СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ КОРМОВ И ПОЛНОСМЕШАННОГО РАЦИОНА ДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2023 года по МПК A23K10/00 A23K20/00 A23K50/00 G01N33/00 G01N33/02 

Изобретение относится к области сельского хозяйства и используется в кормовой промышленности при оценке токсичности основных грубых кормов и полносмешанного рациона.

Из уровня техники известен способ оценки токсичности кормов по выживаемости Paramecium caudatum (И.А. Шадрин, Вестник КрасГАУ, 2008, № 2), основанный на извлечении из исследуемых продуктов различных фракций токсических веществ ацетоном и последующем воздействии водных растворов этих фракций на инфузории, после чего определяют степень токсичности по выживаемости инфузорий, при этом инфузории предварительно культивируются в чашках Петри, при комнатной температуре 18-28°С и естественном освещении, в подготовленной водопроводной воде, а в качестве корма для них используются пекарские дрожжи.

Также, известен метод оценки токсичности зерна фуражного, продуктов его переработки и комбикорма (ГОСТ 13496.7-92 «Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма, методы определения токсичности»), путем проведения биопробы на инфузориях стилонихиях, основанный на извлечении исследуемых продуктов различных фракций токсических веществ ацетоном и последующем воздействии водных растворов этих фракций на инфузории стилонихии, для чего подготавливают емкости (луночные микроаквариумы и чашки Петри), приобретенную культуру инфозорий культивируют в водопроводной воде, используя в качестве корма для них сухие пекарские дрожжи, при комнатной температуре 18-28°С и естественном освещении, затем готовят пробу для испытаний, водный раствор ацетонового экстракта исследуемого продукта, после чего равномерно размещают инфузории в микроаквариумы и вносят в каждый микроаквариум по две капли пробы, а далее через 5 минут и повторно через 1 час подсчитывают численность живых инфузорий, и по их количеству определяют степень токсичности исследуемого продукта.

Кроме того, известен способ комплексной оценки токсичности кормовых и пищевых продуктов (RU 2266015 С2, 20.08.2003), с использованием инфузорий Paramecium caudatum, включающий следующие операции: приготовление одновременно водного раствора ацетонового экстракта исследуемого продукта и водного раствора того же продукта, в которые помещают инфузории Paramecium caudatum, культивируемые на зернах длиннозерного риса, промытых водопроводной, затем дистиллированной водой, подсушенных на фильтровальной бумаге, а затем в сушильном шкафу при температуре 50-60°С в течение 1 часа, стерилизованных при температуре 100°С в течение 45 минут, после чего проводят оценку токсичности продукта, при тестировании водного раствора ацетонового экстракта, по проценту выживших инфузорий, а токсичность водного раствора продукта определяют по времени, за которое происходит гибель инфузорий.

Недостатками известных технических решений является низкая достоверность получаемых результатов при тестировании основных грубых кормов и полносмешанного рациона, связанная тем, что в условиях биотестирования гибель инфузорий, в большей мере, происходит по причине погружения их в среду с повышенной кислотностью.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в снижении количества случаев интоксикации, возникающих на животноводческих предприятиях, повышении точности и достоверности результатов оценки токсичности кормов для животных, повышение качества профилактики токсикозов животных.

Указанный технический результат обеспечивается в способе экспресс-оценки токсичности основных грубых кормов и полносмешанного рациона для сельскохозяйственных животных, который заключается в том, что проводят усреднение пробы корма, отбирают из нее навеску массой 1-50 г, и помещают её в колбу объемом 100-1000 мл, с последующим добавлением к ней 1-50 мл ацетона, и интенсивным перемешиванием полученного образца в колбе от 1 до 20 минут до получения экстракта, который затем фильтруют либо центрифугируют, отделяя надосадочную жидкость, и далее нейтрализуют её, путём добавления NaHCO3, доводя, получаемый таким образом раствор, до уровня рН 4,5-8, после чего вносят его в количестве 50-5000 мкл в отдельную емкость, содержащую питательную среду в количестве от 1 до 100 мл, а затем добавляют полученную смесь в количестве 50-500 мкл в лунку аквариума, с предварительно размещенными в ней инфузориями, в количестве от 10 до 20 шт., после чего, через 1 час проводят подсчет количества активных инфузорий, для определения % их выживаемости и соответственно определения токсичности образца корма, при котором более 70 % выживаемости – образец нетоксичный; от 40 до 69% выживаемости – слаботоксичный; менее 40 % выживаемости – токсичный.

При этом, анализ каждого образца корма проводится в двух параллельных лунках аквариума.

При этом, инфузории отбираются из видов стилонихии, Paramecium caudatum, Tetrahymena pyriformis, колподы.

Качество кормов является одним из важнейших условий повышения продуктивности сельскохозяйственных животных. Понятие качества кормов включает в себя совокупность показателей исходного химического состава корма (содержание протеина, углеводов, клетчатки, жира, макро- и микроэлементов, влажность) и изменение содержания компонентов корма и его свойств в зависимости от сроков хранения. Сохранение свойств кормов и комбикормов во времени имеет большое значение, поскольку в процессе хранения происходит ухудшение качества кормов по химическим и биологическим показателям. К химическим показателям относятся перекисное и кислотное числа, к биологическим ― зараженность патогенными бактериями и грибами. Комплекс этих показателей образует характеристику кормов - общую токсичность, которая определяется как способность вещества или продукта в средних дозировках вызывать негативную реакцию у животных. Под воздействием недоброкачественных кормов происходят серьезные нарушения в организме животных, обмене веществ, расстраиваются функции центральной нервной системы, эндокринных желез, органов пищеварения, а при попадании с кормом ядовитых растений, грибов или химических веществ (пестициды, дезинфекционные средства, минеральные удобрения) могут возникать отравления. Основной мерой по профилактике токсикозов животных является контроль качества кормов, основанный на определении их общей токсичности. 

Заявленный в качестве изобретения способ экспресс-оценки токсичности основных грубых кормов и полносмешанного рациона для сельскохозяйственных животных (далее – способ экспресс-оценки), основан на методике биотестирования, и заключается в определении токсичности образца, после добавления инфузорий к подготовленному определенным образом образцу корма, и дальнейшей оценке токсичности этого образца, в зависимости от количества выживших инфузорий.

Существующие на настоящий момент способы оценки токсичности кормов основаны на добавлении к навеске корма растворителя в чистом виде, либо его водного раствора, при этом, получаемый в результате экстракт обладает повышенной кислотностью, и дополнительно усиливается изначальным обязательным наличием в этих кормах и рационе консервантов, обеспечивающих их длительное хранение, вследствие чего, в дальнейшем, воздействуя на инфузории приводит к их гибели, основной причиной которой является увеличенная кислотность среды, а не повышенная токсичность образца корма, что искажает фактические результаты существующих методик, и приводит к неверной оценке токсичности образца корма.

В заявленном изобретении вышеуказанный недостаток устраняется путём нейтрализации кислоты, что позволяет получать по итогам способа экспресс-оценки оценочные данные с высокой достоверностью результатов.

Для оценки токсичности в способе экспресс-оценки используются следующие виды инфузорий: стилонихии, Paramecium caudatum (парамеции каудатум), Tetrahymena pyriformis (тетрахимена пириформис) и колподы.

Последовательность этапов способа экспресс-оценки заключается в следующем:

1. Производят отбор пробы корма и её измельчение:

- усредняют пробу образца методом квартования, который заключается в следующем: пробу раскладывают по форме квадрата и делят диагоналями на четыре треугольника, затем две противоположные части отбрасывают, а оставшиеся две соединяют, после чего ещё раз измельчают и снова проводят квартование, то есть делят на четыре части и две противоположные отбрасывают;

- после чего, полученную таким образом среднюю пробу измельчают, просеивают через соответствующее сито без остатка и помещают в банку с притертой пробкой.

2. Производят отбор усредненной навески массой 1-50 г и помещают её в колбу объемом 100-1000 мл.

3. В колбу, к навеске, вносят 1-50 мл ацетона.

4. Содержимое колбы перемешивают в течение 1-20 минут, до получения экстракта.

5. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр либо центрифугируют, после чего отделяют надосадочную жидкость.

6. С помощью pH-метра замеряют первоначальный уровень pH надосадочной жидкости, и затем постепенно добавляют реагент NaHC03, таким образом нейтрализуя кислоты, содержащиеся в пробе, при этом проводя периодические измерения для контроля полученного уровня pH. Добавление реагента NaHC03 проводят до достижения раствором уровня pH в пределах 4,5-8.

7. В отдельную ёмкость вносят питательную среду (NaCL — 0,03 %, KCL — 0,001 %, СаСl2-водный — 0,005%, NaHC03 — 0,002 %, глюкоза – 0,2%) в количестве 1-100 мл.

8. В ёмкость с питательной средой добавляют 50-5000 мкл раствора, полученного в результате нейтрализации надосадочной жидкости.

9. Из чашки Петри в лунки аквариума помещают инфузории в количестве от 10 до 20 шт. Анализ каждого образца проводят в двух параллельных лунках.

10. В каждую лунку аквариума с инфузориями вносят 50 - 500 мкл смеси, состоящей из питательной среды и раствора.

11. Через 1 час определяют количество активных инфузорий, подсчёт количества выживших инфузорий проводят визуально с помощью микроскопа для дальнейшего определения процента их выживаемости.

12. Выживаемость инфузорий вычисляют по формуле:

где N2 - среднеарифметическое (по двум испытаниям) значение количества инфузорий в конце опыта, через 1 час экспозиции, шт.;

N1- среднеарифметическое (по двум испытаниям) значение количества инфузорий в начале опыта, шт.

При этом, оценка токсичности образца корма проводится согласно следующих критериев выживаемости инфузорий:

- более 70 % выживаемости – нетоксичный;

- от 40 до 69% выживаемости – слаботоксичный;

- менее 40% выживаемости – токсичный.

Пример реализации заявленного изобретения.

В качестве образца исследуемого корма выбран кукурузный силос.

Исследование каждой пробы корма проводят дважды. Пересадку и подсчет инфузорий выполнют под микроскопом при увеличении 2x14.

Проводят подготовку исследуемого образца корма в следующем порядке: образец кукурузного силоса массой 1000 г усредняют методом квартования, среднюю пробу просеивают через сито, после чего производят отбор усредненной навески массой 10 г.

Выполнят приготовление экстракта в следующем порядке: усредненную навеску массой 10 г, вносят в колбу вместимостью 250 см³ и заливают 50 мл ацетона, после чего содержимое колбы встряхивают на лабораторном шейкере ПЭ-6500 в течение 20 минут, и либо фильтруют полученную в результате встряхивания смесь через бумажный фильтр, либо центрифугируют на аппарате TAGLER CM -12-06, с частотой вращения 1000 оборотов/мин в течение 5 минут, после чего отделяют надосадочную жидкость, которую доводят до значения рН=5,5, путем добавления к ней щелочного реагента NaHCO3.

В отдельную емкость, содержащую питательную среду объёмом 20 мл, вносят 100 мкл раствора, полученного после нейтрализации надосадочной жидкости. Автоматической пипеткой с заменяемым наконечником помещают в два параллельных микроаквариума по 10 инфузорий. Затем, в аквариумы к инфузориям, автоматической пипеткой с чистым наконечником, вносят по 50 мкл смеси, состоящей из раствора и питательной среды, подготовленной для биотестирования заранее.

По истечении 1 часа, анализ численности инфузорий показал, что количество живых инфузорий в лунках параллельных микроаквариумов составляет 8 и 9 штук соответственно.

Выживаемость инфузорий вычисляют по формуле, в %

.

По итогам проведенного анализа выживаемость инфузорий составила 85%, и, следовательно, согласно применяемых критериев выживаемости, образец корма - кукурузного силоса является нетоксичным.

Таким образом, заявленный в качестве изобретения способ экспресс-оценки позволяет обеспечить снижение количества случаев интоксикации, возникающих на животноводческих предприятиях, с высокой точностью и достоверностью провести оценку токсичности кормов для животных, а также повысить качество профилактики токсикозов у сельскохозяйственных животных.

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Предложен способ экспресс-оценки токсичности основных грубых кормов и полносмешанного рациона для сельскохозяйственных животных, согласно которому проводят усреднение пробы корма, отбирают из нее навеску и смешивают с ацетоном, затем интенсивно перемешивают до получения экстракта. Экстракт фильтруют либо центрифугируют, отделяя надосадочную жидкость, нейтрализуют ее и смешивают с питательной средой. Полученную смесь вносят в лунку аквариума с предварительно размещенными в ней инфузориями в количестве от 10 до 20 шт. Через час проводят подсчет количества активных инфузорий для определения % их выживаемости и соответственно определения токсичности образца корма, при котором более 70% выживаемости – образец нетоксичный; от 40 до 69% выживаемости - слаботоксичный; менее 40% выживаемости - токсичный. Изобретение направлено на повышение эффективности оценки токсичности кормов. 2 з.п. ф-лы, 1 пр.

1. Способ экспресс-оценки токсичности основных грубых кормов и полносмешанного рациона для сельскохозяйственных животных, заключающийся в том, что проводят усреднение пробы корма, отбирают из нее навеску массой 1-50 г и помещают её в колбу объемом 100-1000 мл с последующим добавлением к ней 1-50 мл ацетона и интенсивным перемешиванием полученного образца в колбе от 1 до 20 минут до получения экстракта, который затем фильтруют либо центрифугируют, отделяя надосадочную жидкость, и далее нейтрализуют её путём добавления NaHCO₃, доводя получаемый таким образом раствор до уровня рН 4,5-8, после чего вносят его в количестве 50-5000 мкл в отдельную емкость, содержащую питательную среду в количестве от 1 до 100 мл, а затем добавляют полученную смесь в количестве 50-500 мкл в лунку аквариума с предварительно размещенными в ней инфузориями в количестве от 10 до 20 шт., после чего через 1 час проводят подсчет количества активных инфузорий для определения % их выживаемости и соответственно определения токсичности образца корма, при котором более 70 % выживаемости – образец нетоксичный; от 40 до 69% выживаемости – слаботоксичный; менее 40 % выживаемости – токсичный.

2. Способ экспресс-оценки токсичности по п. 1, отличающийся тем, что анализ каждого образца корма проводится в двух параллельных лунках аквариума.

3. Способ экспресс-оценки токсичности по п. 2, отличающийся тем, что инфузории отбираются из видов стилонихии, Paramecium caudatum, Tetrahymena pyriformis, колподы.