Приспособление для определения токсичности водных сред на основе измерения двигательных реакций инфузории Paramecium Caudatum Российский патент 2024 года по МПК G01N33/18 B01L3/00 C12M1/14 C12M1/34 

Изобретение относится к области охраны окружающей среды и может быть использовано для оперативного контроля токсичности вод и водных вытяжек в аналитических и экологических лабораториях с помощью исследования двигательных реакция инфузории Paramecium Caudatum.

Известен прибор “Концентратомер Биотестер-2М”, внесенный в Госреестр измерительных средств РФ под номером 29189-05 и удостоверенный сертификатом RU.C.31001.A. №2057, представляет собой специализированный импульсный фотометр, разработанный для оперативного контроля токсичности водных сред. Прибор оснащен двумя оптическими кюветами и держателем для них, а также интерфейсным комплектом, обеспечивающим связь с компьютером IBM-PC.

Принцип работы прибора основан на специфической реакции инфузории-туфельки (хемотаксисе) в ответ на присутствие опасных химических веществ в исследуемой среде. Для проведения анализа в нижней части двух вертикальных оптических кювет устанавливается взвесь инфузорий. Верхнюю часть одной из кювет заполняет испытуемая проба, а другой - контрольная проба. Процесс определения токсичности начинается, и все инфузории стремятся переместиться из взвеси в чистую среду испытуемой и контрольной проб. Этот процесс занимает приблизительно 15-20 минут.

Относительное уменьшение количества инфузорий, вышедших в верхнюю часть кюветы с испытуемой пробой, по сравнению с контрольной пробой, служит основой для расчета индекса токсичности и позволяет оценить степень токсичности водной среды.

Недостатком устройства является подготовка к процессу измерения, а именно, наслаивание на взвеси инфузорий контрольной и исследуемой проб, что приводит к перемешиванию в обоих кюветах слоев, стиранию граней между ними, неопределенности сведений о переместившихся инфузориях и, соответственно, к снижению точности оценки токсичности исследуемой среды.

Известен комплекс оборудования “БиоЛат-3.2”, используемый для автоматического тестирования и включающий систему визуализации, и программное обеспечение для анализа данных. Этот комплекс предназначен для биологической оценки влияния различных продуктов, включая корма, пищевые продукты, добавки, сырье для сельского хозяйства, фармацевтические препараты и БАДы, на организмы Parametium Сaudatum и Tetrahimena pyriforis.

Прибор “БиоЛат-3.2” работает путем подсчета подвижных инфузорий с использованием телевизионного метода, который основан на сравнении изображений тестовых образцов в разные моменты времени. В отличие от рассмотренного выше устройства прибор применяет иной подход в биотестировании. Двигательная активность клеток отслеживается только с целью установления выживших клеток. Биотестирование с применением такого подхода требует значительно больших временных затрат (от 2-х часов), чем при использовании в качестве тест-реакции хемотаксиса (от 15 минут). Помимо прочего, у прибора есть несколько недостатков: большие размеры, высокая стоимость оборудования.

Наиболее близким аналогом предлагаемого устройства является «Приспособление для оценки токсичности воды и водных вытяжек различных сред» № RU 176876 МПК G01N33/18, предназначенное для исследования токсичности воды путем изучения реакции хемотаксиса, представляющее собой две склеенные между собой пластины, в верхней пластине сформированы три ячейки, причем средняя из них соединена с соседними перемычками. В центральную ячейку помещается раствор с инфузориями, а в одну боковую - исследуемая среда, а в другую контрольная среда. Заключение о токсичности дается по отношению количества клеток, переместившихся в исследуемую и контрольную пробы.

Недостатками данного приспособления являются отсутствие стабильной границы раздела между раствором с микроорганизмами - маточной культуры, исследуемой и контрольной средами, что затрудняет точную оценку степени разбавления исследуемой пробы раствором маточной культуры Причиной этого явления является перемешивание взвеси инфузорий контрольной и исследуемой проб, что приводит к перемешиванию в обеих кюветах слоев, стиранию граней между ними, неопределенности сведений о переместившихся инфузориях и соответственно к снижению точности оценки токсичности исследуемой среды.

Задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является создание устройства, снижающего процесс перемешивания двух сред, находящихся в разных объемах устройства.

Поставленная задача решается за счет того, что предлагаемое устройство, так же, как и известное приспособление для определения токсичности водных сред на основе измерения двигательных реакций инфузории Paramecium Caudatum, выполнено на основе склеенных пластин Но, в отличие от известного устройства, оно содержит три склеенные оптически прозрачные пластины, в средней из которых выполнены два выреза, образующих вместе с двумя внешними пластинами две равные по объему полости, в средней из которых выполнены вырезы, образующие вместе с двумя внешними пластинами две равные по объему полости, соединенные отверстием, размер которого находится в пределах от 1,7 мм до 2,2 мм, причем одна из полостей снабжена каналом для поступления исследуемой среды и каналом для соединения с внешней средой, а вторая полость снабжена каналом для поступления раствора инфузорий

Техническим результатом является повышение достоверности оценки токсичности водной среды за счет более точного подсчета количества переместившихся инфузорий Paramecium Caudatum при стабильном градиенте химического раздражителя.

Наличие отдельных полостей для раствора с микроорганизмами и исследуемым (контрольным) раствором, при условии выполнения размера соединительного отверстия, обеспечивающего предотвращение перемешивания растворов и не препятствующего свободному перемещению тест-организмов и гарантирующего формирование стабильного градиента химического раздражителя во время проведения эксперимента, позволяет давать однозначное заключение о хемотаксической реакции инфузорий Paramecium Caudatum. Использование прозрачного материала позволяет отслеживать параметры движения каждой клетки, отделять подвижные объекты от взвешенных и осаждающихся частиц.

На фиг. 1 изображен общий вид приспособления для определения токсичности водных сред на основе измерения двигательных реакций инфузорий Paramecium Caudatum. На фиг. 2 приведен пример схемы выполнения полостей, заполняемых взвесью тест-организмов и исследуемым (контрольным) раствором.

Устройство состоит из двух внешних пластин 1, 2 (фиг. 1) и средней пластины 3. Пластины выполнены из оптически прозрачного материала. В средней пластине 3 выполнены вырезы (фиг. 2), которые вместе с внешними пластинами 1 и 2 образуют полости одинакового объема 4, 5 с внутренним соединительным отверстием 6. Каждая полость сообщается с внешней средой. По каналу 7 поступает исследуемый (контрольный) раствор, по каналу 8 вносится раствор с микроорганизмами, канал 9 служит для поступления воздуха. Размер соединительного отверстия выполнен с учетом размера поперечного сечения инфузории Paramecium Caudatum.

Для обеспечения свободного перемещения клеток необходимо соединительное отверстие выбрать максимально возможного размера, при сохранении стабильного градиента химического раздражителя. Была проведена серия опытов, с разным размером соединительного отверстия.

Для того чтобы тест-объект мог свободно перемещаться необходимо обеспечить безопасную среду. Для того ячейка 4 заполнялась раствором Лозины-Лозинского, такой растров является безопасной средой для жизнедеятельности инфузории Paramecium Caudatum и используется для размножения и поддержания культуры.

При размере соединительного отверстия меньше 2-х продольных размеров микроорганизма (≤0,7 мм) формируется граница раздела жидких сред и обеспечивается стабильный градиент химического раздражителя, при этом наблюдаются препятствия для свободного перемещения клеток. При размере канала больше 8-и (3 мм) продольных размеров клетки невозможно получить стабильный градиент химического раздражителя, вследствие механического перемешивания жидкостей. Наиболее оптимальным оказался размер кратный 6-и (от 1,7 до 2,2 мм) продольным размерам микроорганизма. При таком размере формируется стабильная граница раздела жидких сред и клетки не испытывают сложностей в перемещении во всем объеме кюветы. В таком исполнении наблюдался наиболее высокий выход инфузорий из ячейки 5 в ячейку 4.

Для подтверждения гипотезы о протекании хемотаксической реакции в устройстве был проведен эксперимент с использованием модельного токсиканта с последующим сравнением результатов с безопасным раствором в качестве контрольного. Согласно методике, ФР.1.39.2015.19242 был приготовлен раствор 5-водной сернокислой меди в дистиллированной воде.

Процесс определения токсичности водных сред сводится к измерению двигательных реакций инфузории Paramecium Caudatum. Ячейку 5 по подводящему каналу 7 заполняют раствором с микроорганизмами с рабочей концентрацией 1000±500 шт./мл до внутреннего соединительного канала. Затем ячейка 4 заполняется исследуемым (контрольным) раствором по внешнему подводящему каналу 7. Внесение пробы является верным, если в соединительном канале образуется видимая граница раздела жидких сред.

Через 15-20 минут было определено: общее количество клеток, количество клеток, переместившихся в исследуемый раствор. При заполнении ячейки 4 раствором модельного токсиканта, наблюдалось значительное снижение выхода клеток из ячейки 5, в сравнении с количеством инфузорий, вышедших при заполнении ячейки 4 безопасным раствором.

Приспособление для определения токсичности водных сред на основе измерения двигательных реакций инфузории Paramecium Caudatum относится к области охраны окружающей среды и может быть использовано для оперативного контроля токсичности вод и водных вытяжек в аналитических и экологических лабораториях с помощью исследования двигательных реакций инфузории Paramecium Caudatum. Устройство состоит из двух внешних пластин и средней склеенных между собой пластин. Пластины выполнены из оптически прозрачного материала. В средней пластине выполнены вырезы, которые вместе с внешними пластинами образуют полости одинакового объема, с внутренним соединительным каналом. Каждая полость сообщается с внешней средой отдельным каналом. По каналу 7 поступает исследуемый (контрольный) раствор, по каналу 8 вносится раствор с микроорганизмами, канал 9 служит для поступления воздуха. Размер соединительного отверстия выполнен с учетом размера поперечного сечения инфузории Paramecium Caudatum. Техническим результатом является повышение достоверности оценки токсичности водной среды за счет более точного измерение параметров движения инфузорий Paramecium Caudatum. 2 ил.

Приспособление для определения токсичности водных сред на основе измерения двигательных реакций инфузории Paramecium Caudatum, выполненное на основе склеенных пластин, отличающееся тем, что устройство содержит три склеенные оптически прозрачные пластины, в средней из которых выполнены вырезы, образующие вместе с двумя внешними пластинами две равные по объему полости, соединенные отверстием, размер которого находится в пределах от 1,7 до 2,2 мм, причем одна из полостей снабжена каналом для поступления исследуемой среды и каналом для соединения с внешней средой, а вторая полость снабжена каналом для поступления раствора инфузорий.