Способ получения экзосом винограда Российский патент 2024 года по МПК A61K36/87 B01D21/26 B01D61/14 

Изобретение относится к биотехнологии и позволяет получать экзосомальные везикулы (экзосомы) растений, в частности винограда, которые могут быть использованы в медицинской и косметической промышленности.

Экзосомы представляют собой биогенные мембранные образования с характерным размером от 30 до 200 нм, которые высвобождаются из клетки путем слияния мультивезикулярного тельца (МВТ) с плазматической мембраной [Yang M, Liu X, Luo Q, Xu L, Chen F. An efficient method to isolate lemon derived extracellular vesicles for gastric cancer therapy. J Nanobiotechnology 2020; 18: 100]. Состав экзосом варьируется в зависимости от объекта, из которого их получают. Однако все из них содержат специфические белки, матричную РНК (мРНК), микроРНК и другие некодирующие РНК, а также липиды и никзомолекулярные соединения [Rutter BD, Innes RW. Extracellular Vesicles Isolated from the Leaf Apoplast Carry Stress-Response Proteins. Plant Physiol 2017; 173:728-741].

В последнее десятилетие внимание исследователей привлекает возможность использования экзосом растений в качестве системы доставки лекарственных соединений. Растительное происхождение и высокая биосовместимость, а также универсальный терапевтический потенциал экзосом дает им преимущество перед синтетическими липосомами, используемыми в качестве наноносителей.

Было обнаружено, что экзосомы растений обладают выраженным противовоспалительным действием, участвуя в регуляции иммунного ответа. Благодаря способности экзосом к межвидовой транслокализации, содержащиеся в них молекулы регулируют взаимодействие между кишечной микробиотой и иммунной системой хозяина, что приводит к гомеостатическому балансу [Deng Z, Rong Y, Teng Y, Mu J. Broccoli-derived nanoparticle inhibits mouse colitis by activating dendritic cell amp-activated protein kinase. Mol Ther 2017; 25: 1641-1654]. Кроме того, экзосомы осуществляют доставку нарингина, ключевого флаванона грейпфрута. При высвобождении нарингин гидролизуется кишечной микробиотой в его активный метаболит нарингенин. Было показано, что обе формы проявили противоопухолевое действие на модели колита у мышей, вызванного декстраном сульфата натрия [Ines Amaro M, Rocha J, Vila-Real H. Anti-inflammatory activity of naringin and the biosynthesised naringenin by naringinase immobilized in microstructured materials in a model of DSS-induced colitis in mice. Food Res Int 2009; 42: 1010-1017]. При загрузке экзосом из имбиря доксорубицином с целью его адресной доставки, они эффективно внедрялись в клетки опухолевой модели толстой кишки и подавляли их рост. Предположительно экзосомы высвобождают доксорубицин при кислом рН внеклеточной микросреды опухолей и уменьшают побочные эффекты доксорубицина [Zhuang X, Deng ZB, Mu J, Zhang L. Ginger-derived nanoparticles protect against alcohol-induced liver damage. J Extracell Vesicles 2015; 4: 28713]. Экзосомы из винограда также проявляют противоопухолевое действие. Эффект достигался за счет увеличения экспрессии генов Lgr5, BMI1, служащих маркерами стволовых клеток кишечника и генов, регулирующих рост и пролиферацию стволовых клеток [Ju S, Mu J, Dokland T, Zhuang X. Grape exosome-like nanoparticles induce intestinal stem cells and protect mice from DSS-induced colitis. Mol Ther 2013; 21: 1345-1357].

Помимо противоопухолевого действия, известно об использовании экзосом растений в регенеративной медицине. Было показано, что экзосомы винограда способны проникать в стволовые клетки кишечника, индуцировать их пролиферацию и тем самым регенерировать эпителиальную ткань посредством регуляции экспрессии генов SOX2, Oct4 и Klf4, ответственных за плюрипотентность [Cho EG, Choi SY, Kim H. Panax ginseng-derived extracellular vesicles facilitate anti-senescence effects in human skin cells: an eco-friendly and sustainable way to use ginseng substances. Cells 2021; 10: 1-25]. В то же время экзосомы имбиря проявляли гепатопротекторную активность за счет снижения генерации активных форм кислорода в поврежденной алкоголем печени мышей. Благодаря биоактивным компонентам они могут повлиять на активацию ядерного фактора NRF2. Как известно, стимуляция NRF2 приводит к экспрессии генов детоксикации печени и антиоксидантов, что в совокупности способствует гепатопротекции [Zhuang X, Deng ZB, Mu J, Zhang L. Ginger-derived nanoparticles protect against alcohol-induced liver damage. J Extracell Vesicles 2015; 4: 28713].

На примере экзосом из грейпфрута, нагруженных метотрексатом, исследованы иммунологические реакции организма. Было показано, что при пероральном введении таких экзосом они эффективно таргетируют мышиные макрофаги F4/80, локализованные в кишечнике, посредством микропиноцитоза и клатрин-зависимых клеточных путей поглощения. После введения экзосом приостановилось уменьшение веса и сокращение длины толстой кишки. Наряду с очевидной противовоспалительной реакцией также снизилась продукция провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-1β и IL-6. Побочные эффекты при применении метотрексата в составе экзосом значительно уменьшались [Wang B, Zhuang X, Deng ZB, Jiang H. Targeted drug delivery to intestinal macrophages by bioactive nanovesicles released from grapefruit. Mol Ther 2014; 22: 522-534]. Также известны аналогичные исследования с использованием экзосом из брокколи, винограда и моркови, что подтверждает значительный потенциал экзосом в модуляции иммунологических реакций [Mu J, Zhuang X, Wang Q, Jiang H. Interspecies communication between plant and mouse gut host cells through edible plant derived exosome-like nanoparticles. Mol Nutr Food Res 2014; 58: 1561-1573].

Растительные экзосомы имеют ряд преимуществ в доставке веществ в сравнении с существующими аналогами. Во-первых, небольшой размер, отрицательный заряд, сродство с плазматической мембраной, выраженная физико-химическая стабильность при различных значениях рН и температурах позволяют экзосомам эффективно проникать целевые клетки. При этом фосфолипидный бислой защищает содержимое экзосомы от ферментативного разложения протеиназами и нуклеазами. Во-вторых, экзосомы имеют высокий потенциал для адресной доставки терапевтических агентов, что уменьшает потенциальную опасность нежелательной реакции при клиническом использовании. В-третьих, экзосомы успешно диффундируют через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что позволяет избежать воспалительной реакции, в отличие от искусственно изготовленных липосом и животных экзосом [Basu A, Nguyen A, Betts NM. Strawberry as a functional food: an evidence-based review. Crit Rev Food Sci Nutr 2014; 54: 790-806].

В настоящее время наибольшее число исследований посвящено использованию нативных экзосом, содержащих присущие данному виду растения биомолекулы: белки, микроРНК, вторичные метаболиты и др. При этом терапевтический потенциал нативных экзосом определяется главным образом видом растения, используемым для выделения [Dad HA, Gu TW, Zhu AQ, Huang LQ. Plant exosome-like nanovesicles: emerging therapeutics and drug delivery nanoplatforms. Mol Ther 2021; 29: 13-31]. Стоит отметить, что состав молекул в нативных экзосомах и, как следствие, биологические свойства нестабильны. Кроме того, для некоторых редких или прихотливых растений остается актуальной проблема наработки достаточного количества биомассы для выделения экзосом в промышленных масштабах.

Таким образом, несмотря на большой потенциал использования экзосом, остается значительный пробел в разработке современных способов получения возобновляемого сырья. По мнению авторов в этом отношении наибольшей перспективностью обладают выращиваемые in vitro на искусственных питательных средах клетки растений, т.н. каллусные культуры. Культура каллусных клеток является более простой системой по сравнению с целым растением, а параметры культивирования легко поддаются регулированию и являются стабильными.

Известен способ получения экзосом винограда, в котором ягоды винограда очищают от кожуры, добавляют буферный раствор и готовят гомогенат, который центрифугируют в градиенте сахарозы [Ju S, Mu J, Dokland T, Zhuang X. Grape exosome-like nanoparticles induce intestinal stem cells and protect mice from DSS-induced colitis. Mol Ther 2013; 21:1345-1357].

Недостатком этого способа является использование нестандартизированного исходного растительного материала, биохимический состав которого варьируется в зависимости от сезона сбора и внешних факторов [Ali K, Maltese F, Fortes AM, Pais MS, Choi YH, Verpoorte R. Monitoring biochemical changes during grape berry development in Portuguese cultivars by NMR spectroscopy. Food Chem 2011; 124: 1760-1769; Miras-Avalos JM, Intrigliolo DS. Grape Composition under Abiotic Constrains: Water Stress and Salinity. Front Plant Sci 2017; 8], а также может быть контаминирован нежелательной микрофлорой, в т.ч. небезопасной для человека [Habib W. Fungal pathogens associated with harvested table grapes in Lebanon, and characterization of the mycotoxigenic genera. Phytopathol Mediterr 2021; 60: 427-439].

Особую опасность представляет заражение ягод винограда грибами рода Aspergillus spp., которые продуцируют охратоксин А – иммунотоксичное, нефротоксичное и карценогенное производное кумарина [Giannoukos K, Giannoukos S, Lagogianni C, Tsitsigiannis DI, Taylor S. Analysis of volatile emissions from grape berries infected with Aspergillus carbonarius using hyphenated and portable mass spectrometry. Sci Rep 2020; 10: 21179]. К тому же авторы работы используют центрифугирование в градиенте сахарозы для очищения выделенных экзосом, что является весьма трудозатратной и дорогостоящей процедурой.

Кроме того, дзета-потенциал раствора растительных экзосом лежит в очень широком диапазоне от −69,6 до +2,52 мВ.

В качестве ближайшего аналога (прототипа) принят способ выделения микровезикул из растений семейства амарантовых, включающий подготовку исходного материала и его гомогенизацию, последовательное центрифугирование в два этапа, отбор жидкой фазы и ее ультрацентрифугирование, суспендирование полученного осадка растительных экзосом в буфере и повторное ультрацентрифугирование при тех же условиях [патент РФ № 2771096, МПК A61K 36/21, B01D 21/26, B01D 61/14, дата публикации 26.04.2022 г.].

Недостатком прототипа является большой размер получаемых внеклеточных везикул, диаметр которых достигает 50-1200 нм.

Проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа получения экзосом винограда, в котором были бы сглажены вышеуказанные недостатки.

Технический результат, проявляющийся при решении поставленной проблемы, выражается в следующем:

1. расширение ассортимента используемого исходного материала, обладающего более стандартизированными свойствами, за счет:

- использования независимого от внешних факторов и самовоспроизводимого биотехнологического источника экзосом винограда;

- культивирования в стандартных условиях, что позволяет получать большое количество экзосом, биологически равноценных выделенным из растений;

- накопления биомассы в асептических условиях, что позволяет избежать заражения каллусной культуры опасными для человека патогенами или их производными;

2. обеспечение возможности получения экзосом винограда:

- со средним размером 200-350 нм;

- с более узким диапазоном значений поверхностного заряда (дзета-потенциала), что способствует повышению однородности;

- с выходом не менее 4,4 мг на 1 г использованной сырой биомассы клеток.

Поставленная проблема решается тем, что способ получения экзосом винограда, включающий подготовку исходного материала и его гомогенизацию, последовательное центрифугирование в два этапа, отбор жидкой фазы и ее ультрацентрифугирование, суспендирование полученного осадка растительных экзосом в буфере и повторное ультрацентрифугирование при тех же условиях, отличается тем, что в качестве исходного материала используют биомассу каллусной культуры клеток винограда, которую гомогенизируют с фосфатным буфером при их соотношении 1 г : 5 мл – 1 г : 15 мл, полученную гомогенизированную смесь центрифугируют в течение 19-21 минут при 9 000-11 000g, далее повторно центрифугируют супернатант в течение 19-21 минут при 19 000-21 000g, жидкую фазу пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и ультрацентрифугируют ее в течение 59-61 минут при 90 000-110 000g, полученный осадок экзосом винограда суспендируют в фосфатном буфере, причем на 1 г биомассы каллусной культуры клеток винограда берут 0,9-1,1 мл фосфатного буфера, и повторно ультрацентрифугируют в течение 59-61 минут при 90 000-110 000g.

Сопоставительный анализ признаков заявляемого изобретения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявляемого решения критерию «новизна».

При этом отличительные признаки формулы изобретения обеспечивают решение следующих функциональных задач.

Признак, указывающий что «в качестве исходного материала используют биомассу каллусной культуры клеток винограда» описывает используемый исходный материал, обладающий более стандартизированными свойствами, за счет:

- использования независимого от внешних факторов и самовоспроизводимого биотехнологического источника растительных экзосом;

- культивирования в стандартных условиях, что позволяет получать большое количество экзосом, биологически равноценных выделенным из растений;

- накопления биомассы в асептических условиях, что позволяет избежать заражения каллусной культуры опасными для человека патогенами или их производными.

Признак, указывающий что «биомассу каллусной культуры клеток винограда гомогенизируют с фосфатным буфером при их соотношении 1 г : 5 мл – 1 г : 15 мл» способствует выделению экзосом винограда из исходного материала.

Признак, указывающий что «полученную гомогенизированную смесь центрифугируют в течение 19-21 минут при 9 000-11 000g» обеспечивает осаждение клеточного дебриса.

Признак, указывающий что «повторно центрифугируют супернатант в течение 19-21 минут при 19 000-21 000 g» обеспечивает осаждение мелкой взвеси, содержащей субклеточные органеллы.

Признак, указывающий что «жидкую фазу пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм», позволяет ограничить размер получаемых экзосом винограда.

Признак, указывающий, что жидкую фазу «ультрацентрифугируют в течение 59-61 минут при 90 000-110 000g», обеспечивает осаждение экзосом винограда.

Признак, указывающий что «осадок экзосом винограда суспендируют в фосфатном буфере… и повторно ультрацентрифугируют в течение 59-61 минут при 90 000-110 000g» позволяет очистить экзосомы винограда от возможных примесей.

Признак, указывающий что «на 1 г биомассы каллусной культуры клеток винограда берут 0,9-1,1 мл фосфатного буфера» описывает количество фосфатного буфера, необходимое для промывки осадка экзосом винограда.

Другие отличительные признаки и преимущества изобретения ясно вытекают из описания, приведенного ниже для иллюстрации и не являющегося ограничительным, со ссылками на прилагаемые чертежи:

на фиг.1 показано распределение размеров экзосом из каллусной культуры винограда;

на фиг.2 изображен поверхностный заряд экзосом из каллусной культуры винограда;

на фиг.3 представлен внешний вид осадка экзосом из каллусной культуры винограда.

Заявляемый способ осуществляют на стандартном оборудовании в несколько этапов.

Подготовка исходного материала включает получение каллусной культуры и ее выращивание

Каллусную культуру получают стандартным методом [Bonner J. Plant Tissue Cultures from a Hormone Point of View. Proc Natl Acad Sci 1936; 22: 426-430].

Каллусная культура винограда характеризуется следующими признаками:

1) культурально-морфологические признаки: рыхлая, быстро растущая биомасса клеток, индекс роста в экспоненциальной фазе составляет 16±0,4, имеют беловато-желтоватый цвет;

2) биохимические признаки: каллус характеризуется способностью к продукции стильбенов [Makhazen DS, Veremeichik GN, Shkryl YN, Grigorchuk VP, Tchernoded GK, Degtyarenko AI, Bulgakov VP. RNA inhibition of the JAZ9 gene increases the production of resveratrol in grape cell cultures. Plant Cell. Tissue Organ Cult 2021; 147: 611-618].

Каллусная культура винограда не токсична, а при ее получении и культивировании используют безопасные для здоровья человека компоненты.

Полученную каллусную культуру клеток винограда массой 1 г помещают в колбу (объем 250 мл) с 60 мл питательной среды «W_B/A» [Bulgakov VP, Gorpenchenko TY, Shkryl YN, Veremeichik GN, Mischenko NP, Avramenko TV, Fedoreyev SA, Zhuravlev YN. CDPK-driven changes in the intracellular ROS level and plant secondary metabolism. Bioeng Bugs 2011; 2: 327-30] с добавлением растительных гормонов 6-бензилоаминопурин (0,5 мг/л) и α-нафтилуксусной кислоты (2 мг/л), после чего культивируют в темноте при температуре 25 °С и относительной влажности воздуха 70 % в течение 30 суток.

Получают 10-20 г сырой каллусной культуры винограда с одной колбы. По истечении периода культивирования каллусную культуру винограда извлекают из культуральных сосудов, взвешивают и используют для выделения экзосом.

При этом выращивание каллусной культуры винограда производится в строго асептических условиях, а ее биохимический состав стабилен в течение длительного культивирования благодаря использованию стандартных питательных сред.

Приготовление основы

Готовят гомогенизированную смесь, для чего биомассу каллусной культуры клеток винограда растирают с фосфатным буфером (0,01 М натрий фосфорнокислый однозамещенный, 0,0018 М натрий фосфорнокислый двузамещенный, 0,0027 М хлорид калия, 0,137 М хлорид натрия, pH 7.4) при их соотношении 1 г : 5 мл – 1 г : 15 мл.

Полученную гомогенизированную смесь центрифугируют в течение 19-21 минут при 9 000-11 000g и температуре 3-5 °С.

Далее повторно центрифугируют супернатант в течение 19-21 минут при 19 000-21 000g и температуре 3-5 °С.

Жидкую фазу пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Выделение экзосом винограда из основы и их очистка

Отобранную жидкую фазу ультрацентрифугируют в течение 59-61 минут при 90 000-110 000g и температуре 3-5 °С.

Полученный осадок экзосом винограда промывают в фосфатном буфере (0,01 М натрий фосфорнокислый однозамещенный, 0,0018 М натрий фосфорнокислый двузамещенный, 0,0027 М хлорид калия, 0,137 М хлорид натрия, pH 7.4), причем на 1 г биомассы каллусной культуры клеток винограда берут 0,9-1,1 мл фосфатного буфера, и повторно ультрацентрифугируют в течение 59-61 минут при 90 000-110 000g и температуре 3-5 °С.

Подготовка целевого продукта к хранению

Полученный очищенный осадок экзосом винограда имеет характерную слабую желтую или желто-оранжевую окраску.

Целевой продукт, т.е. очищенные экзосомы винограда, суспендируют в фосфатном буфере (0,01 М натрий фосфорнокислый однозамещенный, 0,0018 М натрий фосфорнокислый двузамещенный, 0,0027 М хлорид калия, 0,137 М хлорид натрия, pH 7.4) объемом 200-400 мкл и хранят при температуре 4 °С в течение нескольких суток или замораживают при температуре -86 °С для долговременного хранения.

Точный размер и содержание экзосом винограда определяют на основе анализа траекторий наночастиц с помощью прибора NS500 (Malvern Panalytical, Великобритания) (см. фиг. 1). Проведенные исследования показали, что каллусная культура винограда позволяет получить экзосомы с преобладающим размером 200-350 нм.

Поверхностный заряд (дзета-потенциал) экзосом винограда определяют тем же методом (фиг. 2).

Отрицательный заряд необходим для обеспечения коллоидной стабильности раствора экзосом, а также способствует их адсорбции в очаге воспаления [Cai, Y.; Zhang, L.; Zhang, Y.; Lu, R. Plant-derived exosomes as a drug-delivery approach for the treatment of inflammatory bowel disease and colitis-associated cancer. Pharmaceutics, 2022, 14, 822; DOI: 10.3390/pharmaceutics14040822].

Заявляемый способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Биомассу каллусной культуры клеток винограда (5 г) растирают с фосфатным буфером в соотношении 1 г : 5 мл.

Полученную гомогенизированную смесь центрифугируют в течение 19 минут при 9 000g и температуре 4 °С.

Далее повторно центрифугируют супернатант в течение 19 минут при 19 000g и температуре 4 °С.

Жидкую фазу фильтруют через мембранный фильтр Millipore с диаметром пор 0,45 мкм.

Отобранную жидкую фазу (20 мл) ультрацентрифугируют в течение 59 минут при 90 000g и температуре 4 °С.

Промывают полученный осадок экзосом винограда, для чего его суспендируют в фосфатном буфере, причем на 1 г биомассы каллусной культуры клеток винограда берут 0,9 мл фосфатного буфера, и ультрацентрифугируют в течение 59 минут при 90 000g и температуре 4 °С. Процедуру промывки повторяют.

Осадок очищенных экзосом винограда суспендируют в 400 мкл фосфатного буфера и получают коллоидную суспензию, готовую к использованию.

Целевой продукт в виде коллоидной суспензии экзосом винограда имеет концентрацию 4.5х10¹⁰ частиц/мл, средний размер 233 нм и дзета-потенциал -23 мВ. Таким образом, общий выход экзосом составляет 5 мг на 1 г использованной сырой биомассы клеток.

Получившуюся суспензию экзосом хранят при +4 °С в течение 1-2 суток или замораживают при -86 °С для долговременного хранения.

Пример 2.

Биомассу каллусной культуры клеток винограда (5 г) растирают с фосфатным буфером в соотношении 1 г : 10 мл.

Полученную гомогенизированную смесь центрифугируют в течение 20 минут при 10 000g и температуре 3 °С.

Далее повторно центрифугируют супернатант в течение 20 минут при 20 000g и температуре 3 °С.

Жидкую фазу фильтруют через мембранный фильтр Millipore с диаметром пор 0,45 мкм.

Отобранную жидкую фазу (20 мл) ультрацентрифугируют в течение 60 минут при 100 000g и температуре 3 °С.

Промывают полученный осадок экзосом винограда, для чего его суспендируют в фосфатном буфере, причем на 1 г биомассы каллусной культуры клеток винограда берут 1 мл фосфатного буфера и ультрацентрифугируют в течение 60 минут при 100 000g и температуре 3 °С. Процедуру промывки повторяют.

Осадок очищенных экзосом винограда суспендируют в 200 мкл фосфатного буфера и получают коллоидную суспензию, готовую к использованию.

Целевой продукт в виде коллоидной суспензии экзосом имеет концентрацию 9,2×10¹⁰ частиц/мл, средний размер 241 нм и дзета-потенциал -28 мВ. Таким образом, общий выход экзосом составляет 4,4 мг на 1 г использованной сырой биомассы клеток.

Получившуюся суспензию экзосом хранят при +4 °С в течение 1-2 суток или замораживают при -86 °С для долговременного хранения.

Пример 3.

Биомассу каллусной культуры клеток винограда (5 г) растирают с фосфатным буфером в соотношении 1 г : 15 мл.

Полученную гомогенизированную смесь центрифугируют в течение 21 минут при 11 000g и температуре 5 °С.

Далее повторно центрифугируют супернатант в течение 21 минут при 21 000g и температуре 5 °С.

Жидкую фазу фильтруют через мембранный фильтр Millipore с диаметром пор 0,45 мкм.

Отобранную жидкую фазу (20 мл) ультрацентрифугируют в течение 61 минут при 110 000g и температуре 5 °С.

Промывают полученный осадок экзосом винограда, для чего его суспендируют в фосфатном буфере, причем на 1 г биомассы каллусной культуры клеток винограда берут 1,1 мл фосфатного буфера, и ультрацентрифугируют в течение 61 минут при 110 000g и температуре 5 °С. Процедуру промывки повторяют.

Осадок очищенных экзосом винограда суспендируют в 300 мкл фосфатного буфера и получают коллоидную суспензию, готовую к использованию.

Целевой продукт в виде коллоидной суспензии экзосом винограда имеет концентрацию 5.8×10¹⁰ частиц/мл, средний размер 217 нм и дзета-потенциал -29 мВ. Таким образом, общий выход экзосом составляет 5,3 мг на 1 г использованной сырой биомассы клеток.

Получившуюся суспензию экзосом хранят при +4 °С в течение 1-2 суток или замораживают при -86 °С для долговременного хранения.

Заявляемое изобретение позволяет с помощью каллусной культуры винограда, культивируемой in vitro на питательных средах, получать большое количество растительных экзосом, что может быть использовано для медицинской и косметической промышленности.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения экзосом винограда, которые могут быть использованы в медицинской и косметической промышленности. Способ получения экзосом винограда, включающий подготовку исходного материала и его гомогенизацию, последовательное центрифугирование в два этапа, отбор жидкой фазы и ее ультрацентрифугирование, суспендирование полученного осадка растительных экзосом в буфере и повторное ультрацентрифугирование при тех же условиях, при этом в качестве исходного материала используют биомассу каллусной культуры клеток винограда, которую гомогенизируют с фосфатным буфером при их соотношении 1 г:5 мл – 1 г:15 мл, полученную гомогенизированную смесь центрифугируют в течение 19-21 минут при 9000-11000g, далее повторно центрифугируют супернатант в течение 19-21 минут при 19000-21000g, жидкую фазу пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и ультрацентрифугируют ее в течение 59-61 минут при 90000-110000g, полученный осадок экзосом винограда суспендируют в фосфатном буфере, причем на 1 г биомассы каллусной культуры клеток винограда берут 0,9-1,1 мл фосфатного буфера и повторно ультрацентрифугируют в течение 59-61 минут при 90000-110000g. Вышеописанный способ расширяет ассортимент используемого исходного материала, обладающего более стандартизированными свойствами, обеспечивает получение экзосом винограда: со средним размером 200-350 нм; с более узким диапазоном значений поверхностного заряда (дзета-потенциала), что способствует повышению однородности; с выходом не менее 4,4 мг на 1 г использованной сырой биомассы клеток. 3 ил., 3 пр.

Способ получения экзосом винограда, включающий подготовку исходного материала и его гомогенизацию, последовательное центрифугирование в два этапа, отбор жидкой фазы и ее ультрацентрифугирование, суспендирование полученного осадка растительных экзосом в буфере и повторное ультрацентрифугирование при тех же условиях, отличающийся тем, что в качестве исходного материала используют биомассу каллусной культуры клеток винограда, которую гомогенизируют с фосфатным буфером при их соотношении 1 г:5 мл – 1 г:15 мл, полученную гомогенизированную смесь центрифугируют в течение 19-21 минут при 9000-11000g, далее повторно центрифугируют супернатант в течение 19-21 минут при 19000-21000g, жидкую фазу пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и ультрацентрифугируют ее в течение 59-61 минут при 90000-110000g, полученный осадок экзосом винограда суспендируют в фосфатном буфере, причем на 1 г биомассы каллусной культуры клеток винограда берут 0,9-1,1 мл фосфатного буфера, и повторно ультрацентрифугируют в течение 59-61 минут при 90000-110000g.