УЛУЧШЕННЫЕ ПОЛИЭТИЛЕНИМИНОВЫЕ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕВЫЕ ВЕКТОРЫ Российский патент 2022 года по МПК A61K31/7115 A61K47/34 C07K17/06 A61K9/51 B82Y5/00 C07K16/28 C12N15/117 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение относится к невирусным полиплексам на основе полиэтиленимина, конъюгированным с нацеливающимся фрагментом, способным к связыванию с раковым антигеном.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Одним из препятствий, с которым сталкивается молекулярная медицина, является направленная доставка терапевтических агентов, таких как молекул ДНК или РНК. Перспективной стратегией является конструирование невирусных векторов, таких как катионные полимеры и катионные липиды, которые связывают и конденсируют нуклеиновые кислоты. Данные невирусные катионные векторы обладают многими преимуществами по сравнению с вирусными векторами гена, так как они не иммуногенны, не онкогенны и их легко синтезировать [1-4]. В настоящее время разрабатываются несколько синтетических поликатионных полимеров для доставки нуклеиновой кислоты. Среди них полиэтиленимины (PEI) рассматриваются в качестве перспективных агентов для доставки генов [5].

[0003] PEI представляют собой водорастворимые органические макромолекулы, которые доступны как в качестве линейных, так и разветвленных структур [6]. PEI меняют свою степень ионизации в широком диапазоне рН, поскольку каждый третий атом в их основной цепи представляет собой аминоазот, который может быть протонирован. Приблизительно 55% атомов азота в PEI протонируются при физиологическом значении рН [7]. Они обладают высокой катионной плотностью заряда и, таким образом, способны образовывать нековалентные комплексы с нуклеиновыми кислотами. Более того, их физико-химические и биологические свойства можно изменять при помощи различных химических модификаций [8]. Комплексы на основе PEI (также известные как полиплексы) могут быть эндоцитированы многими типами клеток [9]. После интернализации полиплексов, "эффект протонной губки" диктует высвобождение эндосом и перенос генов высокой эффективности [10]. Способность PEI конденсировать ДНК, по всей видимости, является важным фактором в доставке больших ДНК-конструкций во многие типы клеток.

[0004] Основной проблемой использования PEI в качестве носителей для доставки является токсичность вследствие их высокого положительного поверхностного заряда, что может привести к неспецифическому связыванию [11]. Недавние попытки осуществлялись для того, чтобы улучшить селективность и биосовместимость невирусных векторов. Это привело к модификации молекул PEI с полиэтиленгликолем (PEG) в целях экранирования частицы PEI [12]. Конъюгация гетеробифункциональных PEG-групп с PEI облегчает связывание PEI с нацеливающимся лигандом, который обеспечивает эффективную доставку генов в клетки, несущие когнатный рецептор [12]. Авторы настоящего изобретения ранее уже описывали поколение нацеливающихся векторов, демонстрируя разницу между разветвленным PEI (brPEI-EGF) и линейным PEI (LPEI), прикрепленных к EGF в качестве нацеливающихся векторов [13, WO 2004/045491, WO 2010/073247]. Недостаток современных способов синтеза заключается в том, что они приводят к образованию недостаточно гомогенных продуктов. Таким образом, существует острая потребность в разработке способов, которые могут обеспечить эффективную конъюгацию нацеливающихся фрагментов с LPEI-PEG воспроизводимым образом, для того чтобы образовывать гомогенные партии продуктов, надежно применяемых в способах для лечения рака.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к полиплексу двухцепочечной РНК (дцРНК) и полимерного конъюгата, при этом указанный полимерный конъюгат состоит из линейного полиэтиленимина (LPEI), ковалентно связанного с одним или более фрагментами полиэтиленгликоля (PEG), каждый PEG-фрагмент конъюгирован посредством линкера с нацеливающимся фрагментом, способным к связыванию с раковым антигеном при условии, что нацеливающийся фрагмент не представляет собой EGF мыши (mEGF) или пептид согласно последовательности YHWYGYTPQNVI (GE11) (SEQ ID №: 1).

[0006] В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель и полиплекс по настоящему изобретению, определенный в настоящем описании.

[0007] В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает полиплекс по настоящему изобретению, определенный в настоящем описании, или фармацевтическую композицию, содержащую полиплекс, для применения для лечения рака, выбранного из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспессирующими EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы.

[0008] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы, способу, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, полиплекса по настоящему изобретению, определенного в настоящем описании.

[0009] В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и полиплекс по настоящему изобретению, для лечения рака, выбранного из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы.

[0010] Полиплекс по настоящему изобретению можно применять в комбинации с иммунными клеткам.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0011] На Фигуре 1 представлено, что конъюгация LPEI (~22 кДа) с NHS-PEG-OPSS (~ 2 кДа) в основном позволяет получить две сополимерные сетки, которые различаются по степени РЕGилирования. Сополимер LPEI-(PEG_2k-OPSS)₃ ("ди-конъюгат 1:3") состоял в среднем из 1 моль LPEI и 3 моль PEG, в то время как сополимер LPEI-PEG_2k-OPSS ("ди-конъюгат 1:1") состоял в среднем из 1 мольного соотношения LPEI и 1 моль PEG. (соотношения LPEI:PEG определяли при помощи анализа ПМР (¹H-NMR)).

[0012] На Фигуре 2 представлен ПМР-анализ двух ди-конъюгатов, LPEI-PEG_2k-OPSS (ди-конъюгат 1:1) и LPEI-(PEG_2k-OPSS)₃ (ди-конъюгат 1:3). На присоединение PEG-групп к LPEI указывало наличие химических сдвигов, которые коррелируют с водородами этиленгликоля (а) при 3,7 ppm и водородами этиленимина при ~ 3,0 ppm (b). Интегральные значения данных пиков обеспечивают молярные соотношения PEG к LPEI, по которым вывели указанные проиллюстрированные структуры ди-конъюгата 1:1 (А) и ди-конъюгата 1:3 (В).

[0013] На Фигуре 3 представлена схема для конъюгации сополимерных сеток (ди-конъюгат 1:1 и ди-конъюгат 1:3) с аффителом ("Her-2") посредством дисульфидного обмена, приводящего к образованию двух различно РЕGилированных три-конъюгатов [20].

[0014] На Фигуре 4 изображен ДСН-ПААГ-электрофорез очищенного аффитела, ди-конъюгата и три-конъюгата в отсутствие и в присутствии ДТТ. В присутствии ДТТ аффитело высвобождается из три-конъюгата и мигрирует наряду с очищенным аффителом (чуть выше 10 кДа).

[0015] На Фигуре 5 представлено измерение размеров частиц с применением измерений DLS (динамического светорассеяния) LPEI, ди-конъюгатов и три-конъюгатов, находящихся в комплексе с плазмидой pGreenfire 1 в HBG буфере рН 7,4.

[0016] На Фигуре 6 изображены распределения ξ-потенциалов LPEI, ди-конъюгатов и три-конъюгатов, находящихся в комплексе с плазмидой pGreenfire1. ξ-потенциалы измеряли при помощи DLS и рассчитывали по уравнению Смолуховского.

[0017] На Фигурах 7А-В представлены изображения атомно-силовой микроскопии (АСМ), полученные от измерений, выполненных в HBG-буфере рН 7,4 для обоих полиплексов. (А) три-конъюгатный 1:1 полиплекс (В) три-конъюгатный 1:3 полиплекс. Масштабная отметка равна 1 мкм.

[0018] На Фигуре 8 изображен агар-гель, показывающий, что дифференциально РЕGилированные полиплексы защищают плазмиду pGreenFire1 от разложения ДНКазой I. 1 мкг плазмиды (pGreenFire1) по отдельности или в три-конъюгатных полиплексах: 1:1 и 1:3 обрабатывали в присутствии или без ДНКазы I (2 ME). Суперспиральная плазмида (s.c), открытая кольцевая плазмида (о.с).

[0019] На Фигурах 9А-С представлен HER-2-опосредованный перенос pGFP-LUC гена с применением три-конъюгатного 1:1 полиплекса и три-конъюгатного 1:3 полиплекса, содержащих соотношение LPELPEG 1:1 и 1:3 соответственно. 10000 ВТ474 и MDA-MB-231 клеток рака молочной железы на лунку обрабатывали в течение 48 ч с три-конъюгатами 1:1 и 1:3, находящимися в комплексе с pGFP-LUC (1 мкг/мл), чтобы образовать два полиплекса. Соотношение азот PEI/фосфат ДНК равнялось 6 (N/P=6) в HBS. (А) Измерения активности люциферазы демонстрируют значимую уменьшенную доставку pGreenFire1 в MDA МВ-231 клетки по сравнению с ВТ474 и пониженную доставку генов, опосредованную три-конъюгатными 1:3 полиплексами по сравнению с три-конъюгатными 1:1 (*р<0,001). Активность люциферазы измеряли в трех повторах через 48 ч., представленную в виде относительных люциферазных единиц (RLU) как среднее значение + стандартное отклонение. (В) Флуоресцентные изображения клеток, обработанные полиплексами. Изображения представлены при десятикратном увеличении и являются примерами трех проведенных экспериментов. (С) Анализ метиленовым синим изображает процент выживаемости клеток по сравнению с необработанными (UT) клетками.

[0020] На Фигуре 10 представлено, что PEI-РЕС-Неr2Аффитело (РРНА), находящееся в комплексе с PolyIC, ингибирует ВТ474 клетки рака молочной железы, гиперэкспрессирующие Her2. Комплексный вектор ингибирует клетки, гиперэкспрессирующие Her2, включая клетки, резистентные к Герцептину/трастузумабу.

[0021] На Фигуре 11 представлено ингибирование MCF7 клеток, гиперэкспрессирующих Her2, инъецированных бестимусным мышам.

[0022] На Фигурах 12А-В представлена эффективность (А) PEI-PEG-ЕGFRAффитела (РРЕАффитела) в сравнении с активностью (В) РРЕ.

[0023] На Фигуре 13 представлена активность PolyIC/РРЕАффитела in vivo по сравнению с необработанными (UT), pIC/PPE, pI/РРЕ, pI/РРЕА и низким pIC/PPEA (0,1 мкг/мкл pIC в комплексе).

[0024] На Фигуре 14 представлена выживаемость U87MG, U87MGwtEGFR клеток после применения различных концентраций PolyIC/LPEI-PEG-hEGF комплекса по сравнению с применением PolyIC/mPPE (мыши), описанного в Schaffert D, Kiss М, Rodl W, Shir A, Levitzki A, Ogris M, Wagner E. (2011) Poly(I:C)-mediated tumor growth suppression in EGF-receptor overexpressing tumors using EGF-polyethylene glycol-linearpolyethylenimine as carrier. Pharm Res. 28:731-41.

[0025] На Фигуре 15 представлено, что PEI-PEG(PP)-DUPA(PPD)/PolyIC является высоко эффективным против LNCaP и VCAP клеток. Жизнеспособность измеряли после 96 часов воздействия.

[0026] На Фигурах 16А-В представлено образование цитокинов (A) IP-10, (В) RANTES LNCaP клеткой, трансфицированной PolyIC/PPD.

[0027] На Фигуре 17 представлено, что среда, кондиционированная LNCaP клетками, стимулирует экспрессию цитокинов в МКПК. Экспрессия после 24 ч инкубации.

[0028] На Фигуре 18 представлено, что совместная инкубация обработанных PolyIC/PPD LNCaP клеток с РС3-люциферазными клетками, которые не экспрессируют PSMA, приводит к более 70% гибели РС3-люциферазных клеток через эффект "свидетеля". Добавление здоровых МКПК человека резко улучшает эффект и приводит к гибели 90% РС3-клеток.

[0029] На Фигуре 19 представлено воздействие PolyIC/PPD на подкожные LNCaP опухоли in vivo. UT, необработанные.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0030] Поликатионы, в особенности PEI, интенсивно исследовались в качестве агентов для трансфекции генов. Оптимальные эффекты от трансфекции получают, когда полимерные комплексы наночастиц обладают общим положительным зарядом, который позволяет им связываться с отрицательно заряженными гепаринсульфатпротеогликанами на клеточной поверхности [28]. Предыдущие исследования показали, что линейный PEI (LPEI) является более эффективным при трансфекции генов, чем разветвленный PEI (brPEI) [29-31] [32, 33, WO 2010/073247], однако LPEI имеет более высокий положительный заряд и, следовательно, является более токсичным. Осуществляли конъюгацию различных объектов экранирования, таких как PEG [12], поли-(этиленоксид)-поли(пропиленоксид)-поли(этиленоксид) (ПЭО-ППО-ПЭО) [18, 34] и поли(этиленоксид) [35], с катионными полимерами в попытке снизить положительный заряд и, как следствие, токсичность. Экранирование PEI PEG-группами различной длины действительно значимо снижало токсичность при сохранении эффективности трансфекции [12, 13, 36].

[0031] В соответствии с настоящим изобретением было установлено, что конъюгация LPEI с PEG_2k позволяет получить ди-конъюгатные сополимеры, содержащие различные соотношения LPEI к PEG_2k. Данные ди-конъюгаты можно отделить друг от друга, применяя катионообменную хроматографию из-за различий в заряде, которые отображают различное число конъюгированных PEG_2k-групп. ПМР-анализ подтвердил, что ди-конъюгаты отличались друг от друга по среднему числу PEG_2k-единиц на единицу LPEI, где ди-конъюгат 1:1 обладал соотношением LPEI:PEG_2k 1:1 и ди-конъюгат 1:3 обладал соотношением LPEI:PEG_2k 1:3. Конъюгация Her-2-нацеливающегося аффитела с каждым из очищенных ди-конъюгатов позволяет получить три-конъюгатный продукт соответствующей молекулярной массы, т.е. из ди-конъюгата 1:1 авторы настоящего изобретения получили "три-конъюгат 1:1" с LPEI:PEG_2k:Her-2 равным 1:1:1 и из ди-конъюгата 1:3 авторы настоящего изобретения получили "три-конъюгат 1:3" с соотношением 1:3:3. Данный протокол позволил авторам настоящего изобретения получить однородные продукты при почти полной конъюгации нацеливающегося аффитела с LPEI-PEG воспроизводимым образом.

[0032] Авторы настоящего изобретения наблюдали, что РЕGилирование сильно влияет на размер полиплексных частиц, получаемых при комплексообразовании ди-конъюгатов или три-конъюгатов с плазмидной ДНК. Как ди-конъюгатные 1:3, так и три-конъюгатные 1:3 полиплексы обладали средним размером частиц больше, чем ди-конъюгатные 1:1 и три-конъюгатные 1:1 полиплексы. Авторы настоящего изобретения считают, что увеличение количества РЕGилирований на одиночной катионной цепи приводит к стерическому затруднению, что предотвращает полимерную цепь от конденсации указанной плазмиды в более маленькую частицу. Это согласуется с обнаруженным фактом, что полиплекс с оголенным LPEI обладал самыми маленькими частицами. К тому же, в то время как три-конъюгаты 1:1 и 1:3 защищали комплексную плазмиду от ДНКазы I, три-конъюгатный 1:3 полиплекс обеспечивал лучшую защиту, возможно вследствие увеличенных стерических затруднений.

[0033] Предыдущие исследования показали, что увеличение молекулярной массы PEG-единиц, конъюгированных с катионными полимерами, приводило к уменьшенному поверхностному заряду полиплексов, полученных при комплексообразовании с нуклеиновыми кислотами [13]. Данные авторов настоящего изобретения показывают, что увеличение числа PEG-групп схожих молекулярных масс приводит к уменьшенному поверхностному заряду, определенному при помощи распределения ξ-потенциала. Самый высокий поверхностный заряд действительно показал оголенный LPEI, находящийся в комплексе с плазмидой. Данные результаты подтверждают идею о том, что чем больше нейтральных объектов присутствуют в химическом векторе, тем меньше поверхностный заряд. Неожиданно три-конъюгатные полиплексы, конъюгированные с аффителами, обладали более низким поверхностным зарядом, нежели чем ди-конъюгатные полиплексы, представляя, что Her-2 аффитело (которое само по себе обладает небольшим положительным зарядом) также снижало поверхностный заряд частиц. Авторы настоящего изобретения подозревают, что Her-2 аффитело изменяет топографию частицы с более нацеливающимися фрагментами, маскирующими заряд на поверхности, что приводит к уменьшению поверхностного заряда.

[0034] Форма полиплекса оказывает существенное влияние на его показатели работы в качестве кандидата для доставки лекарственного средства [37,38], хотя пока не известно, какие полиплексные формы являются желательными для эффективной доставки лекарственного средства. Воздействие РЕGилирования на полиплексную форму, насколько известно авторам настоящего изобретения, до сих пор не исследовали. В АСМ-изображениях, три-конъюгатный 1:1 полиплекс, который был более эффективным в доставке генов, представлял гомогенность формы, в то время как три-конъюгатный 1:3 был более гетерогенным со множеством асимметричных, эллипсоидальных частиц.

[0035] Селективный перенос генов с применением катионных полимеров остается серьезной проблемой. Предыдущие исследования показали, что нацеливание LPEI и LPEI-PEG конъюгатов с EGF или трансферрином повышало их селективность и снижало неспецифичные взаимодействия как in vitro, так и in vivo [39, 40]. Например, для изучения селективности исследуемых Her-2-нацеливающихся три-конъюгатных 1:1 и 1:3 полиплексов, авторы настоящего изобретения использовали две клеточных линии рака молочной железы, которые дифференцированно экспрессируют Her-2. Доставка генов, представленная активностью люциферазы и экспрессией GFP, была значительно выше в ВТ474 клетках, который сильно гиперэкспрессируют Her-2-рецептор, чем в MDA-MB-231 клетках, которые экспрессируют 100-кратно меньше Her-2-рецепторов на клеточной поверхности. Таким образом данные показывают, что оба три-конъюгата 1:1 и 1:3 являются высоко селективными для клеток, гиперэкспрессирующих Her-2 (Фигура 10).

[0036] Предыдущие исследования показали, что высокие уровни РЕGилирования могут привести к пониженной трансфекции генов [41]. Данные результаты находятся в соответствии с наблюдением авторов настоящего изобретения, что высоко РЕGилированный три-конъюгатный 1:3 полиплекс продемонстрировал значимое снижение в доставке генов по сравнению с менее РЕGилированным три-конъюгатным 1:1 полиплексом, представленное посредством активности люциферазы и экспрессии GFP. Увеличенная доставка генов при помощи менее РЕGилированного три-конъюгатного 1:1 полиплекса сопровождалась небольшой клеточной токсичностью, скорее всего, вследствие его более высокого поверхностного заряда.

[0037] До участия в данном исследовании, рабочая гипотеза авторов настоящего изобретения заключалась в том, что увеличение числа нацеливающихся фрагментов на единицу LPEI должно было привести к улучшенной доставке генов и/или селективности. Авторы настоящего изобретения предполагали, что три-конъюгат 1:3, который обладает 3 моль молекул Her-2 аффитела, конъюгированных на моль LPEI, будет демонстрировать увеличенную рецептор-опосредованную интернализацию частиц. Тем не менее, три-конъюгатные 1:3 полиплексы показали более низкий ξ-потенциал, более значительный размер частиц и гетерогенную несферическую форму, все характеристики из которых могли способствовать реально наблюдаемым уменьшенным трансфекционным эффективностям. Результаты авторов настоящего изобретения показывают, что менее РЕGилированный три-конъюгат 1:1 превосходит более РЕGилированный три-конъюгат 1:3 в опосредовании селективной и эффективной доставки генов в клетки, гиперэкспрессирующих Her-2.

[0038] В соответствии с настоящим изобретением было установлено, что РЕСилирование полиплексов на основе LPEI приводит к уменьшенному поверхностному заряду, увеличенному размеру полиплекса и увеличенной гетерогенности формы, и что данные свойства могут оказать сильное воздействие на нацеленную доставку генов. Упрощенный синтез авторов настоящего изобретения допускает очистку гомогенных продуктов воспроизводимым образом, который теперь может быть расширен для того, чтобы образовать различные три-конъюгаты, применяя различные нацеливающиеся фрагменты.

[0039] С учетом вышесказанного настоящее изобретение в одном аспекте обеспечивает полиплекс двухцепочечной РНК (дцРНК) и полимерного конъюгата, при этом указанный полимерный конъюгат состоит из линейного полиэтиленимина (LPEI), ковалентно связанного с одним или более фрагментами полиэтиленгликоля (PEG), каждый PEG-фрагмент конъюгирован через линкер с нацеливающимся фрагментом, способным к связыванию с раковым антигеном, при условии, что нацеливающийся фрагмент не является mEGF или пептидом согласно последовательности YHWYGYTPQNVI (GE11) (SEQ ID №: 1).

[0040] В определенных вариантах реализации указанный раковый антиген может представлять собой, но не ограничиваться этим, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), рецептор эпидермального фактора роста человека 2 (HER2), простатический специфический мембранный антиген (PSMA), рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R), рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR), рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR) или рецептор фактора роста фибробластов (FGFR). Нацеливающийся фрагмент может быть нативным, природным или модифицированным лигандом или его паралогом, или ненативным лигандом, таким как антитело, одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv) или миметиком антитела, таким как аффитело, к любым раковым антигенам. Основу аффител составляет Z-домен (иммуноглобулин-G-связывающий домен) белка А, и уникальные свойства связывания приобретаются посредством рандомизации 13 аминокислот, расположенных в двух альфа-спиралях, вовлеченных в активность связывания домена родительского белка.

[0041] В определенных вариантах реализации настоящего изобретения дцРНК представляет собой двухцепочечную РНК полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (polyI:C), полимерный конъюгат состоит из LPEI, ковалентно связанного с одним PEG-фрагментом (LPEI-PEG 1:1) или тремя PEG-фрагментами (LPEI-PEG 1:3), и раковый антиген представляет собой EGFR, HER2 или PSMA.

[0042] Молекулярная масса PEG может находиться в диапазоне от 2 до 8 кДа, в частности, 2 кДа; молекулярная масса LPEI может находиться в диапазоне от 10 до 30 кДа, в частности, 22 кДа; и polyI:C полиплекса по настоящему изобретению можно сформировать из РНК нитей, каждая из которых содержит по меньшей мере 22, предпочтительно по меньшей мере 45 рибонуклеотидов. В определенных вариантах реализации каждая нить содержит число рибонуклеотидов в диапазоне от 20 до 300.

[0043] В определенных вариантах реализации один или более PEG-фрагментов каждый независимо образует -NH-CO- связь с LPEI и связь с линкером, выбранную из -NH-CO-, -СО-NH-, -S-C-, -S-S-, -О-СО- или -СО-O-. В частности, каждый из одного или более PEG-фрагментов образует -NH-CO- связи с LPEI и линкером.

[0044] В определенных вариантах реализации линкер образует -S-S-, NH-CO-, -CO-NH-, -S-C-, О-СО-, -СО-О- или мочевинную (-NH-CO-NH) связь с нацеливающимся фрагментом. Линкер можно выбрать из -CO-R₂-R_x-R₃ или пептидного фрагмента, состоящего из 3 до 7 аминокислотных остатков, при этом

R₂ выбран из (С₁-С₈)алкилена, (С₂-С₈)алкенилена, (С₂-С₈)алкинилена, (С₆-С₁₀)арилендиила или гетероарилендиила;

R_x отсутствует или представляет собой -S-;

R₃ отсутствует или представлен согласно формуле

R₄ выбран из (С₁-С₈)алкилена, (С₂-С₈)алкенилена, (С₂-С₈)алкинилена, (С₁-С₈)алкилен-(С₃-С₈)циклоалкилена, (С₂-С₈)алкенилен-(С₃-С₈)циклоалкилена, (С₂-С₈)алкинилен-(С₃-С₈)циклоалкилена, (С₆-С₁₀)арилендиила, гетероарилендиила, (С₁-С₈)алкилен-(С₆-С₁₀)арилендиила или (С₁-С₈)алкиленгетероарилендиила;

при этом каждый из указанного (С₁-С₈)алкилена, (С₂-С₈)алкенилена или (С₂-С₈)алкинилена необязательно замещен одной или более группами, каждая из которых независимо выбрана из галогена, -COR₅, -COOR₅, -OCOOR₅, - OCON(R₅)₂, -CN, -NO₂, -SR₅, -OR₅, -N(R₅)₂, -CON(R₅)₂, -SO₂R₅, -SO₃H, -S(=O)R₅, (С₆-С₁₀)арила, (С₁-С₄)алкилен-(С₆-С₁₀)арила, гетероарила или (С₁-С₄)алкиленгетероарила, а также необязательно прерван одним или более одинаковыми или различными гетероатомами, выбранными из S, О или N и/или по меньшей мере одной группой, каждая из которых независимо выбрана из -NH-CO-, -CO-NH-, -N(R₅)-, -N(С₆-С₁₀арил)-, (С₆-С₁₀)арилендиила или гетероарилендиила; и

R₅ представляет собой Н или (С₁-С₈)алкил.

[0045] В определенных вариантах реализации R₂ выбран из (С₁-С₈)алкилена, предпочтительно (С₁-С₄)алкилена, необязательно замещенного одной или более группами, каждая из которых независимо выбрана из галогена, -СОН, -СООН, -ОСООН, -OCONH₂, -CN, -NO₂, -SH, -ОН, -NH₂, -CONH₂, -SO₂H, -SO₃H, -S(=O)H, (С₆-С₁₀)арила, (С₁-С₄)алкилен-(С₆-С₁₀)арила, гетероарила или (C₁-С₄)алкиленгетероарила, а также необязательно прерванного одним или более одинаковыми или различными гетероатомами, выбранными из S, О или N, и/или по меньшей мере одной группой, каждая из которых независимо выбрана из -NH-CO-, -CO-NH-, -NH-, -N(С₁-С₈алкил)-, -N(C₆-С₁₀арил)-, (С₆-С₁₀)арилендиила или гетероариледиила. В частности R₂ выбран из (С₁-С₈)алкилена, предпочтительно (С₁-С₄)алкилена.

[0046] В определенных вариантах реализации R_x представляет собой -S-.

[0047] В определенных вариантах реализации R₃ отсутствует или представляет собой

при этом

R₄ представляет собой (С₁-С₈)алкилен-(С₃-С₈)циклоалкилен, предпочтительно (C₁-С₄)алкилен-(С₅-С₆)циклоалкилен.

[0048] В определенных вариантах реализации в полиплексе, определенном выше, R₂ представляет собой -СН₂-СН₂-; R_x представляет собой -S-, a R₃ отсутствует или представляет собой , при этом R₄ представляет собой

[0049] В определенных вариантах реализации линкер представляет собой пептидный фрагмент, содержащий по меньшей мере один, в частности, два или три остатка ароматических аминокислот, таких как фенилаланина, триптофана, тирозина или гомофенилаланина. В определенных вариантах реализации пептидный фрагмент представляет собой -(NH-(CH₂)₇-CO)-Phe-Gly-Trp-Trp-Gly-Cys- (SEQ ID №: 2) или -(NH-(CH₂)₇-CO)-Phe-Phe-(NH-CH₂-CH(NH₂)-CO)-Asp-Cys- (SEQ ID №: 3), связанный через свою меркаптогруппу с нацеливающимся фрагментом.

[0050] В определенных вариантах реализации изобретения полимерный конъюгат представляет собой ди-конъюгат согласно формуле (i)-(viii), связанный с нацеливающимся фрагментом/фрагментами:

(i)

(ii)

(iii) -(NH-(CH₂)₇-CO)-Phe-Phe-(NH-CH₂-CH(NH₂)-CO)-Asp-Cys-PEG_2k-LPEI;

(iv) -(NH-(CH₂)₇-CO)-Phe-Gly-Trp-Trp-Gly-Cys-PEG_2k-LPEI;

(v)

(vi)

(vii)

где R₆ представляет собой

или

(viii)

где R₇ представляет собой

[0051] В конкретных вариантах реализации указанный полиплекс выбран из

(a) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой HER2 аффитело, и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (i), и HER2 аффитело связано через его меркаптогруппу, в настоящем описании также упоминаемого как LPEI-PEG_2k-HER2;

(b) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой HER2 аффитело, и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (v), и HER2 аффитело связано через его меркаптогруппу, в настоящем описании также упоминаемого как к LPEI-(PEG_2k-HER2)₃;

(c) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой EGFR аффитело, и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (i), и EGFR аффитело связано через его меркаптогруппу, в настоящем описании также упоминаемого как LPEI-PEG_2k-EGFR;

(d) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой EGFR аффитело, и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (у), и EGFR аффитело связано через его меркаптогруппу, в настоящем описании также упоминаемого как LPEI-(PEG_2k-EGFR)3;

(e) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой EGF человека (hEGF). и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (ii), при этом указанный hEGF связан через его аминогруппу, в настоящем описании также упоминаемого как LPEI-PEG_2k-hEGF;

(f) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой hEGF, и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (vi), при этом указанный hEGF связан через его аминогруппу, в настоящем описании также упоминаемого как LPEI-(PEG_2k-hEGF)₃;

(g) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой HOOC(CH₂)₂-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH₂)₂-CO- (DUPA-остаток), и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (iii);

(h) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой HOOC(CH₂)₂-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH₂)₂-CO- (DUPA-остаток), и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (vii);

(i) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой HOOC(CH₂)₂-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH₂)₂-CO- (DUPA-остаток), и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (iv); или

(j) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой HOOC(CH₂)₂-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH₂)₂-CO- (DUPA-остаток), и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (viii).

[0052] Размер наночастиц, сформированных при помощи полиплекса по настоящему изобретению, может находиться в диапазоне от 120 до 150 нм, в частности 135-148 нм или 142 нм.

[0053] Не ограничивающие примеры процедур для получения полимерных конъюгатов, применяемых в настоящем изобретении, представлены в приведенных ниже Примерах.

[0054] В конкретных вариантах реализации EGFR аффителу соответствует аминокислотная последовательность, указанная в SEQ ID №: 4, HER2 аффителу соответствует аминокислотная последовательность, указанная в SEQ ID №: 5, и hEGF соответствует аминокислотная последовательность, указанная в SEQ ID №: 6.

[0055] В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и полиплекс, определенный выше.

[0056] В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен полиплекс по настоящему изобретению, определенный в настоящем описании, или фармацевтическая композиция, содержащая полиплекс, для применения для лечении рака, выбранного из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы.

[0057] В определенных вариантах реализации рак, характеризующийся клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, выбран из немелкоклеточной легочной карциномы, рака молочной железы, глиобластомы, плоскоклеточного рака головы и шеи, колоректального рака, аденокарциномы, рака яичников, рака мочевого пузыря или рака предстательной железы и их метастаз. В определенных вариантах реализации полиплекс, применяемый для лечения рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, выбран из полиплексов (с), (d), (е) или (f), определенных выше.

[0058] В определенных вариантах реализации рак, характеризующийся клетками, гиперэкспрессирующими HER2, выбран из рака молочной железы, рака яичников, рака желудка и агрессивных форм рака матки, таких как серозная эндометриальная карцинома матки. В определенных вариантах реализации настоящего изобретения клетки, гиперэкспрессирующие Her2, представляют собой клетки, резистентные к Герцептину/трастузумабу. Таким образом полиплекс по настоящему изобретению можно применять для лечении рака, резистентного к Герцептину/трастузумабу, т.е. рака, содержащего клетки, которые не реагируют или реагируют в меньшей степени на воздействие Герцептина/трастузумаба.

[0059] В частности полиплекс, применяемый для лечения рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, выбран из полиплексов (а), (b), (е) или (f), определенных выше.

[0060] В определенных вариантах реализации рак представляет собой рак предстательной железы, и полиплекс, применяемый для лечения рака предстательной железы, выбран из (g), (h), (i) или (j), определенных выше.

[0061] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы, указанному способу, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, полиплекса по настоящему изобретению, определенному в настоящем описании.

[0062] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и полиплекс по настоящему изобретению, для лечения рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы.

[0063] В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к полиплексу, способу или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в комбинации с иммунными клетками.

[0064] В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к полиплексу, определенному выше в настоящем описании, в котором дцРНК заменена молекулой ДНК, такой как плазмида, содержащей белок-кодирующие последовательности нуклеиновых кислот, функционально связанные с регуляторными элементами, такими как соответствующие промоторы и терминаторы.

[0065] В определенных вариантах реализации иммунные клетки представляют собой проникающие в опухоль Т-клетки (T-TILs), сконструированные опухолевоспецифичные Т-клетки или мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК).

[0066] В контексте настоящего описания термин "полиплекс" относится к комплексу между нуклеиновой кислотой и полимером. Нуклеиновая кислота связана с полимером посредством нековалентных или ковалентных связей, в частности электростатических связей. Термин "полиплекс" относится к вектору, т.е. невирусному вектору, подходящему для осуществления переноса и доставки нуклеиновых кислот в клетки.

[0067] Термин "пациент", "субъект", или "индивидуум" применяют взаимозаменяемо и относят либо к человеку, либо к животному, не относящемуся к человеку.

[0068] В контексте настоящего описания термин "(С₁-С₈)алкил", как правило, означает линейный или разветвленный углеводородный радикал, имеющий 1-8 углеродных атомов, и включает, к примеру, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутнп, изобутил, трет-бутил, н-пентил, 2,2-диметилпропил, н-гексил, н-гептил, н-октил и т.п.

[0069] Термин "(С₁-С₈)алкилен" относится к прямому или разветвленному двухвалентному углеводородному радикалу, имеющему 1-8 углеродных атомов, и включает, к примеру, метилен, этилен, пропилен, бутилен, пентанилен, гексанилен, гептанилен, октанилен и т.п. Термины "(С₂-С₈)алкенилен" и "(С₂-С₈)алкинилен", как правило, означают линейные или разветвленные двухвалентные углеводородные радикалы, имеющие 2-8 углеродных атомов и одну или более двойных или тройных связей соответственно. Не ограничивающие примеры таких радикалов включают этенилен, пропенилен, 1- и 2-бутенилен, 1- и 2-пентенилен, 1-, 2- и 3-гексенилен, 1-, 2- и 3-гептенилен, 1-, 2 -, 3- и 4-октенилен, этинилен, пропинилен, 1- и 2-бутинилен, 2-метилпропилен, 1- и 2-пентинилен, 2-метилбутилен, 1-, 2- и 3-гексинилен, 1-, 2-и 3-гептинилен, 1-, 2-, 3- и 4-октинилен и т.п.

[0070] Термин "(С₆-С₁₀)арил" обозначает ароматическую карбоциклическую группу, имеющую 6-10 углеродных атомов, состоящую из одного кольца или нескольких конденсированных колец, такую как, но не ограничиваясь ими, фенил и нафтил; термин "(С₆-С₁₀) арилендиил" обозначает двухвалентную ароматическую карбоциклическую группу, имеющую 6-10 углеродных атомов, состоящую из либо одного кольца, либо из нескольких конденсированных колец, такую как, но не ограничиваясь ими, фенилен и нафтилен.

[0071] Термин "гетероарил" относится к радикалу, полученному из 5-10-членного моно- или полициклического гетероароматического кольца, содержащего от одного до трех, предпочтительно 1-2, гетероатомов, выбранных из N, О или S. Примеры моноциклических гетероарилов включают, не ограничиваются ими, пирролил, фурил, тиенил, тиазинил, пиразолил, пиразинил, имидазолил, оксазолил, изоксазолил, тиазолил, изотиазолил, пиридил, пиримидинил, 1,2,3-триазинил, 1,3,4-триазинил и 1,3,5-триазинил. Полициклические гетероарильные радикалы предпочтительно состоят из двух колец, такие как, но не ограничиваясь ими, бензофурил, изобензофурил, бензотиенил, индолил, хинолинил, изохинолинил, имидазо[1,2-а]пиридил, бензимидазолил, бензтиазолил, бензоксазолил, пиридо[1,2-а]пиримидинил и 1,3-бензодиоксинил. Гетероарил может быть необязательно замещен одной или более группами, каждая из которых независимо выбрана из галогена, -ОН, -СООН, -CN, -NO₂, -SH или -CONH₂. Следует понимать, что, когда полициклический гетероарил замещен, то замещение может быть в любом из карбоциклических и/или гетероциклических колец. Термин "гетероариледиил" означает двухвалентный радикал, полученный из "гетероарила", определенного в настоящем описании, путем удаления двух водородных атомов из любых кольцевых атомов.

[0072] В контексте настоящего описания термин "галоген" относится к фтору, хлору, брому или йоду.

[0073] Термин "(С₃-С₈)циклоалкилен" обозначает моно- или бициклический насыщенный двухвалентный циклический углеводородный радикал, содержащий от трех до восьми атомов углерода. Не ограничивающие примеры таких радикалов включают 1,2-циклопропандиил, 1,2-циклобутандиил, 1,3-циклобутандиил, 1,2-циклопентандиил, 1,3-циклопентан-диил, 1,2-циклогександиил, 1,3-циклогександиил, 1,4-циклогександиил, 1,2-циклогептандиил, 1,3-циклогептандиил, 1,4-циклогепта-диил, 1,2-циклооктандиил, 1,3-циклооктандиил, 1,4-циклооктандиил, 1,5-циклооктандиил и т.п.

[0074] В контексте настоящего описания термин "аминокислотный остаток" относится к любому природному или синтетическому, т.е. неприродному, аминокислотному остатку в его обоих L- и D-стереоизомерах. В то время как природная аминокислота представляет собой любую одну из двадцати аминокислотных остатков, обычно встречающихся в белках, термин синтетическая/неприродная аминокислота относится к любой аминокислоте, модифицированной аминокислоте и/или ее аналогу, которая не является одной из двадцати природных аминокислот. Не ограничивающие примеры природных аминокислот включают глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, лизин, валин, фенилаланин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, аспарагин, глутамин, аргинин, гистидин, пролин, серии, тирозин, метионин, треонин, и триптофан. Примеры неприродных аминокислот, не будучи ими ограниченными, включают орнитин, гомолизин, 2,4-диаминобутановую кислоту (DABA), 2,3-диаминопропионовую кислоту (DAP), 8-аминооктановую кислоту (ЕАО), гомофенилаланин, гомовалин, гомолейцин и т.п.

[0075] Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим описанием можно приготовить обычным образом, применяя один или более физиологически приемлемых носителей и/или вспомогательных веществ. Носитель(-ли) должен быть "приемлемым" в смысле совместимости с другими ингредиентами композиции и безвредности по отношению к его реципиенту.

[0076] Следующие иллюстративные примеры носителей, способов введения, лекарственных форм и т.д., перечислены в качестве известных возможностей, из которых носители, способы введения, лекарственные формы и т.д., можно выбрать для применения с настоящим изобретением. Специалисту среднего уровня в данной области техники будет, однако, понятно, что любой рассматриваемый состав и выбранный способ введения должен быть сначала исследован для того, чтобы определить, что он достигает желаемых результатов.

[0077] Способы введения включают, но не ограничиваются ими, парентеральный, например, внутривенный, внутрибрюшинный, внутримышечный, подкожный, мукозальный (например, пероральный, интраназальный, буккальный, вагинальный, ректальный, внутриглазной), интратекальный, местный и внутрикожный способы. Введение может быть системным или локальным. В определенных вариантах реализации фармацевтическую композицию адаптируют для введения внутрь мозга.

[0078] Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, наполнителю или переносящей среде, с которой вводят активный агент. Носители в фармацевтической композиции могут содержать связующее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон (поливидон или повидон), камедь трагаканта, желатин, крахмал, лактоза или моногидрат лактозы; дезинтегрирующий агент, такой как альгиновая кислота, кукурузный крахмал и т.п.; смазывающее вещество или поверхностно-активное вещество, такое как стеарат магния или лаурилсульфат натрия; и глидант, такой как коллоидальный диоксид кремния.

[0079] Композиции можно приготовить для парентерального введения путем инъекции, к примеру, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Составы для инъекции могут быть представлены в лекарственной форме с однократной дозировкой, к примеру, в ампулах, или в упаковках с многократными дозами с добавленным консервантом. Композиции могут принимать такие формы, как суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных переносящих средах, а также могут содержать вспомогательные агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. В качестве альтернативы активный ингредиент может быть в форме порошка для приготовления раствора с подходящей переносящей средой, например, стерильной водой, свободной от пирогенов, перед применением.

[0080] Для введения посредством ингаляции, к примеру, для назального введения, композиции согласно настоящему изобретению обычно поставляют в форме выпуска в виде аэрозольного спрея из баллончиков под давлением или распылителя с применением подходящего пропеллента, к примеру, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под давлением единицу дозирования можно определить при помощи клапана, чтобы обеспечить доставку отмеренного количества. Капсулы и картриджи, к примеру, желатина, для применения в ингаляторе или инсуффляторе можно приготовить с содержанием порошкообразной смеси соединения и подходящей порошкообразной основы, такой как лактозы или крахмала.

[0081] В определенных вариантах реализации фармацевтическую композицию приготавливают для введения любым известным способом, описанным выше. Конкретные способы введения, рассматриваемые здесь, представляют собой внутривенное введение и введение внутрь мозга (внутрицеребральное).

[0082] Фармацевтическую композицию согласно любому одному из вариантов реализации, определенному выше, можно приготовить для внутривенного, внутримозгового (внутрицеребрального), перорального, внутрикожного, внутримышечного, подкожного, трансдермального, трансмукозального, интраназального или внутриглазного введения.

[0083] Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано следующими неограничивающими Примерами.

ПРИМЕРЫ

Материалы и способы (М&М)

Химические реагенты

[0084] NHS-PEG-OPSS (эфир ортопиридилдисульфид-полиэтиленгликоль-N-гидросукцинимида), также называемый PDP-PEG-NHS (PDP: пиридилдитиопропионат), с молекулярной массой ~ 2 кДа приобретали у Creative PEGworks (Уинстон, США). Поли(2-этил-2-оксазолин), средняя молекулярная масса (Mn) ~ 50 кДа, и безводный диметилсульфоксид (ДМСО) приобретали у Sigma Aldrich (Израиль). Абсолютный этанол приобретали у Romical (Израиль). Все растворители применяли без дальнейшей очистки.

Синтез ~22 кДа LPEI (основная форма)

[0085] Катионный полимер линейного полиэтиленимина (LPEI) синтезировали, как описано ранее [16]. Вкратце, 8,0 г (0,16 ммоль) поли(2-этил-2-оксазолина) гидролизовали со 100 мл концентрированной HCl (37%) и нагревали с обратным холодильником в течение 48 ч, получая белый осадок. Избыток HCl удаляли при пониженном давлении и оставшееся твердое вещество растворяли в 50 мл воды и лиофилизировали (5 г, 78%, ПМР, D₂O-d6, 400 МГц: синглет 3,5 ppm). Полученную гидрохлоридную соль LPEI (4,5 г) подщелачивали путем добавления водного раствора NaOH (3 М), а полученный белый осадок фильтровали и промывали водой до нейтрального состояния. Затем твердое вещество растворяли в воде и далее лиофилизировали для того, чтобы получить белое твердое вещество (2 г, 81%).

Синтез ди-конъюгата LPEI-PEG_2k-OPSS

[0086] 174 мг (8 мкмоль) LPEI растворяли в 2,7 мл абсолютного этанола и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. 5-кратный молярный избыток OPPS-PEG_2k-CONHS (79 мг, 39,5 мкмоль) растворяли в 500 мкл безводном ДМСО и вводили небольшими порциями в смесь LPEI. Реакционную смесь перемешивали при ~ 800 оборотах в минуту на вихревой мешалке при температуре окружающей среды в течение 3 ч. Различные PEG-замещенные LPEI разделяли при помощи катионообменной хроматографии, применяя HR10/10 колонку, заполненную ионообменной смолой MacroPrep High S (BioRad). Чистоту элюированных фракций ди-конъюгатов оценивали, применяя ВЭЖХ с обращенной фазой, оборудованную аналитической Vydac С-8 мономерной 5 мкм колонкой (300 ангстрем, 4,6×150 мм), применяя линейный градиент 5%-95% ацетонитрила в течение 25 мин при скорости потока 1 мл/мин. Объединяли фракции с чистотой 95% или выше. Далее проводили диализ объединенных фракций против 20 мМ HEPES рН 7,4. Соотношение конъюгированных с LPEI PEG_2k-групп в ди-конъюгатах определяли при помощи ПМР. Интегральные значения водородов из полиэтилена -(СН2-СН2-О)- и из LPEI-(CH2-CH2-NH)- применяли для того, чтобы определить соотношение между двумя конъюгированными сополимерами. Из различных продуктов, полученных из катионообмена, выбрали два продукта, LPEI-PEG_2k-OPSS (ди-конъюгат 1:1 с молярным соотношением LPEI к PEG ~ 1:1) и LPEI-(PEG_2k)₃-(OPSS)₃ (ди-конъюгат 1:3 с молярным соотношением ~ 1:3) для образования три-конъюгатов. Применяли анализ на медь, чтобы оценить концентрацию сополимера [17]. Вкратце, сополимеры инкубировали с CuSO₄ (23 мг, растворенные в 100 мл ацетатного буфера) в течение 20 минут и измеряли их оптическую плотность при 285 нм.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ)

[0087] Образцы (30 мкл) разводили в ДСН-буфере для образца белка с добавлением или без 100 мМ ДТТ и далее наносили на Трицин-гель (13% полиакриламида). Электрофорез проводили, применяя катодный буфер (0,1 М Tris, 0,1 М Трицина и 0,1% ДСН рН 8,25) и анодный буфер (0,21 М Tris рН 8,9) и полосы белка визуализировали путем окрашивания InstantBlue™.

Экспрессия и очистка аффитела

[0088] Ген Her-2 аффитела клонировали в плазмиду рЕТ28а, образуя вектор, кодирующий Z:2891 аффитело, слитое с гексагистидиновой (His6) меткой на N-конце и Cys-остатком на С-конце. Экспрессию аффитела осуществляли в E.coli BL21 (DE3) следующим образом: Клетки выращивали при 37°С до OD₆₀₀ ~ 0,7. Добавляли IPTG до конечной концентрации 0,5 мМ с последующей инкубацией при 30°С в течение 4 ч. Клеточный осадок хранили при -80°С. Для того, чтобы очистить аффитело, клеточный осадок ресуспендировали в буфере А (20 мМ HEPES рН 7,4, 500 мМ NaCl, 10% глицерина, 10 мМ имидазола и 2 мМ β-меркаптоэтанола) и разрушали, применяя технологическую установку Micro fluid izer M-110EHI согласно инструкции изготовителя. Растворимую фракцию выделяли при помощи центрифугирования при 12000 × g в течение 10 мин при температуре 4°С. Полученную фракцию наносили на никелевую колонку для аффинной хроматографии (Clontech, Маунтин-Вью, Калифорния). Колонку промывали буфером А в объеме 14 колонок (cv). После этого стадию градиентной элюции проводили, применяя возрастающие концентрации буфера В (20 мМ HEPES рН 7,4, 500 мМ NaCl, 10% глицерина, 500 мМ имидазола и 2 мМ β-меркаптоэтанола); 6% буфера В в объеме 5 колонок, 10%) буфера В в объеме 1,5 колонок, 30% буфера В в объеме 2 колонок. Связанный белок элюировали 100% буфером В в объеме 5 колонок (установка очистки белка, центр Wolfson, Израиль). Далее элюированные фракции концентрировали с фильтром Amicon (с пороговым значением в 3 кДа) и наносили на гель-фильтрационную колонку Superdex 30 prep grade (120 мл) (GE Healthcare). Далее очищенные белки анализировали при помощи ДСН-ПААГ и подтверждали при помощи вестерн-блоттинга с антителом против аффитела (Abeam). Чистоту также оценивали посредством ВЭЖХ с обращенной фазой (Merck-Hitachi модель L-7100), описанной ранее.

Синтез аффитела с PEI-PEG лигандом (три-конъюгата 1:1 и 1:3)

[0089] 4,97 мг каждого ди-конъюгата (1:1 и 1:3) растворяли в 940 мкл 20 мМ HEPES рН 7,4. Далее 3,4 мг Her-2 аффитела в HBS добавляли по каплям к реакционной смеси. Для увеличения растворимости в реакционную смесь вводили 4 мл 20 мМ HEPES совместно с 700 мкл ацетонитрила (с квалификацией «для ВЭЖХ»). Далее реакционную смесь встряхивали (800 оборотов в минуту) при комнатной температуре до тех пор, пока А343 не показало полное обновление. Полученные три-конъюгаты очищали при помощи катионообменной хроматографии на HR10/10 колонке, заполненной ионообменной смолой MacroPrep High S (BioRad) (применяя трехстадийную градиентную элюцию 20 мМ HEPES рН 7,4 до 20 мМ HEPES, содержащего 3 М NaCl). Элюированные фракции вводили в аналитический ВЭЖХ-хроматограф с обращенной фразой, чтобы оценить чистоту три-конъюгатов, фракции с чистотой 95% и выше объединяли и содержали при -80°С. Концентрацию три-конъюгата определяли при помощи анализа на медь (указано выше). Количество конъюгированного белка определяли при помощи А₂₈₀, применяя Nano-Drop 2000.

Проверка и чистота химических векторов, конъюгированных с нацеливающимся белком.

[0090] Три-конъюгаты подвергали ДСН-ПААГ-электрофорезу и окрашивали InstantBlue™, чтобы подтвердить конъюгацию аффитела с LPEI-PEG_2k. Чистоту три-конъюгатов подтверждали при помощи ВЭЖХ с обращенной фазой, применяя аналитическую Vydac С-8 мономерную 5 мкм колонку (300 ангстрем, 4,6 х 150 мм) при 1 мл/мин, одновременно отслеживая при 220 нм. Для ВЭЖХ-анализа применяли градиентную элюцию с ацетонитрилом 5%-95% через 25 мин с троекратно дистиллированной водой (TDW), содержащей 0,1% ТФУ в качестве подвижной фазы.

Образование полиплекса

[0091] Плазмиду pGreenFirel, кодирующую люциферазу светлячков и зеленый флуоресцентный белок (GFP) (System Biosciences, Inc), амплифицировали в E.coli и очищали при помощи набора Qiagen Plasmid Maxi Kits (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США) согласно протоколу производителя. Три-конъюгат 1:1 или три-конъюгат 1:3 связывали в комплекс с плазмидой при соотношении N/P= 6 в HEPES-буфере глюкозы (где N = азот из LPEI и Р = фосфат из ДНК) с образованием двух полиплексов. Для того, чтобы осуществить полное образование частиц полиплексов, образцы инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Конечная концентрация плазмиды в образцах полиплексов составляла 100 мкг/мл, тогда как для анализа защиты от ДНКазы и анализа люциферазы, конечная концентрация плазмиды составляла 10 мкг/мл.

Измерения ξ-потенциала и размеров

[0092] Размеры полиплексных частиц, полученных после диспергирования в HBG буфере, измеряли при 25°С при помощи динамического светорассеяния, применяя nano-ZS Zetasizer (Malvern, Великобритания), применяя расчет распределения объема. Прибор оснащен 633 нм лазером и светорассеяние обнаруживается при 173° по технологии обратного рассеяния (NIBS, неинвазивного обратного рассеяния). Каждый образец запускали в трех повторах. Измерения ζ-потенциала также проводили при 25°С, применяя nano-ZS Zetasizer (Malvern, Великобритания), ζ-потенциал оценивали после инкубации полиплексов в HBG-буфере (рН 7,4). Светорассеяние от движущихся частиц обнаружили при 17° и применяли модель Смолуховского для определения значения функции Генри.

Лтомно-силовая микроскопия

[0093] Для АСМ-измерений полиплексы размещали на свежеотколотых слюдяных дисках (VI 12 мм, Ted Pella США). Визуализацию проводили в HBG-буфере при 250°С, применяя коммерческий ACM, NanoWizard® 3 (JPK instrument, Берлин, Германия) с режимом QI™. Кантеливеры Si3N4 (серия MSNL-10, Bruker) с пружинными константами, отранжированными от 10 до 30 пН нм-1, калибровали при помощи термофлуктуационного способы (входит в состав программного обеспечения АСМ) с абсолютной погрешностью приблизительно 10%. Настройки QI™ были следующими: Z-длина: 0,1 мкм; приложенная сила: 0,5 нН; скорость: 50 мкм/с.

Анализ защиты от ДНКазы

[0094] Анализы защиты от ДНКазы I проводили так, как описано ранее [18]. Вкратце, 1 мкг отдельной ДНК pGreenFirel, с полиплексом 1:1 или с полиплексом 1:3 смешивали в конечном объеме 50 мкл в HBS-растворе. После 30 минут инкубации при комнатной температуре 2 мкл ДНКазы I (2 единицы) или PBS добавляли к 10 мкл каждого образца и инкубировали в течение 15 мин при 37°С. Активность ДНКазы I останавливали путем добавления 5 мкл 100 мМ ЭДТА в течение 10 мин при комнатной температуре. Для того, чтобы диссоциировать плазмиды от три-конъюгатов, добавляли 10 мкл 5 мг/мл гепарина (Sigma, Сент-Луис, Миссури) и инкубировали пробирки в течение 2 ч при комнатной температуре. Проводили электрофорез образцов на 0,8% агарозном геле и окрашивали бромистым этидием. Изображения получали, применяя Gel Doc EZ Imager (Bio Rad Laboratories, Inc).

Клеточная культура

[0095] ВТ474 клетки, гиперэкспрессирующие Her-2, культивировали в RPMI-среде, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 10⁴ Ед/л пенициллином и 10 мг/л стрептомицином, при 37°С в 5% СО₂. MDA-MB-231 клетки карциномы молочной железы человека культивировали в среде Лейбовиц L-15 с 10%) FBS, 10⁴ Ед/л пенициллином и 10 мг/л стрептомицином при 37°С в 5% СО₂. Клеточные линии были из АТСС, а реагенты клеточных культур были из Biological Industries, Bet Ha'emek, Израиль.

Анализ люциферазы и конфокальная микроскопия

[0096] 10000 ВТ474 и MDA-MB-231 клеток высевали в трех повторах в 96-луночных планшетах. Клетки обрабатывали три-конъюгатом 1:1 и три-конъюгатом 1:3, находящихся в комплексе с плазмидой. Через 48 ч после обработки клетки промывали PBS и лизировали с 30 мкл буфером клеточного лизиса (Promega, Мангейм, Германия) на лунку. Активность люциферазы измеряли в 25 мкл образцах лизатов, применяя систему анализа люциферазы (Luciferase Assay system) (Promega) согласно рекомендаций производителя. Измерения проводили, применяя восходящий микропланшетный люминометр Luminoskan™ (Thermo Scientific). Значения в относительных световых единицах (RLU) представлены как среднее и стандартное отклонение активности люциферазы из трех параллельных образцов. Конфокальную микроскопию (FV-1200 Olympus) применяли, чтобы визуализировать GFP, который брали для того, чтобы отразить интернализацию плазмиды pGreenFirel. Фотографии были сделаны при десятикратном (×10) увеличении.

Количественное определение жизнеспособности клеток

[0097] Жизнеспособность клеток измеряли посредством колориметрического анализа, применяя метиленовый синий, описанного ранее [19]. Вкратце, 10000 ВТ474 и MDA-MB-231 клеток высевали в трех повторах в 96-луночные планшеты. Клетки обрабатывали полиплексами 1:1 и 1:3, содержащими 1 мкг/мл pGreenFire1. Через 48 ч после обработки клетки фиксировали с 1% формальдегидом в PBS (рН 7,4), промывали DDW и далее окрашивали 1% раствором (масс/объем) метиленового синего в боратного буфере в течение 1 ч. После этого пятно экстрагировали при помощи 0,1 М HCl, и оптическую плотность раствора красителя считывали при 630 нм в считывающем устройстве для микропланшетов (ELx800 BIO-ТЕХ Instruments Inc.).

Пример 1. Синтез тиолреактивных сополимеров

[0098] 3.1. Предыдущие исследования продемонстрировали РЕGилирование LPEI и его конъюгатов с EGFR-нацеливающимся фрагментом [13]. Тем не менее, количество ПЭГилирований на одиночную цепь LPEI полностью не охарактеризовано. Для того, чтобы образовать дифференцированно РЕСилированные сополимеры, вторичные амины на LPEI конъюгировали с концевой ортогональной защитной группой NHS-эфира на PEG. Эфир N-гидроксисукцинимида (NHS) спонтанно реагирует с вторичными аминами основной цепи LPEI, обеспечивая эффективное РЕGилирование LPEI. Кроме того, реакция NHS-PEG-OPSS с аминами PEI приводит к образованию стабильных необратимых амидных связей (Фигура 1).

[0099] Продукты РЕGилирования очищали при помощи катионообменной хроматографии. Два пика элюировали при высоких концентрациях NaCl, один при 120 мСм/см, а другой при 132 мСм/см (данные не показаны). Предположительно оба продукта отличались по своим соотношениям LPELPEG и, следовательно, по своим чистым положительным зарядам. ПМР-спектры анализировали, применяя относительные интегральные значения водородных атомов на PEG (-СН₂-СН₂-О-) (Фигура 2) и интегральные значения водородных атомов на LPEI (-СН₂-CH₂-NH-) (Фигура 2). Данный анализ показал, что материал, элюированный в первом пике, состоял из сополимера, в котором каждый моль LPEI был сконъюгирован с приблизительно тремя молями PEG. Данный продукт назвали LPEI-(PEG_2k)₃-(OPPS)₃ ("ди-конъюгат 1:3"). Второй пик состоял из сополимера, в котором равные моли PEG были сконъюгированы с LPEI, и его назвали LPEI-PEG_2k-OPSS ("ди-конъюгат 1:1") (Фигура 2).

Пример 2. Синтез три-конъюгатов, LPEI-PEG_2k-Her2 аффитела (три-конъюгат 1:1) и LPEI-(PEG_2k)-(Her2)₃ аффитела (три-конъюгат 1:3)

[00100] Основная цель данного исследования состояла в том, чтобы разработать катионный полимер, который бы нацеливался на опухолевые клетки, гиперэкспрессирующие Her-2. Поскольку Her-2 представляет собой "сиротский рецептор", молекулы аффитела, нацеливающиеся на Her-2-рецептор (нежели чем лиганд), применяли для образования три-конъюгатов, нацеливающихся на Her-2. Авторы настоящего изобретения экспрессировали и очищали Her-2 аффитело с Cys-остатком на С-концевой области для того, чтобы обеспечить дальнейшую конъюгацию. Тиолреактивные сополимеры, ди-конъюгаты 1:1 и 1:3, конъюгировали с Her-2 аффителом через свой концевой Cys-остаток, образуя три-конъюгаты 1:1 и 1:3 соответственно (Фигура 3). Для того, чтобы образовать три-конъюгаты, реакцию следовало проводить с низкой концентрацией аффитела (для того, чтобы предотвратить агрегацию) и в присутствии 10% ацетонитрила (ACN) в качестве органического полярного растворителя для повышенной растворимости. Выход реакции для обеих три-конъюгатных реакций составлял приблизительно 33%, определенный анализом на медь. Для того, чтобы подтвердить конъюгацию аффитела с ди-конъюгатом, три-конъюгатные продукты восстанавливали с ДТТ и разделяли ДСН-ПААГ-электрофорезом. Окрашивание с кумасси голубым подтверждало, что восстановленный три-конъюгат высвобождал аффитело (Фигура 4). Количество Her-2 аффитела, присутствующего в три-конъюгатах, определяли путем измерения А₂₈₀. Применяя анализ на медь, авторы настоящего изобретения количественно определили LPEI. Как было описано выше, ПМР-анализ показал, что соотношение LPELPEG в очищенных ди-конъюгатах составляло 1:1 или 1:3. Сравнивая молярные соотношения Her-2 аффитела и LPEI, авторы настоящего изобретения определили, что среднее соотношение Her-2 аффитела к LPEI в три-конъюгате 1:1 составляло 1:1, а в три-конъюгате 1:3 среднее соотношение составляло 3:1. Таким образом, авторы настоящего изобретения сделали вывод, что была достигнута почти полная конъюгация аффитела к LPEI-PEG.

[00101] Для того, чтобы образовать полиплексы, чистые ди-конъюгаты и три-конъюгаты (1:1 и 1:3) соединяли в комплекс с плазмидной ДНК, как описано в Материалах и Способах (Фигура 3).

Пример 3. ξ-потенциал и определение размера полиплексов

[00102] Далее авторы настоящего изобретения охарактеризовали полиплексы по размеру и поверхностному заряду, применяя динамическое светорассеяние (DLS). Размер полиплекса оказывает существенное влияние на его свойства доставки [21]. Для того, чтобы исследовать воздействие нацеливающегося лиганда на размер полиплекса, авторы настоящего исследования решили образовать комплекс обоих ди-конъюгатов 1:1 и 1:3 с плазмидой и измерить их размер. Ди-конъюгат 1:1 обладал средним размером частиц 115,2±8,2 нм и ди-конъюгат 1:3 обладал средним размером частицы 253,1±9,5 нм. Полиплекс, образованный из три-конъюгата 1:1 с плазмидой, приводил к получению среднего размера частиц 141±5,8 нм, в то время как три-конъюгат 1:3, находящийся в комплексе с плазмидой, обладал средним размером частицы 256±24,2 нм (Фигура 5). Мельчайшие частицы (73,9±3,0 нм) получали в полиплексах, образованных путем комплексообразования плазмиды только с LPEI. Конъюгация аффитела с ди-конъюгатами обладала лишь незначительным воздействием на размер частиц. Число PEG-групп, тем не менее, действительно влияло на размер частицы, подтверждая, что PEG-группы вызывают стерические затруднения, препятствуя плазмидной конденсации.

[00103] Положительный поверхностный заряд способствует связыванию полиплекса с отрицательно заряженной клеточной поверхностью, однако чрезмерный положительный заряд может привести к неспецифичному связыванию и значимой токсичности [12]. ξ-потенциалы различных комплексов, представленных на Фигуре 6, согласуются с предыдущими исследованиями, которые показали понижение ξ-потенциала в увеличенном числе PEG-единиц [13]. Для того чтобы оценить воздействие PEG-групп на поверхностный заряд исследуемых химических векторов, авторы настоящего изобретения измеряли ξ-потенциалы полиплексов, сформированных путем комплексообразования плазмидной ДНК с предшественниками, ди-конъюгатами 1:1 и 1:3, и с три-конъюгатами 1:1 и 1:3. Ди-конъюгатный полиплекс 1:1 обладал средним ξ-потенциалом 27,0±0,1 мВ, а ди-конъюгатный полиплекс 1:3 обладал средним ξ-потенциалом 20,0±1,0 мВ. Три-конъюгатный полиплекс 1:1 показал ξ-потенциал в среднем 17,1±0,7 мВ, в то время как три-конъюгатный полиплекс 1:3 показал средний 10,2±0,44 мВ (Фигура 6). В отличие от размеров, на ξ-потенциалы полиплексов влияло как число PEG-групп, так и конъюгация Her-2 аффитела. Хотя самые маленькие, наиболее положительно заряженные полиплексы получали с оголенным LPEI, данные частицы являются чрезвычайно токсичными [22]. Авторы настоящего изобретения ожидали, что добавление PEG-групп и нацеливающегося фрагмента приведет к снижению токсичности, однако в связи с тем, что полиплексы все еще были относительно небольшими по размеру, авторы настоящего изобретения рассчитывали на то, что их эффективность в качестве векторов для доставки нуклеиновой кислоты не будет поставлена под угрозу.

Пример 4. Оценка полиплексной формы с применением атомно-силовой микроскопии

[00104] Получает признание важность формы частицы и ее влияние на свойства доставки [23]. Авторы настоящего изобретения анализировали морфологию полиплексов, полученных с три-конъюгатами в растворе, применяя атомно-силовую микроскопию (АСМ). Диаметры обоих три-конъюгатных 1:1 и 1:3 полиплексов находились в диапазоне наноразмеров (Фиг. 7А-В), что согласуется с результатами, полученными при помощи DLS. Три-конъюгатный 1:1 полиплекс отображает в основном эллиптические частицы. Диаметр большинства частиц составлял от 101 нм до 178 нм со средним диаметром частицы 142 нм. Несколько частиц были исключительно велики, некоторые даже достигали >250 нм (Фиг. 7А). Три-конъюгатный 1:3 полиплекс был более гетерогенным по форме, и, более того, позволял получить крупные агрегаты с частицами неопределенной формы (Фиг. 7 В). Их длина составляла от 150 нм до 650 нм при средней длине частиц 312 нм, а их ширина составляла от 85 нм до 400 нм при средней ширине 175 нм.

Пример 5. Анализ защиты от ДНКазы

[00105] Успешная доставка генов in vivo зависит от эффективной защиты от нуклеаз. Для того, чтобы определить способность три-конъюгатов обеспечивать защиту плазмид от разложения и позволять осуществлять эффективную доставку гена, полиплексы обрабатывали ДНКазой 1 и анализировали, применяя гель-электрофорез. Как показано на Фигуре 8, ДНК оголенной плазмиды pGreenFire1 была полностью разложена после 10-минутной инкубации с 2 единицами ДНКазы I. В противоположность этому, когда полиплексы образовывали путем смешивания плазмиды с три-конъюгатами, плазмиду защищали от разложения ДНКазой I. Полную защиту плазмиды наблюдали для три-конъюгатного полиплекса 1:3, в то время как несколько никований происходили для три-конъюгатного полиплекса 1:1, что показано переходом от суперспиральной (s.c.) к открытой кольцевой форме (о.с) плазмиды. Более сильная защита от ДНКазы I, обеспечиваемая три-конъюгатным полиплексом 1:3, может быть связана с увеличенным стерическим затруднением, которое обеспечивается дополнительными PEG-белковыми единицами в данных комплексах. Предыдущие исследования действительно показали, что РЕGилирование PEI может обеспечить стабилизацию полиплексов и увеличить их циркуляцию в крови, препятствуя их взаимодействиям с ферментами и сывороточными факторами [24, 25].

Пример 6. Биологическая активность нацеливающихся три-конъюгатных полиплексов

[00106] Размер полиплекса и ξ-потенциал влияют на эффективность направленной доставки ДНК и экспрессию генов, однако влияние размера, по всей видимости, зависит от конкретного конъюгата [2] [21]. Для того, чтобы оценить специфичность и эффективность трансфекции три-конъюгатных полиплексов 1:1 и 1:3, использовали две клеточные линии рака молочной железы, которые дифференцированно экспрессируют Her-2. Полиплексы три-конъюгатов 1:1 и 1:3 формировали с pGreenFire1 и трансфицировали в MDA-MB-231 клетки (экспрессирующие приблизительно 9×10³ Her-2-рецепторов на клетку [26]) и ВТ474 клетки (экспрессирующие приблизительно 1×10⁶ Her-2-рецепторов на клетку [27). Дифференциальную активность люциферазы наблюдали через 48 ч после трансфекции. Оба три-конъюгатных полиплекса 1:1 и 1:3 привели к более 300-кратно высокой активности люциферазы в ВТ474 клетках, нежели чем в MDA-MB-231 (*р<0,001) (Фигура 9А). Более эффективная доставка генов в ВТ474 подтверждалась экспрессией GFP, как это показано при помощи конфокальной микроскопии (Фигура 9 В). Данные результаты показывают, что селективность полиплекса зависит от экспрессии Her-2.

[00107] Направленная доставки в ВТ474 клетки три-конъюгатным полиплексом 1:1 была в 10 раз более эффективной, нежели чем доставка три-конъюгатным полиплексом 1:3 (Фигура 9А, В), даже если три-конъюгат 1:3 обладал более нацеливающимися фрагментами. Это может находить отражение в более высоком ξ-потенциале и более низком размере три-конъюгатного полиплекса 1:1.

[00108] Положительно заряженные химические векторы на основе LPE1 связывают со значимой токсичностью. Таким образом авторы настоящего исследования следующим исследовали выживаемость MDA-MB-231 и ВТ474 клеток после обработки с три-конъюгатными полиплексами 1:1 и 1:3. Ни один из полиплексов не показал цитотоксических эффектов в MDA-MB-231 клетках при анализе с метиленовом синим. Аналогичные результаты наблюдали в ВТ474клетках, обработанных три-конъюгатным полиплексом 1:3. Тем не менее небольшое увеличение клеточной цитотоксичности наблюдалось в ВТ474 клетках, обработанных три-конъюгатным полиплексом 1:1 (Фигура 9С). В целом данные результаты указывают на то, что малый размер и более высокий ξ-потенциал три-конъюгатного полиплекса 1:1 обеспечивают свойства эффективной направленной доставки с только небольшим увеличением токсичности. Таким образом полиплекс три-конъюгата 1:1 в доставке генов превосходит более экранированный три-конъюгатный полиплекс 1:3.

Пример 7. Противоопухолевая активность PEI-РЕС-Неr2Аффитела

[00109] PEI-РЕС-Неr2ААффитело (РРНА), находящееся в комплексе с Полиинозин/Полицитозин (PolyIC), обладает сильной противоопухолевой активностью. Было обнаружено, что клеточные линии рака молочной железы, гиперэкспрессирующие Her-2, сильно ингибируются комплексом PEI-РЕО-Неr2ААффитела с PolyIC. Сильное ингибирование также наблюдали в отношении трастузумаб-резистентных клеточных линий рака молочной железы, гиперэкспрессирующих Her2.

[00110] На Фигуре 10 представлено, что вектор/полиплекс ингибирует клетки, гиперэкспрессирующие Her2, включая клетки, резистентные к Герцептину/трастузумабу.

[00111] Инъекцию 0,5×10⁶ MCF-7 HER-2 клеток подкожно осуществляли бестимусным мышам. Лечение начинали после того, как опухоли в среднем достигали 100 мм³. Каждые 24 часа осуществляли в.в инъекцию 1 мг/кг pIC/PPHA. Трастузумаб вводили в.в. один раз в неделю (указано стрелками) двум группам мышей. Рост опухоли измеряли два раза в неделю. Было обнаружено, что комплекс PolyIC/PPHA обладает сильной противоопухолевой активностью в мышиных моделях, в которые осуществляли имплантацию данных клеточных линий бестимусным мышам, проиллюстрированной на Фигуре 11.

Пример 8. Синтез LPEI-PEG-EGFR аффитела

[00112] 5 мг (2×10^-4 ммоль) LPEI-PEG_2k-OPSS (ди-конъюгат 1:1) растворяли в 1 мл 20 мМ HEPES рН 7,4. Далее 3,4 мг (3,8×10^-4 ммоль, ~ 2 экв) EGFR аффитела в HBS добавляли по каплям к реакционной смеси. 4 мл 20 мМ HEPES плюс 700 мкл ацетонитрила (в квалификации для «ВЭЖХ») вводили в реакционную смесь для увеличенной растворимости. Далее реакционную смесь встряхивали (800 оборотов в минуту) при комнатной температуре и в условиях темноты до тех пор, пока А343 не показало полное обновление. Полученный в результате три-конъюгат очищали при помощи катионообменной хроматографии на HR10/10 колонке, заполненной ионообменной смолой MacroPrep High S (BioRad) (применяя трехстадийную градиентную элюцию 20 мМ HEPES рН 7,4 до 20 мМ HEPES, содержащего 3 М NaCl). Элюированные фракции вводили в аналитический ВЭЖХ-хроматограф с обращенной фразой, чтобы оценить чистоту LPEI-PEG-EGFR три-конъюгата, фракции с чистотой 95% и выше объединяли и содержали при -80°С. Концентрацию три-конъюгата определяли при помощи анализа на медь. Количество конъюгированного белка определяли при помощи А₂₈₀, применяя Nano-Drop 2000.

Пример 9. Противоопухолевая активность PEI-PEG-EGFR аффитела

[00113] PEI-PEG-EGFRAффитeлo (РРЕА), находящееся в комплексе с PolyIC, обладает сильной противоопухолевой активностью. Было обнаружено, что разнообразные клеточные линии, гиперэкспрессирующие EGFR, сильно ингибируются комплексом PEI-PEG-ЕGFRАффитело (РРЕА) в комплексе с Полиинозином/Полицитозином (PolyIC). Можно увидеть, что эффективность РРЕА выше, чем активность у РРЕ (Фигура 12).

[00114] Было обнаружено, что комплекс PolyIC/PPEA обладает сильной противоопухолевой активностью в мышиных моделях, в которые осуществляли имплантацию данных клеточных линий бестимусным мышам.

[00115] Инъекцию 2 млн А431 клеток осуществляли подкожно 65 самкам бестимусных мышей в возрасте 5 недель. Семь дней спустя выросли опухоли среднего объема 136 мм³, и мышей разделили на 6 групп (7-8 мышей в группе) следующим образом: UT; pIC/PPEA, 0,75 мг/кг = 250 мкл pIC для 25 гр мыши, IC, 6/неделю; pI/РРЕА, 0,75 мг/кг IV, 6/неделю; pIC/PPEA низкий, 0,1 мг/кг = 250 мкл 0,01 мкг/мкл pf pIC 25 гр мыши, IC, 6/неделю. pIC, pI и РРЕ и РРЕА разбавляли перед смешиванием, чтобы получить концентрацию в комплексе pIC ниже обычной (0,1 мкг/мкл). На Фигуре 13 представлена активность PolyIC/РРЕАффитела in vivo. В этом же случае эффективность PPEA/PolyIC выше, чем у PolyIC/PPE.

Пример 10. Синтез LPEI-PEG-h/mEGF

10.1. Синтез LPEI-PEG-SH интермедиата

[00116] К 5 мг LPEI-PEG-OPSS (0,2 мкмоль, что соответствует 24000 г/моль) в 5 мл 20 мМ HEPES (рН 7,4) буфера добавляли 50-кратный молярный избыток дитиотреитола (DTT (ДТТ), 0,1 ммоль, 1,5 мг) и перемешивали при помощи вихревой мешалки в течение 20 мин при комнатной температуре в 15 мл пластиковой центрифужной пробирке. Восстановленный ди-конъюгат разделяли на колонке Sephadex G-25 (20 мл, 4×5 мл), применяя 5 мл пробоотборные петли, и осуществляли элюирование с 20 мМ HEPES рН 7,4 при скорости потока 1,0 мл/мин и анализировали при помощи ВЭЖХ, применяя те же условия и способы, описанные выше.

[00117] Анализ Эллмана применяли, чтобы оценить концентрацию сульфгидрильной группы в LPEI-PEG-SH интермедиате. Концентрация SH-групп прямо пропорциональна концентрации хромофор-6-нитро-3-тиоксоциклогеска-1,4-диен-1-карбоновой кислоты, высвобождаемой при помощи свободных тиолов, которые в количественном соотношении вступают в реакцию с реагентом Эллмана. Хромофор измеряли посредством оптической плотности в 412 нм без какого-либо вмешательства со стороны образца или реагента в Эллмана.

10.2 Синтез m/h EGF-MCC интермедиата

[00118] Основные принципы синтеза. Указанный h/mEGF (человеческий/мышиный Эпидермальный Фактор Роста) модифицировали в h/mEGF-MCC (EGF-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоновая кислота; МСС) и очищали, чтобы впоследствии применить для конъюгации с LPEI-PEG-SH. Активация h/mEGF путем присоединения МСС-группы позволяет устранить уменьшение белка ДТТ и позволяет не подвергать h/mEGF-MCC воздействию суровых условий. Таким образом, эффективность реакции конъюгации улучшается, и более того, EGF-MCC является стабильным материалом, который можно хранить при температуре -80°С в течение нескольких недель.

[00119] Синтез hEGF-MCC: 1 мг hEGF (160 нмоль) ресуспендировали в 0,5 мл воды, далее дегазировали аргоном. Количество hEGF определяли при длине волны 280 нм, применяя nano-drop 2000. Раствор добавляли к 0,5 мл 200 мМ натрий-ацетатного буфера рН 6,0 и 60% этанола при энергичном перемешивании. Раствор смешивали с 10 эквивалентами 4-натриевой соли 3-сульфо-М-гидроксисукцинимид эфира (N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоновой кислоты в 0,5 мл 100% этанола в атмосфере аргона. Слегка кислый рН реакционной смеси (рН 6) был необходим для того, чтобы избирательно модифицировать N-концевую аминогруппу hEGF. После 4 ч при комнатной температуре функционализованный пептид очищали при помощи диализных мешков (с пороговым значением в 3,5k) против HBS (100 мМ), три раза в 1 л в течение 1 ч, далее в 1 л в течение ночи. Указанный hEGF-MCC анализировали, применяя ВЭЖХ-масс-спектры (МС), и он обладал молекулярной массой 6435,7 г/моль, что указывает на наличие одной конъюгации сульфо-SMCC с hEGF. Анализ методом ВЭЖХ-МС проводили, применяя Thermo SCIENTIFIC/ LCQ FLEET, оборудованный С-18 колонкой с обращенной фазой (Phenomenex, Aeris, 3,6 мкм, 2,1 мм × 50 мм, 100 ангстрем).

[00120] Синтез mEGF-MCC: 0,5 мг (0,088 мкмоль общего количества) мышиного EGF (PeproTech) растворяли в 2100 мкл 20 мМ HEPES буфера с образованием прозрачного вязкого раствора. Один мг сульфо-SMCC (30 экв., Орнат, Иллинойс) растворяли в 0,9 мл абсолютного этанола и медленно смешивали с раствором EGF, чтобы достичь конечной концентрации 30% этанола в общем 3,0 мл объеме. Кратковременное перемешивание привело к получению прозрачного раствора. Далее реакционный сосуд встряхивали при температуре окружающей среды в течение 4-х часов. По истечении данного периода времени раствор оставался прозрачным. mEGF-MCC отделяли первым на G-25 колонке Sephadex (4×5 мл) и осуществляли элюирование 20 мМ HEPES рН 7,4 при скорости потока 1,0 мл/мин, а также очищали и анализировали при помощи ВЭЖХ, применяя те же условия и стандартный способ, описанный выше для LPEI-PEG-OPSS.

10.3 Синтез LPEI-PEG-h/mEGF

[00121] Один с половиной эквивалента hEGF-MCC или mEGF-MCC смешивали с 1,0 эквивалентом LPEI-PEG-SH. Реакционную смесь сначала перемешивали при комнатной температуре в течение 2-х часов, а далее инкубировали в течение 4 дней при температуре +4°С при медленном встряхивании. Продукт реакции (LPEI-PEG-hEGF или LPEI-PEG-mEGF) отделяли при помощи катионообменной хроматографии (7,8 см ионообменная смола MacroPrep High S (BioRad) в 10/1 см колонке Tricorn GE Healthcare), применяя градиентный насос через входное отверстие для буфера А18 при скорости потока 0,5 мл/мин и применяя растворитель А: 20 мМ HEPES рН 7,4 и растворитель В: 20 мМ HEPES рН 7,4, NaCl 3,0 М. Очищенный LPEI-PEG-hEGF или LPEI-PEG-mEGF три-конъюгат анализировали при помощи ВЭЖХ и количественно определяли концентрации [LPEI] и [EGF] при помощи "анализа на медь" и EGF-фотометрического анализа соответственно.

10.4 Биологическая активность LPEI-PEG-hEGF

[00122] Применяя клеточный анализа, который авторы настоящего исследования обычно использовали, авторы настоящего изобретения сравнивали активность PolyIC/LPEI-PEG-hEGF комплекса (PPEm) с PolyIC/MPPE (мыши), описанного в Schaffert D, Kiss М, Rodl W, Shir A, Levitzki A, Ogris M, Wagner E., 2011 (Poly(I:C)-mediated tumor growth suppression in EGF-receptor overexpressing tumors using EGF-polyethylene glycol-linear polyethylenimine as carrier. Pharm Res. 28:731-41). Можно видеть, что новый HEGF-конъюгат является более эффективным при гибели клеток, гиперэкспрессирующих EGFR (Фигура 14). Клетки, которые экспрессируют умеренное количество молекул EGFR на своей поверхности (U87MG клетки экспрессируют 80000 EGFR на клетку), менее чувствительны к обработке, нежели чем клетки, гиперэкспрессирующие огромное количество (U87MGwtEGFR клетки экспрессируют 1000000 EGFR на клетку).

Пример 11. Синтез DUPA-аналога - DyLight 680

[00123] Пептид синтезировали, применяя стандартные процедуры Fmoc-твердофазного пептидного синтеза (ТФПС) на Fmoc-Cys(trt) смоле Ванга в качестве твердой подложки. Набухание: смола набухала в течение по меньшей мере 2 ч в дихлорметане. Fmoc-удаление: сначала смолу обрабатывали раствором 20% пиперидина в диметилформамиде (ДМФА) (2×20 мин), далее промывали ДМФА (5×2 мин). Связывание Fmoc-Asp(OtBu)-OH: 3 экв. Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 3 экв. (гексафторфосфат 1-[бис(диметиламино)метилен]-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний-3-оксида) (HATU) растворяли в 15 мл ДМФА и 8 экв. N,N-диизопропилэтиламин (DIEA или DIPEA) добавляли к смеси. Раствор перемешивали (предварительно активированный) в течение 10 минут при комнатной температуре до того, как его добавляли к смоле в течение 1 часа. Присоединение повторяли дважды с новой смесью для того, чтобы обеспечить полное присоединение аспарагиновой кислоты. Тест Кайзера проводили для того, чтобы обеспечить полное присоединение. Смолу промывали ДМФА (3×2 мин) и дихлорметаном (ДХМ) (2×2 мин). Кэширование: смолу обрабатывали раствором уксусного ангидрида (10 экв.) и DIPEA (8 экв.) в ДМФА в течение 20 мин и промывали ДМФА (3×2 мин). Fmoc-удаление: смолу сначала обрабатывали раствором 20% пиперидина в ДМФА (2×20 мин), далее промывали ДМФА (5x2 мин). Присоединение Fmoc-диаминопропионовой (ДАП) кислоты: 3 экв. Fmoc-диаминопропионовой (ДАП) кислоты, 3 экв. HATU и 8 экв. DIEA растворяли в 15 мл ДМФА. Раствор перемешивали (предварительно активированный) в течение 10 минут при комнатной температуре до того, как его добавляли к смоле в течение 1 часа. Тест Кайзера проводили для того, чтобы обеспечить полное присоединение. Смолу промывали ДМФА (3×2 мин) и ДХМ (2×2 мин). Удлинение пептида: следующие соединения присоединяли к смоле в следующем порядке (1) Fmoc-Phe-OH, (2) Fmoc-Phe-OH, (3) Fmoc-8-аминооктановая (ЕАО) кислота и (4) OtBu-Glu(Fmoc)-OH. Fmoc-удаление: смолу обрабатывали раствором 20% пиперидина в ДМФА (2×20 мин), далее промывали ДМФА (5×2 мин) и ДХМ (3×2 мин). Присоединение DUPA-лиганда: 0,9 мл триэтиламина (6,6 ммоль) соединяли с 0,9 г (3 ммоль) гидрохлорида ди-трет-бутилового эфира L-глутаминовой кислоты в 15 мл ДХМ. Данный раствор по каплям добавляли в течение 45 минут к раствору 5 мл ДХМ и трифосгена (0,35 г, 1,1 ммоль) при 0°С. После перемешивания в течение дополнительных 50 мин смесь добавляли к смоле с дополнительными 0,9 мл триэтиламина. Реакционную смесь со смолой встряхивали в течение 3 ч и промывали ДМФА (3×2 мин). Полное расщепление: смолу промывали ДХМ (3×2 мин) и сушили в вакууме. Добавляли раствор 2,5% TDW и 2,5% триизопропилсилана в трифторуксусной кислоте (ТФУ) при температуре 0°С. Реакцию проводили в течение 4 ч при комнатной температуре, фильтровали и обрабатывали охлажденным раствором эфир/гексан 1:1, и осаждали пептиды центрифугированием. Неочищенные пептиды растворяли в растворе ацетонитрил/TDW 1:1 и подвергали лиофилизации. Сырой продукт очищали при помощи препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (ОФ). Присоединение DyLight 680: в атмосфере аргона 1 мг DyLight™ 680 (Life Technologies., Cat №46418) растворяли в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО, 100 мкл), содержащем 50 эквивалентов безводного диизопропилэтиламина. Двукратный молярный избыток DUPA-пептидного линкера, растворенного в безводном ДМСО (100 мкл), добавляли к указанной выше смеси и перемешивали при комнатной температуре. Образование продуктов подтверждали при помощи жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (LC-MS). Неочищенные DUPA-пробы ближней ИК области спектра (NIR) далее очищали при помощи препаративной ОФ-ВЭЖХ.

Пример 12. Синтез DUPA-аналога - Носителя лекарственного средства

[00124] Пептид синтезировали, применяя стандартные процедуры Fmoc-ТФПС на Fmoc-Cys(trt) смоле Ванга в качестве твердой подложки. Набухание: смола набухала в течение по меньшей мере 2 ч в дихлорметане. Fmoc-удаление: смолу обрабатывали раствором 20% пиперидина в ДМФА (2×20 мин), далее промывали ДМФА (5×2 мин). Связывание Fmoc-Gly-ОН: 3 экв. Fmoc-Gly-OH и 3 экв. HATU растворяли в 15 мл ДМФА с последующим добавлением 8 экв. DIEA. Раствор перемешивали (предварительно активированный) в течение 10 минут при комнатной температуре до того, как его добавляли к смоле в течение 1 часа. Присоединение повторяли дважды с новой смесью. Тест Кайзера проводили для того, чтобы обеспечить полное присоединение. Смолу промывали ДМФА (3×2 мин) и дихлорметаном (ДХМ) (2×2 мин). Кэппирование: смолу обрабатывали раствором уксусного ангидрида (10 экв.) и DIPEA (8 экв.) в ДМФА в течение 20 мин и промывали ДМФА (3×2 мин). Fmoc-удаление: смолу обрабатывали раствором 20% пиперидина в ДМФА (2×20 мин), далее промывали ДМФА (5×2 мин). Присоединение Fmoc-Trp(Boc)-OH: 3 экв. Fmoc-Trp(Boc)-OH, 3 экв. HATU и 8 экв. DIEA растворяли в 15 мл ДМФА. Раствор перемешивали (предварительно активированный) в течение 10 минут при комнатной температуре до того, как его добавляли к смоле в течение 1 часа. Тест Кайзера проводили для того, чтобы обеспечить полное присоединение. Смолу промывали ДМФА (3×2 мин) и ДХМ (2×2 мин). Удлинение пептида: следующие соединения присоединяли к смоле в следующем порядке (1) Fmoc-Trp(Boc)-OH, (2) Fmoc-Gly-OH, (3) Fmoc-Phe-OH и (4) Fmoc-8-аминооктановая (ЕАО) кислота и (5) OtBu-Glu(Fmoc)-OH. Fmoc-удаление: смолу обрабатывали раствором 20% пиперидина в ДМФА (2×20 мин), далее промывали ДМФА (5×2 мин) и ДХМ (3×2 мин). Присоединение DUPA-лиганда: 0,9 мл триэтиламина (6,6 ммоль) соединяли с 0,9 г (3 ммоль) гидрохлорида ди-трет-бутилового эфира L-глутаминовой кислоты в 15 мл ДХМ. Данный раствор по каплям добавляли в течение 45 минут к раствору 5 мл ДХМ и трифосгена (0,35 г, 1,1 ммоль) при 0°С. После перемешивания в течение дополнительных 50 мин смесь добавляли к смоле с дополнительными 0,9 мл триэтиламина. Реакционную смесь со смолой встряхивали в течение 3 ч и промывали ДМФА (3×2 мин). Полное расщепление: смолу промывали ДХМ (3x2 мин) и сушили в вакууме. Добавляли раствор 2,5% TDW и 2,5% триизопропилсилана в трифторуксусной кислоте (ТФУ) при температуре 0°С. Реакцию проводили в течение 4 ч при комнатной температуре, фильтровали и обрабатывали охлажденным раствором эфир/гексан 1:1, и пептиды, содержащие DUPA-аналог, осаждали центрифугированием. Неочищенные пептиды растворяли в растворе ацетонитрил/TDW 1:1 и подвергали лиофилизации. Сырой продукт очищали при помощи препаративной ОФ-ВЭЖХ. Синтез PEI-PEG-DUPA-аналога: 4,37 мг (1,2×10^-4 ммоль) ди-конъюгата 1:1 или 1:3 (полученного, как описано выше в Примере 1 настоящего описания) растворяли в 940 мкл 20 мМ HEPES рН 7.4. Далее 1 мг (9,1×10^-4 ммоль, ~ 5 экв) DUPA-аналога, растворенного в 2 мл ацетонитрила (ACN; в квалификации для «ВЭЖХ»)/(20 мМ HEPES рН 7,4) в соотношении 1:1, по каплям добавляли к реакционной смеси. Далее чтобы достичь приблизительно ~ 10% общей концентрации ACN в реакции, в реакционную смесь вводили дополнительные 4 мл 20 мМ. Реакционную смесь также перемешивали (800 оборотов в минуту) на вихревой мешалке в темноте при комнатной температуре до тех пор, пока полное поглощение при длине волны 343 (А₃₄₃) не указало на полное обновление. Полученный в результате три-конъюгат очищали при помощи катионообменной хроматографии на HR10/10 колонке, заполненной ионообменной смолой MacroPrep High S (BioRad) (применяя трехстадийную градиентную элюцию 20 мМ HEPES рН 7,4 до 20 мМ HEPES, содержащего 3 М NaCl). Элюированные фракции вводили в аналитический ОФ-ВЭЖХ-хроматограф для того, чтобы оценить чистоту три-конъюгата. Фракции с чистотой 95% и выше объединяли и содержали при -80°С. Концентрацию три-конъюгата определяли при помощи анализа на медь. Количество конъюгированного DUPA-аналога определяли при помощи хромофорного (аминокислота Trp) поглощения.

Пример 13. PolyIC/LPEI-PEG-DUPA нацеливается на рак предстательной железы

[00125] Простатический специфический мембранный антиген (PSMA) гиперэкспрессируется в метастатическом раке предстательной железы. Его также обнаруживают в новообразованных сосудах большинства солидных опухолей. Поскольку интернализация PSMA происходит непосредственно после связывания лиганда, авторы настоящего изобретения выбрали его в качестве мишени для разработки и синтезирования PolyIC PSMA-нацеливающегося вектора. В самом деле, интернализация Dupa-Daylight680 происходит в отношении клеток, гиперэкспрессирующих PSMA (LNCaP), но не MCF7 (гиперэкспрессирующих Her2) (не показано).

[00126] На Фигуре 15 представлено, что PEI-PEG-DUPA (PPD)/PolyIC является высоко эффективным против LNCaP и VCAP клеток. Жизнеспособность измеряли после 96 часов воздействия. PPD также индуцирует образование цитокинов (Фигура 16). На Фигуре 17 показано, что среда, кондиционированная LNCaP клетками, стимулирует экспрессию цитокинов ИФН-γ, ИЛ-2 и ФНО-α в МКПК, выращенных в кондиционированной среде. Далее было показано, что совместное инкубирование PolyIC/PPD, обработанного LNCaP клетками, с РС3-люциферазными клетками, которые не экспрессируют PSMA, приводит к более 70% гибели РС3-люциферазных клеток через эффект свидетеля. Добавление здоровых человеческих МКПК сильно улучшает эффект и приводит к гибели 90% РС3-клеток (Фигура 18).

Пример 14. Лечение рака in vivo

[00127] PolyIC/PPD обладает значимыми противоопухолевыми воздействиями при испытании на мышах с ТКИН (Фигура 19). Ингибирование опухоли не является полным в связи с отсутствием иммунной системы у подопытных мышей.

ССЫЛКИ

1. Boussif, О. и др. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci USA, 1995. 92(16): p. 7297-301.

2. Wagner, E. и др. Transferrin-polycation-DNA complexes: the effect of polycations on the structure of the complex and DNA delivery to cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1991. 88(10): p. 4255-9.

3. Little, S.R. и др. Poly-beta amino ester-containing microparticles enhance the activity of nonviral genetic vaccines. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(26): p. 9534-9.

4. Davis, M.E., Z.G. Chen, and D.M. Shin, Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nat Rev Drug Discov, 2008. 7(9): p. 771-82.

5. Remy, J.S. и др. Targeted gene transfer into hepatoma cells with lipopolyamine-condensed DNA particles presenting galactose ligands: a stage toward artificial viruses. Proc Natl Acad Sci USA, 1995. 92(5): p. 1744-8.

6. Jager, M. и др. Branched and linear poly(ethylene imine)-based conjugates: synthetic modification, characterization, and application. Chem Soc Rev, 2012. 41(13): p. 4755-67.

7. Ziebarth, J.D. and Y. Wang, Understanding the protonation behavior of linear polyethylenimine in solutions through Monte Carlo simulations. Biomacromolecules, 2010. 11(1): p. 29-38.

8. Hobel, S. и др. Maltose- and maltotriose-modified, hyperbranched poly(ethylene imine)s (OM-PEIs): Physicochemical and biological properties of DNA and siRNA complexes. J Control Release, 2011. 149(2): p. 146-58.

9. Rejman, J., A. Bragonzi, and M. Conese, Role of clathrin- and caveolae-mediated endocytosis in gene transfer mediated by lipo- and polyplexes. Mol Ther, 2005. 12(3): p. 468-74.

10. Behr, J.P., The proton sponge: A trick to enter cells the viruses did not exploit. Chimia, 1997. 51(1-2): p. 34-36.

11. Suh, J., H.J. Paik, and B.K. Hwang, Ionization of Poly(Ethylenimine) and Poly(Allylamine) at Various Phs. Bioorganic Chemistry, 1994. 22(3): p. 318-327.

12. Ogris, M. и др. PEGylated DNA/transferrin-PEI complexes: reduced interaction with blood components, extended circulation in blood and potential for systemic gene delivery. Gene Ther, 1999. 6(4): p. 595-605.

13. Schaffert, D. и др. Poly(I:C)-mediated tumor growth suppression in EGF-receptor overexpressing tumors using EGF-polyethylene glycol-linear polyethylenimine as carrier. Pharm Res, 2011. 28(4): p. 731-41.

14. Nilsson, В. и др. A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein A. Protein Eng, 1987. 1(2): p. 107-13.

15. Lofblom, J. и др. Affibody molecules: engineered proteins for therapeutic, diagnostic and biotechnological applications. FEBS Lett, 2010. 584(12): p. 2670-80.

16. Brissault, В. и др. Synthesis, characterization, and gene transfer application of poly(ethylene glycol-b-ethylenimine) with high molar mass polyamine block. Biomacromolecules, 2006. 7(10): p. 2863-70.

17. Ungaro, F. и др. Spectrophotometric determination of polyethylenimine in the presence of an oligonucleotide for the characterization of controlled release formulations. J Pharm Biomed Anal, 2003. 31(1): p. 143-9.

18. Gebhart, C.L. и др. Design and formulation of polyplexes based on pluronic-polyethyleneimine conjugates for gene transfer. Bioconjug Chem, 2002. 13(5): p. 937-44.

19. Dent, M.F. и др. The methylene blue colorimetric microassay for determining cell line response to growth factors. Cytotechnology, 1995. 17(1): p. 27-33.

20. Eigenbrot, С.и др. Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(34): p. 15039-44.

21. Ogris, M. и др. The size of DNA/transferrin-PEI complexes is an important factor for gene expression in cultured cells. Gene Ther, 1998. 5(10): p. 1425-33.

22. Chollet, P. и др. Side-effects of a systemic injection of linear polyethylenimine-DNA complexes. J Gene Med, 2002. 4(1): p. 84-91.

23. Champion, J.A., Y.K. Katare, and S. Mitragotri, Particle shape: A new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release, 2007. 121(1-2): p. 3-9.

24. Kleemann, E. и др. Nano-carriers for DNA delivery to the lung based upon a TAT-derived peptide covalently coupled to PEG-PEL J Control Release, 2005. 109(1-3): p. 299-316.

25. Rudolph, С.и др. Nonviral gene delivery to the lung with copolymer-protected and transferrin-modified polyethylenimine. Biochim Biophys Acta, 2002. 1573(1): p. 75-83.

26. Aguilar, Z. и др. Biologic effects of heregulin/neu differentiation factor on normal and malignant human breast and ovarian epithelial cells. Oncogene, 1999. 18(44): p. 6050-62.

27. Park, J.W. и др. Anti-HER2 immunoliposomes: enhanced efficacy attributable to targeted delivery. Clin Cancer Res, 2002. 8(4): p. 1172-81.

28. Rabenstein, D.L., Heparin and heparan sulfate: structure and function. Nat Prod Rep, 2002. 19(3): p. 312-31.

29. Seib, F.P., A.T. Jones, and R. Duncan, Comparison of the endocytic properties of linear and branched PEIs, and cationic РАМАМ dendrimers in В 16f 10 melanoma cells. J Control Release, 2007. 117(3): p. 291-300.

30. Jeong, G.J. и др. Biodistribution and tissue expression kinetics of plasmid DNA complexed with polyethylenimines of different molecular weight and structure. J Control Release, 2007. 118(1): p. 118-25.

31. Kawakami, S. и др. Evaluation of proinflammatory cytokine production induced by linear and branched polyethylenimine/plasmid DNA complexes in mice. J Pharmacol Exp Ther, 2006. 317(3): p. 1382-90.

32. Goula, D. и др. Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. Gene Ther, 1998. 5(9): p. 1291-5.

33. Bragonzi, А. и др. Comparison between cationic polymers and lipids in mediating systemic gene delivery to the lungs. Gene Ther, 1999. 6(12): p. 1995-2004.

34. Lee, К. и др., Pluronic/polyethylenimine shell crosslinked nanocapsules with embedded magnetite nanocrystals for magnetically triggered delivery of siRNA. Macromol Biosci, 2010. 10(3): p. 239-45.

35. Zheng, M. и др. Poly(ethylene oxide) grafted with short polyethylenimine gives DNA polyplexes with superior colloidal stability, low cytotoxicity, and potent in vitro gene transfection under serum conditions. Biomacromolecules, 2012. 13(3): p. 881-8.

36. Petersen, H. и др. Polyethylenimine-graft-poly(ethylene glycol) copolymers: influence of copolymer block structure on DNA complexation and biological activities as gene delivery system. Bioconjug Chem, 2002. 13(4): p. 845-54.

37. Champion, J.A., Y.K. Katare, and S. Mitragotri, Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. J Control Release, 2007. 121(1-2): p. 3-9.

38. Liu, Y. и др. The shape of things to come: importance of design in nanotechnology for drug delivery. Ther Deliv, 2012. 3(2): p. 181-94.

39. Kloeckner, J. и др. Photochemically enhanced gene delivery of EGF receptor-targeted DNA polyplexes. J Drug Target, 2004. 12(4): p. 205-13.

40. Kircheis, R. и др. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther, 2001. 8(1): p. 28-40.

41. Ogris, M. и др. DNA/polyethylenimine transfection particles: influence of ligands, polymer size, and PEGylation on internalization and gene expression. AAPS PharmSci, 2001. 3(3): p. E21.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Alex Levitzki management and holdings, Ltd

Levitzki, Alexander

Joubran, Salim

Shir, Alexei

Zigler, Maya

<120> УЛУЧШЕННЫЕ ПОЛИЭТИЛЕНИМИНОВЫЕ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕВЫЕ ВЕКТОРЫ

<130> ALEX-003 PCT

<150> 61993110

<151> 2014-05-14

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 1

Tyr His Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Gln Asn Val Ile

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<220>

<221> X представляет собой 8-аминооктановую кислоту

<222> (1)..(1)

<400> 2

Xaa Phe Gly Trp Trp Gly Cys

1 5

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<220>

<221> X представляет собой 8-аминооктановую кислоту

<222> (1)..(1)

<220>

<221> X представляет собой диаминопропионовую кислоту

<222> (4)..(4)

<400> 3

Xaa Phe Phe Xaa Asp Cys

1 5

<210> 4

<211> 82

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 4

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Met

20 25 30

Trp Ala Ala Trp Glu Glu Ile Arg Asn Leu Pro Asn Leu Thr Gly Trp

35 40 45

Gln Met Thr Ala Phe Ile Ala Lys Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser

50 55 60

Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro

65 70 75 80

Lys Cys

<210> 5

<211> 79

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 5

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Met Arg Asn Ala

20 25 30

Tyr Trp Glu Ile Ala Leu Leu Pro Asn Leu Thr Asn Gln Gln Lys Arg

35 40 45

Ala Phe Ile Arg Lys Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu

50 55 60

Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Cys

65 70 75

<210> 6

<211> 53

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His

1 5 10 15

Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn

20 25 30

Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys

35 40 45

Trp Trp Glu Leu Arg

50

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к невирусному вектору — полиплексу, и может быть использовано в медицине. Изобретение позволяет получить полимерный конъюгат, состоящий из линейного полиэтиленимина, ковалентно связанного с одним или более фрагментами полиэтиленгликоля (PEG), при этом каждый PEG-фрагмент конъюгирован посредством линкера с нацеливающимся фрагментом, способным к связыванию с антигеном рака. Настоящее изобретение способно связывать и конденсировать молекулы нуклеиновых кислот — ДНК или РНК — и служить в качестве невирусного вектора для направленной доставки терапевтических агентов в клетки/ткани организма потенциального пациента, страдающего от рака предстательной железы или иных типов рака, клетки которого гиперэкспрессируют EGFR или HER2, для осуществления генной терапии указанных заболеваний. 7 н. и 22 з.п. ф-лы, 19 ил., 14 пр.

1. Полиплекс двухцепочечной РНК (дцРНК) и полимерного конъюгата для доставки нуклеиновых кислот в клетки, при этом указанный полимерный конъюгат состоит из линейного полиэтиленимина (LPEI), ковалентно связанного с одним фрагментом полиэтиленгликоля (PEG) (LPEI-PEG 1:1) или тремя PEG-фрагментами (LPEI-PEG 1:3), каждый PEG-фрагмент конъюгирован посредством линкера с нацеливающимся фрагментом, способным к связыванию с раковым антигеном, причем раковый антиген представляет собой рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), рецептор эпидермального фактора роста человека 2 (HER2) или простатический специфический мембранный антиген (PSMA), при условии, что нацеливающийся фрагмент не представляет собой EGF мыши или пептид согласно последовательности YHWYGYTPQNVI (GE11) (SEQ ID №: 1), указанный линкер образует -S-S-, NH-СО-, -СО-NH-, -S-C-, O-СО-, -СО-O- или мочевинную (-NH-CO-NH) связь с указанным нацеливающимся фрагментом и при этом указанный линкер выбран из -CO-R₂-R_x-R₃ или пептидного фрагмента, состоящего из от 3 до 7 аминокислотных остатков,

где R₂ выбран из (С₁-С₈)алкилена, (С₂-С₈)алкенилена, (С₂-С₈)алкинилена, (С₆-С₁₀)арилендиила или гетероарилендиила,

R_x отсутствует или представляет собой -S-;

R₃ отсутствует или представлен согласно формуле

;

R₄ выбран из (С₁-С₈)алкилена, (С₂-С₈)алкенилена, (С₂-С₈)алкинилена, (С₁-С₈)алкилен-(С₃-С₈)циклоалкилена, (С₂-С₈)алкенилен-(С₃-С₈)циклоалкилена, (С₂-С₈)алкинилен-(С₃-С₈)циклоалкилена, (С₆-С₁₀)арилендиила, гетероарилендиила, (С₁-С₈)алкилен-(С₆-С₁₀)арилендиила или (С₁-С₈)алкиленгетероарилендиила;

при этом каждый из указанных (C₁-C₈)алкилена, (С₂-С₈)алкенилена или (С₂-С₈)алкинилена необязательно замещен одной или более группами, каждая из которых независимо выбрана из галогена, -COR₅, -COOR₅, -OCOOR₅, - OCON(R₅)₂, -CN, -NO₂, -SR₅, -OR₅, -N(R₅)₂, -CON(R₅)₂, -SO₂R₅, -SO₃H, -S(=O)R₅, (С₆-С₁₀)арила, (С₁-С₄)алкилен-(С₆-С₁₀)арила, гетероарила или (С₁-С₄)алкиленгетероарила, и дополнительно необязательно прерван одним или более одинаковыми или различными гетероатомами, выбранными из S, O или N, и/или по меньшей мере одной группой, каждая из которых независимо выбрана из -NH-CO-, -CO-NH-, -N(R₅)-, -N(С₆-C₁₀арил)-, (С₆-С₁₀)арилендиила или гетероарилендиила; и

R₅ представляет собой Н или (С₁-С₈)алкил.

2. Полиплекс по п. 1, отличающийся тем, что дцРНК представляет собой двухцепочечную РНК полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (poly I:C).

3. Полиплекс по п. 1, отличающийся тем, что каждый из указанных одного или более PEG-фрагментов независимо образует -NH-CO- связь с указанным LPEI и связь, выбранную из -NH-СО-, -CO-NH-, -S-C-, -S-S-, -О-СО- или -CO-O-, с указанным линкером.

4. Полиплекс по п. 3, отличающийся тем, что каждый из указанных одного или более PEG-фрагментов образует -NH-CO- связи с указанным LPEI и указанным линкером.

5. Полиплекс по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что R₂ выбран из (С₁-С₈)алкилена, предпочтительно (С₁-С₄)алкилена, необязательно замещенного одной или более группами, каждая из которых независимо выбрана из галогена, -СОН, -СООН, -ОСООН, -OCONH₂, -CN, -NO₂, -SH, -ОН, -NH₂, -CONH₂, -SO₂H, -SO₃H, -S(=O)H, (С₆-С₁₀)арила, (С₁-С₄)алкилен-(С₆-С₁₀)арила, гетероарила или (С₁-С₄)алкиленгетероарила, и дополнительно необязательно прерванного одним или более одинаковыми или различными гетероатомами, выбранными из S, О или N, и/или по меньшей мере одной группой, каждая из которых независимо выбрана из -NH-CO-, -CO-NH-, -NH-, -N(С₁-С₈алкил)-, -N(С₆-С₁₀арил)-, (С₆-С₁₀)арилендиила или гетероарилендиила.

6. Полиплекс по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что R₂ представляет собой (С₁-С₈)алкилен.

7. Полиплекс по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что R₂ представляет собой (С₁-С₄)алкилен.

8. Полиплекс по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что R_x представляет собой -S-.

9. Полиплекс по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что R₃ отсутствует или представляет собой

,

где R₄ представляет собой (С₁-С₈)алкилен-(С₃-С₈)циклоалкилен.

10. Полиплекс по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что R₃ отсутствует или представляет собой

,

где R₄ представляет собой (C₁-С₄)алкилен-(C₅-C₆)циклоалкилен.

11. Полиплекс по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что

R₂ представляет собой -СН₂-СН₂-;

R_x представляет собой -S-; и

R₃ отсутствует или представляет собой

,

при этом R₄ представляет собой .

12. Полиплекс по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный пептидный фрагмент представляет собой -(NH-(CH₂)₇-CO)-Phe-Gly-Trp-Trp-Gly-Cys- (SEQ ID №: 2) или -(NH-(CH₂)₇-CO)-Phe-Phe-(NH-CH₂-CH(NH₂)-CO)-Asp-Cys- (SEQ ID №: 3), связанный через свою меркаптогруппу с указанным нацеливающимся фрагментом.

13. Полиплекс по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что полимерный конъюгат представляет собой диконъюгат согласно формуле (i)-(viii), связанный с указанным нацеливающимся фрагментом/фрагментами:

где R₆ представляет собой

; или

где R₇ представляет собой

.

14. Полиплекс по п. 13, отличающийся тем, что

(а) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой HER2 аффитело, и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(i), и HER2 аффитело связано через его меркаптогруппу;

(b) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой HER2 аффитело, и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(v), и HER2 аффитело связано через его меркаптогруппу;

(c) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой EGFR аффитело, и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(i), и EGFR аффитело связано через его меркаптогруппу;

(d) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой EGFR аффитело, и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(v), и EGFR аффитело связано через его меркаптогруппу;

(e) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой hEGF и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(ii), причем hEGF связан через его аминогруппу;

(f) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой hEGF и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(vi), причем hEGF связан через его аминогруппу;

(g) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой НООС(СН₂)₂-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH₂)₂-CO- (DUPA-остаток) и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(iii);

(h) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой НООС(СН₂)₂-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH₂)₂-CO- (DUPA-остаток) и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(vii);

(i) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой НООС(СН₂)₂-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH₂)₂-CO- (DUPA-остаток) и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(iv); или

(j) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой НООС(СН₂)₂-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH₂)₂-CO- (DUPA-остаток) и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(viii).

15. Полиплекс по п. 14, отличающийся тем, что указанному EGFR аффителу соответствует аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID №: 4, и указанному HER2 аффителу соответствует аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID №: 5.

16. Композиция для доставки нуклеиновых кислот в клетки, гиперэкспрессирующие EGFR или HER2, или в клетки рака предстательной железы, причем указанная композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество полиплекса по любому из пп. 1-15.

17. Полиплекс по любому из пп. 2-15 или композиция по п. 16 для применения для лечения рака, выбранного из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и раком предстательной железы.

18. Полиплекс по п. 17, отличающийся тем, что указанный рак, характеризующийся клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, выбран из немелкоклеточной легочной карциномы, рака молочной железы, глиобластомы, плоскоклеточного рака головы и шеи, колоректального рака, аденокарциномы, рака яичников, рака мочевого пузыря или рака предстательной железы и их метастаз.

19. Полиплекс по п. 18, отличающийся тем, что указанный полиплекс определен в п. 14(c), 14(d), 14(e) или 14(f).

20. Полиплекс по п. 17, отличающийся тем, что указанный рак, характеризующийся клетками, гиперэкспрессирующими HER2, выбран из рака молочной железы, рака яичников, рака желудка и агрессивных форм рака матки, таких как серозная эндометриальная карцинома матки.

21. Полиплекс по п. 20, отличающийся тем, что указанный рак, характеризующийся клетками, гиперэкспрессирующими HER2, представляет собой рак, резистентный к герцептину/трастузумабу.

22. Полиплекс по п. 20 или 21, отличающийся тем, что указанный полиплекс определен в п. 14(a), (b), (е) или (f).

23. Полиплекс по п. 17, отличающийся тем, что указанный рак представляет собой рак предстательной железы и указанный полиплекс определен в п. 14(g), (h), (i) или (j).

24. Способ для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полиплекса согласно любому из пп. 2-15.

25. Применение полиплекса по любому из пп. 17-23, способа по п. 24 или композиции по п. 16 в комбинации с иммунными клетками.

26. Применение по п. 25, отличающееся тем, что указанные иммунные клетки представляют собой проникающие в опухоль Т-клетки (Т-ТIL), сконструированные опухолевоспецифичные Т-клетки или мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК).

27. Применение полиплекса по любому из пп. 2-15 для приготовления лекарственного средства для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы.

28. Применение полиплекса по любому из пп.2-15 для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы.

29. Фармацевтическая композиция для лечения рака, выбранного из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы, причем указанная фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество полиплекса по любому из пп. 2-15.