Способ выделения экзосом из кондиционированной среды культуры клеток Российский патент 2021 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, а именно к методам выделения экзосом для анализа микроРНК.

Экзосомы представляют собой внеклеточные везикулы диаметром 30-150 нанометров, которые выделяются в межклеточное пространство клетками различных тканей. Их особенность заключается в том, что они несут в себе ряд молекул, таких как фрагменты ДНК, различные типы РНК, белков и продукты метаболизма. С точки зрения диагностики, перспективно исследование микроРНК, малых некодирующих молекул РНК длиной 18-25 нуклеотидов, которые принимают участие в регуляции экспрессии генов. Для анализа микроРНК необходимо выделить экзосомы. До сих пор нет стандартизированного способа выделения экзосом, который был бы доступен большинству молекулярных лабораторий и обладал должной эффективностью.

В настоящее время есть несколько способов выделения экзосом. В результате проведенного патентного поиска нами были выявлены следующие прямые аналоги:

Способ выделения экзосом с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) 10000. Сначала 25 г ПЭГ 10000 растворяли в 50 мл деионизированной воды путем ультразвукового воздействия в течение 1 часа для получения гомогенного водного раствора. Раствор ПЭГ центрифугировали при 5000 g в течение 20 минут при 4°С, полученный супернатант фильтровали через фильтр 0,22 мкм. Затем данный раствор ПЭГ смешивали с HeLa клеточной культурой до концентрации ПЭГ 10%. После инкубации при 4°С в течение 30 минут образцы центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут. Выпавший осадок с экзосомами был суспендирован в фосфатно-солевой буфер (ФСБ), снова смешан с раствором ПЭГ до концентрации ПЭГ 10%. После инкубации при +4°С в течение 30 минут, образцы центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут. Полученный осадок дополнительно собирался и ультрацентрифугировался при 120000 g в течение 2 часов. Супернатант осторожно удаляли, осадок промывали 20 мл раствора фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Второй этап ультрацентрифугирования проводился с теми же параметрами /1, Effective Isolation of Exosomes by Polyethylene Glycol from_Cell Culture Supernatant for In-depth Proteome Profiling. / Weng, Y., Sui, Z., Shan, Y., et al. // Analyst. - 2016. - P. 4640-4646/. Недостатком данного способа является длительность выделения экзосом (более 7 часов) и использование для фильтрации клеточного дебриса дорогие фильтры с размером пор 220 нм.

Другим способом выделения экзосом является способ с применением ПЭГ 6000. Перед выделением экзосом клеточную среду с 10% фетальной бычьей сывороткой предварительно ультрацентрифугировали при 100000 g в течение 20 часов (4°С). 2 миллиона клеток линии HEK293T были высеяны на приготовленную клеточную среду, где они росли в течение 4 дней. Далее клетки в течение 2 дней были инкубированы при 37°С в атмосфере с 5% содержанием углекислого газа. После 2 дней роста клетки 1 раз промывали ФСБ, нагретым до 37°С. Затем в течение 2 дней клетки, культивировали в бессывороточной среде. Для приготовления раствора ПЭГ использовался ПЭГ 6000, который смешивали с отфильтрованной в системе очистки ELGA Purelab flex водой и хлоридом натрия (1 М) для получения 2х-концентрированного раствора ПЭГ. Непосредственно перед смешиванием с раствором ПЭГ приготовленная клеточная культура центрифугировалась при 500 g 5 минут, а затем при 2000 g 30 минут, при 4°С. После центрифугирования среду добавляли в равный объем 2х-концентрированного раствора ПЭГ при 4°С до достижения концентрации ПЭГ от 5 до 15%. Раствор тщательно перемешивали путем переворачивания. Далее он был инкубирован при 4°С на ночь (по меньшей мере, 12 часов). На следующий день образцы центрифугировали в настольной центрифуге на максимальной скорости в течение 1 часа при 4°С. Затем конические пробирки декантировали и давали стечь в течение 5 минут, периодически постукивая, чтобы удалить избыток ПЭГ. Полученный осадок суспендировали в 50-500 мкл ФСБ без частиц (рН 7,4). Подмножества образцов затем либо хранили при -80, либо дополнительно очищали с помощью осаждения ПЭГ во 2 раз, используя более низкую концентрацию ПЭГ, или путем повторного суспендирования в ФСБ и центрифугирования при 100000 g /2, ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. / Rider, M.A., Hurwitz, S.N., Meckes, D.G., et al. // Nature Scientific Reports. - 2016. - P.l-14/. Недостатком данного метода является использование в качестве клеточной среды очищенной фетальной бычьей сыворотки, что увеличивает время и стоимость одного выделения.

Среди косвенных аналогов были найдены следующие: Патент РФ №2678988 /3/. Способ характеризуется тем, что к полученному супернатанту последовательно добавляют раствор, содержащий NaCl до конечной концентрации 0,48-0,6М в плазме крови, затем раствор, содержащий 1М Tris НС1 рН 7.0 до конечной концентрации 50 мМ, далее, к полученному раствору добавляют декстран синий с мол. массой 2000 кДа до конечной концентрации 4-8 мкг/мл, и ПЭГ с мол. массой 20 кДа, до конечной концентрации 1,5-5,0%. Недостатками способа являются высокое содержание в целевом продукте частиц неэкзосомального происхождения (диаметром более 150 нм), ограниченное количество экзосом, выделенных из сыворотки крови.

Патент РФ №2608509 /4/. Способ получения экзосом из крови, в котором кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию с помощью центрифугирования при 600 g в течение 20 минут. Клеточную фракцию подвергают последовательной обработке буферным раствором ФСБ при рН 7,4, инкубации в течение 15 минут с последующим центрифугированием в течение 25 минут при 600 g, и сбором первого супернатанта. Затем проводят встряхивание с последующим центрифугированием в течение 10 минут при 500 g, и сбор второго супернатанта. Фильтрацию и ультрацентрифугирование выполняют одновременно с помощью ультрацентрифужных фильтровальных пробирок. Недостатками способа являются длительность выделения экзосом (более 6 часов), ограниченное количество экзосом, выделенных из сыворотки крови, присутствие в растворе и других везикул.

Патент РФ №2556825 /5/. Кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию. Далее клеточную фракцию крови подвергают последовательной двухстадийной обработке сначала буферным раствором ФСБ, содержащим 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), с последующим центрифугированием и сбором супернатанта. Обрабатывают клетки равным объемом 0,15-0,35% раствора трипсина в ФСБ, с последующим центрифугированием и сбором супернатанта. Плазму и полученные супернатанты из клеточной фракции объединяют, удаляют клеточный дебрис центрифугированием при 15000-17000 g в течение 10-20 минут. Удаляют примесь частиц не экзосомального происхождения путем фильтрации через фильтры с диаметром пор 0,1 мкм, а суммарный пул экзосом осаждают ультрацентрифугированием при 100000-160000 g в течение 60-120 минут. Недостатками данного способа являются недостаточный выход и чистота целевого продукта, а также высокая стоимость его выделения.

Технической проблемой, решаемой данным изобретением, является создание способа выделения экзосом из кондиционированной среды культуры клеток, доступного в осуществлении, не требующего больших материальных затрат, проводимого в короткие сроки и с выделением экзосом размерами до 150 нм.

Сущность изобретения заключается во взятии кондиционированной бессывороточной среды от культур клеток меланомы человека, центрифугировании кондиционированной среды при 5000 g в течение 30 минут, изъятии надосадочной жидкости с помощью микропипетки, центрифугировании надосадочной жидкости при 12000 g в течение 90 минут, удалении надосадочной жидкости, ресуспендировании осадка, смешивании получившегося образца с 16% раствором ПЭГ 6000, инкубировании раствора, его центрифугировании при 1500 g в течение 30 минут, удалении надосадочной жидкости и ресуспендировании осадка.

Изобретение поясняется рисунками.

Фиг. 1. Экспериментальный образец из группы №2 с молекулярной массой ПЭГ 6000 16%. Исследование путем сканирующей электронной микроскопией, увеличение 51 000. Выявлены микровезикулы шарообразной формы, размером 46-71 нм, что соотносится с размерами экзосом.

Фиг. 2. Экспериментальный образец из группы №2 с молекулярной массой ПЭГ 6000 16%. Исследование путем сканирующей электронной микроскопией, увеличение 25000. Выявлены микровезикулы шарообразной формы, размером 46-71 нм, что соотносится с размерами экзосом.

Фиг. 3. Экспериментальный образец из группы №3 с молекулярной массой ПЭГ 6000 32%. Исследование путем сканирующей электронной микроскопией, увеличение 17000. В образцах обнаружено множество полиморфных объектов, различных размеров, из-за чего невозможно обнаружить микровезикулы.

Фиг. 4. Экспериментальный образец из группы №1 с молекулярной массой ПЭГ 6000 8%. Исследование путем сканирующей электронной микроскопией, увеличение 20000. Выявлено незначительное количество образований различной формы и размеров. Экзосомы не обнаружены.

Фиг. 5. Контрольный образец из группы №2 с молекулярной массой ПЭГ 6000 8%. Исследование путем сканирующей электронной микроскопией, увеличение 32100. Выявлено незначительное количество образований различной формы и размеров. Экзосомы не обнаружены.

Было проведено исследование выделения экзосом с помощью преципитации полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ 6000) в различных концентрациях.

Способ осуществлялся следующим образом.

Культура клеток меланомы человека после очищения от клеточного дебриса и микровезикул путем отмывки в ФСБ, была переведена на бессывороточную питательную среду для исключения попадания в кондиционированную среду микровезикул из сыворотки крови. Через 3 дня культивирования из флакона с культурой клеток была изъята кондиционированная среда в объеме 15 мл, которая была разделена на 3 группы по 5 мл в каждой. В качестве контроля для каждой группы использовали образец с деионизированной водой. Общее количество образцов - 6.

Далее образцы были центрифугированы при 5000 g в течение 30 минут, при 4°С, после чего с помощью микропипетки надосадочная жидкость была изъята. Затем образцы подвергались повторному центрифугированию при 17000 g в течение 1,5 часов, при 4°С. Удалив надосадочную жидкость из образцов, мы получили осадок, который был ресуспендирован в 30 мкл ФСБ. Затем полученные образцы были смешаны с раствором ПЭГ 6000 в ФСБ, и были разделены на 3 группы, в зависимости от массовой доли ПЭГ 6000 в растворе: для первой группы доля ПЭГ 6000 составила 8%, для второй - 16%, для третьей - 32%. Объемное соотношение образцов к ПЭГ 6000 составляло 1:1. В таком виде образцы инкубировались при 4°С в течение 1 часа и периодически перемешивались с помощью вортекс-центрифуги. Далее образцы центрифугировались при 1500 g в течение 30 минут, при температуре 4°С, для осаждения ПЭГ 6000 с адсорбированными на его поверхности экзосомами. После удаления надосадочной жидкости, осадок ресуспендировали в 300 мкл ФСБ.

Для визуализации экзосом использовалась сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Приготовление образцов к СЭМ осуществлялось по следующему протоколу: центрифугирование при 1500 g в течение 15 минут, удаление надосадочной жидкости, ресуспендирование осадка в 300 мкл 3,2% раствора глутарового альдегида, инкубирование полученных растворов в течение 50 минут при температуре 4°С, центрифугирование при 1500 g в течение 15 минут, удаление надосадочной жидкости, ресуспендирование осадка в 300 мкл ФСБ, центрифугирование растворов при 1500 g в течение 15 минут, удаление надосадочной жидкости, повторное ресуспендирование в 300 мкл ФСБ, центрифугирование при 1500 g в течение 15 минут и удаление надосадочной жидкости. После осадок ресуспендировался в 300 мкл ФСБ. Получившиеся образцы наносили на предварительно обезжиренную с помощью этилового спирта алюминиевую фольгу и оставляли на 17 часов при комнатной температуре (24°С). После фольгу с образцами последовательно помещали на 5 минут в 50% этиловый спирт, на 5 минут в 70% этиловый спирт, на 10 минут в 96% этиловый спирт, на 10 минут в 100% этиловый спирт, на 10 минут в ацетон, на 2 минуты в амилацетат для удаления лишних органических соединений. Затем фольга с образцами подвергалась сушке в критической точке CO₂ (SPI-Dry Critical Point Dryer, США) для удаления остатков жидкости. Образцы перед исследованием напыляли слоем золота (SPI Module™ Sputter Coater, США), после чего они исследовались при помощи сканирующей электронной микроскопии (Hitachi-S3400N, Япония).

По результатам СЭМ была определена оптимальная массовая доля ПЭГ 6000 в растворе ФСБ для выделения экзосом из кондиционированной среды - 16%. При этой массовой доле ПЭГ 6000 были обнаружены микровезикулы шарообразной формы, размером 46-71 нм, что соотносится с размерами экзосом (Фиг. 1, Фиг. 2). При массовой доле ПЭГ 6000 32% в образцах обнаружено множество полиморфных объектов, различных размеров, из-за чего невозможно обнаружить микровезикулы (Фиг. 3). При массовой доле ПЭГ 6000 8% экзосомы не были обнаружены (Фиг. 4). В контрольных образцах всех групп не было обнаружено экзосом (Фиг. 5).

Пример осуществления способа.

Культура клеток меланомы человека после очищения от клеточного дебриса и микровезикул путем отмывки в ФСБ, была переведена на бессывороточную питательную среду для исключения попадания в кондиционированную среду микровезикул из сыворотки крови. Через 3 дня культивирования из флакона с культурой клеток была изъята кондиционированная среда в объеме 15 мл, которую центрифугировали при 5000 g в течение 30 минут, при 4°С. После этого с помощью микропипетки была изъята надосадочная жидкость, которую вторично подвегли центрифугированию при 12000 g в течение 90 минут, при 4°С. Затем надосадочная жидкость была удалена, а осадок ресуспендирован в 30 мкл ФСБ. Получившийся образец смешали с 16% раствором ПЭГ 6000 в соотношении 1:1, инкубировали в течение 1 часа при 4°С с периодическим перемешиванием, центрифугировали раствор при 1500 g в течение 30 минут, при 4°С, удаляли надосадочную жидкость и ресуспендировали осадок в 300 мкл ФСБ.

Технический результат использования способа:

1. Возможность выделения экзосом из кондиционированной среды, в отличие от указанных аналогов, выявленных при патентном поиске.

2. Низкая стоимость реагентов на одно выделение экзосом. Себестоимость метода при оценке с существующими аналогами в 2-2,5 раза меньше, при расчете на одно выделение.

3. Простота способа: протокол выделения экзосом не требует специального дорогостоящего оборудования.

4. Быстрота выполнения - 4 часа.

Литература

1. Effective Isolation of Exosomes by Polyethylene Glycol from_Cell Culture Supernatant for In-depth Proteome Profiling. / Weng, Y., Sui, Z., Shan, Y., et al. // Analyst. - 2016. - P. 4640-4646.

2. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. / Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G., et al. // Nature Scientific Reports. - 2016. - P. 1-14.

3. Патент №2678988 C1. Коношенко Мария Юрьевна, Лехнов Евгений Анатольевич, Брызгунова Ольга Евгеньевна и др. Способ выделения внеклеточных везикул из биологических жидкостей. Дата начала действия патента: 5.03.2018.

4. Патент №2608509 С1. Кастарнова Елена Сергеевна, Оробец Владимир Александрович. Способ получения экзосом из крови. Дата начала действия патента: 11.02.2016.

5. Патент №2556825 С1. Тамкович Светлана Николаевна, Лактионов Павел Петрович, Тутанов Олег Сергеевич и др. Способ получения экзосом из крови. Дата начала действия патента: 15.09.2014.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ выделения экзосом из кондиционированной бессывороточной среды культуры клеток, включающий в себя взятие кондиционированной среды от культур клеток, ее центрифугирование при 5000 g в течение 30 минут при 4°С, отделении надосадочной жидкости, ее центрифугирование при 12000 g в течение 90 минут при 4°С, повторное удаление надосадочной жидкости, ресуспендирование осадка, смешивание получившегося образца с 16% по массовой доле раствором полиэтиленгликоля 6000 в соотношении 1:1, инкубирование полученной смеси в течение 1 часа при 4°С с периодическим перемешиванием, центрифугирование получившегося раствора при 1500 g в течение 30 минут при 4°С, удаление надосадочной жидкости и ресуспендирование осадка в 300 мкл ФСБ, выделение экзосом. Изобретение позволяет выделить экзосомы из кондиционированной среды и ускорить процесс выделения экзосом. 5 ил.

Способ выделения экзосом из кондиционированной бессывороточной среды культуры клеток, включающий в себя взятие кондиционированной среды от культур клеток, ее центрифугирование при 5000 g в течение 30 минут при 4°С, отделение надосадочной жидкости, ее центрифугирование при 12000 g в течение 90 минут при 4°С, повторное удаление надосадочной жидкости, ресуспендирование осадка, смешивание получившегося образца с 16% по массовой доле раствором полиэтиленгликоля 6000 в соотношении 1:1, инкубирование полученной смеси в течение 1 часа при 4°С с периодическим перемешиванием, центрифугирование получившегося раствора при 1500 g в течение 30 минут при 4°С, удаление надосадочной жидкости и ресуспендирование осадка в 300 мкл ФСБ, выделение экзосом.