Способ генотипирования полиморфного локуса rs4757429 (C>T) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/6827 C12Q1/6813 C12Q1/6858 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs4757429 (C>T) гена C11orf58 молекулярно-генетическим методом исследования.

Уровень техники

Ген C11orf58 кодирует белок, открытый в 2020 г. японскими учеными [Tsuboyama K. et al. A widespread family of heat-resistant obscure (Hero) proteins protect against protein instability and aggregation //PLoS Biology. - 2020. - Vol. 18. - №. 3. - P. e3000632]. Данный белок характеризуется высокой устойчивостью к воздействию неблагоприятных физических и химических факторов и способствует восстановлению нативной третичной или четвертичной структуры других белков в условиях стресса, что доказывает его выраженные шапероноподобные свойства. Потенциально значимая роль данного белка в широком спектре заболеваний (нейродегенеративных, атеросклероза и др.) определяет необходимость проведения молекулярно-генетических исследований гена C11orf58 и разработки методик генотипирования полиморфных вариантов данного гена.

Ген C11orf58 (Gene ID: 10944) локализован на хромосоме 11p15.2. Однонуклеотидный полиморфизм rs4757429, позиция chr11:16742895 (GRCh38.p14) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs4757429] локализован в интроне и характеризуется заменой C>T. Согласно биоинформатическим ресурсам, данный генетический вариант характеризуется cis-eQTL-опосредованным влиянием на снижение экспрессии генов C11orf58, PIK3C2A в периферической крови [https://eqtlgen.org/cis-eqtls.html], ассоциирован с модификациями гистонов, маркирующих промоторы/энхансеры в большинстве органов/тканей человека [https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/detail_v4.2.php?query=&id=rs4757429].

Установлено влияние rs4757429 на связывание с транскрипционными факторами в зависимости от носительства референсного/альтернативного аллелей [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. Это доказывает высокую функциональную значимость данного генетического варианта и создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs4757429 (C>T) гена C11orf58.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016 //Nature protocols. - 2017. - Vol. 12. - №. 2. - P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение многофакторных заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. - 2022. - Vol. 2. - №. 5. - P. 385-404]. Недостатками метода являются трудоемкость, высокая стоимость оборудования, высокая стоимость эксперимента, наличие высококвалифицированного персонала.

За прототип выбран коммерческий набор по генотипированию rs4757429 (С/Т) гена C11orf58 (Assay ID C__32300329_10; каталог 4351379) компании ThermoFisher. Однако генотипирование с использованием коммерческих наборов характеризуется высокой стоимостью, а информация о структуре необходимых для проведения ПЦР праймеров и аллель-специфических зондов является закрытой для исследователей, в связи с чем он не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов.

Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма rs4757429 (C>T) гена C11orf58, с доступной всем исследователям структурой праймеров и аллель-специфических зондов, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в любой ПЦР-лаборатории.

Раскрытие сущности изобретения. Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs4757429 (C>T), локализованного в позиции chr11:16742895 (GRCh38.p14) гена C11orf58 (Gene ID: 10944) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащих флуорофоры FAM и ROX.

Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs4757429 (C>T) гена C11orf58 осуществляют с использованием прямого праймера rs4757429 5'- TTCTTTGTTTTCCTGATTTTGATG-3' (SEQ ID NO: 1), обратного праймера rs4757429 5'-CCCAAGTATATGGAAGGCTGA-3' (SEQ ID NO: 2), rs4757429-С-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(FAM)CAAATCTTGCATACTCA(RTQ1)-3' (SEQ ID NO: 3),

rs4757429-Т-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(ROX)CAAATCTTGTATACTCA(BHQ2)-3' (SEQ ID NO: 4).

Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация аллелей по локусу rs4757429 (C>T) гена C11orf58 при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs4757429-С/С показаны оранжевыми кругами, генотипы rs4757429-С/Т показаны зелеными треугольниками, генотипы rs4757429-Т/Т показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.

Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:

1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран сиквенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [С/Т] rs4757429 C11orf58, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции:

прямой общий праймер rs4757429 5'-TTCTTTGTTTTCCTGATTTTGATG-3' (SEQ ID NO: 1),

обратный общий праймер rs4757429 5'-CCCAAGTATATGGAAGGCTGA-3' (SEQ ID NO: 2).

Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена C11orf58 составляет 170 пар нуклеотидов:

TTCTTTGTTTTCCTGATTTTGATGTACATATAGTCATCCTTCAGTATGCTAAATGTGGGGGATTGGTTCCAGGACCCACCCACCTCTTTGGCAAATCTTG[С/Т]ATACTCAAGTTCTGCAGCCAGCCCTGTGGAACCTGAGAATAGGAAAAATCAGCCTTCCATATACTTGGG.

2) Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. - New York: Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2.

На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:

rs4757429-С-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-(FAM)CAAATCTTGCATACTCA(RTQ1)-3' (SEQ ID NO: 3),

rs4757429-Т-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-(ROX)CAAATCTTGTATACTCA(BHQ2)-3' (SEQ ID NO: 4).

3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.

4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 52°C в течение 1 минуты].

5) Разработанный способ был апробирован в лаборатории геномных исследований на 100 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зондов с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs4757429 128 человек (64 %) оказались гомозиготами по аллелю С (генотип С/С); 64 человека (32 %) - гетерозиготами (генотип С/Т), 8 человек (4 %) индивидуумов были гомозиготами по аллелю Т (генотип Т/Т).

6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100 % генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs4757429 (C>T) гена C11orf58 методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).

Осуществление изобретения

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1 % раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95 % этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs4757429 (C>T) гена C11orf58 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO: 1) и обратный (SEQ ID NO: 2), а также аллель-специфические зонды: С-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO: 3), Т-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO: 4).

ПЦР в «реальном времени» проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкM каждого праймера, по 5 мкM каждого зонда, 0.03 мM каждого dNTP, 3 мМ MgCl₂; 1xПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,01 % Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 52°C в течение 1 минуты].

4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs4757429 (C>T) гена C11orf58 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю С, зонд с красителем ROX - аллелю Т (фиг. 1). На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов - соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот С/С. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот Т/Т. Кластер зеленых треугольников характеризует накопление уровня флуоресценции по обоим зондам позволяет идентифицировать гетерозигот С/Т.

Резюме

Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс-идентификации полиморфного варианта rs4757429 (C>T) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфизмов гена C11orf58, а также в научных целях.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ

генотипирования полиморфного локуса rs4757429 (C T) гена C11orf58 у

человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением

аллель-специфических флуоресцентных зондов.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-01-26">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>

2023134784/20(076330)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-23</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования

&quot;Курский государственный медицинский университет&quot;

Министерства здравоохранения Российской Федерации,</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical

University</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования

полиморфного локуса rs4757429 (C&gt;T) гена C11orf58 у человека

методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением

аллель-специфических флуоресцентных зондов</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttctttgttttcctgattttgatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cccaagtatatggaaggctga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caaatcttgcatactca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caaatcttgtatactca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу генотипирования полиморфного локуса rs4757429 (C>T) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме реального времени с применением праймеров SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и аллель-специфичных флуоресцентно-меченых зондов SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 в амплификаторе с детекцией флуоресценции. Изобретение эффективно для точного и недорогого генотипирования полиморфного локуса rs4757429 (C>T) гена C11orf58 у человека. 1 ил., 1 пр.

Способ генотипирования полиморфного локуса rs4757429 (C>T) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, отличающийся тем, что идентификацию аллельных вариантов rs4757429 (C>T) гена C11orf58 осуществляют с использованием прямого праймера rs4757429 с SEQ ID NO: 1, обратного праймера rs4757429 с SEQ ID NO: 2, rs4757429-С-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда с SEQ ID NO: 3, rs4757429-Т-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда с SEQ ID NO: 4.