СПОСОБ КОМПЛЕКСНОЙ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ КОРМОВЫХ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ Российский патент 2005 года по МПК A23K1/00 G01N33/02 

Изобретение относится к области оценки качества кормовых и пищевых продуктов и может быть использовано при определении токсичности, например, комбикормов для сельскохозяйственных животных, птицы, рыбы и т.д., являющихся основой белкового питания человека. Сущность предложенного способа оценки токсичности заключается в следующем: одновременно готовят водный раствор ацетонового экстракта и водный раствор исследуемого продукта, затем инкубируют инфузории Paramecium caudatum в том и другом растворах. Оценку токсичности производят в водном растворе ацетонового экстракта продукта по проценту выживаемости инфузорий за определенный период времени, а оценку токсичности водного экстракта того же продукта определяют по времени полной гибели инфузорий Paramecium caudatum. В качестве питания для выращивания инфузорий применяют специально подготовленные зерна риса.

В соответствии с нормативами, принятыми в отрасли для данного вида продукции, производят оценку степени токсичности и делают выводы о возможном использовании продукта.

Известен способ оценки качества кормовых и пищевых продуктов с помощью культуры инфузорий Stylonichia mytilus, описанный в патенте №2049994 "Способ оценки качества кормовых и пищевых продуктов" авторов Гроздова А.О. и Цвылева О.П. Однако данный способ не позволяет определить наличие в кормовых продуктах водорастворимых микотоксинов (патулин, токсины дрожжеподобных микрогрибов и некоторые другие), что составляет около 10% из общего числа токсичных проб кормовых продуктов, о чем сообщается в статье А.Гроздова "Определение общей токсичности на инфузориях парамециях". Это связано с тем, что в указанном способе для биотестирования используется водно-ацетоновый экстракт, т.е. извлечение токсинов из кормовых продуктов проводится ацетоном, который в дальнейшем разбавляется водой в 80-160 раз до концентрации ацетона в 0,6-1,3%. В случае присутствия в кормовом продукте водорастворимых токсинов, которые извлекаются из продукта ацетоном значительно хуже чем водой, полученная концентрация токсинов недостаточна для их обнаружения.

Для устранения этого недостатка можно сконцентрировать токсины путем выпаривания ацетонового экстракта на водяной бане, однако это увеличивает время подготовки пробы с 0,5 час до 4 час, что не удовлетворяет производственные лаборатории комбикормовых и сельскохозяйственных производств.

Кроме того, недостатком известного способа является также использование в качестве среды инкубации воды, которая из разных источников водоснабжения значительно отличается по своему химическому составу и соответственно по показателю общей жесткости воды, который оказывает существенное влияние на результаты биотестирования, вплоть до получения диаметрально противоположных результатов (токсично - не токсично) на одном и том же образце комбикорма, но на разной по жесткости воде, о чем сообщается в статье Е.Головни "Что влияет на токсичность биотестирования кормов".

Известен также способ определения токсичности объектов внешней среды с помощью культуры инфузорий Colpoda steinii с тестированием водных растворов исследуемых проб, описанный в патенте №2039825 "Способ определения токсичности объектов внешней среды" авторов Виноходова Д.О. и Виноходова В.О. Однако данный способ не позволяет определить наличие в кормовых продуктах бактериальных токсинов, которые в воде не растворимы, что составляет около 20% из общего числа токсичных проб кормовых продуктов, о чем сообщается в статье А.Гроздова "Определение общей токсичности на инфузориях парамециях".

Известен также способ определения токсичности кормов для сельскохозяйственных животных с тестированием водных растворов исследуемых проб с помощью культуры инфузорий Paramecium caudatum, изложенный в статье Агеева В. и Долторниязова И. "Определение токсичности корма". Однако данный способ также не позволяет определить присутствие в кормовых продуктах бактериальных токсинов. Кроме этого, для биотестирования берут инфузорий из культуры в возрасте от 4 дней до 1 месяца, не учитывая при этом изменение токсикорезистентности инфузорий за этот период времени, что отражается на достоверности результатов.

Первые два указанных способа, вошедшие в ГОСТ 13496.7-97 "Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения токсичности", имеют еще один общий недостаток. Для проведения биотестирования требуется 24-часовая подготовка инфузорий к биоанализу. В результате этого общая длительность биоанализа составляет более суток, что часто не удовлетворяет производственные лаборатории по времени анализа.

Поэтому целью данного изобретения является одновременное получение сведений о наличии всех токсинов, присутствующих в исследуемом продукте, и сокращении времени проведения биоанализа.

Поставленная цель достигается тем, что при биоанализе готовят одновременно водный раствор ацетонового экстракта и водный раствор того же продукта, в которые помещают инфузории Paramecium caudatum, культивированных в присутствии специально подготовленных зерен риса, и затем производят оценку токсичности продукта соответственно по проценту выживаемости инфузорий и времени полной гибели инфузорий.

В качестве тест-организмов при тестировании водных растворов ацетоновых экстрактов продуктов и водных растворов тех же продуктов инфузории Paramecium caudatum выбраны потому, что они менее требовательны к условиям культивирования, чем другие виды инфузорий, и могут быть культивированы в присутствии зерен риса без дополнительного введения растворенных органических питательных веществ в виде сенного настоя, пептона и т.д.

Приготовление ацетонового экстракта кормового продукта и его водного раствора для биотестирования: измельченную на лабораторной мельнице пробу в количестве 10±0,1 г помещают в стеклянную посуду для экстракции, заливают 15-25 мл ацетона в зависимости от консистенции экстракционной смеси и экстрагируют при энергичном встряхивании в течение 2-х минут. Экстракцию ацетоном для более полного извлечения токсинов лучше всего проводить в стеклянной посуде емкостью 100 мл с притертой крышкой.

После 2-минутной экстракции ацетоновый экстракт отстаивают 10-15 минут. Это время должно быть строго фиксировано, т.к. оно определяет содержание мелкодисперсной взвеси продукта в экстракте. Если прошло более 15 минут, экстракт необходимо несколько раз энергично встряхнуть и дать вновь отстояться 10-15 минут. Отстоявшийся экстракт осторожно отбирают шприцем, не взмучивая осадок.

Водный раствор ацетонового экстракта исследуемого продукта готовят на известной среде Лозина-Лозинского, при этом концентрация ацетонового экстракта в водном растворе определяется процентным содержанием протеина в исследуемом продукте (таблица 1). Водный раствор ацетонового экстракта независимо от вида кормового продукта отфильтровывают через бумажный фильтр. Это избавляет раствор от крупнодисперсной жировой фракции и стандартизирует размер мелкодисперсных частиц кормового продукта.

Подготовка водных экстрактов кормовых продуктов к биотестированию: измельченную на лабораторной мельнице пробу в количестве 10 (20) г помещают в стеклянную посуду для экстракции, приливают 50 (100) мл среды культивирования и энергично встряхивают в течение 20 мин. Встряхивание можно производить также периодически: две минуты после приливания среды и через каждые последующие 10 мин. После экстракции пробу отстаивают 10-15 мин, затем надосадочную жидкость отбирают шприцем и переносят в бумажный фильтр. Если проба представляет собой гранулированный или экструдированный продукт, надосадочная жидкость при отстаивании не образуется и для ее получения пробу необходимо центрифугировать в течение 5 мин при 2,5-3,0 тыс. об./мин, после чего надосадочную жидкость также отфильтровывают через бумажный фильтр. После фильтрации проба готова к биотестированию. Она содержит водорастворимые фракции токсинов и мелкодисперсную взвесь (размер частиц около 5 мкм). Подготовленные пробы, перед внесением в микроаквариумы, необходимо повторно перемешивать.

Биотестирование водного раствора ацетонового экстракта кормового продукта: для испытания используют блок луночных микроаквариумов, указанный в ГОСТ 13496.7-97. Инфузорий из чашки Петри по одной капле вносят одновременно во все микроаквариумы, исходя из общего числа исследуемых проб и контроля, а также количества повторностей для каждой пробы (4-5). После этого инфузории более-менее равномерно распределяют пипеткой по каплям, чтобы в каждой капле было не более 10 штук. Затем проводят первоначальный подсчет инфузорий. Подсчет инфузорий проводят, используя микроскоп МБС-10 при 16-кратном увеличении.

Подсчет в микроаквариуме проводят несколько раз до совпадения результатов подсчета. При подсчете инфузорий их численность заносят в рабочий журнал.

После подсчета инфузорий подготовленные пробы еще раз перемешивают, и вносят опытной пипеткой в микроаквариумы, заполняя их до 2/3 объема. Испытания проводят при температуре 24-26°С.

Вторичный подсчет инфузорий проводят через 1,5 часа. Во время подсчета необходимо постукивать пальцем по блоку микроаквариумов. При подсчете инфузорий Paramecium caudatum регистрируют только подвижных особей, неподвижно лежащих на дне микроаквариума инфузорий не учитывают. После вторичного подсчета рассчитывают % выживших инфузорий N по формуле

где N₂ - суммарное количество инфузорий в исследуемой пробе для 4-5 повторностей через 1,5 часа экспозиции;

N₁ - суммарное количество инфузорий в исследуемой пробе для 4-5 повторностей в начале опыта.

Биотестирование водного раствора кормового продукта: испытание проводят в микроаквариумах, расположенных в блоке луночных микроаквариумов, указанном в ГОСТ 13496.7-97. В микроаквариум из чашки Петри пипеткой вносят 3 капли среды с инфузориями Paramecium caudatum, а затем 6 капель подготовленной для тестирования пробы. При проведении тестирования достаточно 2-х повторностей (2 микроаквариума), так как анализ качественный. Тестирование проводят при температуре 24-26°С.

Оценка токсичности.

Степень токсичности кормового продукта при тестировании водного раствора ацетонового экстракта продукта определяют по % выживших инфузорий (выживаемость, %) в соответствии с таблицей 2.

Степень токсичности продукта при тестировании его водного раствора определяют по времени, за которое происходит гибель инфузорий (таблица 3). При этом инфузории становятся неподвижными, оседая на дно микроаквариума. При постукивании пальцем по блоку с микроаквариумами движения инфузорий не наблюдается.

Сокращение общей длительности биоанализа с использованием инфузорий Paramecium caudatum достигается тем, что в качестве питания при культивировании инфузорий применяют зерна риса без дополнительного введения органических питательных веществ в виде сенного настоя, пептона и т.д. При таком культивировании инфузории в возрасте от 2-х до 8-ми недель имеют постоянную токсикорезистентность и поэтому не требуют 24-часовой подготовки к биоанализу (таблица 4).

Культивирование инфузорий проводят в чашке Петри при температуре 24-26°С. Чашку Петри до половины объема заливают средой Лозина-Лозинского, состав которой указан в ГОСТ 13496.7-97, добавляют 3 зерна риса и пересаживают инфузории пипеткой из резервных чашек со старой культурой.

Через 2 недели со дня пересадки культура переходит в фазу замедленного роста. В этой фазе культуру можно поддерживать в течение 2-х месяцев. Для этого необходимо один раз в неделю добавлять в чашку Петри по одному зерну риса. В этой фазе роста культуру инфузорий используют для биотестирования, так как именно в этот период культура инфузорий обладает наибольшей биомассой и стабильной чувствительностью к действию токсинов.

Свыше 2-х месяцев культура инфузорий переходит в стационарную фазу. В этой фазе состояния культуру инфузорий для биотестирования не используют и чашки Петри переводят в разряд резервных. В жизнеспособном состоянии культуру инфузорий в стационарной фазе можно поддерживать в течение 1 года при комнатной температуре. Для этого необходимо один раз в месяц, по мере испарения среды из чашки Петри доливать среду Лозина-Лозинского и добавлять по одному зерну риса, удаляя при этом из чашки наиболее старые разбухшие зерна риса.

Подготовка риса: исходную партию риса необходимо проверить на наличие токсичности методом комплексной оценки токсичности (выживаемость в водном растворе ацетонового экстракта должна быть 100%). Проверенный рис промывают водопроводной, а затем дистиллированной водой, подсушивают на фильтровальной бумаге и высушивают в сушильном шкафу при 50-60°С в течение 1 часа, затем стерилизуют при температуре 100°С в течение 45 минут. Необходимо использовать длиннозернистый рис, так как он содержит меньше крахмальных веществ. Хранят рис в стерильной баночке с притертой крышкой не более 6 месяцев.

Технико-экономическое обоснование.

Предложенный способ комплексной оценки токсичности кормовых и пищевых продуктов с использованием инфузорий Paramecium caudatum является дальнейшим усовершенствованием изобретения "Способ оценки качества кормовых и пищевых продуктов" на инфузориях Stilonichia mytilus, разработанного в 1992 году и вошедшего в качестве экспрессного метода в ГОСТ 13496.7-92 и ГОСТ 13496.7-97 "Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения токсичности".

Необходимость усовершенствования указанного метода диктовалась тем, что данный метод не позволяет определять присутствие в кормовых продуктах водорастворимых токсинов, так как извлечение токсинов в данном методе осуществляется органическим растворителем - ацетоном. В результате этого около 10% токсичных проб данным методом не выявлялось, что приводило к значительному экономическому ущербу на сельскохозяйственных комплексах, особенно крупных, таких как ОАО "Омский бекон" с поголовьем 240000 свиней, ГП совхоз "Пермский" с поголовьем 180000 свиней и некоторых других.

Способ комплексной оценки токсичности кормовых и пищевых продуктов с параллельным биотестированием водных растворов ацетоновых экстрактов кормовых продуктов и водных растворов тех же продуктов на инфузориях Paramecium caudatum позволяет выявить 100% токсичных проб максимум за 3-4 часа. Экспресс-методы, вошедшие в новый ГОСТ 13496.7-97 "Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения токсичности" с биотестированием водных растворов ацетоновых экстрактов комбикормов на инфузориях стилонихиях и биотестированием водных экстрактов кормов на инфузориях колподах не позволяют этого сделать, так как указанные методы взаимозаменяемые, а не комплексные, то есть лабораториям предлагается работать любым из указанных методов.

Использование в предложенном способе комплексной оценки токсичности кормовых и пищевых продуктов инфузорий Paramecium caudatum обусловлено тем, что данный вид инфузорий наименее требователен к условиям культивирования, по сравнению с другими видами инфузорий, и может культивироваться на зернах риса без дополнительного введения легкодоступного корма, такого как пекарские дрожжи, пептон или сенной отвар.

Культивирование инфузорий Paramecium caudatum с использованием зерен риса обусловлено тем, что данный вид корма не дает мелкодисперсной пищевой взвеси в среде обитания инфузорий и поэтому труднодоступен. В результате этого рост биомассы инфузорий происходит медленно и различные фазы роста культуры, во время которых инфузории имеют одинаковую токсикорезистентность, значительно растянуты во времени. При культивировании Paramecium caudatum на зернах риса удалось получить культуру инфузорий в фазе замедленного роста и возрасте от 2-х до 8-ми недель, которая имеет постоянную чувствительность к токсическому воздействию. В этой фазе роста культуры, при которой инфузории имеют наибольшую биомассу, Paramecium caudatum используют для биотестирования. В результате этого, работая на культуре парамеций в возрасте от 2-х до 8-ми недель, отпадает необходимость в 24-часовой подготовке культуры к биотестированию, как при работе с культурой инфузорий стилонихий или колпод.

Способ комплексной оценки токсичности кормовых и пищевых продуктов апробирован на двух комбикормовых заводах ООО "Провими". На основании проведенной работы подготовлены рекомендации по дополнению и изменению в действующий ГОСТ 13496.7-97 "Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения токсичности", для представления в Государственный комитет Российской Федерации по стандартизации и метрологии.

ТАБЛИЦА 1Зависимость концентрации ацетонового экстракта в водном растворе от содержания протеина в продуктеСодержание протеина в продукте, %Кол-во водной среды, млКоличество ацетонового экстракта, мл (его концентрация в %)ПрототипПредлагаемый методКультура парамецийКультура стилонихий, Возраст 1 суткиВозраст 4-10 сут.Возраст 2-8 нед.25 и менее400,5(1,25%)0,3 (0,75%)0,25 (0,63%)26-35500,5(1,00%)0,3 (0,60%)0,25 (0,50%)36-45600,5 (0,83%)0,3 (0,50%)0,25 (0,42%)46-55700,5 (0,71%)0,3 (0,43%)0,25 (0,36%)56 и более800,5 (0,63%)0,3 (0,38%)0,25 (0,31%)ТАБЛИЦА 2Степень токсичности исследуемого продукта при тестировании водного раствора ацетонового экстрактаСтепень токсичности исследуемого продуктаВыживаемость инфузорий, %ПрототипПредлагаемый способКомбикорма для всех видов с/х животных, птицы и рыб; фуражное зерно и продукты его переработкиКомбикорма (фуражное зерно и продукты его переработки) для свиноматок, поросят, телят, цыплят, и молоди рыбКомбикорма (фуражное зерно и продукты его переработки) для взрослых с/х животных всех видов, птицы и рыбыНетоксичный81-10091-10081-100Слаботоксичный50-8051-9051-80Токсичный0-490-500-50

ТАБЛИЦА 3Степень токсичности кормового продукта при тестировании водного экстракта.Степень токсичностиВозраст культуры парамецийПрототипПредлагаемый метод4-31 день4-10 дней2-8 недельПроба остротоксичнагибель от 0 до 3 мин.гибель от 0 до 30 мин.Гибель от 0 до 60 мин.Проба токсичнагибель от 3 до 10 мин.гибель от 31 до 60 мин.Гибель от 1,0 до 1,5 часПроба слаботоксичнагибель от 10 мин. до 3-х часовгибель от 1 до 3-х часовГибель от 1,5 до 3,5 часовПроба нетоксичнагибели за 3 часа нет.гибели за 3 часа нет.Гибели за 3,5 часа нет.ТАБЛИЦА 4Изменение токсикорезистентности инфузорий в зависимости от возраста культуры на примере биотестирования слаботоксичного комбикорма.Возраст культуры со дня пересадкиВодный раствор ацетонового экстракта комбикормаВодный раствор комбикормаВыживаемость парамеций в % от численности посадки за 1 час экспозицииДозировка 0,3 мл ацетонового экстракта на 40 мл средыДозировка 0,25 мл ацетонового экстракта на 40 мл средыВремя гибели парамеций от начала экспозиции, минут1 неделя56±393±375±52 недели14±356±3105±53 недели9±352±3105±54 недели13±355±3105±55 недель12±355±3105±58 недель10±353±3105±512 недель5±345±3120±5Примечание: в возрасте культуры от 4 до 10 дней чувствительность инфузорий не изменялась.

Использованная литература.

1. Патент РФ №2049994, кл. 6 G 01 N 33/18 "Способ оценки качества кормовых и пищевых продуктов", авторы Гроздов А.О. и Цвылев О.П.

2. А.Гроздов. Определение общей токсичности на инфузориях парамециях. Журн. "Комбикорма", Москва, 2001 г., №4, стр. 31-33.

3. Е.Головня. Что влияет на токсичность биотестирования кормов. Журн. "Комбикорма", Москва, 2000 г., №6, стр. 36-37.

4. Патент РФ №2039825, кп.6 C 12 O 1/02, G 01 N 33/18 "Способ определения токсичности объектов внешней среды", авторы Виноходов Д.О. и Виноходов В.О.

5. Агеев В., Долторниязов И. Определение токсичности корма. Журн. "Птицеводство", Москва, 1988 г., стр. 41-42.

6. ГОСТ 13496.7-97. "Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения токсичности".

Изобретение относится к области оценки качества кормовых и пищевых продуктов. Способ заключается в использовании инфузорий Paramecium caudatum, культивируемых на зернах длиннозерного риса, оценку токсичности проводят по проценту выживших инфузорий в водном растворе ацетонового экстракта исследуемого продукта. Способ позволяет сократить время проведения биоанализа, получить сведения о наличии токсинов. 4 табл.

Способ комплексной оценки токсичности кормовых и пищевых продуктов с помощью инфузорий Paramecium caudatum, отличающийся тем, что готовят одновременно водный раствор ацетонового экстракта исследуемого продукта и водный раствор того же продукта, в которые помещают инфузории Paramecium caudatum, культивируемые на зернах длиннозерного риса, промытых водопроводной, затем дистиллированной водой, подсушенных на фильтровальной бумаге, а затем в сушильном шкафу при температуре 50-60°С в течение 1 ч, стерилизованных при температуре 100°С в течение 45 мин, оценку токсичности продукта при тестировании водного раствора ацетонового экстракта определяют по проценту выживших инфузорий, а токсичность водного раствора продукта определяют по времени, за которое происходит гибель инфузорий.