Биосовместимая матрица на основе бактериальной целлюлозы и пептидов природного происхождения для активизации репаративных процессов поврежденных тканей Российский патент 2024 года по МПК C12P19/04 A61L15/36 A61L15/44 

Изобретение относится к биотехнологии (и/или медицине), в частности к получению биосовместимой матрицы на основе бактериальной целлюлозы культуры Medusomyces gisevii и пептидов природного происхождения для активизации репаративных процессов поврежденных тканей.

Сегодня в регенеративной медицине при лечении дефектов тканей наиболее перспективным является принцип тканевого инжиниринга -направления по использованию матриц для создания каркаса поврежденного органа или части органа и обогащение этого каркаса биологически активными веществами.

Одним из главных свойств матриц, используемых в регенеративной медицине, является их биосовместимость, низкая иммуногенность и инертность, которые заключаются в способности находиться в контакте с живыми тканями, не вызывая каких-либо токсических или иммунологических побочных эффектов. Для этого матрицы должны быть изготовлены из химически-чистого, инертного материала, обеспечивающего минимизацию иммунного ответа. Также важным требованием к матрицам, используемым в тканевой инженерии, является их небиодеградируемость хотя бы на первом этапе заселения и размножения клеток. Это связано с тем, что для целей роста и размножения клеток биодеградация каркаса может быть нежелательной особенностью, поскольку она вводит другую переменную, которую трудно контролировать, и которая может влиять на активность клеток неизвестным образом. Кроме того, такая матрица должна обладать высокой влагопоглощающей способностью, возможностью доставки биологически активных веществ в ткани организма, и высокой антимикробной активностью. В качестве материала, подходящего под вышеописанные требования, многими исследователями выделяется бактериальная целлюлоза (БЦ). Бактериальная целлюлоза обладает высокой прочностью, эластичностью, газопроницаемостью, высокой водоудерживающей способностью, чистотой и пористостью, а высокая биологическая совместимость делает ее перспективным материалом для реконструктивной хирургии, клеточной и тканевой инженерии, матрицей-носителем для лекарственных веществ, рассматривается в качестве нового источника биоматериала для совершенствования технологий получения трехмерных (ЗД] каркасов имитирующих клеточную среду in vivo для тканевой терапии. Однако, несмотря на огромный потенциал, широкое использование БЦ затруднено высокой стоимостью ее получения и небольшим выходом, определяемым особенностями метаболизма продуцентов.

В настоящее время существует небольшое количество сообщений об использовании БЦ в качестве матрицы для тканевой регенерации.

Так в статье Архаровой Н.А. и соавторов (Архарова Н.А., Северин А.В., Хрипуновс А.К. и др., 2019] описаны композитные пленки на основе бактериальной целлюлозы и нанокристаллов гидроксиапатита для применения в ортопедии. Для их изготовления синтез целлюлозы осуществляли путем поверхностного культивирования Komagataeibacter rhaeticus ВКПМ В-13015 на питательной среде Шрама-Хестрина. Полученную гель-пленку отмывали от остатков культуральной среды дистиллированной водой и обрабатывали кипячением в растворе NaOH 0,5% для удаления нецеллюлозных компонентов с последующим тщательным промыванием в дистил-лированной воде, после чего измельчали. Композиты БЦ-ГАП получали двумя способами: совместным дезинтегрированием водных суспензий нанокристаллов гидроксиапатита и макрофрагментированной нано-гель-пленки бактериальной целлюлозы; синтезом наночастиц гидроксиапатита в присутствии фибриллярных фрагментов суспензии дезинтегрированной бактериальной целлюлозы. Композитные пленки толщиной до 0,05 мм получали методом полива на стекло с последующим высушиванием их при комнатной температуре. Недостатком данного способа является использование в качестве продуцента штамма Komagataeibacter rhaeticus, так как по сравнению с симбиотическими культурами штаммы менее устойчивы и более требовательны к питательным компонентам среды, что затрудняет и удорожает масштабирование культивирования. Кроме того, высушивание пленок при комнатной температуре методом полива на стекло может способствовать обсеменению пленок и получению пленок с неравномерной толщиной.

В статье Кутырева Е.И. и соавторов (Кутырев М.А., Шишацкая Е.И., Скорб Е.В. и др, 2022] описан способ получения матрицы из гидроксиапатита и бактериальной целлюлозы. Ксерогель и гидрогель бактериальной целлюлозы предварительно выдерживали в растворе фосфатного буфера (рН=7,4) для насыщения матрицы биополимера фосфат-ионами, затем на поверхность целлюлозной матрицы капали раствор хлорида кальция, который при его диффузии внутрь 3D-структуры целлюлозного материала формировал периодически упорядоченные осадки в виде колец Лизеганга. Биосовместимость полученных структур исследовали с помощью клеточной линии С2С12 и клеток HeLa. Установлено, что на целлюлозе с 3D-паттернами ГА наблюдалась более высокая пролиферация клеток по сравнению с контрольными образцами. Недостатком данного способа является то, что гидрогель не обладает пористостью необходимой клеткам для миграции внутрь матрицы.

В патенте RU2733137C1 описан способ получения биокомпозита с ре-генерационными свойствами на основе гидрогеля бактериальной целлюлозы. Сущность изобретения заключается в получении гель-пленки бактериальной целлюлозы путем культивирования штамма бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans в статических условиях на среде с мелассой, отделении полученной гель-пленки от культуральной среды, ее очищении, механическом измельчении с получением гидромодуля с соотношением 1:3, получении гидрогеля бактериальная целлюлоза-хитозан в соотношениях 50:50 путем смешения 2%-го раствора хитозана в 1%-ой уксусной кислоте, гидрогеля бактериальной целлюлозы, 25%-го глутарового альдегида, а также получении гидрогеля бактериальная целлюлоза: хитозан: желатин: трансглютаминаза в соотношении 5:5:15:5 соответственно и добавлением фузидина натрия, физиологически активных соединений полифенольной природы в виде дегидрокварцетина или ресвератрола, ферментов в виде трипсина, химотрипсина или лизоцима, низкомолекулярных пептидов. К недостаткам описанной композиции следует отнести высокое содержание влаги в пленках, способствующее быстрому обсеменению пленок и дальнейшей их биодеградации. Кроме того, недостатком является использование в качестве продуцента штамма Gluconacetobacter sucrofermentans, который в отличии от симбиотической культуры более требователен к питательным компонентам среды и менее устойчив, что затрудняет и удорожает масштабирование процесса культивирования.

В статье Черниговой С.В. и соавторов (Чернигова С.В., Чернигов Ю.В., Погорелова НА и др., 2019) описан способ получения импланта трахеи из бактериальной целлюлозы. Биосинтез образцов БЦ осуществляли при статическом культивировании симбиотической культуры Medusomyces gisevii. По окончании культивирования пленки целлюлозы, очищали от остатков питательной среды путем промывания деионизированной водой, промывали 0,1 М NaOH. После этого пленки высушивали на воздухе при комнатной температуре и хранили в пластиковой упаковке. Пленки показали отсутствие воспаления и отторжения импланта из бактериальной целлюлозы в области внедрения, что свидетельствует о его биосовместимости с органами животных. Недостатком данного способа является то, что пленки целлюлозы промывали целиком не измельчая. Такой вид очистки за счет строения зооглеи Medusomyces gisevii не обеспечивает полное освобождение БЦ от компонентов среды и бактерий, а, следовательно, такая БЦ может обладать пирогеностью. Кроме того, высушивание БЦ на воздухе значительно снижает пористость структур и может способствовать микробному обсеменению.

Наиболее близким способом получения матрицы на основе бактериальной целлюлозы является патент RU2624242C1 «Раневое покрытие, обладающее гемостатическим действием, и способ его получения». В качестве раневого покрытия используют бактериальную целлюлозу, которую синтезируют с помощью культуры Medusomyces gisevii Sa-12 с влажностью 99% и формируют ее в виде основы размером 5 см × 5 см при массе влажного образца от 100 до 1000 грамм. Влажный биополимерный материал предварительно подвергают сублимационной сушке до влажности 30,0-50,0%, а после методом распыления наносят растворы гемостатических до 10% и антимикробных до 3% компонентов. Биополимерный материал в виде губки высушивают до влажности 0,1-35,0%. Недостатком данного способа является то, что синтезированную бактериальную целлюлозу не очищают от входящих в ее состав клеток и компонентов питательной среды, а также подвергают лиофильной сушке влажный биополимер без измельчения, что значительно сокращает количество и объем пор в губке.

Технический результат заявленного изобретения заключается в расширении ассортимента биосовместимых матриц на основе бактериальной целлюлозы с комплексным синергетическим эффектом активизации репаративных процессов поврежденных тканей, усиленным антимикробным действием и упрощением технологии изготовления.

Технический результат достигается тем, что в биосовместимой матрице на основе бактериальной целлюлозы и пептидов природного происхождения для активизации репаративных процессов поврежденных тканей, содержащей биополимерный материал на основе бактериальной целлюлозы с комплексом биологически активных компонентов, согласно изобретению в качестве биополимерного материала используют бактериальную целлюлозу, синтезированную с помощью симбиотической культуры Medusomyces gisevii Sa-28, в качестве биологически активных компонентов матрица содержит пептиды, полученные кислотно-ферментативным гидролизом белков эмбриональных и внеэмбриональ-ных тканей 10-ти суточных куриных эмбрионов в количестве 0,12-0,2 мг/см3 при толщине матрицы 3-5 мм, а в качестве антимикробных средств хлоргексидин в количестве 6-10 мкг/см3 при толщине матрицы 3-5 мм и метронидазол в количестве 6-10 мкг/см3 при толщине матрицы 3-5 мм.

Матрица согласно изобретению обладает высокой пористостью и влагоемкостью, доказанной биосовместимостью, низкой иммуногенно-стью и отсутствием цитотоксичности.

Предложенная матрица на основе бактериальной целлюлозы получена путем культивирования симбиотической культуры Medusomyces gisevii Sa-28, поэтапной очистки выращенной пленки раствором NaOH и раствором уксусной кислоты, гомогенизации до однородной гелеобразной массы, автоклавировании, добавлении к 1000 г однородной смеси очищенной бактериальной целлюлозы 50 мл пептидов 2%, полученных кислотно-ферментативным гидролизом белков эмбриональных и внеэмбриональных тканей 10-ти суточных куриных эмбрионов, 100 мл раствора хлоргексидина 0,05% и 10 мл раствора метронидазола 0,5%, доведении смеси до 2000 г очищенной водой и перемешивании до получения однородной массы, лиофилизации до содержания влаги 1-5%, стерилизации этиленоксидом. Полученная матрица не оказывает цитотоксического эффекта и обладает биосовместимостью.

Изобретение поясняется фотографиями. На фиг.1 представлен регенерат 1-ой группы (матрица на основе чистой БЦ, приготовлена по примеру 1) на 7 сутки, вверху окраска гематоксилином и эозином ×50, внизу окраска трихромом по Массону ×50. На фиг.2 представлен регенерат 1-ой группы (матрица на основе чистой БЦ, приготовлена по примеру 1) на 28 сутки, вверху окраска гематоксилином и эозином ×50, внизу окраска трихромом по Массону ×50. На фиг.3 представлен регенерат 2-ой группы (матрица на основе БЦ с включением желатина, приготовлена по примеру 2) на 7 сутки, вверху окраска гематоксилином и эозиномх50, внизу окраска трихромом по Массону ×50. На фиг.4 представлен регенерат 2-ой группы (матрица на основе БЦ с включением желатина, приготовлена по примеру 2) 28 сутки, вверху окраска гематоксилином и эозином × 50, внизу окраска трихромом по Массону ×50. На фиг.5 предоставлен регенерат 3-ей группы (матрица на основе БЦ с включением пептидов, приготовлена по примеру 7) на 7 сутки, вверху окраска гематоксилином и эозином ×50, внизу окраска трихромом по Массону ×50. На фиг.6 предоставлен регенерат 3-ей группы (матрица на основе БЦ с включением пептидов, приготовлена по примеру 7) на 28 сутки, вверху окраска гематоксилином и эозином ×50, внизу окраска трихромом по Массону ×50.

Депонирование культуры Medusomyces gisevii проводилось в БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт», г. Москва под регистрационным номером Sa-28. Биополимер получали путем глубинного выращивания культуры Medusomyces gisevii Sa-28 при температуре 20-30°С в течение 10-20 суток на глюкозосодержащей питательной среде с добавлением отвара (настой) черного чая.

В заявленном изобретении используют хлоргексидин в качестве антисептического средства с доказанной эффективностью при наружном и местном применении. Хлоргексидин проявляет в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий бактерицидное действие, оказывает фунгицидное и вирулицидное действие (в отношении липофильных вирусов). Эффективен в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, вирусов и грибов. Сохраняет активность (хотя несколько сниженную) в присутствии крови, гноя, различных секретов и органических веществ.

Также в качестве противомикробного средства используют метрони-дазол. Препарат активен в отношении Trichomonas vaginalis, Giardia intestinalis (Lamblia intestinalis) Entamoeba histolytica, а также грамотрицательных анаэробов (споро- и неспорообразующих) - Bacteroides spp.(в т.ч. Bacteroides fragilis, Bacteroides distasonis, Bacteroides ovatus, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides vulgatus], Fusobacterium spp., Prevotella spp., Veillonella spp.и некоторых грамположительных анаэробов (чувствительные штаммы Eubacterium spp., Clostridium spp., Peptococcus niger., Peptostreptococcus spp.).

В качестве природных полимеров для придания матрице объема и пористости были выбраны: желатин, хитозан, метилцеллюлоза, пектин, каррагинан.

Желатин представляет собой гидролизат коллагена животного происхождения, сохраняющий ряд его биологических и физико-химических свойств. Желатин является биосовместимым полимером, что делает его перспективным материалом для биоинженерии.

Хитозан - деацетилированная форма широко распространенного в природе полимера хитина. Полимерный материал, получающий все большее признание при формировании тканеинженерных конструкций.

Метилцеллюлоза - природный полимер, полученный из растительной целлюлозы. Ее часто используют для усиления жесткости матриц, повышения эластичности и стабильности матриц, а также придания им микропористости.

Пектин природный полисахарид растительного происхождения основными преимуществами которого являются его биосовместимость, нетоксичность, биоразлагаемость.

Каррагинан - полисахарид водорослей, нетоксичен, обладает уникальными физико-химическими свойствами и разнообразной биологической активностью, поэтому в последние годы находят широкое применение в биомедицине.

В последние годы в современной медицинской и ветеринарной практике отмечена тенденция к широкому применению биопрепаратов на основе пептидов, что связано с широким спектром их действия на организм. Известно, что биоактивные пептиды, полученные из природных источников, обладают высокой биологической активностью, в том числе иммуно-регуляторным, гипотензивным, антимикробным действием, имеют высокую антиоксидантную активность. В изобретении использовали пептиды, полученные кислотно-ферментативным гидролизом белков эмбриональных и внеэмбриональных тканей 10-ти суточных куриных эмбрионов.

Для пояснения реализации биосовместимой матрицы на основе бактериальной целлюлозы и пептидов природного происхождения, для активизации репаративных процессов поврежденных тканей приведены примеры конкретного ее выполнения.

Пример 1. Получают бактериальную целлюлозу путем культивирования Medusomyces gisevii Sa-28 на гюкозосодержащей среде. Выращенную биопленку нарезают, поэтапно очищают раствором NaOH и раствором уксусной кислоты, гомогенизируют до однородной гелеобразной массы, ав-токлавируют.Далее к 1000 г однородной смеси очищенной БЦ добавляют 100 мл раствора хлоргексидина 0,05% и 10 мл раствора метронидазола 0,5%, после чего смесь доводят до 2000 г очищенной водой и перемешивают до получения однородной массы. Полученную субстанцию разливают в формы размером 50 на 70 мм, подвергают лиофилизации до содержания влаги 1-5% и толщины 3-5 мм (содержание метронидазола 6-10 мкг/см³, хлоргексидина 6-10 мкг/см³), стерилизуют этиленоксидом. Матрица, полученная таким образом обладает малым объемом пор и неоднородной структурой.

Пример 2. Получают бактериальную целлюлозу путем культивирования Medusomyces gisevii Sa-28 на гюкозосодержащей среде. Выращенную биопленку нарезают, поэтапно очищают раствором NaOH и раствором уксусной кислоты, гомогенизируют до однородной гелеобразной массы, автоклавируют. Далее к 1000 г однородной смеси очищенной бактериальной целлюлозы добавляют раствор желатина 1% в соотношении 10:1 (10 частей БЦ: 1 части раствора желатина), 100 мл раствора хлоргексидина 0,05% и 10 мл раствора метронидазола 0,5%, после чего смесь доводят до 2000 г очищенной водой и перемешивают до получения однородной массы. Полученную субстанцию разливают в формы размером 50 на 70 мм, подвергают лиофилизации до содержания влаги 1-5% и толщины 3-5 мм (содержание метронидазола 6-10 мкг/см³, хлоргексидина 6-10 мкг/см³), стерилизуют этиленоксидом. Полученная матрица обладает высокой пористостью, объемом, высокой плотностью.

Пример 3. Получают бактериальную целлюлозу путем культивирования Medusomyces gisevii Sa-28 на гюкозосодержащей среде. Выращенную биопленку нарезают, поэтапно очищают раствором NaOH и раствором уксусной кислоты, гомогенизируют до однородной гелеобразной массы, ав-токлавируют. Далее к 1000 г однородной смеси очищенной бактериальной целлюлозы добавляют раствор хитозана 1% в соотношении 10:1 (10 частей БЦ: 1 части раствора хитозана), 100 мл раствора хлоргексидина 0,05% и 10 мл раствора метронидазола 0,5%, после чего смесь доводят до 2000 г очищенной водой и перемешивают до получения однородной массы. Полученную субстанцию разливают в формы размером 50 на 70 мм, подвергают лиофилизации до содержания влаги 1-5% и толщины 3-5 мм (содержание метронидазола 6-10 мкг/см³, хлоргексидина 6-10 мкг/см³), стерилизуют этиленоксидом. Полученная матрица обладает равномерной крупнопористой структурой с размером пор 100 мкм и более.

Пример 4. Получают бактериальную целлюлозу путем культивирования Medusomyces gisevii Sa-28 на гюкозосодержащей среде. Выращенную биопленку нарезают, поэтапно очищают раствором NaOH и раствором уксусной кислоты, гомогенизируют до однородной гелеобразной массы, автоклавируют. Далее к 1000 г однородной смеси очищенной бактериальной целлюлозы добавляют раствор метилцеллюлозы 1% в соотношении 10:1 (10 частей БЦ: 1 части раствора метилцеллюлозы), 100 мл раствора хлоргексидина 0,05% и 10 мл раствора метронидазола 0,5%, после чего смесь доводят до 2000 г очищенной водой и перемешивают до получения однородной массы. Полученную субстанцию разливают в формы размером 50 на 70 мм, подвергают лиофилизации до содержания влаги 1-5% и толщины 3-5 мм (содержание метронидазола 6-10 мкг/см³, хлоргексидина 6-10 мкг/см³}, стерилизуют этиленоксидом. Полученная матрица отличался от контрольного образца БЦ меньшей пористостью и несколько большим разбросом размерности пор.

Пример 5. Получают бактериальную целлюлозу путем культивирования Medusomyces gisevii Sa-28 на гюкозосодержащей среде. Выращенную биопленку нарезают, поэтапно очищают раствором NaOH и раствором уксусной кислоты, гомогенизируют до однородной гелеобразной массы, автоклавируют. Далее к 1000 г однородной смеси очищенной БЦ добавляют раствор пектина 1% в соотношении 10:1 (10 частей БЦ: 1 части раствора пектина), 100 мл раствора хлоргексидина 0,05% и 10 мл раствора метронидазола 0,5%, после чего смесь доводят до 2000 г очищенной водой и перемешивают до получения однородной массы. Полученную субстанцию разливают в формы размером 50 на 70 мм, подвергают лиофилизации до содержания влаги 1-5% и толщины 3-5 мм (содержание метронидазола 6-10 мкг/см³, хлоргексидина 6-10 мкг/см³), стерилизуют этиленоксидом. Полученная матрица отличался низкой пористостью на поверхности и неодинаковой пористостью по слоям.

Пример 6. Получают бактериальную целлюлозу путем культивирования Medusomyces gisevii Sa-28 на гюкозосодержащей среде. Выращенную биопленку нарезают, поэтапно очищают раствором NaOH и раствором уксусной кислоты, гомогенизируют до однородной гелеобразной массы, автоклавируют. Далее к 1000 г однородной смеси очищенной БЦ добавляют раствор каррагинана 1% в соотношении 10:1 (10 частей БЦ: 1 части раствора каррагинана), 100 мл раствора хлоргексидина 0,05% и 10 мл раствора метронидазола 0,5%, после чего смесь доводят до 2000 г очищенной водой и перемешивают до получения однородной массы. Полученную субстанцию разливают в формы размером 50 на 70 мм, подвергают лиофилизации до содержания влаги 1-5% и толщины 3-5 мм (содержание метронидазола 6-10 мкг/см³, хлоргексидина 6-10 мкг/см³), стерилизуют этиленоксидом. Полученная матрица характеризуется низкой пористостью и ее очаговой неравномерностью на поверхности.

Пример 7. Получают бактериальную целлюлозу путем культивирования Medusomyces gisevii Sa-28 на гюкозосодержащей среде. Выращенную биопленку нарезают, поэтапно очищают раствором NaOH и раствором уксусной кислоты, гомогенизируют до однородной гелеобразной массы, автоклавируют. Далее к 1000 г однородной смеси очищенной БЦ добавляют 50 мл пептидов 2%, полученных кислотно-ферментативным гидролизом белков эмбриональных и внеэмбриональных тканей 10-ти суточных куриных эмбрионов, 100 мл раствора хлоргексидина 0,05% и 10 мл раствора метронидазола 0,5%, после чего смесь доводят до 2000 г очищенной водой и перемешивают до получения однородной массы. Полученную субстанцию разливают в формы размером 50 на 70 мм, подвергают лиофилизации до содержания влаги 1-5% и толщины 3-5 мм (содержание пептидов 0,12-0,2 мг/см³, метронидазола 6-10 мкг/см³, хлоргексидина 6-10 мкг/см³), стерилизуют этиленоксидом. Полученная матрица обладает высокой пористостью, объемом, плотностью.

Была проведена оценка влагоемкости, пористости, цитотоксичности и биосовместимости матриц, полученных согласно изобретению.

Пористость определяли по методике, описанной Jian Yang (Yang J., Shi, G., Bei, J., Wang, S., Cao, Y., Shang, Q., Yang, G. and Wang, W. Fabrication and Surface Modification of Macroporous Poly(L-lactic Acid) and Poly(L-lactic-co-glycolic Acid) (70/30) Cell Scaffolds for Human Skin Fibroblast Cell Culture. Journal of Biomedical Materials 2002, 62, 438-446). Кроме того, пористость полученных матриц оценивали методом световой микроскопии с помощью микроскопа Axio Zoom (Carl Zeiss Microscopy, Германия).

Влагоемкость определяли согласно методике Tugce Kutlusoy (Kutlusoy, Т., Oktay, В., Apohan, N.K., Suleymanoglu, M., Serap, E.K. Chitosan-co-Hyaluronic acid porous cryogels and their application in tissue engineering International Journal of Biological Macromolecules 2017, 103, 366-378.).

Цитотоксичность полученных матриц оценивали на фибробластах куриных эмбрионов, исследование проводились в соответствии со стандартом ISO 10993-12-2015 и с применением стандартного колориметрического МТТ-анализа. Жизнеспособности клеток>70% свидетельствует об отсутствии выраженного цитотоксического эффекта.

Биосовместимость образцов матриц изучалась in vivo с использованием модели САМ (chorioallantoic membrane) хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона в соответствии с методикой, описанной в работах Ahtzaz S. (Ahtzaz S., Sher Waris Т., Shahzadi L., Anwar Chaudhry A., Ur Rehman 1., & Yar M. Boron for tissue regeneration it's loading into chitosan/collagen hydrogels and testing on chorioallantoic membrane to study the effect on angiogenesis. International Journal of Polymeric Materials and Polymeric Biomaterials. 2019: 1-10) и Ribatti D. (Ribatti D., Annese Т., & Tamma R. The use of the chick embryo CAM assay in the study of angiogenic activiy of biomaterials. Microvascular Research, 2020: 104026) в некоторой модификации путем имплантации матриц на хориоаллантоисную мембрану куриного эмбриона (САМ). Акцент делался на изучение ангиогенеза. Для этого на 8-й день инкубации яйца через вырезанное окно на поверхность САМ были имплантированы образцы матриц размером 5×5×5 мм. Окно снова закрывали и инкубацию продолжали до 14 дня. Оценку инфильтрации кровеносных сосудов проводили с использованием макроскопа Axio ZOOM.VI6, оснащенного системой визуализации изображений AxioCam MRc5 и программным обеспечением Zen 2 Pro (Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany).

По балльной системе (5 баллов - выраженный ангиогенный эффект) на 14-е сутки инкубации по показателю ангиогенеза лидирующую позицию занимают матрицы, приготовленные по примеру 2 и 7. Данные образцы отличаются максимально выраженным врастанием сосудов внутрь матрицы, по-нашему мнению это может быть связано с ферментным разрушением желатина до биологически активных пептидов. Незначительно ему уступали матрицы с чистой БЦ (пример 1) и с добавлением метилцеллюлозы (пример 4). Матрицы с добавлением хитозана (пример 3), пектина (пример 5) и каррагинана (пример 6) также имели положительный ангиогенный эффект, однако развитие новых сосудов визуализировалось в основном по периферии, что, по всей видимости, связано с более мелкой пористостью в толще матрицы.

Исследования показали, что все образцы полученных матриц обладают высокой пористостью и влагоемкостью, нецитотоксичны и обладают высокой биосовместимостью. Лучший результат показали образцы, приготовленные по примеру 2 и 7. Результаты исследований представлены в таблице.

Биосовместимость образцов матриц согласно изобретению изучалась in vivo на белых крысах.

В эксперименте использовались половозрелые самцы белых крыс массой тела 320-350 г. Имплантация матриц проводилась подкожно, на дорсальной части грудного отдела. Животные анестезировались с помощью препарата «Золетил-100» (VIRBAC, Франция) в дозировке 10 мг/кг. Кожа в области имплантации тщательно выбривалась. Операционное поле обрабатывалось 70% раствором спирта и 1% спиртовым раствором йода. Для имплантации матриц делался один сантиметровый разрез кожи до подлежащей фасции. Под кожу внедрялись матрицы размером 5×5 мм. Рана ушивалась полипропиленовой нитью одним швом.

Резекция матрицы с участками кожи осуществлялась через 7 суток и 28 суток после имплантации. Вывод животных из эксперимента осуществлялся посредством умерщвления в парах эфира Участки кожи, содержащие матрицы (регенераты) вырезали и фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина на протяжении 72 часов, промывали, дегидратировали в изопропиловом спирте и заключали в парафиновые блоки с использованием медицинского парафина Histomix (Biovitrum, Россия).

Гистологические срезы толщиной 6-7 мкм целлюлозных матриц с окружающими тканями окрашивали гематоксилином-эозином и трихромом по Мас-сону.

Оценку микропрепаратов тканей проводили с использованием микроскопа Axio Imager 2 (А2) (Carl Zeiss Microscopy, Германия) при увеличении ×50 с фиксацией изображений с помощью специализированной фотокамеры AxioCam MRc5 (Carl Zeiss Microscopy, Германия) и программного обеспечения Zen 2 Pro.

Для исследования биосовместимости на крысах были выбраны три образца матриц, приготовленные по примеру 1 (группа 1), примеру 2 (группа 2) и примеру 7 (группа 3). Животных делили на 3 группы по 6 крыс в каждой.

Общие виды структуры регенератов после имплантации целлюлозных матриц показаны на фотографиях (фиг.1-6).

Через 7 суток при визуальном осмотре места имплантации матрицы в подкожной клетчатке у животных 3 группы визуализировались признаки умеренной воспалительная реакции. У животных группы 1 и 2 групп воспалительная реакция была более выражена (в пределах нормальной реакции для хирургического вмешательства) и характеризовалась покраснением и увеличением размеров извлекаемого регенерата по сравнению с регенератом 3-й группы.

На 7 сутки в группе 1 (фиг.1 вверху) периферические наружная и внутренняя части регенерата инфильтрированы различными клетками в том числе лейкоцитами (лимфоциты и макрофаги). Из соединительнотканных клеток визуализируются фибробласты, некоторые сосуды кровенаполнены расширены. Между волокнами матрицы визуализируются очаговые скопления жидкости. В центральной части регенерата (фиг.1 внизу) менее выраженная инфильтрация клетками крови, чем по периферии. Фиксируется классическая острая воспалительная реакция на проведенное оперативное вмешательство. Развитых вновь образованных коллагеновых волокон внутри регенерата не наблюдается, есть тонкие волокна по периферии.

На 28 сутки в группе 1 (фиг.2, вверху) наблюдается хорошо развитая тканеспецифическая структура соединительной ткани внутри регенерата. Практически по всей толщине регенерата визуализируется сформированная соединительная ткань с хорошо выраженными многочисленными капиллярами, вокруг регенерата визуализируется жировая ткань. Визуализируются незначительные области, инфильтрированные фибробластами без выраженного развития соединительнотканной капсулы вокруг регенерата. Соединительнотканные волокна (фиг.2, внизу) визуализируются равномерно как по периферии, так и в центре регенерата с вновь образованными капиллярами. Полученные результаты свидетельствуют о биосовместимости и низкой иммуногенности данного типа матрицы.

На 7 сутки в группе 2 (фиг.3, вверху) периферические наружная и внутренняя части регенерата инфильтрированы различными клетками в том числе лейкоцитами (лимфоциты, макрофаги, нейтрофилы и плазматические клетки). Соединительнотканные структуры представлены фибробластами, сосуды кро-венаполнены расширены. В центральной части регенерата (фиг.3, внизу), менее выраженная инфильтрация клетками крови, однако местами имеются более обширные скопления клеток характерные для областей биодеградируемого желатина. Фиксируется более выраженная классическая острая воспалительная реакция на проведенное оперативное вмешательство, чем у животных 1 и особенно 3 группы. Это может быть связано с дополнительной иммунной реакцией на желатин. Развитых вновь образованных коллагеновых волокон внутри регенерата не наблюдается, есть тонкие волокна по периферии.

На 28 сутки в группе 2 (фиг.4, вверху) хорошо развитая несколько утолщенная по сравнению с другими группами тканеспецифическая структура соединительной ткани внутри регенерата. По всей толщине регенерата сформированная соединительная ткань с хорошо выраженными многочисленными капиллярами визуализируется равномерно. Полученные результаты свидетельствуют о наличии некоторой степени иммуногенности и высокой биосовместимости данного типа матрицы, характеризующейся интенсивным развитием кровеносных капилляров. По всей толщине регенерата (фиг.4, внизу) визуализируется сформированная соединительная ткань с хорошо выраженными капиллярами, которые уступают по количеству регенератам 3 группы, но превосходят их количество по сравнению с 1 группой.

На 7 сутки в группе 3 (фиг.5, вверху) периферические наружная и внутренняя части регенерата инфильтрированы различными клетками в том числе лейкоцитами (лимфоциты, макрофаги), а также фибробластами. Кровеносные сосуды расширены визуализируются у большинства животных в периферической части регенерата. В центральной части регенерата, менее выраженная инфильтрация клетками крови, чем по периферии. В периферической части клеточные скопления менее обширны, чем в 1 группе. Фиксируется менее выраженная классическая острая воспалительная реакция (фиг.5, внизу) на проведенное оперативное вмешательство, чем у животных 1 и 2 групп. Развитых вновь образованных коллагеновых волокон внутри регенерата не наблюдается. Имеются рыхло расположенные тонкие соединительнотканные волокна, расположенные по периферии.

На 28 сутки в группе 3 (фиг.6) хорошо развитая тканеспецифическая структура соединительной ткани внутри регенерата. По всей толщине регенерата сформированная соединительная ткань с хорошо выраженными многочисленными капиллярами расположенными равномерно. Полученные результаты свидетельствуют о низкой иммуногенности и высокой биосовместимости данного типа матрицы, характеризующейся интенсивным развитием кровеносных капилляров. Гистологический анализ регенерата на 7 сутки в сравнении с 1 и 2 группами свидетельствуют о противовоспалительном эффекте включаемых пептидов.

Таким образом, заявляемое изобретение за счет оптимальной пористости, высокого уровня влагоемкости, а также стимулирования роста новых кровеносных сосудов позволяет получить биосовместимый материал, предназначенный для применения в биотехнологии и медицине в качестве матриц для замещения дефектов и активизации репаративных процессов поврежденных тканей.

Список использованных источников:

1. Архарова Н. А., Северин А. В., Хрипуновс А. К., Крашенинников С. В., Ткаченко А. А., Орехова А. С, Давыдова Г. А., Ракова Е. В., Клечковская В. В. Композитные пленки на основе бактериальной целлюлозы и нанокристаллов гидроксиапатита: морфология, структура и свойства / Высокомолекулярные соединения. Серия А, 2019, том 61, №5, с. 448-457.

2. Кутырев М.А., Шишацкая Е.И., Скорб Е.В., Уласевич С.А. Формирование паттерна из гидроксиапатита в матрице бактериальной целлюлозы / Гены & Клетки XVII, №3, 2022.

3. Патент RU2733137C1 Способ получения биокомпозита с регенера-ционными свойствами на основе гидрогеля бактериальной целлюлозы, опубл.29.09.2020 Бюл. №28.

4. Наноматериал из бактериальной целлюлозы - современное средство для изготовления имплантатов трахеи С.В. Чернигова, Ю.В. Чернигов, Н.А. Погорелова, А.В. Горбатенко.

5. Патент RU2624242 С1 Раневое покрытие, обладающее гемостатическим действием, и способ его получения, опубл. 03.07.2017 Бюл. №19.

Изобретение относится к биотехнологии. Биосовместимая матрица на основе бактериальной целлюлозы и пептидов природного происхождения, содержащая биополимерный материал на основе бактериальной целлюлозы, синтезированной с помощью симбиотической культуры Medusomyces gisevii Sa-28, и биологически активные компоненты: пептиды, полученные кислотно-ферментативным гидролизом белков эмбриональных и внеэмбриональных тканей 10-суточных куриных эмбрионов, в количестве 0,12-0,2 мг/см³ при толщине матрицы 3-5 мм; в качестве антимикробных средств хлоргексидин в количестве 6-10 мкг/см³ при толщине матрицы 3-5 мм и метронидазол в количестве 6-10 мкг/см³ при толщине матрицы 3-5 мм. Изобретение обеспечивает расширение средств, используемых для активизации репаративных процессов поврежденных тканей, с усиленным антимикробным действием. 6 ил., 1 табл., 7 пр.

Биосовместимая матрица на основе бактериальной целлюлозы и пептидов природного происхождения для активизации репаративных процессов поврежденных тканей, содержащая биополимерный материал на основе бактериальной целлюлозы с комплексом биологически активных компонентов, отличающаяся тем, что в качестве биополимерного материала используют бактериальную целлюлозу, синтезированную с помощью симбиотической культуры Medusomyces gisevii Sa-28, в качестве биологически активных компонентов матрица содержит пептиды, полученные кислотно-ферментативным гидролизом белков эмбриональных и внеэмбриональных тканей 10-суточных куриных эмбрионов, в количестве 0,12-0,2 мг/см³ при толщине матрицы 3-5 мм, а в качестве антимикробных средств хлоргексидин в количестве 6-10 мкг/см³ при толщине матрицы 3-5 мм и метронидазол в количестве 6-10 мкг/см³ при толщине матрицы 3-5 мм.