфекции HC32-DATOU, и Mw ~ 10 кДа является более благоприятной для трансфекции гена кератиноцита РДБЭ для достижения как высокой эффективности трансфекции, так и низкой цитотоксичности.
[00317] Высокая способность к трансфекции генов полимером HC32-DATOU 11 кДа была подтверждена путем сравнения с коммерческим реагентом для трансфекции генов PEI (Mw=25 кДа). Как показано на Фиг. 16a, во всех трех протестированных массовых соотношениях, относительная активность Gluc клеток кератиноцитов РДБЭ после трансфекции полиплексами HC32-DATOU/ДНК была намного выше той, которая опосредована аналогами PEI/ДНК. Наивысшая активность Gluc, достигаемая полиплексами HC32-DATOU/ДНК при массовом соотношении 30:1, была в 17 раз выше, чем у аналогов PEI/ДНК при массовом соотношении 2:1.
[00318] Важно отметить, что полиплексы HC32-DATOU/ДНК не вызывают очевидной цитотоксичности и сохраняют почти 100% жизнеспособность клеток. Напротив, PEI продемонстрировал очевидную цитотоксичность, зависящую от дозировки, жизнеспособность клеток значительно снизилась с 90% при массовом соотношении 1:1 до 38% при массовом соотношении 3:1 (Фиг. 16b). Из-за существенной цитотоксичности PEI в массовом соотношении 1:1 использовался в дальнейших исследованиях.
[00319] Чтобы подтвердить высокую эффективность полиплексов HC32-DATOU/ДНК, для трансфекции использовали ДНК, кодирующую GFP. Полиплексы HC32-DATOU/ДНК опосредуют гораздо более высокий уровень экспрессии GFP, чем PEI, о чем свидетельствует наблюдение значительно более сильной зеленой флуоресценции (Фиг. 16c). Соответственно, количественный анализ способом проточной цитометрии показывает, что большее количество клеток смещается в соответствии с GFP-определяющим каналом (Фиг. 16d). После трансфекции полиплексами HC32-DATOU/ДНК GFP-положительными были 75% клеток кератиноцитов РДБЭ, в отличие от 39%, достигнутых полиплексами PEI/ДНК. Более того, MFI клеток кератиноцитов РДБЭ, трансфицированных полиплексами HC32-DATOU/ДНК, в 13 раз выше, чем значение, опосредованное аналогами PEI/ДНК (Фиг. 16e), что указывает на то, что в отдельных клетках была достигнута гораздо более высокая экспрессия генов. Все эти результаты демонстрируют, что HC32-DATOU намного эффективнее и безопаснее PEI при трансфекции генов в клетки кератиноцитов РДБЭ.
[00320] Биосинтез MCC7 и клеточное поглощение полиплексов HPAE/MCC7 клетками кератиноцитов РДБЭ
[00321] Воспользовавшись миникольцевой технологией с системой расщепления phiC31 plus 1-Scel (Gaspar, V.; de Melo-Diogo, D.; Costa, E.; Moreira, A.; Queiroz, J.; Pichon, C.; Correia, I.; Sousa, F. Minicircle DNA Vectors for Gene Therapy: Advances and Applications. Expert Opin. Biol. Ther. 2015, 15 (3), 353-379. https://doi.org/10.1517/14712598.2015.996544.), биосинтезировали миникольцевую ДНК, кодирующую ~9 т.п.н. полноразмерный COL7A1 (Фиг. 17a). Гель-электрофорез показывает, что среди всех трех COL7A1-меченных ДНК, MCC7 имеет длину остова только 3 т.п.н., что на 2 т.п.н. и 5 т.п.н. короче, чем у обычной плазмиды (RP) pcDNA3.1COL7A1 и родительской плазмиды (PP) MN511A-1-COL7A1 (Фиг. 17b), соответственно, что указывает на MCC7 с миниатюрной производной обычного вектора PP, лишенного бактериальных последовательностей.
[00322] Клеточное поглощение полиплексов HC32-DATOU/MCC7 проводили в клетках кератиноцитов РДБЭ. MCC7 пометили красным флуоресцентным красителем Cy3, а полиплексы HC32-DATOU/MCC7 получали, как описано выше. После 4 часов трансфекции вокруг ядра в клетках наблюдалась очень сильная красная флуоресценция (Фиг. 17c). Для сравнения, полиплексы PEI/MCC7 показывают гораздо более низкую эффективность клеточного поглощения, о чем свидетельствует гораздо более слабая красная флуоресценция. Измерения способом проточной цитометрии дополнительно демонстрируют, что, хотя процент Cy3-положительных клеток является сходным (96,4% против 93%, Фиг. 17d), MFI клеток, инкубированных с полиплексами HC32-DATOU/MCC7, был примерно в 2 раза выше, чем у клеток, обработанных аналогами PEI/MCC7 (Фиг. 17e), что указывает на то, что большее количество копий ДНК было поглощено клетками кератиноцитов РДБЭ. Максимальные размеры ДНК, которые способны нести векторы с RV и аденоассоциированным вирусом (AAV), составляют 7-8 т.п.н. и 5 т.п.н., соответственно. Тот факт, что HC32-DATOU способен эффективно доставлять MCC7 длиной 12 т.п.н. в клетки кератиноцитов РДБЭ, подчеркивает его потенциал для достижения высокой экспрессии C7 при лечении РДБЭ.
[00323] Высокие уровни экспрессии мРНК COL7A1 и рекомбинантного C7
[00324] После интернализации полиплексы вектор/ДНК подвергаются воздействию внутриклеточных барьеров, включая эндо/лизосомальное ускользание, транспорт через цитоплазму, высвобождение ДНК и проникновение в ядро. Клеточный цикл является еще одним препятствием для эффективного поглощения ядром в клетках, находящихся в фазе митоза, которое более чем в 10 раз выше, чем в фазе роста клеточного цикла.
[00325] Для оценки экспрессии транскрипта мРНК COL7A1 и белка C7, опосредованной полиплексами HC32-DATOU/MCC7, были проведены исследования с помощью RT-qPCR, иммунофлуоресцентного окрашивания и вестерн-блоттинга.
[00326] На Фиг. 18a и Фиг. 18b показаны графики амплификации эндогенного контроля GAPDH и экспресии мРНК COL7A1, соответственно, полученные способом RT-qPCR. После нормализации к эндогенному контролю показано, что полиплексы HC32-DATOU/MCC7 опосредуют 4019-кратное усиление экспрессии мРНК COL7A1 по сравнению с необработанными клетками (Фиг. 18c), что в 2,2 раза выше, чем усиление, опосредованное полиплексами PEI/MCC7. Исследования с иммунофлуоресцентным окрашиванием (Фиг. 18d) дополнительно показала, что для необработанных клеток кератиноцитов РДБЭ выявлена нулевая экспрессия C7. Напротив, после трансфекции полиплексами HC32-DATOU/MCC7 на цитоиммунофлуоресцентных изображениях наблюдался гораздо более высокий уровень клеточной экспрессии C7 вокруг ядра. Более того, в соответствии с результатами экспрессии мРНК COL7A1, полиплексы HC32-DATOU/DNA опосредуют более эффективную экспрессию C7, чем аналоги PEI/MCC7.
[00327] Результаты вестерн-блоттинга показывают, что секреция C7 не была выявлена в необработанных клетках кератиноцитов РДБЭ (Фиг. 18e). В противоположность, после трансфекции HC32-DATOU/полиплексами видна очень четкая полоса белка C7 290 кДа, при этом такая полоса C7 является настолько же выраженной, как и у клеток NHK дикого типа с полной функцией выработки C7. Отмечено, что, хотя полиплексы PEI/MCC7 достигли довольно высокого уровня экспрессии мРНК COL7A1, выработка C7 ограничена.
[00328] Исследование механизма показало, что компактная структура ДНК увеличивает клеточное поглощение, количество копий внутриклеточного вектора, расположение ядра и уровни транскрипции мРНК (Kobelt, D.; Schleef, M.; Schmeer, M.; Aumann, J.; Schlag, P. M.; Walther, W. Performance of High Quality Minicircle DNA for in Vitro and in Vivo Gene Transfer. Mol. Biotechnol. 2013, 53 (1), 80-89. https://doi.org/10.1007/s12033-012-9535-6.). Согласно настоящему изобретению, используя преимущества оптимизированного полимера и миниатюрный генный конструкт, HC32-DATOU способен эффективно доставлять ген COL7A1 в клетки кератиноцитов РДБЭ, активировать последующую транскрипцию мРНК и конечную экспрессию рекомбинантного C7, тем самым укрепляя целостность кожи.
[00329] Механистическое исследование высокой эффективности трансфекции генов полиплексами HPAE/MCC7
[00330] Конденсация ДНК, связывание, размер полиплекса, дзета-потенциал, морфология и высвобождение ДНК связаны с эффективностью трансфекции. Чтобы лучше понять механизмы высокой эффективности трансфекции генов, опосредованной полиплексами HC32-DATOU/MCC7, были исследованы эти физико-химические параметры.
[00331] Катионный HC32-DATOU, как полагают, конденсирует отрицательно заряженную MCC7 с образованием полиплексов за счет электростатической самосборки (Фиг. 19a). Чтобы подтвердить это, для оценки способности HC32-DATOU к конденсации ДНК через 2 часа после получения полиплекса был проведен электрофорез в агарозном геле. Как показано на Фиг. 19b, оголенная ДНК MCC7 сдвинута на геле, в то время как HC32-DATOU способна конденсировать ДНК в лунке без очевидного сдвига ДНК. Гепарин-конкурентный анализ дополнительно показал, что полиплексы HC32-DATOU с низкими концентрациями гепарина (0,1-0,3 МЕ/мкл) все еще конденсируют большую часть ДНК, что свидетельствует о сильной способности к конденсации ДНК и очень стабильных свойствах полиплексов HC32-DATOU.
[00332] Аналогично, согласно количественной оценке с помощью анализа PicoGreen (Фиг. 19c), HC32-DATOU показал стабильную и высокую аффинность связывания ДНК на уровне 96,3%, что указывает на распаковку только 3,7% ДНК. Когда применяли гепарин в концентрациях 3 и 6 МЕ/мкл, была выявлена распаковка ДНК в 68,2% и 99,6%, соответственно. Эти результаты показывают, что HC32-DATOU эффективно конденсирует, связывает и высвобождает ДНК контролируемым образом в присутствии регулируемого отрицательно заряженного гепарина.
[00333] При массовом соотношении, оптимизированном для эффективной экспрессии C7 (30:1), наночастицы имели средний размер 110 нм и размер типа 81 нм, соответственно (Фиг. 19d), с дзета-потенциалом в +37,4 мВ (Фиг. 19e), что указывает на компактную структуру наночастиц с положительным поверхностным зарядом. Известно, что полиплексы чаще всего имели сферическую или тороидальную форму. В данном случае полиплексы HC32-DATOU/MCC7 проявляют однородную и сферическую морфологию (Фиг. 19f).
[00334] Сообщают, что повышению эффективности трансфекции способствует модификация концевых диаминовых групп, которая увеличивает катионный заряд полимера, что приводит к улучшению динамики связывания полимер/ДНК, конденсации ДНК в наночастицы и защите ДНК от разложения. Помимо концевой модификации диамином DATOU, множество ДНК-связывающих/конденсационных фрагментов, включая первичные, вторичные и третичные амины, находятся в остове и концевых группах HC32. Как правило, частицы LPAE/ДНК имеют размер менее 250 нм, и было обнаружено, что частицы меньшего размера более эффективно интернализируется клетками.
[00335] Не ограничиваясь какой-либо теорией, возможно, что небольшие, компактные, однородные полиплексы HC32/MCC7 с катионными свойствами обеспечивают высокую эффективность клеточного поглощения. Кроме того, множественные ионизируемые вторичные и третичные амины могут служить буфером для широкого спектра протонов, что может облегчить эндо/лизосомальное ускользание за счет «эффекта протонной губки». Далее, устойчивая стабильность упаковки генов HC32-DATOU предполагает, что он может способствовать внутриклеточному транспорту полиплексов через цитоплазму к ядру.
[00336] Эффективный вектор должен совмещать достаточную прочность связывания для защиты ДНК со способностью высвобождать ДНК. Не ограничиваясь какой-либо теорией, умеренное электростатическое взаимодействие между HC32-DATOU и MCC7 и свойство биоразложения HC32-DATOU могут способствовать высвобождению гена из полиплексов внутри ядра для запуска этапов транскрипции.
[00337] Пример 10: Лиофилизированные композиции, содержащие полиплексы HPAE по настоящему изобретению
[00338] В следующем примере описаны результаты от изменяющихся условий хранения и концентрации криопротектора в процессе лиофилизации для типичных составов полиплексов HPAE/ДНК.
[00339] Состав полиплекса HC32-DATOU/ДНК был оптимизирован путем изменения условий хранения и концентрации криопротектора в процессе лиофилизации. На Фиг. 20a показана схема изготовления полиплексов лиофилизацией и исследования трансфекции генов в клетки кератиноцитов РДБЭ с использованием GFP-кодирующей ДНК. Помимо свежеприготовленного полиплекса, все полиплексы использовали для трансфекции генов через 1 сутки после получения. Как показано на Фиг. 20b, при изменении температуры хранения, за исключением температуры хранения при комнатной температуре, свежие полиплексы и полиплексы, хранящиеся при температуре 4°C, -20°C и -80°C показывают сравнимую и высокую экспрессию GFP со значительным сдвигом клеточной популяции на гистограмме распределений проточной цитометрии (Фиг. 20c). Как показано на Фиг. 20d и 20e, эффективность, количественно определенная способом проточной цитометрии, составила более 70%, а нормализованный MFI был примерно в 10 раз выше, чем в группе необработанных клеток. Эти результаты показывают, что низкая температура хранения благоприятна для поддержания высокой способности полиплексов HC32-DATOU/ДНК к трансфекции генов.
[00340] Затем, используя сахарозу в качестве криопротектора во время процесса сублимационной сушки, было изучено влияние концентрации криопротектора на способность полиплексов HC32-DATOU/ДНК к трансфекции генов. Сублимационная сушка полиплексов без какого-либо криопротектора (0% сахарозы) приводила к потере большей части способности к трансфекции, демонстрируя эффективность 20% и MFI, превышающий аналогичный показатель необработанных клеток всего в 1,4 раза.
[00341] Когда в раствор полиплекса перед лиофилизацией добавляли 1%, 3% и 5% сахарозы, эффективность трансфекции увеличивалась до 54%, 61% и 52%, соответственно. Эти результаты показывают, что 3% сахарозы являются более эффективными для поддержания высокой способности полиплексов HC32-DATOU/ДНК к трансфекции генов. Хотя трансфекция генов была несколько ниже, чем у свежеприготовленных аналогов, способность к трансфекции генов у полиплексов, хранящихся при низкой температуре или лиофилизированных с сахарозой, все еще намного выше, чем у коммерческих реагентов SuperFect и Lipofectamine, которые обеспечивают эффективность 10% и 32%, соответственно.
[00342] Кроме того, лиофилизация полиплекса имеет уникальные преимущества. Во-первых, она позволяет осуществлять последующую реконструкцию полиплексов при более высокой концентрации, что особенно удобно для инъекций in vivo, для которых требуется ограниченный объем введения. Во-вторых, легко регулируемое растворенное вещество (сахароза) может сделать раствор реконструированного полиплекса изотоническим во время его образования. Также ожидается, что по сравнению со свежеприготовленными полиплексами, лиофилизированные полиплексы с сахарозой будут более стабильными в присутствии сыворотки. Наконец, лиофилизированные полиплексы могут храниться годами без потери эффективности.
[00343] Для оценки сроков хранения было проведено исследование трансфекции генов с помощью высокоэффективных полиплексов HC32-DATOU/DNA (группы 4 °C, -20°C и -80°C) с разными длительностями хранения. Как показано на Фиг. 21, после хранения при 4°C в течение 0,5 или 1 месяца, активность Gluc полиплексов была в 2-3 раза меньше, чем опосредованная свежеприготовленными полиплексами. Через 2 месяца эффективность полиплексов стала незначительной.
[00344] В противоположность, даже через год полиплексы, которые хранили при -20°C и -80°C, опосредуют тот же уровень активности Gluc, что и свежеприготовленные полиплексы. Эти результаты показывают, что полиплексы HC32-DATOU/ДНК очень стабильны и сохраняют свою полную функцию по трансфекции генов, просто при хранении при температуре -20°C или -80°C, что делает очень целесообразным их клиническое применение.
[00345] Материалы для примеров 9 и 10: Мономеры 5-амино-1-пентанола (AP, 99%), триметилолпропантриакрилата (TMPTA, 99%), 1,11-диамино-3,6,9-триоксаундекана (DATOU, 98%) были приобретены у компании Sigma-Aldrich, а 1,4-бутандиолдиакрилат (BDA, 98%) был приобретен у компании VWR. Химикаты бромида лития (LiBr, 99%), трис-буферный солевой раствор и Tween 20 (TBST), параформальдегид (PFA) и тритон X-100 были приобретены у компании Sigma-Aldrich. Растворители диметилсульфоксид (DMSO, Sigma-Aldrich, 99%), диметилформамид (DMF, Fisher Scientific, 99%), диэтиловый эфир (Sigma-Aldrich, 99%) и дейтерированный хлороформ (CDCl3, Sigma-Aldrich, 99,9%) были использованы в том виде, в котором они были получены. Разветвленный полиэтиленимин (PEI, Mw=25 кДа, Sigma-Aldrich), SuperFect (QIAGEN), Lipofectamine 2000 (Invitrogen) использовали в качестве коммерческих контрольных реагентов. Базальная среда для клеток кератиноцитов (Clonetics KBM-Gold) с дополнительным пакетом (Clonetics KGM-Gold SingleQuots) была приобретена у компании Lonza. Плазмида секретируемой клетками люциферазы Gaussia princeps (Gluc) и наборы BioLux для анализа люциферазы Gaussia были получены из New England Biolabs UK. Плазмида зеленого флуоресцентного белка (GFP) была приобретена у компании Aldevron. Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS), буфер ацетата натрия (SA, pH 5,2±0,1; 3 M), буфер трисацетат-EDTA (TAE) и буфер для анализа радио-иммунопреципитации (RIPA), агароза, бычий сывороточный альбумин (BSA), козья сыворотка, моноклональное антитело к C7, полученное от мышей, смесь ингибиторов протеазы (PIC) и реагент Брэдфорда были приобретены у компании Sigma-Aldrich. 1× фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко (PBS), среда Gibco OPTI-MEM I с пониженным содержанием сыворотки, 4’,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и наборы для анализа PicoGreen были приобретены у компании Life Technologies. Пенициллин-стрептомицин (PS), EcoRI, Alexa-568 - вторичное козье антимышиное антитело класса IgG (H+L) с высокой перекрестной адсорбцией и субстрат Pierce ECL plus для вестерн-блоттинга были приобретены у компании Thermo Fisher Scientific. Наборы для анализа Alamarblue, гель для окрашивания ДНК SYBR safe и материал SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix приобретены у компании Invitrogen. Коллаген типа VII альфа 1 (Fam-MGB, праймер и зонд), эндогенный контроль глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) человека (зонд VIC/MGB, с ограничением праймера) и мастер-смесь экспрессии генов TaqMan были приобретены у компании Applied Biosystems. Буфер TE (QIAGEN), комплект для Cy3-мечения ДНК (Mirus), RNeasy Mini Kit (QIAGEN), среда для заливки Fluoroshield с DAPI (Abcam) использовались в соответствии с протоколами производителя. Поликлональное первичное антитело кролика к C7 (Merck Millipore), первичное антитело мыши к бета-актину (Abcam), антикроличье HRP-связанное антитело класса IgG (Cell Signaling) и антимышиное HRP-связанное антитело класса IgG \(Cell Signaling) были использованы в том виде, в котором они были получены.
[00346] Все процитированные документы или документы, на которые иным образом сделаны ссылки или которые были раскрыты в данном документе, полностью включены в него посредством ссылки для всех целей.
Ссылки
[1] L. Naldini, Gene therapy returns to centre stage. Nature 2015.
[2] H. Yin, R. L. Kanasty, A. A. Eltoukhy, A. J. Vegas, J. R. Dorkin, D. G. Anderson, Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat. Rev. Genet. 2014.
[3] M. Foldvari, D. W. Chen, N. Nafissi, D. Calderon, L. Narsineni, A. Rafiee, J. Control. Release 2016.
[4] H. Lv, S. Zhang, B. Wang, S. Cui, J. Yan, Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. J. Control. Release 2006.
[5] D. M. Lynn, R. Langer, J Am Chem Soc 2000.
[6] J. J. Green, G. T. Zugates, N. C. Tedford, Y. H. Huang, L. G. Griffith, D. A. Lauffenburger, J. A. Sawicki, R. Langer, D. G. Anderson, Adv. Mater. 2007.
[7] J. C. Sunshine, D. Y. Peng, J. J. Green, Mol. Pharm. 2012.
[8] D. G. Anderson, A. Akinc, N. Hossain, R. Langer, Mol. Ther. 2005.
[9] A. Akinc, D. M. Lynn, D. G. Anderson, R. Langer, J. Am. Chem. Soc. 2003.
[10] D. G. Anderson, D. M. Lynn, R. Langer, Angew. Chemie - Int. Ed. 2003.
[11] J. C. Sunshine, S. B. Sunshine, I. Bhutto, J. T. Handa, J. J. Green, PLoS One 2012.
[12] A. Mangraviti, S. Y. Tzeng, K. L. Kozielski, Y. Wang, Y. Jin, D. Gullotti, M. Pedone, N. Buaron, A. Liu, D. R. Wilson, S. K. Hansen, F. J. Rodriguez, G. D. Gao, F. Dimeco, H. Brem, A. Olivi, B. Tyler, J. J. Green, ACS Nano 2015.
[13] D. Zhou, L. Cutlar, Y. Gao, W. Wang, J. O. Keeffe-ahern, S. Mcmahon, B. Duarte, F. Larcher, B. J. Rodriguez, U. Greiser, W. Wang, Sci. Adv. 2016, 1.
[14] D. Zhou, Y. Gao, J. O’Keeffe Ahern, A. Sigen, Q. Xu, X. Huang, U. Greiser, W. Wang, ACS Appl. Mater. Interfaces 2016.
[15] D. Zhou, Y. Gao, A. Aied, L. Cutlar, O. Igoucheva, B. Newland, V. Alexeeve, U. Greiser, J. Uitto, W. Wang, J. Control. Release 2016.
[16] M. Zeng, D. Zhou, S. Ng, J. O. Ahern, F. Alshehri, Y. Gao, L. Pierucci, U. Greiser, W. Wang, Polymers (Basel). 2017, 9, 161.
[17] D. T. Woodley, M. Chen, Journal of Investigative Dermatology. 2015,.
[18] J.-D. Fine, L. Bruckner-Tuderman, R. A. J. Eady, E. A. Bauer, J. W. Bauer, C. Has, A. Heagerty, H. Hintner, A. Hovnanian, M. F. Jonkman, I. Leigh, M. P. Marinkovich, A. E. Martinez, J. A. McGrath, J. E. Mellerio, C. Moss, D. F. Murrell, H. Shimizu, J. Uitto, D. Woodley, G. Zambruno, J. Am. Acad. Dermatol. 2014.
[19] L. Cutlar, D. Zhou, X. Hu, B. Duarte, U. Greiser, F. Larcher, W. Wang, A non-viral gene therapy for treatment of recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Exp. Dermatol. 2016.
[20] J. W. Fountain, W. K. Lockwood, F. S. Collins, Gene 1988.
[21] T. Wong, L. Gammon, L. Liu, J. E. Mellerio, P. J. C. Dopping-Hepenstal, J. Pacy, G. Elia, R. Jeffery, I. M. Leigh, H. Navsaria, J. a McGrath, J. Invest. Dermatol. 2008.
[22] G. Petrof, M. Martinez-Queipo, J. E. Mellerio, P. Kemp, J. A. McGrath, Br. J. Dermatol. 2013.
[23] A. Nakayama, M. Sato, M. Shinohara, S. Matsubara, T. Yokomine, E. Akasaka, M. Yoshida, S. Takao, Cloning Stem Cells 2007.
[24] M. Lee, K. Chea, R. Pyda, M. Chua, I. Dominguez, J. Biomol. Tech. 2017.
[25] M. S. Tabar, M. Hesaraki, F. Esfandiari, F. S. Samani, H. Vakilian, H. Baharvand, Cell J. 2015.
[26] E. T. Jordan, M. Collins, J. Terefe, L. Ugozzoli, T. Rubio, J. Biomol. Tech. 2008.
[27] Y. Liu, D. Wu, Y. Ma, G. Tang, S. Wang, C. He, T. Chung, S. Goh, Chem. Commun. (Camb). 2003.
[28] J. J. Green, R. Langer, D. G. Anderson, A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Acc. Chem. Res. 2008.
[29] D. W. Pack, A. S. Hoffman, S. Pun, P. S. Stayton, Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 2005.
[30] M. A. Mintzer, E. E. Simanek, Nonviral vectors for gene delivery. Chem. Rev. 2009.
[31] D. V. Schaffer, N. A. Fidelman, N. Dan, D. A. Lauffenburger, Biotechnol. Bioeng. 2000.
[32] O. Zelphati, F. C. Szoka, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996.
[33] J. REJMAN, V. OBERLE, I. S. ZUHORN, D. HOEKSTRA, Biochem. J. 2004.
[34] A. Verma, O. Uzun, Y. Hu, Y. Hu, H. S. Han, N. Watson, S. Chen, D. J. Irvine, F. Stellacci, Nat. Mater. 2008.
[35] J. A. McGrath, A. Ishida-Yamamoto, A. O’Grady, I. M. Leigh, R. A. J. Eady, J. Invest. Dermatol. 1993, 100, 366.
[36] M. Goto, D. Sawamura, K. Ito, M. Abe, W. Nishie, K. Sakai, A. Shibaki, M. Akiyama, H. Shimizu, J. Invest. Dermatol. 2006.
[37] Z. Y. Chen, C. Y. He, A. Ehrhardt, M. A. Kay, Mol. Ther. 2003.
[38] F. Jia, K. D. Wilson, N. Sun, D. M. Gupta, M. Huang, Z. Li, N. J. Panetta, Z. Y. Chen, R. C. Robbins, M. A. Kay, M. T. Longaker, J. C. Wu, Nat. Methods 2010.
[39] C. Perdoni, M. J. Osborn, J. Tolar, Transl. Res. 2016.
[40] C. Georgiadis, F. Syed, A. Petrova, A. Abdul-Wahab, S. M. Lwin, F. Farzaneh, L. Chan, S. Ghani, R. A. Fleck, L. Glover, J. R. McMillan, M. Chen, A. J. Thrasher, J. A. McGrath, W. L. Di, W. Qasim, J. Invest. Dermatol. 2016.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБЫ ОБРАЗОВАНИЯ ПОЛИПЛЕКСОВ | 2019 |
|
RU2821521C2 |
| ПЕГИЛИРОВАННЫЕ ЛИПОСОМЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ КОДИРУЮЩЕЙ ИММУНОГЕН РНК | 2012 |
|
RU2628705C2 |
| УЛУЧШЕННЫЕ ПОЛИЭТИЛЕНИМИНОВЫЕ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕВЫЕ ВЕКТОРЫ | 2015 |
|
RU2771104C2 |
| ДОСТАВКА ГЕНОВ, ОПОСРЕДОВАННАЯ НАНОЧАСТИЦАМИ, ГЕНОМНАЯ КОРРЕКЦИЯ И ЛИГАНД-НАПРАВЛЕННАЯ МОДИФИКАЦИЯ В РАЗЛИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ | 2014 |
|
RU2670512C2 |
| ХИРАЛЬНЫЕ ДИАРИЛЬНЫЕ МАКРОЦИКЛЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2016 |
|
RU2728579C2 |
| МОДИФИЦИРОВАННЫЕ НУКЛЕОЗИДЫ, НУКЛЕОТИДЫ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2012 |
|
RU2707251C2 |
| МОДИФИЦИРОВАННЫЕ НУКЛЕОЗИДЫ, НУКЛЕОТИДЫ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2012 |
|
RU2648950C2 |
| РЕЦЕПТУРА ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ РНК | 2019 |
|
RU2797147C2 |
| Способ получения амфифильных блок-сополимеров N,N-диметиламиноэтилметакрилата для доставки нуклеиновых кислот в живые клетки | 2014 |
|
RU2617059C2 |
| АНТИТЕЛА И ИХ КОНЪЮГАТЫ | 2016 |
|
RU2744860C2 |
Настоящее изобретение относятся к разветвленным полимерам и полиплексам, которые находят свое применение в генной терапии в качестве безопасных и нетоксичных агентов для трансфекции нуклеиновых кислот. Предложен полиплекс, содержащий компонент нуклеиновой кислоты и сильноразветвленный поли(β-аминоэфир), представляющий собой соединение с структурной формулой
,
где каждый A независимо представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода, каждый B независимо представляет собой 
или 
; G представляет собой -C-; n равно по меньшей мере 1; каждый E1 представляет собой алкилен или гетероалкилен; каждый E2 выбран из группы, состоящей из алкилена или гетероалкилена; каждый X независимо представляет собой 
или 
; каждый Y независимо представляет собой 
или 
; каждый L представляет собой 
, где x равно 1-1000; или 
; каждый R1, R2 и R3 в каждом случае независимо представляют собой H, C1-C40 алкил или C1-C40 гетероалкил, а R1 и R2 является незамещённым или замещённым по меньшей мере одним из гидроксильной группы, аминогруппы или С3-С6 гетероциклической группы; a равно 1-1000; b равно 3; c равно 1-3; и z равно 1-100; при условии, что по меньшей мере один из R2 и R3 не является H. Указанный полиплекс используется для исправления дефектной трансляции гена COL7A1 при лечении дистрофического буллезного эпидермолиза. Предложенное изобретение является надежной невирусной системой доставки генов для трансфекции фибробластов с высокой эффективностью и безопасностью. 5 н. и 38 з.п. ф-лы, 21 ил., 2 табл., 10 пр.
1. Полиплекс, содержащий компонент нуклеиновой кислоты и сильноразветвленный поли(β-аминоэфир), в котором компонент нуклеиновой кислоты представляет собой наноплазмиду, мини-кольцо или систему редактирования гена, и сильноразветвленный поли(β-аминоэфир) имеет формулу (I)
(I)
где каждый A независимо представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода,
каждый B независимо представляет собой 
или 
;
G представляет собой -C-;
n равно по меньшей мере 1;
каждый E1 представляет собой алкилен или гетероалкилен;
каждый E2 выбран из группы, состоящей из алкилена или гетероалкилена;
каждый X независимо представляет собой 
или 
;
каждый Y независимо представляет собой 
или 
;
каждый L представляет собой 
, где x равно 1-1000; или
;
каждый R1, R2 и R3 в каждом случае независимо представляют собой H, C1-C40алкил или C1-C40гетероалкил, а каждый R1 и R2 является незамещённым или замещённым по меньшей мере одним из гидроксильной группы, аминогруппы или С3-С6гетероциклической группы;
a равно 1-1000;
b равно 3;
c равно 1-3; и
z равно 1-100;
при условии, что по меньшей мере один из R2 и R3 не является H.
2. Полиплекс по п. 1, в котором каждый B представляет собой 
или 
.
3. Полиплекс по п. 1, в котором каждый L представляет собой ,
где x равно 1-1000.
4. Полиплекс по п.1, в котором
a равно по меньшей мере 2;
b представляет собой 3; и
каждый X представляет собой .
5. Полиплекс по п. 1, в котором каждый A представляет собой 
.
6. Полиплекс по п. 1, в котором каждый L представляет собой .
7. Полиплекс по п.1, в котором Y представляет собой 
, а каждый B представляет собой или .
8. Полиплекс по п. 1, в котором каждый R2 и/или R3 представляет собой 
.
9. Полиплекс по п. 1, в котором каждый R1 представляет собой 
.
10. Полиплекс по п. 1, в котором компонент нуклеиновой кислоты представляет собой систему редактирования гена.
11. Полиплекс по п. 1 или 10, в котором система редактирования гена представляет собой (i) систему (Cas), ассоциированную с кластерными палиндромными повторами (CRISPR), разделенными регулярными промежутками; (ii) систему эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции (TALEN); или (iii) систему нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN).
12. Полиплекс по п. 1, в котором система редактирования гена представляет собой (i) систему (Cas), ассоциированную с кластерными палиндромными повторами (CRISPR), разделенными регулярными промежутками.
13. Полиплекс по любому одному из пп. 10-12, в котором геном является COL7A1.
14. Полиплекс по п. 1, в котором полиплекс доставляет функциональный ген COL7A1 для управления экспрессией белка коллагена (C7) типа VII.
15. Полиплекс по п. 1, в котором сильноразветвлённый поли(β-аминоэфир) имеет MW между около 5 кДа и около 50 кДа.
16. Полиплекс по любому одному из пп. 1 или 15, в котором сильноразветвлённый поли(β-аминоэфир) имеет MW от около 5 кДа до около 15 кДа.
17. Полиплекс по п. 1, в котором сильноразветвлённый поли(β-аминоэфир) имеет параметр альфа, определенный из уравнения Марка - Хаувинка, меньше чем около 0,5.
18. Полиплекс по любому одному из пп. 1 или 17, в котором сильноразветвлённый поли(β-аминоэфир) имеет параметр альфа, определенный из уравнения Марка - Хаувинка, от около 0,3 до около 0,5.
19. Полиплекс, содержащий компонент нуклеиновой кислоты и сильноразветвленный поли(β-аминоэфир), в котором компонент нуклеиновой кислоты представляет собой плазмиду, наноплазмиду, мини-кольцо или систему редактирования гена, и сильноразветвленный поли(β-аминоэфир) получен способом, включающим взаимодействие:
(a) соединения формулы (A)
(A);
(b) первого амина, имеющего формулу R1-NH2;
(с) второго амина, имеющего формулу R2-NH2; и
(d) соединения формулы (B)
(B),
где каждый J независимо представляет собой -O-;
Z и Z' являются связывающими фрагментами;
A представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода;
G представляет собой -C-;
каждый Q представляет собой H;
каждый E1 представляет собой гетероалкилен;
R1 и R2 каждый независимо представляет собой C1-C40алкил или C1-C40гетероалкил; и каждый R1 и R2 является незамещенным или замещенным по меньшей мере одним из следующего: гидроксилом, аминогруппой или C3-C6гетероциклилом; и
каждое n равно по меньшей мере 1.
20. Полиплекс по п. 19, в котором соединение формулы (В) представляет собой
.
21. Полиплекс по п. 19, в котором Z представляет собой:
(i) линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода или содержащую гетероатом разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов;
(ii) линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 10 атомов углерода;
(iii) 
, где x равно 1-1000; или
(iv) 
.
22. Полиплекс по п. 19 или 21, в котором Z представляет собой .
23. Полиплекс по п. 19, в котором:
a) J представляет собой О, каждый Q представляет собой Н и Z представляет собой ; и
b) первый амин представляет собой R1-NH2, где R1 представляет собой 
.
24. Полиплекс по п. 19, в котором:
a) J представляет собой О, каждый Q представляет собой Н и Z представляет собой ;
b) первый амин представляет собой R1-NH2, где R1 представляет собой ; и
c) второй амин представляет собой .
25. Полиплекс по п. 19, в котором R1 и R2 независимо выбирают из группы, состоящей из 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, , 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, и 
.
26. Полиплекс по п.19 или 25, в котором R1 представляет собой , а R2 .
27. Полиплекс, содержащий компонент нуклеиновой кислоты и сильноразветвленный поли(β-аминоэфир), в котором компонент нуклеиновой кислоты представляет собой наноплазмиду, мини-кольцо или систему редактирования гена, и сильноразветвленный поли(β-аминоэфир) содержит:
(a) 
;
(b) 
; и
(c) 
или
каждый J независимо представляет собой -O-;
Z представляет собой связывающий фрагмент;
A представляет собой линейную или разветвленную углеродную цепь из от 1 до 30 атомов углерода;
G представляет собой -C-;
каждый Q представляет собой H;
каждый E1 представляет собой гетероалкилен;
R1 и R2 каждый независимо представляет собой C1-C40алкил или C1-C40гетероалкил; и каждый R1 и R2 является незамещенным или замещенным по меньшей мере одним из следующего: гидроксилом, аминогруппой, C3-C6гетероциклилом; и каждое n равно по меньшей мере 1.
28. Полиплекс по п. 27, в котором сильноразветвленный поли(β-аминоэфир) содержит:
(a) 
; и
(b) 
.
29. Полиплекс по п. 27, в котором сильноразветвленный поли(β-аминоэфир) содержит:
(a) 
;
(b) 
; и
(c) ,
где R1 представляет собой 
, а
R2 выбран из .
30. Полиплекс по п. 27, в котором сильноразветвленный поли(β-аминоэфир) содержит:
(a) 
;
(b) ; и
(c) 
,
в котором Q представляет собой Н, J является О, а Z - 
, где х составляет 1-1000;
R1 представляет собой , а
R2 представляет собой 
.
31. Полиплекс по любому из пп. 19-30, в котором сильноразветвленный поли(β-аминоэфир) имеет MW от около 5 кДа до около 50 кДа.
32. Полиплекс по любому из пп. 19-30, в котором сильноразветвленный поли(β-аминоэфир) имеет MW от около 5 кДа до около 15 кДа.
33. Полиплекс по любому одному из пп. 19-30, в котором компонент нуклеиновой кислоты содержит ген, ассоциированный с генетическим нарушением или заболеванием.
34. Полиплекс по п. 33, в котором такое генетическое нарушение или заболевание вызваны мутацией одного или большего количества генов, которая приводит к пониженной экспрессии, отсутствующей экспрессии или экспрессии дисфункционального белка.
35. Полиплекс по п. 33, в котором такой ген выбран из группы, состоящей из COL7A1, LAMB3, ADA, SERPINA1, CFTR, HTT, NF1, PHA, HBS, FERMT1, KRT14, DSP, SPINK5 и FLG.
36. Полиплекс по п.33 или 35, в котором ген представляет собой COL7A1.
37. Полиплекс по п.33 или 35, в котором геном является COL7A1, а генетическим нарушением или заболеванием является какая-либо форма буллезного эпидермолиза.
38. Полиплекс по любому одному из пп. 35-37, в котором последовательность гена оптимизирована для максимальной экспрессии белка при доставке полиплекса в клетку.
39. Способ трансфекции клеток, включающий приведение одной или более клеток-мишеней, содержащих мутацию COL7A1, в контакт с полиплексом по любому одному из пп. 1-38 в условиях, пригодных для трансфекции клетки-мишени полиплексом.
40. Способ по п. 39, в котором одной или большим количеством клеток-мишеней являются эукариотические клетки.
41. Способ по п. 40, в котором одной или большим количеством клеток-мишеней являются кератиноциты.
42. Способ лечения буллезного эпидермолиза у нуждающегося в этом пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества полиплекса по любому одному из пп. 1-38, в котором введение такого полиплекса исправляет дефектную трансляцию COL7A1 гена у субъекта.
43. Способ по п. 42, в котором такое заболевание представляет собой дистрофический буллезный эпидермолиз (аутосомно-рецессивный) или дистрофический буллезный эпидермолиз (локализованная форма).
| WO 2016020474 A1, 11.02.2016 | |||
| Zhou, D., at al (2016) | |||
| Кипятильник для воды | 1921 |
|
SU5A1 |
| ACS Applied Materials & Interfaces, 8(50), 34218-34226 | |||
| WO 2006118547 A1, 11.02.2016 | |||
| СТИМУЛЯЦИЯ ПУТИ Wnt ПРИ ПЕРЕПРОГРАММИРОВАНИИ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК | 2008 |
|
RU2492232C2 |
