Способ подавления метастазирования опухолей Российский патент 2019 года по МПК A61K9/08 A61K35/14 A61P35/04 

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и может быть использовано для лечения пациентов с диагнозом - рак.

Известен способ иммунотерапии опухолей, заключающийся в приеме пациентом экзомсодержащего препарата per os (патент: RU 2593003 С2, опубл. 27.07.2016, МПК A61K 35/54, А61Р 35/00, А61Р 37/00), в котором для лечения пациентов с онкологическими заболеваниями используют экзосомы, выделенные культурой клеток K562/i-S9, что не позволяет получить специфические экзосомы, вследствие чего не удается достигнуть высокой эффективности иммунного ответа, в отличие от экзосом, продуцируемых собственными опухолевыми клетками пациента - которые содержат специфические антигены, сходные с антигенами опухолевых клеток, ввиду чего позволяют достигнуть высоко эффективного иммунного ответа, в следствие чего известный способ недостаточно эффективен.

Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего способа, является повышение эффективности лечения пациентов с диагнозом рак.

Указанный технический результат достигается тем, что при реализации способа подавления метастазирования опухолей, согласно настоящему изобретению, для пациента с диагнозом - рак получают образец его биоматериала, содержащий опухолевые клетки, затем из полученного образца выделяют опухолевые клетки с выделением от них супернатанта, который далее культивируют в культуральной среде следующего состава: среда DMEM/F12 1:1с HEPES с добавлением 2 ммоль/мл или 3,65 мг/10 мл L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10% эмбриональной сыворотки, в условиях Т=37°С и 5% CO2 в течение 48-72 часов, затем выделяют из полученной культуральной среды экзосомосодержащий осадок, растворяют его в фосфатно-солевом буфере в соотношении 1:5-1:20, и далее полученный раствор вводят пациенту перорально.

Известно, что экзосомы причастны к различным этапам иммунных реакций, в частности, экзосомы, выделяемые В-клетками, несут на своей поверхности рецепторы МНС II (главного комплекса гистосовместимости II), костимулирующие и адгезируюшие молекулы, что свидетельствует об их способности непосредственно стимулировать CD4 позитивные Т-клетки. [В lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Raposo G, Nijman HW, Stoorvogel W, Liejendekker R, Harding CV, Melief С J, Geuze HJ J Exp Med. 1996 Mar 1; 183(3): 1161-72.] Для усиления этого эффекта экзосомы концентрируют, например, с помощью магнитных бидсов и нагружают пептидами. Наряду со способностью активировать CD4 позитивные клетки, экзосомы, полученные от дендритных клеток и пулированные пептидами процессированных антигенов опухоли, способны активировать опухоль-специфические цитотоксические лимфоциты и тем самым подавлять рост опухоли. [Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes. Zitvogel L, Regnault A, Lozier A, Wolfers J, Flament C, Tenza D, Ricciardi-Castagnoli P, Raposo G, Amigorena S Nat Med. 1998 May; 4(5):594-600.]

Таким образом, экзосомы, выделяемые опухолевыми клетками, также выступают в роли активаторов иммунной системы, однако с течением опухолевого процесса происходят трансформации, позволяющие атипичным клеткам избегать действия иммунокомпетентных клеток, к одной из подобных трансформаций относится неспособность лимфоцитов воспринимать экзосомы в качестве носителей опухолевого генетического материала. При использовании экзосом per os, полученных от пациента, происходит контакт между клетками иммунной системы и экзосомами, синтезированными опухолевыми клетками, что способно привести к активации противоопухолевого иммунитета.

В качестве образца биоматериала предпочтительно использование венозной крови пациента, однако возможно использование и периферической крови пациента или опухолевой ткани, полученной интраоперационно, или асцистической / плевритной жидкости метастатического генеза, при этом в заявленном способе будет различаться процедура выделения опухолевых клеток с выделением от них супернатанта (данная процедура реализуется любым известным способом).

При использовании в качестве образца биоматериала венозной крови пациента предпочтительно выделение опухолевых клеток с выделением от них супернатанта реализовать следующим образом: забор венозной крови производят в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА, далее полученную кровь разбавляют в 2 раза раствором Хэнкса, после чего наслаивают на раствор фиколла-урографина плотностью 1,077 г/см² в соотношении 1:4, далее проводят центрифугирование при 4°С на 2000 об/мин в течение 15 минут, затем собирают образовавшееся в ходе центрифугирования интерфазное кольцо к которому добавляют фосфатно-солевой буфер в соотношении 1:10-1:15 и далее подвергают центрифугированию при 1500 об/мин в течение 10 минут, затем отделяют осадок к которому добавляют 1-2 мл лизирующего раствора и выдерживают полученную смесь в течение 10 минут при 15-25°С, далее к смеси добавляют фосфатно-солевой буфер в соотношении 1:10 и перемешивают, после чего подвергают центрифугированию при 1500 об/мин в течение 10 минут, затем сливают супернатант и к осадку добавляют 3-4 мл фосфатно-солевого буфера, дополнительно содержащего 0,9М CaCl2 и перемешивают, далее из полученной суспензии выделяют опухолевые клетки в виде осадка посредством пропускания ее через микротрубку, затем полученный осадок с опухолевыми клетками культивируют в культуральной среде следующего состава: среда 79% RPMI, 20% FBS, 1% раствор пенициллина стрептомицина, в условиях Т=37°С и 5% CO2 в течение 72 часов, при этом каждые 24 часа отбирают супернатант, а к оставшемуся осадку добавляют культуральную среду следующего состава: среда 79% RPMI, 20% FBS, 1% раствор пенициллина стрептомицина, в объеме отобранного супернатанта.

Преимуществом такого способа выделения опухолевых клеток является возможность получить максимально в количественном отношении возможный пул опухолевых клеток с сохранением их жизнеспособности и стерильности. Наряду с этим данный способ позволяет с минимальными для опухолевых клеток потерями избавиться от клеток, не попадающих в интересующий пул, таких как эритроциты, лейкоциты и отчасти тромбоциты. Использование определенного рода ферментов, таких как аккутаза, позволяет минимизировать повреждение клеточных поверхностных рецепторов и антигенных детерминант. Условия центрифугирования подобраны таким образом, чтобы позволять дифференцировать дебрис (обломки клеток и продукты распада) с экзосомами от клеток, на этапах работы с супернатантом, содержащим осадок с обломками клеток, продуктами распада и экзосомами, описанные условия работы позволяют получить из всего осадка фракцию с наиболее высоким содержанием экзосом.

Преимущественно выделение из полученной культуральной среды экзосомосодержащего осадка осуществить путем дифференциального центрифугирования, а именно: центрифугируют полученную культуральную среду при 3000 об/мин в течение 10 мин., затем собирают образовавшийся супернатант далее проводят центрифугирование при 10000 об/мин в течение 30 минут, затем отбирают образовавшийся супернатант и проводят ультрацентрифугирование при 100000 об/мин в течение 2-х часов, далее отделяют образовавшийся осадок.

Такой способ выделения экзосом позволяет максимально сконцинтрировать экзосомы и добиться очистки от фрагментов клеток, органелл и протеинов.

Алгоритм заявленного способа:

Получают образец биоматериала, содержащий опухолевые клетки, пациента с диагнозом- рак, а именно - образец венозной крови. Затем из полученного образца выделяют опухолевые клетки с выделением от них супернатанта: забор венозной крови производят в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА, далее полученную кровь разбавляют в 2 раза раствором Хэнкса, после чего наслаивают на раствор фиколла-урографина плотностью 1,077 г/см² в соотношении 1:4, далее проводят центрифугирование при 4°С на 2000 об/мин в течение 15 минут, затем собирают образовавшееся в ходе центрифугирования интерфазное кольцо к которому добавляют фосфатно-солевой буфер в соотношении 1:10-1:15 и далее подвергают центрифугированию при 1500 об/мин в течение 10 минут, затем отделяют осадок к которому добавляют 1-2 мл лизирующего раствора и выдерживают полученную смесь в течение 10 минут при 15-25°С, далее к смеси добавляют фосфатно-солевой буфер в соотношении 1:10 и перемешивают, после чего подвергают центрифугированию при 1500 об/мин в течение 10 минут, затем сливают супернатант и к осадку добавляют 3-4 мл фосфатно-солевого буфера, дополнительно содержащего 0,9М CaCl2 и перемешивают, далее из полученной суспензии выделяют опухолевые клетки в виде осадка посредством пропускания ее через микротрубку, затем полученный осадок с опухолевыми клетками культивируют в культуральной среде следующего состава: среда 79% RPMI, 20% FBS, 1% раствор пенициллина стрептомицина, в условиях Т=37°С и 5% CO2 в течение 72 часов, при этом каждые 24 часа отбирают супернатант, а к оставшемуся осадку добавляют культуральную среду следующего состава: среда 79% RPMI, 20% FBS, 1% раствор пенициллина стрептомицина, в объеме отобранного супернатанта. Полученный супернатант с опухолевыми клетками культивируют в культуральной среде следующего состава: среда DMEM/F12 1:1 с HEPES с добавлением 2 ммоль/мл или 3,65 мг/10 мл L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10% эмбриональной сыворотки, в условиях Т=37°С и 5% CO2 в течение 48-72 часов, затем выделяют из полученной культуральной среды экзосомосодержащий осадок путем дифференциального центрифугирования, а именно: центрифугируют полученную культуральную среду при 3000 об/мин в течение 10 мин., затем собирают образовавшийся супернатант далее проводят центрифугирование при 10000 об/мин в течение 30 минут, затем отбирают образовавшийся супернатант и проводят ультрацентрифугирование при 100000 об/мин в течение 2-х часов, далее отделяют образовавшийся осадок. Полученный экзосомосодержащий осадок растворяют в фосфатно-солевом буфере в соотношение 1:5-1:20, и далее полученный раствор вводят пациенту перорально.

Пример реализации заявленного способа:

Пациент, 14 лет, школьник, анамнез без особенностей, острый В лимфобластный лейкоз, цитогенетический вариант t (1;19)(q23;р13), Е2А/РВХ1. В пунктате костного мозга бласты (CD19+, CD79+, CD22cyt+, TdT+, HLADR+) 17,5%, все лейкоцитарное звено превышает верхнюю границу нормы, более всего повышены нейтрофильные метамиелоциты (до 67%), миелобласты не определяются. В гемограмме определяются бластные клетки 9%, метамиелоциты 3%, эритропения до 2,9*10^∧12/л, лейкопения 2,3*10^∧9/л. На этапе поддерживающей терапии наряду с 6-меркаптопурином проводился прием экзосом per os, полученных из аутологичных опухолевых клеток, 2 раза в неделю.

Спустя 2 месяца после приема препарата и на поддерживающей терапии у пациента наблюдается снижение лейкопении с 2,3*10^∧9 / л до 3,1*10^∧9/л, что свидетельствует о постепенном повышении доли зрелых лейкоцитов в кровеносном русле; в пунктате костного мозга количество бластов снижается с 17,5% до 14%, в гемограмме перестают определяться бластные клетки. Среди иммунологических показателей наблюдается повышение цитотоксической активности NK (natural killer) клеток с 65% до приема препарата до 78% после приема препарата (при соотношении клеток-эффекторов к таргетнам клеткам 1:5). Данные изменения говорят в пользу улучшения состояния пациента и стабилизации процесса.

Опухолевые клетки были получены из венозной крови пациента, забор венозной крови производят в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА, далее полученную кровь разбавляют в 2 раза раствором Хэнкса, после чего наслаивают на раствор фиколла-урографина плотностью 1,077 г/см² в соотношении 1:4, далее проводят центрифугирование при 4°С на 2000 об/мин в течение 15 минут, затем собирают образовавшееся в ходе центрифугирования интерфазное кольцо к которому добавляют фосфатно-солевой буфер в соотношении 1:15 и далее подвергают центрифугированию при 1500 об/мин в течение 10 минут, затем отделяют осадок к которому добавляют 2 мл лидирующего раствора и выдерживают полученную смесь в течение 10 минут при 15°С, далее к смеси добавляют фосфатно-солевой буфер в соотношении 1:10 и перемешивают, после чего подвергают центрифугированию при 1500 об/мин в течение 10 минут, затем сливают супернатант и к осадку добавляют 4 мл фосфатно-солевого буфера, дополнительно содержащего 0,9М CaCl2 и перемешивают, далее из полученной суспензии выделяют опухолевые клетки в виде осадка посредством пропускания ее через микротрубку, затем полученный осадок с опухолевыми клетками культивируют в культуральной среде следующего состава: среда 79% RPMI, 20% FBS, 1% раствор пенициллина стрептомицина, в условиях Т=37°С и 5% CO2 в течение 72 часов, при этом каждые 24 часа отбирают супернатант, а к оставшемуся осадку добавляют культуральную среду следующего состава: среда 79% RPMI, 20% FBS, 1% раствор пенициллина стрептомицина, в объеме отобранного супернатанта. выделение из полученной культуральной среды экзосомосодержащего осадка осуществить путем дифференциального центрифугирования, а именно: центрифугируют полученную культуральную среду при 3000 об/мин в течение 10 мин., затем собирают образовавшийся супернатант далее проводят центрифугирование при 10000 об/мин в течение 30 минут, затем отбирают образовавшийся супернатант и проводят ультрацентрифугирование при 100000 об/мин в течение 2-х часов, далее отделяют образовавшийся осадок.

1.1. Для создания опухолевой модели, направленной на изучение процессов метастазирования и активации иммунного ответа, были взяты иммунокомпетентные мыши-самцы линии C57BL/6 возрастом не более 4 нед., n=27. В хвостовую вену всем животным были введены по 1×105 клеток мышиной меланомы линии F10/B16 в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS, 100 000 клеток / 0,1 мл PBS). Процесс метастазирования до момента воздействия происходил в течение 8 дней.

1.2. Для приготовления препарата клетки мышиной меланомы линии F10/B16 были разморожены и культивировались в течение 72 ч до достижения количества в 6000000, после чего были процентрифугированы при 3000 об/мин, супернатант передан Заказчику для подготовки Препарата.

1.3. Животных разделили на 3 группы: №1 (в/в введение), №2 (пероральное введение), №3 (контроль).

1.4. Мыши содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к брикетированному корму и воде. На 8-й и на 11-й день с момента инакуляции проводили введение Препарата:

- группе №1 вводили в хвостовую вену 100 мкг Препарата

- группе №2 вводили перорально 100 мкг Препарата

- группе №3 вводили в хвостовую вену 100 мкг чистого PBS (без Препарата)

Забой происходил методом цервикальной дислокации через 16 дней после инакуляции опухолевых клеток. С целью оценки метастатического процесса проводилась визуальная оценка наличия и числа метастаз в печени и замерялась ее масса. Статистическая значимость оценивалась с помощью одностороннего анализа дисперсии в программе SPSS 22.

- Среднее количество метастазов в печени в группе №1: 5,5+-0,5. Средняя масса печени: 1,2+-0,1

- Среднее количество метастазов в печени в группе №2: 3,8+-0,3. Средняя масса печени: 1,1+-0,2

- Среднее количество метастазов в печени в группе №3: 9,0+-2,1. Средняя масса печени: 1,4+-0,2

Отличия количества метастазов в группах наблюдения от контроля достоверно (р<0,05). Различие в количестве метастаз между группами 1 и 2 на грани достоверности (р<0,1). Масса печени в группах наблюдения и в контроле различалась недостоверно (р>0,05).

С целью оценки активации иммунной системы из селезенок животных были выделены спленоциты, в которых определялся процент цитотоксических Т-лимфоцитов CD8+ при помощи метода проточной цитометрии. С этой целью после выделения спленоциты отмывали в PBS и инкубировали в течение часа при 4С с антителами antiCD8, с дальнейшим анализом на проточном цитофлюориметре Beckman&Dickinson.

В группе №1 средний процент Т-лимфоцитов CD8+: 27%

В группе №2 средний процент Т-лимфоцитов CD8+: 36%

В группе №2 средний процент Т-лимфоцитов CD8+: 17%

Значения «наблюдение-контроль» отличаются достоверно (р<0,05). Различие между группами 1 и 2 достоверно (р<0,05).

Применение Препарата перорально ингибирует процесс метастазирования более выраженно, чем применение внутривенно. Аналогичные наблюдения отмечены при анализе степени активации иммунной системы. Возможно, процесс связан с макрофаг-опосредованной антиген-презентацией опухоли Т-киллерам.

Изобретение относится к медицине и касается способа подавления метастазирования раковых заболеваний, характеризующегося тем, что для пациента с диагнозом рак получают образец его биоматериала, содержащий опухолевые клетки. Затем из полученного образца выделяют опухолевые клетки с выделением от них супернатанта, который далее культивируют в культуральной среде следующего состава: среда DMEM/F12 1:1 с HEPES с добавлением 2 ммоль/мл или 3,65 мг/10 мл L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10% эмбриональной сыворотки, в условиях Т=37°C и 5% CO₂ в течение 48-72 ч. Затем выделяют из полученной культуральной среды экзосомосодержащий осадок, растворяют его в фосфатно-солевом буфере в соотношении 1:5-1:20 и далее полученный раствор вводят пациенту перорально. Изобретение обеспечивает повышение эффективности лечения пациентов с диагнозом рак. 3 з.п. ф-лы, 1 пр.

1. Способ подавления метастазирования раковых заболеваний, характеризующийся тем, что для пациента с диагнозом рак получают образец его биоматериала, содержащий опухолевые клетки, затем из полученного образца выделяют опухолевые клетки с выделением от них супернатанта, который далее культивируют в культуральной среде следующего состава: среда DMEM/F12 1:1 с HEPES с добавлением 2 ммоль/мл или 3,65 мг/10 мл L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10% эмбриональной сыворотки, в условиях Т=37°C и 5% CO₂ в течение 48-72 ч, затем выделяют из полученной культуральной среды экзосомосодержащий осадок, растворяют его в фосфатно-солевом буфере в соотношении 1:5-1:20 и далее полученный раствор вводят пациенту перорально.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве образца биоматериала используют венозную кровь.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что выделение опухолевых клеток с выделением от них супернатанта реализуют следующим образом: забор венозной крови производят в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА, далее полученную кровь разбавляют в 2 раза раствором Хэнкса, после чего наслаивают на раствор фиколла-урографина плотностью 1,077 г/см² в соотношении 1:4, далее проводят центрифугирование при 4°C на 2000 об./мин в течение 15 мин, затем собирают образовавшееся в ходе центрифугирования интерфазное кольцо, к которому добавляют фосфатно-солевой буфер в соотношении 1:10-1:15, и далее подвергают центрифугированию при 1500 об./мин в течение 10 мин, затем отделяют осадок, к которому добавляют 1-2 мл лизирующего раствора, и выдерживают полученную смесь в течение 10 мин при 15-25°C, далее к смеси добавляют фосфатно-солевой буфер в соотношении 1:10 и перемешивают, после чего подвергают центрифугированию при 1500 об./мин в течение 10 мин, затем сливают супернатант и к осадку добавляют 3-4 мл фосфатно-солевого буфера, дополнительно содержащего 0,9М CaCl₂, и перемешивают, далее из полученной суспензии выделяют опухолевые клетки в виде осадка посредством пропускания ее через микротрубку, затем полученный осадок с опухолевыми клетками культивируют в культуральной среде следующего состава: среда 79% RPMI, 20% FBS, 1% раствор пенициллина стрептомицина, в условиях Т=37°C и 5% CO₂ в течение 72 ч, при этом каждые 24 ч отбирают супернатант, а к оставшемуся осадку добавляют культуральную среду следующего состава: среда 79% RPMI, 20% FBS, 1% раствор пенициллина стрептомицина, в объеме отобранного супернатанта.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделение из полученной культуральной среды экзосомосодержащего осадка осуществляют путем дифференциального центрифугирования, а именно: центрифугируют полученную культуральную среду при 3000 об./мин в течение 10 мин, затем собирают образовавшийся супернатант, далее проводят центрифугирование при 10000 об./мин в течение 30 мин, затем отбирают образовавшийся супернатант и проводят ультрацентрифугирование при 100000 об./мин в течение 2 ч, далее отделяют образовавшийся осадок.