СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ Российский патент 2024 года по МПК C12P19/04 C12N1/20 

Изобретение относится к области микробиологического получения полисахаридов, а именно: бактериальной целлюлозы, которая может быть использована в медицине, промышленности и технике.

Из уровня техники известен способ получения бактериальной целлюлозы по патенту РФ №2536257 (дата публикации 20.12.2014). Данный способ включают культивирование бактерий на поверхности питательной среды в течение 3-5 суток с последующим отделением бактериальной целлюлозы от культуральной среды, промывку и сушку при 80°С.

Основным недостатком описанного способа является однократный отбор пленки бактериальной целлюлозы с поверхности питательной среды. Кроме того, в описанном техническом решении бактериальной целлюлозы предлагается использовать в высушенном состоянии.

Наиболее близким, а потому и принятым за прототип, является техническое решение по патенту РФ №2597291 (дата публикации 10.09.2016 г), которое включает культивирование продуцента бактериальной целлюлозы на поверхности питательной среды, отделение пленки бактериальной целлюлозы, обработку ее гидроксидом натрия, затем соляной кислотой, промывку водой, а затем сушку при комнатной температуре.

Основным недостатком описанного способа является однократный отбор бактериальной целлюлозы с поверхности питательной среды через 5-14 суток культивирования. Кроме того, бактериальную целлюлозу предлагается использовать в высушенном состоянии.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения бактериальной целлюлозы, который позволит многократно повысить площадь поверхности бактериальной целлюлозы, получаемой с единицы производственного оборудования при однократной загрузке питательной среды.

Поставленная задача решается предлагаемым способом получения бактериальной целлюлозы, который включает однократную загрузку жидкой питательной среды и инокулята, культивирование продуцента, отделение бактериальной целлюлозы от культуральной жидкости, обработку гидроксидом натрия, соляной кислотой, промывку водой, стерилизацию и упаковывание, при этом отбор бактериальной целлюлозы, полученной в виде гель-пленок осуществляют многократно при однократной загрузке питательной среды.

Особенностью предлагаемого способа является следующее: бактериальную целлюлозу, получают в виде гель-пленок, отбор которых осуществляется до одиннадцати раз при однократной загрузке питательной среды, после промывки бактериальную целлюлозу стерилизуют и упаковывают, стадия сушки исключена.

Бактериальная целлюлоза широко применяется в биомедицинских целях, самым востребованным направлением является перевязка ран, регенерация тканей кожи, лечения ожогов, использование в качестве искусственной кожи (Dhar P. et al. Valorization of sugarcane straw to produce highly conductive bacterial cellulose/graphene nanocomposite films through in situ fermentation: kinetic analysis and property evaluation // Journal of Cleaner Production. - 2019. - T. 238. - C. 117859; Dugan J. M., Gough J. E., Eichhorn S. J. Bacterial cellulose scaffolds and cellulose nanowhiskers for tissue engineering // Nanomedicine. - 2013. - T. 8. - №. 2. - C. 287-298.). Потребность в таких материалах велика как в мирное, так и в военное время.

Тонкие прозрачные гель-пленки бактериальной целлюлозы позволяют «контролировать» процесс регенерации раны или ожога в процессе лечения (Shen, Z., Zhu, W., Huang, Y., Zhang, J., Wu, Y., Pan, Y.,… & Tang, B. Z. (2023). Visual Multifunctional Aggregation-Induced Emission-Based Bacterial Cellulose for Killing of Multidrug-Resistant Bacteria. AdvancedHealthcareMaterials, 2300045. DOI: 10.1002/adhm.202300045). Сходство наноструктурированной влажной бактериальной целлюлозы с тканью живого организма обуславливает высокую биосовместимость БЦ, по этой причине чаще всего для лечения используют именно гель-пленки, а не сухую бактериальную целлюлозу.

Предлагаемое техническое решение основано на физиологических особенностях уксуснокислых бактерий, являющихся продуцентами бактериальной целлюлозы. Уксуснокислые бактерии - это строгие аэробы, поэтому основное скопление популяции наблюдается на границе раздела фаз жидкость-воздух. Синтезируя бактериальную целлюлозу, уксуснокислые бактерии по сути производят самоиммобилизацию. Известно, что увеличение толщины целлюлозных гель-пленок происходит из-за образования новых слоев целлюлозы на границе раздела пленка/воздух (Borzani, W., & Souza, S.J. (1995). Mechanism of the film thickness increasing during the bacterial production of cellulose on non-agitated liquid media. BiotechnologyLetters, 17(11), 1271-1272. https://doi.org/10.1007/BF00128400), таким образом, старые пленки опускаются вниз, а новые образуются на поверхности культуральной среды, при этом недостаток аэрации в толще пленки ведет к замедлению процесса биосинтеза бактериальной целлюлозы. Одновременно с этим происходит исчерпание питательных веществ среды и накопление побочных продуктов метаболизма, то есть для биосинтеза бактериальной целлюлозы статическим способом работают классические для любого биотехнологического процесса ограничения. Биосинтез может быть интенсифицирован и продлен путем доливки питательной среды, что для бактериальной целлюлозы описано в работах (Dubey, S., Singh, J., & Singh, R.P. (2018). Biotransformation of sweet lime pulp waste into high-quality nanocellulose with an excellent productivity using Komagataeibactereuropaeus SGP37 under static intermittent fed-batch cultivation. Bioresource Technology, 247, 73-80. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2017.09.089; Hornung, M., Ludwig, M., & Schmauder, H.-P. (2007). Optimizing the Production of Bacterial Cellulose in Surface Culture: A Novel Aerosol Bioreactor Working on a Fed Batch Principle (Part 3). EngineeringinLifeSciences, 7(1), 35-41. DOI: 10.1002/elsc.200620164), либо путем отъема гель-пленок метаболита, что впервые предлагается в данном патенте. За счет отбора образовавшейся гель-пленки бактериальной целлюлозы доступ кислорода для уксуснокислых бактерий сохраняется постоянно, популяция клеток на протяжении всего процесса является высокой, поэтому технически возможен многократный отбор гель-пленок бактериальной целлюлозы. Отбор гель-пленок производится до исчерпания объема питательной среды и исчерпания питательных веществ.

По сравнению с известным решением предлагаемый способ позволяет повысить производительности бактериальной целлюлозы с единицы производственного оборудования при однократной загрузке питательной среды путем многократного отбора гель-пленок бактериальной целлюлозы. Способ позволяет получать бактериальную целлюлозу в статических условиях в виде гель-пленки, производя их отбор до 11 раз при использовании однократной загрузки питательной среды.

Сравнение характеристик предлагаемого способа с известным техническим решением, приведено в таблице 1.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1.

Продуцент бактериальной целлюлозы Medusomyces gisevii ВКПМ Sa-12 культивируют на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата, полученного из предварительно обработанного химическим способом мискантуса. Ферментативный гидролизат представляет собой жидкость светло-коричневого цвета с небольшим количеством взвесей, с характерным кисловатым запахом мискантуса и имеет следующий состав: массовая доля сухих веществ - 4,8%, концентрация редуцирующих веществ - 35 г/л; рН 5,0. В 1 л ферментативного гидролизата мискантуса добавляют 15 г/л черного байхового чая, доводят до кипения, жидкость отфильтровывают, охлаждают до температуры 28°С.

Культивирование осуществляется в стационарных условиях в открытых сосудах в течение 49 суток при температуре 28°С с отделением гель-пленок бактериальной целлюлозы от культуральной жидкости десятикратно на 3-е, 6-е, 9-е, 13-е, 17-е, 21-е, 26-е, 32-е, 39-е, 49-е сутки. При этом новые порции питательной среды не добавляются. Остаточная концентрация редуцирующих веществ среды составляет 0,6 г/л.

Образцы пленок очищают следующим способом: в течение 24 ч пленку выдерживают в 0,5%-ном растворе NaOH для удаления клеток, промывают в дистиллированной воде до нейтральной реакции, после этого пленку обрабатывают в течение 24 ч в 0,5%-ном растворе HCl с целью отбелки бактериальной целлюлозы от красящих компонентов питательной среды, промывают дистиллированной водой. Образцы фасуют в отдельные емкости, стерилизуют методом автоклавирования при 1,0 атм 40 минут и упаковывают.

Пример 2.

Продуцент бактериальной целлюлозы Medusomyces gisevii ВКПМ Sa-12 культивируют на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата, полученного из предварительно обработанной химическим способом шелухи овса. Ферментативный гидролизат представляет собой прозрачную жидкость янтарно-желтого цвета с характерным запахом шелухи овса и имеет следующий состав: массовая доля сухих веществ - 6,3%, концентрация редуцирующих веществ - 45 г/л; рН 4,8. В 1 л ферментативного гидролизата добавляют 10 г/л зеленого байхового чая, доводят до кипения, жидкость отфильтровывают, охлаждают до температуры 30°С.

Культивирование осуществляется в стационарных условиях в открытых сосудах в течение 60 суток при температуре 30°С с отделением гель-пленок бактериальной целлюлозы от культуральной жидкости одиннадцатикратно на 3-е, 6-е, 10-е, 14-е, 19-е, 24-е, 30-е, 36-е, 42-е, 49-е, 60-е сутки. При этом новые порции питательной среды не добавляются. Остаточная концентрация редуцирующих веществ среды составляет 0,7 г/л.

Образцы пленок очищают следующим способом: в течение 24 ч пленку выдерживают в 0,5%-ном растворе NaOH для удаления клеток, промывают в дистиллированной воде до нейтральной реакции, после этого пленку обрабатывают в течение 24 ч в 0,5%-ном растворе HCl с целью отбелки бактериальной целлюлозы от красящих компонентов питательной среды, промывают дистиллированной водой. Образцы фасуют в отдельные емкости, стерилизуют методом автоклавирования при 1,0 атм 40 минут и упаковывают.

Пример 3.

Продуцент бактериальной целлюлозы Medusomyces gisevii ВКПМ Sa-12 культивируют на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата, полученного из предварительно обработанной химическим способом соломы льна-межеумка. Ферментативный гидролизат представляет собой мутноватую жидкость серо-коричневого цвета с характерным запахом соломы льна-межеумка и имеет следующий состав: массовая доля сухих веществ - 7,5%, концентрация редуцирующих веществ - 60 г/л; рН 4,5. В 1 л ферментативного гидролизата добавляют 5 г/л зеленого байхового чая, доводят до кипения, жидкость отфильтровывают, охлаждают до температуры 26°С.

Культивирование осуществляется в стационарных условиях в открытых сосудах в течение 62 суток при температуре 26°С с отделением гель-пленок бактериальной целлюлозы от культуральной жидкости одиннадцатикратно на 3-е, 6-е, 10-е, 14-е, 19-е, 24-е, 30-е, 36-е, 43-е, 51-е, 62-е сутки. При этом новые порции питательной среды не добавляются. Остаточная концентрация редуцирующих веществ среды составляет 0,8 г/л.

Образцы пленок очищают следующим способом: в течение 24 ч пленку выдерживают в 0,5%-ном растворе NaOH для удаления клеток, промывают в дистиллированной воде до нейтральной реакции, после этого пленку обрабатывают в течение 24 ч в 0,5%-ном растворе HCl с целью отбелки бактериальной целлюлозы от красящих компонентов питательной среды, промывают дистиллированной водой. Образцы фасуют в отдельные емкости, стерилизуют методом автоклавирования при 1,0 атм 40 минут и упаковывают.

Пример 4.

Продуцент бактериальной целлюлозы Medusomyces gisevii ВКПМ Sa-12 культивируют на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата, полученного из предварительно обработанной химическим способом костры конопли. Ферментативный гидролизат представляет собой мутноватую жидкость светло-коричневого цвета с характерным запахом костры конопли и имеет следующий состав: массовая доля сухих веществ - 2,4%, концентрация редуцирующих веществ - 15 г/л; рН 4,6. В 1 л ферментативного гидролизата добавляют 2 г/л черного байхового чая, доводят до кипения, жидкость отфильтровывают, охлаждают до температуры 20°С.

Культивирование осуществляется в стационарных условиях в открытых сосудах в течение 51 суток при температуре 20°С с отделением гель-пленок бактериальной целлюлозы от культуральной жидкости десятикратно на 3-е, 6-е, 9-е, 13-е, 17-е, 21-е, 26-е, 32-е, 40-е, 51-е сутки. При этом новые порции питательной среды не добавляются. Остаточная концентрация редуцирующих веществ среды составляет 0,5 г/л.

Образцы пленок очищают следующим способом: в течение 24 ч пленку выдерживают в 0,5%-ном растворе NaOH для удаления клеток, промывают в дистиллированной воде до нейтральной реакции, после этого пленку обрабатывают в течение 24 ч в 0,5%-ном растворе HCl с целью отбелки бактериальной целлюлозы от красящих компонентов питательной среды, промывают дистиллированной водой. Образцы фасуют в отдельные емкости, стерилизуют методом автоклавирования при 1,0 атм 40 минут и упаковывают.

Пример 5.

Продуцент бактериальной целлюлозы Medusomyces gisevii ВКПМ Sa-12 культивируют на полусинтетической питательной среде. К 1 л воды добавляют 12 г/л черного байхового чая, 25 г/л глюкозы, доводят до кипения, жидкость отфильтровывают, охлаждают до температуры 35°С.

Культивирование осуществляется в стационарных условиях в открытых сосудах в течение 61 суток при температуре 35°С с отделением гель-пленок бактериальной целлюлозы от культуральной жидкости одиннадцатикратно на 3-е, 6-е, 10-е, 14-е, 19-е, 24-е, 30-е, 36-е, 42-е, 50-е, 61-е сутки. При этом новые порции питательной среды не добавляются. Остаточная концентрация редуцирующих веществ среды составляет 0,6 г/л.

Образцы пленок очищают следующим способом: в течение 24 ч пленку выдерживают в 0,5%-ном растворе NaOH для удаления клеток, промывают в дистиллированной воде до нейтральной реакции, после этого пленку обрабатывают в течение 24 ч в 0,5%-ном растворе HCl с целью отбелки бактериальной целлюлозы от красящих компонентов питательной среды, промывают дистиллированной водой. Образцы фасуют в отдельные емкости, стерилизуют методом автоклавирования при 1,0 атм 40 минут и упаковывают.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения бактериальной целлюлозы, включающий культивирование продуцента на питательной среде с последующим отделением бактериальной целлюлозы от культуральной жидкости до одиннадцати раз при однократной загрузке питательной среды. Полученные гель-плёнки обрабатываются гидроксидом натрия, соляной кислотой, промываются водой; затем стерилизуются и упаковываются. Изобретение обеспечивает повышение выхода целевого продукта с единицы производственного оборудования при однократной загрузке питательной среды. 1 табл., 5 пр.

Способ получения бактериальной целлюлозы, включающий культивирование продуцента на питательной среде с последующим отделением бактериальной целлюлозы от культуральной жидкости, обработку гидроксидом натрия, соляной кислотой, промывку водой, отличающийся тем, что отбор бактериальной целлюлозы осуществляется до одиннадцати раз при однократной загрузке питательной среды, а полученные гель-плёнки после промывки стерилизуются и упаковываются.