СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ ДИАТОМОВОЙ ВОДОРОСЛИ NANOFRUSTULUM SHILOI Российский патент 2023 года по МПК C12N1/12 A01G33/00 C12R1/89 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном получении биомассы диатомовой водоросли Nanofrustulum shiloi.

Микроводоросль Nanofrustulum shiloi является ценным сырьем для получения биологически активных веществ. Она характеризуется высоким содержанием липидов (27-28% от сухой биомассы) и каротиноидов, в частности фукоксантина (Demirel et al., 2020), содержит флавоноиды и оксилипины ( et al., 2022), что предполагает возможность ее массового культивирования. Nanofrustulum shiloi проявляет антиоксидантную и противомикробную активность в отношении грамотрицательных Е. coli и S. typhimurium и грамположительных S. aureus. Благодаря этим ценным качествам, биомасса Nanofrustulum shiloi может применяться в пищевой промышленности, медицине, а также в качестве кормовых добавок при культивировании гидробионтов.

Известен способ, в котором микроводоросль Nanofrustulum shiloi культивируют на питательной среде BG11 (Stanier et al., 1971) с содержанием (г⋅л¹): NaNO₃ - 1,5; KHPO₄ - 0,04; Na₂EDTA - 0,001; Fe(NH₄)₃(C₆H₅O₇)₂ - 0,006, в плоскопараллельных культиваторах объемом 7 л с барботажной системой аэрации U-образного типа и L-образного типа со скоростью аэрации 4 л⋅мин^-1 при освещенности 50 мк⋅моль⋅фотон⋅м²⋅с^-1 и температуре 22±2°С в накопительном режиме культивирования (Demirel et al., 2020). При таких условиях культивирования зафиксирована максимальная плотность культуры 0,38 г⋅л^-1 при аэрации L-образного типа и 0,62 г⋅л^-1 при аэрации U-образного типа.

Известен способ культивирования Nanofrustulum shiloi на питательной среде BG11 (Stanier et al., 1971), приготовленной на основе искусственной морской воды в трубчатом фотобиоректорах объемом 2 л с аэрацией 5 л⋅мин^-1 при освещенности 300 мк⋅моль⋅фотон⋅м²⋅с^-1 и температуре 21±2°С в накопительном режиме культивирования. В конце данного эксперимента биомасса достигала своей максимальной плотности 0,6 г⋅л^-1 ( et al., 2023).

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является способ выращивания Nanofrustulum shiloi на питательной среде F/2 (Guillard, Ryther, 1963) с содержанием NaNO₃ - 7,5 мг⋅л^-1; NaH₂PO₄ × 2Н₂ О - 5 мг⋅л^-1; Na₂SiO₃×9H₂O - 30 мг⋅л^-1; Na₂EDTA - 4,36 мг⋅л^-1; FeSO₄ × 7H₂O - 3,15 мг⋅л^-1 в культиваторах объемом 15 л при освещенности 3 клк с фотопериодом 12:12 при температуре 20°С в накопительном режиме культивирования ( et al., 2021). В начале стационарной фазы роста культура достигала максимальной плотности 0,1 г⋅л^-1. Недостаток данного метода заключается в получении небольшого количества биомассы культуры Nanofrustulum shiloi из-за использования обедненной биогенными элементами питательной среды F/2.

Задачей изобретения является усовершенствование способа путем уточнения состава питательной среды для культивирования Nanofrustulum shiloi с целью увеличения скорости роста культуры.

Технический результат поставленной задачи заключается в увеличении выхода биомассы микроводоросли в результате оптимизации соотношений и концентраций биогенных элементов в питательной среде, приготовленной на основе стерильной морской воды.

Заявленный технический результат достигается тем, что в Способе получения биомассы диатомовой водоросли Nanofrustulum shiloi, предусматривающий культивирование в накопительном режиме, культуру диатомовой водоросли Nanofrustulum shiloi выращивают в течение 20 суток в плоскопараллельных культиваторах с рабочей толщиной слоя 2-5 см и при температуре 22±1°С, круглосуточном освещении 11,5 клк на оптимальной питательной среде, приготовленной на основе стерильной морской воды соленостью 17%о, имеющей состав, г⋅л^-1: Na₂SiO₃ × 9H₂O - 0,150; NaNO₃ - 0,3875; NaH₂PO4 × 2H₂O - 0,045; Na₂EDTA - 0,017; FeSO₄ × 7H₂O - 0,01; NaMoO₄ × H₂O - 1,2⋅10^-5; CuSO₄ × 5 H₂O - 2,8⋅10^-5; ZnSO₄ × 7 H₂O - 4,4⋅10^-5; CoCl₂ × 6 H₂O - 2⋅10^-5; MnCl₂ x 4 H₂O - 3,6⋅10^-5.

Общим для прототипа ( et al., 2021) и заявляемого способа является применение накопительного режима культивирования. Основное отличие от прототипа заключается в том, что в заявляемом способе при культивировании используется питательная среда, обогащенная макро- и микроэлементами, количественный состав которой авторами подобран в результате экспериментов, учитывая соотношение долей химических элементов в биомассе Nanofrustulum shiloi.

Способ поясняется описанием и иллюстрациями. Фиг. 1 - Динамика плотности накопительной культуры Nanofrustulum shiloi при различной концентрации биогенных элементов в питательной среде, выращенной в культиваторе с рабочей толщиной освещаемого слоя 5 см. Фиг. 2 - Динамика плотности накопительной культуры Nanofrustulum shiloi при различной концентрации биогенных элементов в питательной среде, выращенной в культиваторе с рабочей толщиной освещаемого слоя 2 см.

Оптимизация питательной среды заключается в увеличении концентрации всех биогенных элементов среды, учитывая истинные потребности культуры Nanofrustulum shiloi, соответственно представлениям о субстрат зависимом росте микроорганизмов в культуре (Тренкеншу, 2010 а, б). Показано, что использование обедненной стандартных питательных сред F/2 и BG11 для интенсивного культивирования Nanofrustulum shiloi с целью накопления биомассы нецелесообразно (Demirel et al., 2020; Grubisict et al., 2021). При увеличении концентрации биогенных элементов продуктивность культуры возрастает (см. Фиг. 1). Максимальное значение плотности культуры в стационарной фазе роста так же, как и продуктивность зависит от концентрации биогенных элементов в среде.

Рассчитав доли биогенных элементов в биомассе по результатам химического анализа Nanofrustulum shiloi, была составлена оптимальная питательная среда для интенсивного культивирования (Табл. 1).

Выращивание осуществляли при круглосуточном освещении 11,5 клк в накопительном режиме в культиваторах с рабочей толщиной освещаемого слоя 2 см и 5 см. При таких условиях культивирования выход биомассы микроводоросли Nanofrustulum shiloi составляет 3,2 г сухого вещества на 1 л культуры в культиваторе с рабочей толщиной освещаемого слоя 2 см, и 2,2 г сухого вещества на 1 л культуры в культиваторе с рабочей толщиной освещаемого слоя 5 см (см. Фиг. 1 и Фиг. 2).

Способ культивирования бетопланктонной диатомовой водоросли Nanofrustulum shiloi реализуется следующим образом.

Для культивирования используют диатомовую водоросль Nanofrustulum shiloi, коллекционное хранение которой осуществляют на питательной среде F/2 при температуре 22±1°С. Для получения инокулята культуру водоросли в течение 7-8 дней выращивают методом накопительной культуры на среде F, в которой концентрации всех биогенных элементов увеличены в пять раз (5F) при освещении 6 клк и при непрерывном барботаже воздухом (1 л⋅мин^-1⋅л^-1 культуры).

Для засева культиваторов используют активно делящуюся культуру, взятую на линейной стадии роста, когда ее продуктивность максимальна. Суспензию клеток вносят в культиваторы из такого расчета, чтобы начальная плотность культур составляла не менее 0,1-0,2 г сухого вещества на 1 л культуры. Процесс культивирования осуществляют на модифицированной питательной среде (Табл. 1).

Пример 1

Для культивирования использовали вид Nanofrustulum shiloi, обнаруженный в обрастании полимерных материалов в полузакрытой части Карантинной бухты крымского прибрежья Черного моря (44⁰36 56``N; 33°30 10``Е) (Blaginina, Ryabushko, 2021).

Для получения инокулята культуру в течение 10 суток выращивали методом накопительной культуры в колбах объемом 1 л при освещении 6 клк на питательной среде F, в которой концентрации всех биогенных элементов увеличены в пять раз (5F). Полученную культуру использовали в качестве инокулята.

Культуру переносили в культиваторы плоскопараллельного типа объемом Зле рабочей толщиной слоя 5 см, содержащие предлагаемую в изобретении питательную среду, оптимальную по соотношению биогенных элементов, приготовленную на основе стерильной морской воды с соленостью 17%: Na₂SiO₃ × 9H₂O - 0,150, NaNO₃ - 0,3875, NaH₂PO₄ × 2H₂O - 0,045, Na₂EDTA - 0,017, FeSO₄ × 7H₂O - 0,010, NaMoO₄ × H₂0 - 1,2⋅10^-5; CuSO₄ × 5 H₂O - 2,8⋅10^-5, ZnSO₄ × 7 H₂O - 4,4⋅10^-5, CoCl₂ × 6 H₂O - 2⋅10^-5, MnC_l2 × 4 H₂O - 3,6⋅10^-5, концентрация биогенных элементов в которой рассчитаны на 3 г⋅л^-1 сухой массы, и продолжали выращивать в течение 20 суток при освещении 11,5 клк и непрерывном барботаже воздухом со скоростью 1 л⋅мин^-1⋅л^-1 культуры, и при температуре 22±1°С до плотности 2,2 г сухой биомассы на 1 л культуры. Выход сухой биомассы в стационарной фазе роста составил 2,2 г на 1 л культуры.

Пример 2

Активно делящуюся культуру водоросли Nanofrustulum shiloi, взятую на линейной стадии роста, когда ее продуктивность максимальна, переносили в культиваторы плоскопараллельного типа объемом 2 л с рабочей толщиной слоя 2 см, содержащие модифицированную питательную среду на основе стерилизованной морской воды с соленостью 17%, состав которой соответствует составу питательной среды в Примере 1, и продолжали выращивать в течение 20 суток при освещении 11,5 клк и непрерывном барботаже воздухом со скоростью 1 л⋅мин^-1⋅л^-1 культуры, и при температуре 22±1°С. В стационарной фазе роста плотность культуры достигла 3,2 г⋅л^-1 сухой биомассы, что соответствовало ожидаемому значению максимальной плотности культуры, поскольку в эксперименте использовали предлагаемую питательную среду, рассчитанную на 3 г⋅л^-1.

Таким образом, предложенная питательная среда и условия культивирования диатомовой водоросли Nanofrustulum shiloi обеспечивают продуктивность по биомассе в 10 раз выше, чем в известном способе. Предложенный способ является эффективным и может быть положен в основу промышленного культивирования диатомовой водоросли Nanofrustulum shiloi.

Работа выполнена в рамках темы госзадания №121030300149-0 "Исследование механизмов управления продукционными процессами в биотехнологических комплексах с целью разработки научных основ получения биологически активных веществ и технических продуктов морского генезиса"

Источники информации:

1. Тренкеншу Р.П. Простейшие модели роста микроводорослей. 5. Скорость энергообмена // Экология моря. - 2010 а. - Спец. вып. 80: Биотехнология водорослей. - С. 79-84.

2. Тренкеншу Р.П. Простейшие модели роста микроводорослей. 6. Предельные скорости роста // Экология моря. - 2010 б. - Спец. вып. 80: Биотехнология водорослей. - С. 85-91.

3. Blaginina A., Ryabushko L. Finding of a rare species of diatom Nanofrustulum shiloi (Lee, Reimer et Mcenery) Round, Hallsteinsen & Paasche, 1999 in the periphyton of the coastal waters of the Black Sea // International Journal on Algae. - 2021. - Vol. 23, iss. 3. - P. 247-256. doi:10.1615/InterJAlgae.v23.i3.40.

4. Demirel Z., Imamoglu E., Dalay M.C. Growth kinetics of Nanofrustulum Shiloi under different mixing conditions in flat-plate photobioreactor // Brazilian Archives of Biology and Technology. - 2020. - Vol. 63, iss. 4. - P. 1-8.

http://dx.doi.org/10.1590/1678-4324-2020190201.

5. A., Karatas. A.B., Demir D., Demirel Z., M., Conk-Dalay M. Manipulation in culture conditions of Nanofrustulum shiloi for enhanced fucoxanthin production and isolation by preparative chromatography // Molecules. - 2023. - Vol. 28, iss. 4. - P. 1-17. https://doi.org/10.3390/molecules28041988.

6. M., В., Z., Z., Vrana I., В., R., M.I. Bioprospecting of microalgae isolated from the Adriatic Sea: characterization of biomass, pigment, lipid and fatty acid composition, and antioxidant and antimicrobial activity // Molecules. - 2022. - Vol. 27, iss. 4. - P. 1-27. https://doi.org/10.3390/molecules27041248.

7. Guillard R.R.L., Ryther J. Studies on marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana husted and Detonula confervacea (cleve) gran // Canadian Journal of Microbiology. - 1963. - Vol. 8, iss. 2. - P. 229-239. https://doi.org/10.1139/m62-029.

8. Stanier R.Y., Kunisawa R., Mandel M., Cohen-Bazire G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales) // Bacteriological Reviews. - 1971. - Vol. 35, iss. 2. - P. 171-205. doi: 10.1128/br.35.2.171-205.1971.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения биомассы диатомовой водоросли Nanofrustulum shiloi, предусматривающий культивирование в накопительном режиме в течение 20 сут в плоскопараллельных культиваторах с рабочей толщиной слоя 2-5 см при 22±1°С, круглосуточном освещении 11,5 клк на питательной среде, приготовленной на основе стерильной морской воды соленостью 17%о. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов культивирования Nanofrustulum shiloi с повышенным выходом биомассы. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

Способ получения биомассы диатомовой водоросли Nanofrustulum shiloi, предусматривающий культивирование в накопительном режиме в культиваторах, отличающийся тем, что культуру диатомовой водоросли Nanofrustulum shiloi выращивают в течение 20 сут в плоскопараллельных культиваторах с рабочей толщиной слоя 2-5 см и при температуре 22±1°С, круглосуточном освещении 11,5 клк на питательной среде, приготовленной на основе стерильной морской воды соленостью 17%о, имеющей состав, г⋅л^-1: Na₂SiO₃ × 9H₂O - 0,150; NaNO₃ - 0,3875; NaH₂PO4 × 2H₂O - 0,045; Na₂EDTA - 0,017; FeSO₄ × 7H₂O - 0,01; NaMoO₄ × H₂O - 1,2⋅10^-5; CuSO₄ × 5 H₂O - 2,8⋅10^-5; ZnSO₄ × 7 H₂O - 4,4⋅10^-5; CoCl₂ × 6 H₂O - 2⋅10^-5; MnCl₂ × 4 H₂O - 3,6⋅10^-5.