СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИКОЭРИТРИНА ИЗ КРАСНОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/12 

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для получения натурального пигмента фикоэритрина из микроводорослей в лабораторных и промышленных условиях.

В последнее время возрос интерес к использованию нетрадиционных источников сырья для получения натуральных красителей, так как многие синтетические красители токсичны. К таким перспективным пищевым красителям можно отнести и фикоэритрин, содержащийся в красных морских водорослях. Этот красный пигмент абсолютно нетоксичен, имеет белковую природу и ярко выраженную оранжевую флуоресценцию, что открывает широкие перспективы для его использования в пищевой, косметической и медицинской промышленности.

Морские красные водоросли, такие как филлофора, грацилярия, лауренция, гелидиум и др., возможно использовать для получения фикоэритрина., однако, в Чёрном море запасы их ограничены и неуклонно сокращаются. Выращивание в промышленной культуре ограничивается невысокими скоростями роста макрофитов. а также сезонностью в динамике биохимического состава и накопления биомассы.

Все известные способы выделения фикоэритрина из биомассы водорослей, как правило, включают в себя комбинацию различных методов очистки, таких как: осаждение сульфатом аммония, диализ, ионообменную хроматографию и на гидроксиапатите, электрофорез на сульфополиакриламидном геле и др. Данные методы позволяют получить препарат очень высокой чистоты (которая не требуется для целей пищевого использования фикоэритрина), но они малопроизводительны, требуют сложного специального дорогостоящего оборудования (промышленные колонки, насосы, детекторы, градиентные смесители), что в итоге приводит к значительному удорожанию продукта.

Известен Способ получения фикоэритрина с высокой оптической плотностью (см. Пат. №2315094, РФ, МПК C12N 1/12). В способе пигмент фикоэритрин получают экстрагированием из водорослей, выбранных из группы Galaxaura oblongata, Halymenia ceulanica, Helminthocladia australis. Водоросли выращивают до стадии образования колоний, затем собирают и фильтруют. Профильтрованные водоросли сушат, измельчают в порошок, добавляют в раствор с уровнем рН в пределах 5-10. После центрифугирования получают раствор пигмента, а затем, путем добавления 20-30% насыщенного раствора (NH₄)₂S0₄ неочищенный фикоэритрин. Для получения неочищенного фикоэритрина с высокой оптической плотностью добавляют 60-65% насыщенный раствор (NH₄)₂S0₄. Осажденный неочищенный фикоэритрин дополнительно очищают методом гель-хроматографии или ультрафильтрации. К недостаткам способа следует отнести трудоемкость и дороговизну.

В основу изобретения Способ получения фикоэритрина из красной микроводоросли поставлена задача путем максимального упрощения технологического процесса обеспечить снижение себестоимости готового продукта, получить водный экстракт препарата как пищевой краситель.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения фикоэритрина из микроводорослей красную микроводоросль Porphyridium purpurewn культивируют в условиях естественного или искусственного освещения, барботирования газовоздушной смесью с 3% СО₂, с применением питательной среды по Тренкеншу и квазинепрерывного режима культивирования. Отбор биомассы осуществляют при ежедневном обмене. Для разрушения биомембран 6-5-9 раз проводят процедуру «замораживание-оттаивание». Затем экстрагируют водным буферным раствором с рН 7-7,5 в соотношении 1:3 в течение 24 часов при 3-5°С в отсутствии света. К полученному водному раствору пигмента добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 20% для последующего хранения.

Предполагаемое изобретение поясняется иллюстрациями. На фиг.1 - Спектр поглощения В-фикоэритрина, выделенного из красной микроводоросли Porphyridium purpureum.

Красная микроводоросль Porphyridium purpureum вызывает большой интерес у исследователей как источник разнообразных биологически ценных веществ. Биомасса Porphyridium purpureum, выращенная в интенсивных условиях, является источником широкого спектра биологически активных веществ, таких как: фотосинтетические пигменты (хлорофилл-a, каротиноиды, В-фикоэритрин), внеклеточные сульфополисахариды и ненасыщенные жирные кислоты, в том числе арахидоновая и эйкозапентаеновая кислоты. Фикоэритрин - белоксодержащий комплекс, входящий в состав фотосинтезирующих пигментных комплексов красных водорослей. Из красной одноклеточной водоросли Porphyridium purpureum выделены два ФЭ: В-ФЭ и b-ФЭ, последний отличается от предыдущего меньшей долей коротковолнового поглощения. Количество фикоэритрина в водоросли Porphyridium purpureum может достигать 50% от общей суммы ФБП. Соотношение ФБП в Porphyridium purpureum (В-ФЭ - 84%, R-ФЦ - 11%, АФЦ - 25%). Изобретение реализуется следующим образом:

1. Интенсивное культивирование микроводоросли Porphyridium purpureum в условиях роста, оптимальных для накопления фикоэритрина

Культивирование микроводоросли может проводиться в квазинепрерывном и накопительном режимах, однако, в условиях, исключающих лимитирование по азоту и углероду. В случае накопительного культивирования отбор биомассы осуществляется на линейной стадии роста, а при квазинепрерывном - ежедневно при осуществлении обмена среды. В таком случае количество внеклеточных полисахаридов, препятствующих разрушению клеточных стенок, минимально. Наиболее благоприятные условия для накопления фикоэритрина при лабораторном культивировании: температура - 26°С, освещенность - 40 Вт/м² -сек, барботаж газовоздушной смесью с 3% СО₂, питательная среда Тренкеншу, при промышленном: температура - 18-28°С, освещенность - естественная, барботаж газо-воздушной смесью с 3% СО₂, питательная среда по Тренкеншу.

2. Отделение биомассы водоросли от культуральной среды

Отделение биомассы микроводоросли от культуральной среды осуществляется несколькими способами: сепарированием, центрифугированием или с использованием естественных гравитационных сил (отстаивание культуры микроводоросли в течение 2-х часов). Первые два метода достаточно энергоёмки, но дают возможность эффективно отделить биомассу от культуральной среды. Учитывая, что клетки микроводоросли Porphyridium purpureum объединены в конгломераты и легко осаждаются при отстаивании, возможно использовать третий способ для снижения себестоимости конечного продукта.

3. Промывание биомассы Porphyridium purpureum

Для удаления солей биомасса заливается водой в количестве эквивалентном объему слитой культуральной жидкости. Для удаления жидкости используются методы, описанные в п. 2.

4. Разрушение клеточных стенок Porphyridium purpureum

Полнота экстракции В-фикоэритрина водным буфером зависит от степени деструкции клеточных оболочек. На сегодняшний день существует большое количество методов разрушения клеточных оболочек. Одним из наиболее простых является чередование циклов замораживания-оттаивания. Однако, однократного цикла не достаточно для полного разрушения клеточных оболочек красной микроводоросли Porphyridium purpureum. При этом длительность нахождения в замороженном состоянии и объем растворителя не являются определяющими. С другой стороны, большое количество заморозок является нецелесообразным с точки зрения трудо- и энергозатрат. При отборе биомассы на линейной стадии роста (или квазинепрерывная культура) достаточно шести циклов для разрушения основного количества биомембран и последующего извлечения большей части фикоэритрина. Девяти циклов достаточно для разрушения всех биомембран и для количественного определения фикоэритрина.

5. Экстрагирование пигментов из биомассы клеток

Экстракция проводится водным буферным раствором с рН 7-7,5 (в соотношении 1:3) в течение 24 часов на холоде в темноте; данные условия способствуют стабилизации химической структуры фикоэритрина. 6. Отделение экстракта от балластных веществ. Отделение экстракта пигмента от примесей проводится при помощи' центрифугирования (1600g, 5 мин.).

7. Контроль качества полученного продукта Качественный и количественный анализ раствора В-фикоэритрина проводится с помощью спектрофотометрического метода, измеряя спектр поглощения раствора в диапазоне длин волн 400-800 нм.

Концентрацию пигмента в водном экстракте определяется согласно уравнению, используя значения оптической плотности при длинах волн: 650, 615, 545 нм:

В-РЕ=0.023D₆₅₀ - 0.063D₆₁₅+0.100D₄₅

Чистота пигмента определяется отсутствием в растворе примесей других пигментов или других белков. Для вычислений используются значения оптической плотности при длинах волн: 620, 545, 495, 280 нм.

Отношение D₅₄₅/D₂₈₀ показывает чистоту препарата относительно большинства форм загрязняющих белков. Величина поглощения на длине волны 280 нм в экстракте фикоэритрина, главным образом, обусловлена ароматическими аминокислотами и она примерно пропорциональна общей концентрации белков в растворе, включая В-фикоэритрин. Величина поглощения на 545 нм отражает только концентрацию В-фикоэритрина.

Отношение D₆₂₀/D₅₄₅ примерно показывает уровень загрязнения. R-фикоцианином, не смотря на то, что В-фикоэритрин имеет незначительное поглощение на 620 нм.

8. Хранение раствора пигмента.

К полученному водному раствору пигмента добавляется этиловый спирт до конечной концентрации 20% для последующего хранения (в темноте при t=3-5°С). Пример

Культивирование микроводоросли Porphyridium purpureum проводили в 5 л плоскопараллельных стеклянных культиваторах в квазинепрерывном режиме. При условиях: питательная среда Тренкеншу, температура - 26°С, круглосуточное освещение с освещенностью - 40 Вт/м²-с, круглосуточный барботаж газовоздушной смесью с 3% СО₂. Отделение биомассы микроводоросли от культуральной среды осуществляли с помощью центрифуги ОС-6М при 2500 об/мин и факторе разделения 1600g. Полученный осадок ресуспендировали в воде и повторно центрифугировали при тех же условиях. Для разрушения клеточных стенок Porphyridium purpureum к 100 г сырой биомассы, помещенной в стеклянный кристаллизатор, добавили 100 мл дистиллированной воды и поместили в бытовую морозильную камеру с температурой -18°С. После полного замерзания увлажненной биомассы вынимали кристаллизатор из морозильной камеры и проводили оттаивание при комнатной температуре. Таких циклов было проведено шесть.

Экстракцию фикоэритрина проводили 460 мл водного буферного раствора с рН 7,5 в течение 24 часов на холоде в темноте. Водный экстракт пигмента очищали от балластных веществ с помощью центрифуги ОС-6М при 2500 об/мин и факторе разделения 1600g в течение 5 минут.

К полученному водному экстракту фикоэритрина добавляли этиловый спирт до. конечной концентрации 20%. Таким образом, получили водно-спиртвого раствор фикоэритрина с конечной концентрацией пигмента 0,4 мг/мл, и консерванта (этанола) 20% (срок хранения на холоде в темноте - 1-1.5 месяца).

Состав водно-спиртового раствора экстракта фикоэритрина из красной микроводоросли Porphyridium purpureum

Вода дистиллированная 560 мл Спирт этиловый 140 мл Фикоэритрин 0,4 мг/мл Общий объем 700 мл

Конечный продукт - раствор пигмента розового цвета с оранжевой флюоресценцией.

Основное преимущество заявляемого Способа получения фикоэритрина из красной микроводоросли заключается в простоте и надёжности. Способ не требует дорогостоящего оборудования, значительных затрат материальных и временных ресурсов и при этом позволяет получать препарат, содержащий фикоэритрин, пригодный для пищевых целей.

Способ получения фикоэритрина из красной микроводоросли относится к биотехнологии и предназначен для получения натурального пигмента из микроводоросли в лабораторных и промышленных условиях. Практическое значение изобретения связано с возрастающими потребностями медицинской, пищевой й косметической отраслей в натуральных нетоксичных красителях и биомаркерах

В способе, включающем в себя отделение биомассы микроводоросли от культуральной среды, промывание биомассы, разрушение клеточных стенок, водную экстракцию пигмента, консервацию конечного продукта, отбор биомассы проводят на линейной стадии роста или в режиме квазинепрерывной культуры. Способ включает отделение биомассы от культуральной среды, промывание биомассы, разрушение клеточных биомембран, водную экстракцию. Изобретение позволяет упростить и снизить себестоимость готового продукта и получить препарат, пригодный для использования в пищевой и косметической промышленности.

Способ получения фикоэритрина из красной микроводоросли, включающий культивирование водорослей, отбор и промывку биомассы, разрушение биомембран, экстрагирование пигмента, отличающийся тем, что для получения β-фикоэритрина красную микроводоросль Porphyridium purpureum культивируют в условиях естественного или искусственного освещения при барботировании газовоздушной смесью с 3% СО₂ с применением питательной среды Тренкеншу и квазинепрерывного режима культивирования; отбор биомассы осуществляют при ежедневном обмене, а для разрушения биомембран 6-9 раз проводят процедуру «замораживание-оттаивание», после чего пигмент экстрагируют водным буферным раствором с рН 7-7,5 в соотношении 1:3 в течение 24 ч при 3-5°С в отсутствии света, с последующим центрифугированием и добавлением этилового спирта до конечной концентрации 20%.