ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 61/774110, поданной 7 марта 2013 года, и предварительных заявок на патенты США №№ 61/774627; 61/774629; 61/774635; 61/774638; 61/774642; 61/774645; 61/774647; 61/774650; 61/774655 и 61/774659, каждая из которых была подана 8 марта 2013 года, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

Официальная копия данного перечня последовательностей отправлена в электронном виде с помощью EFS-Web как отформатированный под ASCII перечень последовательностей в файле с названием “APA13-6008US01_SEQLIST.txt”, созданном 5 марта 2014 г. и имеющем размер 411 килобайт, и подана одновременно с описанием. Перечень последовательностей, содержащийся в данном отформатированном под ASCII документе, является частью описания и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ НАСТОЯЩЕЕ ИЗОБРЕТНИЕ

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии. Представлены новые гены, которые кодируют пестицидные белки. Эти белки и последовательности нуклеиновых кислот, которые их кодируют, пригодны для получения пестицидных составов и для получения трансгенных растений, устойчивых к вредителям.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Bacillus thuringiensis представляет собой грамположительную спорообразующую почвенную бактерию, которая характеризуется своей способностью продуцировать кристаллические включения, которые специфично токсичны для определенных отрядов и видов насекомых, но безвредны для растений и других организмов, не являющихся мишенью. На основании этого композиции, включающие штаммы Bacillus thuringiensis или их инсектицидные белки, могут быть использованы в качестве экологически приемлемых инсектицидов для контроля насекомых-вредителей сельскохозяйственных культур или насекомых-переносчиков ряда заболеваний человека или животных.

Кристаллические (Cry) белки (дельта-эндотоксины), продуцируемые Bacillus thuringiensis, обладают выраженной инсектицидной активностью преимущественно по отношению к личинкам отрядов чешуекрылые, полужестокрылые, двукрылые и жесткокрылые. Эти белки также показали активность по отношению к вредителям отрядов Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga и Acari, а также других отрядов беспозвоночных, таких как Nemathelminthes, Platyhelminthes и Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. В руководстве Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., Нью-Йорк, Н.Й.). Эти белки первоначально классифицировали как CryI-CryV на основании главным образом их инсектицидной активности. Основными классами являлись Lepidoptera-специфичные (I), Lepidoptera- и Diptera-специфичные (II), Coleoptera-специфичные (III), Diptera-специфичные (IV) и специфичные к нематодам (V) и (VI). Белки дополнительно классифицировали на подсемейства; более близкородственным белкам в каждом семействе присваивали буквы разделов, такие как Cry1A, Cry1B, Cry1C, и т.д. Еще более близкородственным белкам в каждом разделе давали названия, такие как Cry1C1, Cry1C2, и т.д.

Для генов Cry была описана номенклатура на основании гомологии аминокислотной последовательности вместо специфичности к насекомым-мишеням (Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). В этой классификации каждому токсину присваивают уникальное обозначение, включающее основной таксономический уровень (арабская цифра), вторичный таксономический уровень (заглавная буква), третичный таксономический уровень (строчная буква) и четвертичный таксономический уровень (другая арабская цифра). В основном таксономическом уровне римские цифры заменили арабскими цифрами. Белки с идентичностью последовательности менее 45% имеют разные основные таксономические уровни, а критерии для вторичных и третичных таксономических уровней составляют 78 и 95%, соответственно.

Кристаллический белок не проявляет инсектицидной активности до тех пор, пока он не будет поглощен и солюбилизирован в средней кишке насекомого. В пищеварительном тракте насекомого, поглощенный протоксин гидролизуется протеазами до активной токсичной молекулы. (Höfte and Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Этот токсин связывается с рецепторами на апикальной поверхности щеточной каемки средней кишки личинки-мишени и встраивается в апикальную мембрану, образуя ионные каналы или поры, приводящие к гибели личинки.

Дельта-эндотоксины, как правило, обладают пятью доменами с консервативными последовательностями и тремя консервативными структурными доменами (см., например, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). Первый консервативный структурный домен состоит из семи альфа-спиралей и участвует во встраивании в мембрану и формировании пор. Домен II состоит из трех бета-складчатых слоев, расположенных в конфигурации "греческий ключ", и домен III состоит из двух антипараллельных бета-складчатых слоев в расположении "рулет с вареньем" (de Maagd et al., 2001, выше). Домены II и III участвуют в распознавании и связывании рецептора и поэтому считаются детерминантами специфичности токсина.

Помимо дельта-эндотоксинов, существует несколько других известных классов пестицидных белковых токсинов. Токсины VIP1/VIP2 (см., например, патент США № 5770696) представляют сбой бинарные пестицидные токсины, которые обладают сильной активностью по отношению к насекомым, как полагают, за счет включения механизма эндоцитоза, опосредованного рецептором, с последующей клеточной токсификацией, подобного способу действия других бинарных ("A/B") токсинов. Токсины А/B, такие как VIP, С2, CDT, CST или токсины B. anthracis, вызывающие отек или смерть, изначально взаимодействуют с клетками-мишенями посредством специфического связывания, опосредованного рецептором, компонентов "B" в виде мономеров. Эти мономеры затем образуют гомогептамеры. Затем комплекс "B" гептамер-рецептор действует как связывающая платформа, которая впоследствии связывает ферментативный(ферментативные) компонент(компоненты) "А" и обеспечивает его(их) перенос в цитозоль посредством эндоцитоза, опосредованного рецептором. После проникновения внутрь цитозоля клетки компоненты "А" ингибируют нормальную функцию клетки путем, например, АДФ-рибозилирования G-актина или повышения внутриклеточных уровней циклического АМФ (цАМФ). См. Barth et al. (2004) Microbiol Mol Biol Rev 68:373-402.

Интенсивное применение на полях инсектицидов на основе В. thuringiensis уже привело к устойчивости популяций капустной моли Plutella xylostella (Ferre and Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533). Самым распространенным механизмом устойчивости является снижение связывания токсина с его(их) специфическим(специфическими) рецептором(рецепторами) средней кишки. Это также может приводить к перекрестной устойчивости к другим токсинам, которые используют тот же рецептор (Ferre and Van Rie (2002)).

Из-за опустошения, которое наступает вследствие насекомых и необходимости улучшения урожайности путем контроля насекомых-вредителей существует постоянная необходимость разработки новых форм пестицидных токсинов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Представлены композиции и способы для придания пестицидной активности бактериям, растениям, клеткам, тканям и семенам растений. Композиции включают молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие последовательности пестицидных и инсектицидных полипептидов, векторы, содержащие такие молекулы нуклеиновой кислоты, и клетки-хозяева, содержащие векторы. Композиции также включают последовательности пестицидных полипептидов и антитела к таким полипептидам. Нуклеотидные последовательности могут быть использованы в ДНК-конструкциях или кассетах экспрессии для трансформации и экспрессии в организмах, в том числе микроорганизмах и растениях. Нуклеотидные или аминокислотные последовательности могут быть синтетическими последовательностями, которые были разработаны для экспрессии в организме, в том числе без ограничения микроорганизме или растении. Композиции также содержат бактерии, растения, клетки, ткани и семена растений, содержащие нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению.

В частности, представлены выделенные или рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют пестицидный белок. Дополнительно, охвачены аминокислотные последовательности, соответствующие пестицидному белку. В частности, в настоящем изобретении предусматривают выделенную или рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID №: 21-74, или нуклеотидную последовательность, изложенную в SEQ ID №: 1-20, а также ее биологически активные варианты и фрагменты. Также охвачены нуклеотидные последовательности, которые комплементарны нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению или которые гибридизуются с последовательностью по настоящему изобретению или комплементарны ей. Дополнительно представлены векторы, клетки-хозяева, растения и семена, содержащие нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению или нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности по настоящему изобретению, а также их биологически активные варианты и фрагменты.

Представлены способы получения полипептидов по настоящему изобретению, а также применения этих полипептидов для контроля или уничтожения чешуекрылого, полужесткокрылого, жесткокрылого, нематодного или двукрылого вредителя. Также включены способы и наборы для выявления в образце нуклеиновых кислот и полипептидов по настоящему изобретению.

Композиции и способы настоящего изобретения пригодны для получения организмов с улучшенной устойчивостью или толерантностью к вредителям. Эти организмы и композиции, содержащие организмы, подходят для сельскохозяйственных целей. Композиции по настоящему изобретению также пригодны для получения измененных или улучшенных белков, которые обладают пестицидной активностью, или для выявления присутствия пестицидных белков или нуклеиновых кислот в продуктах или организмах.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям и способам регуляции устойчивости или толерантности к вредителю в организмах, в частности, растениях или клетках растений. Под выражением "устойчивость" подразумевается, что вредитель (например, насекомое) погибает при проглатывании или другом контакте с полипептидами по настоящему изобретению. Под выражением "толерантность" подразумевается ухудшение или снижение подвижности, питания, размножения или других функций вредителя. Способы включают трансформацию организмов с помощью нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок по настоящему изобретению. В частности, нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению пригодны для получения растений и микроорганизмов, которые обладают пестицидной активностью. Таким образом, представлены трансформированные бактерии, растения, клетки растений, ткани и семена растений. Композиции представляют собой пестицидные нуклеиновые кислоты и белки Bacillus или других видов. Последовательности нуклеиновой кислоты находят применение в конструировании векторов экспрессии для последующей трансформации организмов, представляющих интерес, в качестве зондов для выделения других гомологичных (или частично гомологичных) генов и для получения измененных пестицидных белков с помощью способов, известных из уровня техники, таких как замена доменов или шаффлинг ДНК, например, с членами семейств эндотоксинов Cry1, Cry2 и Cry9.

Белки можно применять для контроля или уничтожения популяций чешуекрылых, полужесткокрылых, жестокрылых, двукрылых и нематодных вредителей и для получения композиций с пестицидной активностью.

Под выражением "пестицидный токсин" или "пестицидный белок" подразумевается токсин, который обладает токсичной активностью в отношении одного или нескольких вредителей, в том числе без ограничения членов отрядов Lepidoptera, Diptera, и Coleoptera или типа Nematoda, или белок, который обладает гомологичностью к такому белку. Пестицидные белки были выделены из других организмов, в том числе, например, Bacillus sp., Clostridium bifermentans и Paenibacillus popilliae. Пестицидные белки включают аминокислотные последовательности, выведенные из нуклеотидных последовательностей полной длины, раскрытых в настоящем документе, и аминокислотные последовательности, которые короче последовательностей полной длины либо вследствие применения альтернативного расположенного ниже сайта инициации, либо вследствие процессинга, при котором продуцируется более короткий белок, обладающий пестицидной активностью. Процессинг может происходить в организме, в котором экспрессируется белок, или во вредителе после поглощения белка.

Пестицидные белки охватывают дельта-эндотоксины. Дельта-эндотоксины включают белки, обозначаемые как cry1-cry72, cry1 и cyt2 и Cyt-подобный токсин. На сегодняшний день существует более 250 известных видов дельта-эндотоксинов с широким диапазоном специфичностей и токсичностей. Для расширенного перечня см. Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813, и регулярные обновления доступны на сайте, см. Crickmore et al. (2003) “Bacillus thuringiensis toxin nomenclature”, на www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.

Таким образом, в настоящем документе представлены новые выделенные или рекомбинантные нуклеотидные последовательности, которые обеспечивают пестицидную активность. Эти нуклеотидные последовательности кодируют полипептиды с гомологией к известным дельта-эндотоксинам или бинарным токсинам. Также представлены аминокислотные последовательности пестицидных белков. Белок, полученный после трансляции этого гена, позволяет клеткам контролировать или уничтожать вредителей, которые его поглощают.

Молекулы нуклеиновых кислот и их варианты и фрагменты

Один аспект настоящего изобретения относится к выделенным или рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие пестицидные белки и полипептиды или их биологически активные части, а также к молекулам нуклеиновых кислот, соответствующим для применения в качестве гибридизационных зондов для идентификации молекул нуклеиновых кислот, кодирующих белки с участками с гомологией последовательностей. Также, в настоящем документе охвачены нуклеотидные последовательности, способные к гибридизации с нуклеотидными последовательностями по настоящему изобретению при жестких условиях, как это определено в настоящем документе ниже. Подразумевается, что используемое в настоящем документе выражение "молекула нуклеиновой кислоты" включает молекулы ДНК (например, рекомбинантную ДНК, кДНК или геномную ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, полученные с применением нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК. Выражение “рекомбинантный” охватывает полинуклеотиды или полипептиды, которые были изменены относительно нативных полинуклеотида или полипептида таким образом, что полинуклеотид или полипептид отличается (например, по химическому составу или структуре) от таковых, встречающихся в природе. В другом варианте осуществления "рекомбинантный" полинуклеотид не содержит внутренних последовательностей (т.е., интронов), которые естественно встречаются в геномной ДНК организма, из которого получают полинуклеотид. Типичным примером такого полинуклеотида является так называемая комплементарная ДНК (кДНК).

Применяемая в настоящем документе выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота (или ДНК) относится к нуклеиновой кислоте (или ДНК), которая не длиннее таковой в своем естественном окружении, например, in vitro или в рекомбинантной бактериальной или растительной клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота не содержит последовательности (предпочтительно, последовательности, кодирующие белок), которые в естественных условиях фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е. последовательности, расположенные на 5′- и 3′-концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого получена нуклеиновая кислота. Для целей настоящего изобретения “выделенные”, при применении для обозначения молекул нуклеиновой кислоты, исключает выделенные хромосомы. Например, в различных вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая дельта-эндотоксин, может содержать менее приблизительно 5 т.о., 4 т.о., 3 т.о., 2 т.о., 1 т.о., 0,5 т.о. или 0,1 т.о. нуклеотидных последовательностей, которые в естественных условиях фланкируют молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клетки, из которой нуклеиновая кислота получена. В различных вариантах осуществления белок дельта-эндотоксин, который фактически не содержит клеточный материал, включает препараты белка, имеющие менее приблизительно 30%, 20%, 10% или 5% (по сухому весу) любого белка, отличающегося от дельта-эндотоксина (также называемого в настоящем документе как “загрязняющий белок”).

Нуклеотидные последовательности, кодирующие белки по настоящему изобретению, включают последовательность, изложенную в SEQ ID №: 1-20, а также ее варианты, фрагменты и комплементарные ей последовательности.

Под “комплементарной последовательностью” подразумевают нуклеотидную последовательность, которая в достаточной степени комплементарна заданной нуклеотидной последовательности, так что она может гибридизоваться с заданной нуклеотидной последовательностью с образованием, тем самым, стабильного дуплекса. Соответствующие аминокислотные последовательности для пестицидного белка, кодируемого этой нуклеотидной последовательностью, изложены в SEQ ID №: 21-74.

Молекулы нуклеиновой кислоты, которые являются фрагментами этих нуклеотидных последовательностей, кодирующих пестицидные белки, также охвачены настоящим изобретением. Под “фрагментом” подразумевают часть нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок. Фрагмент нуклеотидной последовательности может кодировать биологически активную часть пестицидного белка, или он может представлять собой фрагмент, который можно применять в качестве гибридизационного зонда или ПЦР-праймера с применением способов, раскрытых ниже. Молекулы нуклеиновой кислоты, которые являются фрагментами нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок, содержат по меньшей мере приблизительно 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 смежных нуклеотидов или вплоть до количества нуклеотидов, присутствующих в нуклеотидной последовательности полной длины, кодирующей пестицидный белок, раскрытый в настоящем документе, в зависимости от предполагаемого применения. Под “смежными” нуклеотидами подразумевают нуклеотидные остатки, которые непосредственно прилегают друг к другу. Фрагменты нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению будут кодировать белковые фрагменты, которые будут сохранять биологическую активность пестицидного белка и, следовательно, сохранять пестицидную активность. Таким образом, также охватываются биологически активные фрагменты полипептидов, раскрытых в настоящем документе. Под “сохранять активность” подразумевают, что фрагмент будет обладать по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 70%, 80%, 90%, 95% или большей пестицидной активностью пестицидного белка. В одном варианте осуществления пестицидной активностью является активность против жесткокрылых. В другом варианте осуществления пестицидной активностью является активность против чешуекрылых. В другом варианте осуществления пестицидной активностью является активность против нематод. В другом варианте осуществления пестицидной активностью является активность против двукрылых. В другом варианте осуществления пестицидной активностью является активность против полужесткокрылых. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны из уровня техники. См., например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США № 5743477, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылок во всей своей полноте.

Фрагмент нуклеотидной последовательности, кодирующий пестицидный белок, который кодирует биологически активную часть белка по настоящему изобретению, будет кодировать по меньшей мере приблизительно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 смежных аминокислот или вплоть до общего числа аминокислот, присутствующих в пестицидном белке полной длины по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления фрагмент представляет собой фрагмент протеолитического расщепления. Например, фрагмент протеолитического расщепления может характеризоваться N-концевым или С-концевым усечением по меньшей мере приблизительно 100 аминокислот, приблизительно 120, приблизительно 130, приблизительно 140, приблизительно 150 или приблизительно 160 аминокислот относительно SEQ ID №: 21-74. В некоторых вариантах осуществления охваченные в настоящем документе фрагменты получены путем удаления С-концевого домена кристаллизации, например, посредством протеолиза или посредством вставки стоп-кодона в кодирующую последовательность. См., например, усеченные аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID №: 25, 26, 39-45, 49-51, 58, 63-64, 66, 68 и 72-74. Следует понимать, что сайт усечения может отличаться на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или большее число аминокислот на каждую сторону сайта усечения, представленного концом SEQ ID №: 25, 26, 39-45, 49-51, 58, 63-64, 66, 68 или 72-74 (по сравнению с соответствующей последовательностью полной длины).

Предпочтительные пестицидные белки по настоящему изобретению кодируются нуклеотидной последовательностью, достаточно идентичной по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID №: 1-20, или пестицидные белки являются достаточно идентичными по отношению к нуклеотидной последовательности, изложенной в SEQ ID №:21-74. Под “достаточно идентичной” подразумевают аминокислотную или нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 60 или 65% идентична, на приблизительно на 70 или 75% идентична, на приблизительно на 80 или 85% идентична, на приблизительно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентична эталонной последовательности с применением одной из программ выравнивания, описанных в настоящем документе, с использованием стандартных параметров. Специалист в данной области техники поймет, что эти значения можно соответствующим образом скорректировать для определения соответствующей идентичности белков, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями, принимая во внимание вырожденность кодонов, аминокислотное сходство, расположение рамки считывания и т.п.

Для определения процентной идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновых кислот осуществляют выравнивание последовательностей для целей оптимального сравнения. Процентная идентичность двух последовательностей является функцией количества идентичных положений, имеющихся в обеих последовательностях (т.е. процентная идентичность = количество идентичных положений/общее количество положений (например, перекрывающихся положений)×100). В одном варианте осуществления две последовательности имеют одинаковую длину. В другом варианте осуществления процентную идентичность вычисляют путем сравнения по всей протяженности эталонной последовательности (например, последовательность, раскрытая в настоящем документе как любая из SEQ ID №: 1-74). Процентную идентичность двух последовательностей можно определить с применением методик, аналогичных описанным ниже, которые допускают наличие гэпов или их отсутствие. При расчете процентной идентичности, как правило, подсчитывают точные совпадения. Гэп, т.е. положение в выравнивании, где остаток присутствует в одной последовательности, но отсутствует в другой, рассматривается как положение с неидентичными остатками.

Определение процентной идентичности двух последовательностей можно выполнять с применением математического алгоритма. Не ограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей, является алгоритм Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, модифицированный по Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Такой алгоритм внедрен в программы BLASTN и BLASTX от Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Поиски нуклеотидных последовательностей в BLAST можно выполнять с помощью программы BLASTN, балл = 100, длина слова = 12, с получением нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот, подобным пестицидным, по настоящему изобретению. Поиски белковых последовательностей в BLAST можно выполнять с помощью программы BLASTX, балл = 50, длина слова = 3, с получением аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белка по настоящему изобретению. Для получения выравниваний с гэпами для сравнения можно использовать Gapped BLAST (в BLAST 2.0), как описано в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. В качестве альтернативы, можно применять PSI-Blast для осуществления итерационного поиска, при помощи которого выявляют отдаленные связи между молекулами. См. Altschul et al. (1997) выше. При использовании программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast можно применять параметры по умолчанию соответствующих программ (например, BLASTX и BLASTN). Выравнивание можно проводить вручную с помощью просмотра.

Другим неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). При помощи ClustalW сравнивают последовательности и выравнивает всю протяженность аминокислотной последовательности или последовательности ДНК, и, таким образом, он может предоставлять данные о консервативности последовательностей для полной аминокислотной последовательности. Алгоритм ClustalW применяют в нескольких коммерчески доступных пакетах программного обеспечения для анализа ДНК/аминокислот, таких как модуль ALIGNX пакета программ Vector NTI (Invitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния). После выравнивания аминокислотных последовательностей с помощью ClustalW можно оценивать процентную идентичность аминокислотных последовательностей. Неограничивающим примером программного обеспечения, пригодного для анализа выравниваний с помощью ClustalW, является GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) обеспечивает оценку сходства и идентичности аминокислотных (или ДНК) последовательностей между несколькими белками. Другим неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Такой алгоритм внедрен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью GCG Wisconsin Genetics Software Package, версия 10 (доступна от Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., Сан-Диего, Калифорния, США). При использовании программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей можно применять таблицу весов замен остатков PAM120, штраф за продолжение гэпа 12 и штраф за открытие гэпа 4.

Если не указано другое, будет применяться программа GAP Version 10, в которой используется алгоритм Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, для определения идентичности или сходства последовательностей с применением следующих параметров: % идентичности и % сходства для нуклеотидной последовательности с применением GAP Weight (штраф за открытие гэпа) 50, и Length Weight (штраф за продолжение гэпа) 3, и матрицы замен nwsgapdna.cmp; % идентичности или % сходства для аминокислотной последовательности с применением штрафа за открытие гэпа 8, и штрафа за продолжение гэпа 2, и матрицы замен BLOSUM62. Также можно применять эквивалентные программы. Под “эквивалентной программой” подразумевают любую программу для сравнения последовательностей, в которой для любых двух рассматриваемых последовательностей осуществляют выравнивание с идентичными совпадениями нуклеотидных остатков и идентичной процентной идентичностью последовательности по сравнению с соответствующим выравниванием, осуществляемым с помощью GAP версии 10.

Изобретение также охватывает вариантные молекулы нуклеиновых кислот. "Варианты" нуклеотидных последовательностей, кодирующих пестицидный белок, включают такие последовательности, которые кодируют пестицидные белки, раскрытые в настоящем документе, но которые отличаются консервативными заменами, обусловленными вырожденностью генетического кода, а также последовательности, которые являются достаточно идентичными, как обсуждается выше. Встречающиеся в природе аллельные варианты можно идентифицировать с применением хорошо известных методик молекулярной биологии, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и методика гибридизации, как изложено выше. Вариантные нуклеотидные последовательности также включают синтетические нуклеотидные последовательности, которые были получены, например, с применением сайт-направленного мутагенеза, но которые сохраняют способность кодировать пестицидные белки, раскрытые в настоящем изобретении, как обсуждается ниже. Варианты белков, охватываемые настоящим изобретением, биологически активны, то есть они сохраняют необходимую биологическую активность нативного белка, то есть пестицидную активность. Под “сохранять активность” подразумевают, что вариант будет обладать по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 70% или по меньшей мере приблизительно 80% пестицидной активности нативного белка. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны из уровня техники. См., например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США № 5743477, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылок во всей своей полноте.

Специалист, к тому же, поймет, что изменения можно вводить посредством мутирования нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению, что ведет к изменению в аминокислотной последовательности, кодирующей пестицидные белки, без изменения биологической активности белков. Таким образом, вариантные выделенные молекулы нуклеиновых кислот можно создавать путем введения одной или нескольких нуклеотидных замен, добавлений или делеций в соответствующую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем документе, так что одна или несколько аминокислотных замен, добавлений или делеций вводятся в кодируемый белок. Мутации можно вводить при помощи стандартных методик, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Такие варианты нуклеотидных последовательностей также охвачены настоящим изобретением.

Например, можно делать консервативные аминокислотные замены по одному или нескольким прогнозируемым несущественным аминокислотным остаткам. “Несущественный” аминокислотный остаток представляет собой остаток, который можно изменять по сравнению с последовательностью дикого типа пестицидного белка без изменения биологической активности, в то время как “существенный” аминокислотный остаток необходим для обеспечения биологической активности. “Консервативная аминокислотная замена” представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток замещен на аминокислотный остаток, имеющий аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющие аналогичные боковые цепи, были определены в уровне техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Дельта-эндотоксины, как правило, обладают пятью доменами с консервативными последовательностями и тремя консервативными структурными доменами (см., например, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). Первый консервативный структурный домен состоит из семи альфа-спиралей и участвует во встраивании в мембрану и формировании пор. Домен II состоит из трех бета-складчатых слоев, расположенных в конфигурации "греческий ключ", а домен III состоит из двух антипараллельных бета-складчатых слоев в расположении "рулет с вареньем" (de Maagd et al., 2001, выше). Домены II и III участвуют в распознавании и связывании рецептора и поэтому считаются детерминантами специфичности токсина.

Аминокислотные замены можно осуществлять в тех неконсервативных участках, которые сохраняют функцию. Как правило, такие замены не следует проводить для консервативных аминокислотных остатков или для аминокислотных остатков, находящихся в консервативном мотиве, где такие остатки являются существенными для активности белка. Примеры остатков, которые являются консервативными и которые могут быть существенными для активности белка, включают, например, остатки, которые идентичны у всех белков, содержащихся в выравнивании аналогичных или родственных токсинов с последовательностями по настоящему изобретению (например, остатки, которые идентичны при выравнивании гомологичных белков). Примеры остатков, которые являются консервативными, но которые могут обеспечивать консервативные аминокислотные замены и сохранять активность, включают, например, остатки, которые характеризуются только консервативными заменами у всех белков, содержащихся в выравнивании аналогичных или родственных токсинов с последовательностями по настоящему изобретению (например, остатки, которые характеризуются только консервативными заменами у всех белков, содержащихся в выравнивании гомологичных белков). Однако, специалист в данной области техники поймет, что функциональные варианты могут иметь незначительные консервативные или неконсервативные изменения в консервативных остатках.

В качестве альтернативы, вариантные нуклеотидные последовательности можно получать путем введения мутаций случайным образом по всей или части кодирующей последовательности, как, например, путем сайт-насыщающего мутагенеза, и полученных мутантов можно подвергать скринингу в отношении способности обеспечивать пестицидную активность для идентификации мутантов, которые сохраняют активность. После мутагенеза кодируемый белок можно экспрессировать рекомбинантным способом, и активность белка можно определять с применением стандартных методик анализа.

Применяя способы, такие как ПЦР, гибридизация и подобное, можно идентифицировать соответствующие пестицидные последовательности, причем такие последовательности обладают существенной идентичностью с последовательностями по настоящему изобретению (например, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или большая идентичность последовательности относительно всей протяженности эталонной последовательности) и обладают или обеспечивают пестицидную активность. См., например, Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) and Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

В способе гибридизации для скрининга кДНК или геномных библиотек можно применять всю или часть пестицидной нуклеотидной последовательности. Способы для конструирования таких кДНК или геномных библиотек, как правило, известны из уровня техники и раскрыты в Sambrook and Russell, (2001), выше. Так называемые гибридизационные зонды могут представлять собой фрагменты геномной ДНК, фрагменты кДНК, фрагменты РНК или другие олигонуклеотиды, и они могут быть помечены детектируемой группой, такой как P, или любым другим детектируемым маркером, таким как другие радиоактивные изотопы, флуоресцентным соединением, ферментом или кофактором фермента. Зонды для гибридизации могут быть получены посредством мечения синтетических олигонуклеотидов, основанных на известной кодирующей пестицидный белок нуклеотидной последовательности, раскрытой в настоящем документе. Дополнительно можно применять вырожденные праймеры, разработанные на основе консервативных нуклеотидных или аминокислотных остатков в нуклеотидной последовательности или кодируемой аминокислотной последовательности. Зонд, как правило, содержит участок нуклеотидной последовательности, который гибридизуется при жестких условиях по меньшей мере с приблизительно 12, по меньшей мере с приблизительно 25, по меньшей мере с приблизительно 50, 75, 100, 125, 150, 175 или 200 смежными нуклеотидами нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок по настоящему изобретению или его фрагмент или вариант. Способы получения зондов для гибридизации, как правило, хорошо известны из уровня техники и раскрыты в Sambrook and Russell, 2001, выше, включенном в настоящий документ посредством ссылки.

Например, в качестве зонда, способного специфично гибридизоваться с соответствующими последовательностями, подобными пестицидному белку, и матричными РНК, может быть использована вся пестицидная последовательность, раскрытая в настоящем документе, или одна или несколько ее частей. Для достижения специфичной гибридизации при различных условиях такие зонды включают последовательности, которые являются уникальными, и, предпочтительно, состоят по меньшей мере из приблизительно 10 нуклеотидов в длину или по меньшей мере из приблизительно 20 нуклеотидов в длину. Такие зонды можно использовать для амплификации соответствующих пестицидных последовательностей из выбранного организма или образца с помощью ПЦР. Эту методику можно применять для выделения дополнительных кодирующих последовательностей из требуемого организма или в качестве диагностического анализа для определения присутствия кодирующих последовательностей в организме. Методики гибридизации включают гибридизационный скрининг высеянных на планшет библиотек ДНК (либо бляшек, либо колоний; см., например, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

Таким образом, настоящее изобретение охватывает зонды для гибридизации, а также нуклеотидные последовательности, способные к гибридизации со всей нуклеотидной последовательностью или частью нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению (например, по меньшей мере с приблизительно 300 нуклеотидами, по крайней мере с приблизительно 400, по меньшей мере с приблизительно 500, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 нуклеотидами, или вплоть до полной длины нуклеотидной последовательности, раскрытой в настоящем документе). Гибридизацию таких последовательностей можно проводить в жестких условиях. Под “жесткими условиями” или “жесткими гибридизационными условиями” подразумевают условия, при которых зонд будет гибридизоваться со своей целевой последовательностью явно в большей степени, чем с другими последовательностями (например, по меньшей мере в 2 раза большей по сравнению с фоном). Жесткие условия зависят от последовательности и будут отличаться при различных обстоятельствах. Путем контроля жесткости условий гибридизации и/или отмывки можно идентифицировать целевые последовательности, которые на 100% комплементарны зонду (гомологичное зондирование). В качестве альтернативы, условия жесткости можно регулировать для обеспечения некоторого несовпадения в последовательностях с тем, чтобы выявлять более низкие степени аналогичности (гетерологичное зондирование). Как правило, длина зонда составляет менее приблизительно 1000 нуклеотидов, предпочтительно менее 500 нуклеотидов в длину.

Как правило, жесткие условия будут такими, при которых концентрация соли составляет менее приблизительно 1,5 M ионов Na, как правило, концентрация ионов Na (или других солей) составляет приблизительно 0,01-1,0 M при pH 7,0-8,3, а температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°C для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°C для длинных зондов (например, более 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты с помощью добавления дестабилизирующих средств, таких как формамид. Иллюстративные условия низкой жесткости включают гибридизацию с помощью буферного раствора 30-35% формамида, 1 М NaCl, 1% SDS (додецилсульфата натрия) при 37°С и отмывку в от 1-x - 2-x SSC (20-x SSC=3,0 М NaCl/0,3 М цитрата тринатрия) при 50-55°С. Иллюстративные условия умеренной жесткости включают гибридизацию в 40-45% формамиде, 1,0 М NaCl, 1% SDS при 37°С и отмывку в от 0,5-x - 1-x SSC при 55-60°С. Иллюстративные условия высокой жесткости включают гибридизацию в 50% формамиде, 1 М NaCl, 1% SDS при 37°С и отмывку в 0, 1-x SSC при 60-65°С. Необязательно отмывочные буферы могут содержать от приблизительно 0,1 до приблизительно 1% SDS. Продолжительность гибридизации составляет, как правило, менее приблизительно 24 часов, обычно от приблизительно 4 до приблизительно 12 часов.

Специфичность, как правило, зависит от отмывок после гибридизации, причем ключевыми факторами являются ионная сила и температура конечного отмывочного раствора. Для гибридов ДНК-ДНК Tm можно приблизительно выразить из уравнения в Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm=81,5°C+16,6 (log M)+0,41 (%GC)-0,61 (% форм.)-500/л; где М представляет собой молярность одновалентных катионов, % GC представляет собой процент гуанозиновых и цитозиновых нуклеотидов в ДНК, % форм. представляет собой процент формамида в гибридизационном растворе, и L представляет собой длину гибрида в парах оснований. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе и pH), при которой 50% комплементарной целевой последовательности гибридизуется с идеально совпадающим зондом. Tm снижают на приблизительно 1°C для каждого 1% несовпадения; таким образом, Tm, условия гибридизации и/или отмывки можно отрегулировать для гибридизации с последовательностями с необходимой идентичностью. Например, если необходимы последовательности идентичные на ≥90%, Tm можно снизить на 10°С. Как правило, жесткие условия выбирают так, чтобы температура была на приблизительно 5°С ниже температуры плавления (Tm) для конкретной последовательности и комплементарной ей последовательности при определенной ионной силе и величине рН. Тем не менее, при условиях высокой жесткости можно проводить гибридизацию и/или отмывку при температуре на 1, 2, 3 или 4°С ниже, чем температура плавления (Tm); при условиях умеренной жесткости можно проводить гибридизацию и/или отмывку при температуре на 6, 7, 8, 9 или 10°C ниже температуры плавления (Tm); в условиях низкой жесткости можно проводить гибридизацию и/или отмывку при температуре на 11, 12, 13, 14, 15 или 20°С ниже температуры плавления (Tm). Специалистам в данной области техники будет понятно, что изменения жесткости растворов для гибридизации и/или отмывки по существу описаны с помощью уравнения, композиций для гибридизации и отмывки и необходимой Tm. Если необходимая степень несовпадения приводит в результате к Tm ниже 45°C (водный раствор) или 32°C (раствор формамида), то предпочтительным является повышение концентрации SSC так, чтобы можно было применять более высокую температуру. Исчерпывающее пособие по гибридизации нуклеиновых кислот находится в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); и Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). См. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

Выделенные белки и их варианты и фрагменты

Настоящее изобретение также охватывает пестицидные белки. Под "пестицидным белком" подразумевают белок, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID №: 21-74. Также для осуществления способов настоящего изобретения представлены его фрагменты, биологически активные части и варианты. “Рекомбинантный белок” или “рекомбинантный полипептид” используется для обозначения белка, который не длиннее такого же белка в естественной среде и был изменен относительно нативного белка таким образом, что рекомбинантный белок или рекомбинантный полипептид отличается (например, по химическому составу или структуре) от того белка или полипептида, которые встречаются в природе.

“Фрагменты” или “биологически активные части” включают полипептидные фрагменты, содержащие аминокислотные последовательности, достаточно идентичные аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID №: 21-74, и которые проявляют пестицидную активность. Биологически активная часть пестицидного белка может представлять собой полипептид, который имеет длину, например, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 или более аминокислот. Такие биологически активные части можно получать с помощью рекомбинантных методик и оценивать в отношении пестицидной активности. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны из уровня техники. См., например Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США № 5743477, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылок во всей своей полноте. Как применяется в настоящем документе, фрагмент содержит по меньшей мере 8 смежных аминокислот SEQ ID №: 21-74. Однако, настоящее изобретение охватывает другие фрагменты, такие как любой фрагмент в белке, который имеет длину более приблизительно 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 или более аминокислот.

Под “вариантами” подразумевают белки или полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 60, 65%, приблизительно 70, 75%, приблизительно 80, 85%, приблизительно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности с любым из SEQ ID №:21-74. Варианты также включают полипептиды, кодируемые молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты с SEQ ID №: 1-20, или ее комплементарной последовательностью в жестких условиях. Варианты включают полипептиды, которые отличаются по аминокислотной последовательности по причине мутагенеза. Варианты белков, охватываемые настоящим изобретением, биологически активны, то есть они сохраняют необходимую биологическую активность нативного белка, а именно пестицидную активность. В некоторых вариантах осуществления варианты обладают улучшенной активностью относительно нативного белка. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны из уровня техники. См., например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США № 5743477, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылок во всей своей полноте.

Бактериальные гены, такие как гены axmi по настоящему изобретению, довольно часто обладают несколькими метиониновыми инициаторными кодонами поблизости от стартового сайта открытой рамки считывания. Зачастую, инициация трансляции по одному или нескольким из этих старт-кодонов будет приводить к образованию функционального белка. Эти старт-кодоны могут включать кодоны ATG. Однако, бактерии, такие как Bacillus sp., в качестве старт-кодона также распознают кодон GTG, и белки, трансляция которых инициируется с кодонов GTG, в качестве первой аминокислоты содержат метионин. В редких случаях, трансляция в бактериальных системах может инициироваться по кодону TTG, хотя в этом случае TTG кодирует метионин. Кроме того, зачастую не определяют a priori, какой из этих кодонов используется в естественных условиях в бактерии. Таким образом, понятно, что применение одного из переменных метиониновых кодонов может также приводить к образованию пестицидных белков. Эти пестицидные белки охвачены настоящим изобретением и могут быть использованы в способах настоящего изобретения. Будет понятно, что при экспрессии в растениях, будет необходимо изменить переменный старт-кодон на ATG для полноценной трансляции.

В различных вариантах осуществления настоящего изобретения пестицидные белки включают аминокислотные последовательности, выведенные из нуклеотидных последовательностей полной длины, раскрытых в настоящем документе, и аминокислотные последовательности, которые короче последовательностей полной длины из-за применения альтернативного сайта инициации, расположенного ниже. Таким образом, нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению и/или векторы, клетки-хозяева и растения, содержащие нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению (и способы получения и применения нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению), могут содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным последовательностям, упомянутым в таблице 1.

Также охвачены антитела к полипептидам по настоящему изобретению или к их вариантам или фрагментам. Способы получения антител хорошо известны из уровня техники (см., например, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; патент США № 4196265).

Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к антителам, одноцепочечным антигенсвязывающим молекулам или другим белкам, которые специфично связываются с одной или несколькими молекулами белка или пептида по настоящему изобретению и их гомологам, слияниям или фрагментам. В особенно предпочтительном варианте осуществления антитело специфично связывается с белком, имеющим аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID №: 21-74, или его фрагментом. В другом варианте осуществления антитело специфично связывается со слитым белком, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID №: 21-74, или его фрагментом.

Антитела по настоящему изобретению можно применять для количественного или качественного выявления молекул белка или пептида по настоящему изобретению или для выявления посттрансляционных модификаций белков. Как утверждают, используемое в данном документе антитело или пептид специфично связывается” с молекулой белка или пептида по настоящему изобретению, если такое связывание конкурентно не ингибируется присутствием несвязанных молекул.

Антитела по настоящему изобретению могут содержаться в наборе, пригодном для выявления молекул белка или пептида по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение дополнительно включает способ выявления молекулы белка или пептида по настоящему изобретению (в частности, белка, кодируемого аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID №: 21-74, в том числе его вариантов или фрагментов, которые способны специфично связываться с антителом по настоящему изобретению), включающий приведение в контакт образца с антителом по настоящему изобретению и определение, содержит ли образец молекулу белка или пептида по настоящему изобретению. Способы использования антител для выявления белка или пептида, которые представляют интерес, известны из уровня техники.

Альтернативные или улучшенные варианты

Понятно, что последовательности ДНК пестицидного белка можно изменять различными способами, и что эти изменения могут приводить к последовательностям ДНК, кодирующим белки с аминокислотными последовательностями, отличными от тех, которые кодируют пестицидный белок по настоящему изобретению. Этот белок можно изменять различными путями, в том числе с помощью аминокислотных замен, делеций, усечений и вставок одной или нескольких аминокислот SEQ ID №:21-74, в том числе вплоть до приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 105, приблизительно 110, приблизительно 115, приблизительно 120, приблизительно 125, приблизительно 130, приблизительно 135, приблизительно 140, приблизительно 145, приблизительно 150, приблизительно 155 или большего количества аминокислотных замен, делеций или вставок. Способы осуществления таких манипуляций, как правило, известны из уровня техники. Например, варианты аминокислотных последовательностей пестицидного белка можно получить при помощи мутаций в ДНК. Это также можно осуществлять при помощи одной из нескольких форм мутагенеза и/или путем направленной эволюции. В некоторых аспектах изменения, закодированные в аминокислотной последовательности, не будут существенно влиять на функцию белка. Такие варианты будут обладать необходимой пестицидной активностью. Однако, понятно, что способность пестицидного белка обеспечивать пестицидную активность может быть улучшена за счет применения таких методик к композициям по настоящему изобретению. Например, можно экспрессировать пестицидный белок в клетках-хозяевах, таких как клетки XL-1 Red (Stratagene, Fa Jolla, CA), у которых наблюдаются высокие степени ошибки встраивания основания в процессе репликации ДНК. После размножения в таких штаммах можно выделять ДНК (например, путем получения плазмидной ДНК или путем амплификации с помощью ПЦР и клонирования полученного ПЦР фрагмента в вектор), культивировать мутации пестицидного белка в немутагенном штамме и идентифицировать мутантные гены, обладающие пестицидной активностью, например, осуществляя анализ на тестирование относительно пестицидной активности. Как правило, белок смешивают и применяют в анализах питания. См., например, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Такие анализы могут включать приведение растений в контакт с одним или несколькими вредителями и определение способности растения выживать и/или вызывать гибель вредителей. Примеры мутаций, которые приводят к повышенной токсичности, раскрыты в Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

В качестве альтернативы изменения можно производить в белковой последовательности многих белков на амино- или карбокси-конце без существенного воздействия на активность. Они могут включать вставки, делеции или изменения, введенные при помощи современных молекулярных способов, таких как ПЦР, в том числе амплификации посредством ПЦР, которые изменяют или расширяют последовательность, кодирующую белок, посредством включения последовательностей, кодирующих аминокислоты, в олигонуклеотиды, используемые при амплификации посредством ПЦР. В качестве альтернативы, добавленные белковые последовательности могут включать последовательности, кодирующие весь белок, например, такие, которые обычно применяются в области техники для получения белковых слияний. Такие белки слияния часто применяются для (1) повышения экспрессии белка, представляющего интерес, (2) введения связывающего домена, ферментативной активности или эпитопа для облегчения чего-либо из очистки белка, выявления белка или других экспериментальных применений, известных из уровня техники, (3) нацеливания секреции или трансляции белка во внутриклеточную органеллу, такую как периплазматическое пространство грамотрицательных бактерий или эндоплазматический ретикулум эукариотических клеток, причем последнее зачастую приводит к гликозилированию белка.

Вариантные нуклеотидные и аминокислотные последовательности по настоящему изобретению также охватывают последовательности, полученные в результате методик, связанных с мутациями и рекомбинациями, такими как шаффлинг ДНК. С помощью такой процедуры один или несколько различных участков, кодирующих пестицидный белок, можно применять для создания нового пестицидного белка, обладающего необходимыми свойствами. Таким образом, библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов создают из популяции полинуклеотидов с родственными последовательностями, содержащих участки последовательности, которые обладают значительной идентичностью последовательности и могут подвергаться гомологичной рекомбинации in vitro или in vivo. Например, с использованием этого подхода, мотивы с последовательностями, кодирующими домен, представляющий интерес, можно подвергать шаффлингу между пестицидным геном по настоящему изобретению и другими известными пестицидными генами с получением нового гена, кодирующего белок с улучшенным свойством, представляющим интерес, таким как повышенная инсектицидная активность. Стратегии такого шаффлинга ДНК известны из уровня техники. См., например, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; и патенты США №№ 5605793 и 5837458.

Замена доменов или шаффлинг представляет собой другой механизм создания измененных пестицидных белков. Можно проводить замену доменов между пестицидными белками, что дает гибридные или химерные токсины с улучшенной пестицидной активностью или спектром мишеней. Способы получения рекомбинантных белков и тестирования их в отношении пестицидной активности хорошо известны из уровня техники (см., например, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).

В еще одном варианте осуществления вариантные нуклеотидные и/или аминокислотные последовательности можно получать с применением одного или нескольких способов, таких как ПЦР с внесением ошибок, сайт-направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, сборочная ПЦР (assembly PCR), мутагенез посредством амплификации рекомбинантных родительских фрагментов (sexual PCR), мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный множественный мутагенез, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, повторная сборка гена, сайт-насыщающий мутагенез гена, пермутационный мутагенез, повторная сборка посредством синтетического лигирования (SLR), рекомбинация, рекурсивная рекомбинация последовательности, мутагенез модифицированной фосфотиоатом ДНК, мутагенез с применением урацил-содержащих матриц, мутагенез с применением дуплекса с гэпами, мутагенез с точечной репарацией ошибочно спаренных оснований, мутагенез с применением штаммов-хозяев с недостаточностью репарации, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, делеционный мутагенез, мутагенез посредством рестрикции-отбора, мутагенез посредством рестрикции-очистки, синтез искусственных генов, множественный мутагенез, создание химерной нуклеиновой кислоты с мультимерной структурой, и тому подобное.

Векторы

Пестицидная последовательность по настоящему изобретению может быть получена в кассете экспрессии для экспрессии в растении, которое представляет интерес. Под "растительной кассетой экспрессии" подразумевают ДНК-конструкцию, которая способна приводить к экспрессии белка в растительной клетке, начиная с открытой рамки считывания. Как правило, они содержат промотор и кодирующую последовательность. Зачастую такие конструкции также будут содержать 3'-нетранслируемый участок. Такие конструкции могут содержать “сигнальную последовательность” или “лидерную последовательность” для облегчения сопряженного с трансляцией или посттрансляционного транспорта пептида в определенные внутриклеточные структуры, такие как хлоропласт (или другая пластида), эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи.

Под “сигнальной последовательностью” подразумевают последовательность, которая, как известно или как ожидается, приводит к сопряженному с трансляцией или посттрансляционному транспорту пептида через клеточную мембрану. У эукариот это, как правило, подразумевает секрецию в пузырьках аппарата Гольджи, при этом происходит некоторое гликолизирование. Инсектицидные токсины бактерий зачастую синтезируются в виде протоксинов, которые активируются под действием протеолиза в кишечнике целевого вредителя (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сигнальная последовательность расположена в нативной последовательности или может быть получена из последовательности по настоящему изобретению. Под “лидерной последовательностью” подразумевают любую последовательность, которая при трансляции приводит к аминокислотной последовательности, способной запускать сопряженный с трансляцией транспорт пептидной цепи во внутриклеточную органеллу. Таким образом, это предусматривает лидерные последовательности, нацеливающие транспорт и/или гликозилирование посредством перехода в эндоплазматический ретикулум, перехода в вакуоли, пластиды, в том числе хлоропласты, митохондрии и т.п.

Под "вектором трансформации растений" подразумевают молекулу ДНК, которая необходима для эффективной трансформации растительной клетки. Такая молекула может состоять из одной или нескольких растительных кассет экспрессии и может быть организована в более чем одну "векторную" молекулу ДНК. Например, бинарные векторы представляют собой векторы трансформации растений, в которых используются два несмежных вектора ДНК для кодирования всех необходимых действующих в цис- и транс-положении функций для трансформации растительных клеток (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Вектор" относится к конструкции нуклеиновой кислоты, предназначенной для переноса между различными клетками хозяевами. "Вектор экспрессии" относится к вектору, который обладает способностью встраивать, интегрировать и экспрессировать гетерологичные последовательности или фрагменты ДНК в чужеродной клетке. Кассета будет включать регуляторные 5'- и 3'-последовательности, функционально связанные с последовательностью по настоящему изобретению. Под "функционально связанным" подразумевают функциональную связь между промотором и второй последовательностью, где последовательность промотора инициирует и опосредует транскрипцию последовательности ДНК, соответствующей второй последовательности. Как правило, функционально связанный означает, что последовательности нуклеиновой кислоты, которые связаны, являются непрерывными, и в случае, когда необходимо соединить два белок-кодирующих участка, они являются смежными и находятся в одной рамке считывания. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность функционально связана с гетерологичным промотором, способным управлять экспрессией указанной нуклеотидной последовательности в клетке-хозяине, такой как микробная клетка-хозяин или растительная клетка-хозяин. Кассета может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный ген, подлежащий введению в организм путем котрансформации. В качестве альтернативы, дополнительный (дополнительные) ген(ы) могут быть представлены в нескольких кассетах экспрессии.

В различных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению, функционально связана с промотором, например, промотором растений. "Промотор" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, функцией которой является управление транскрипцией расположенного ниже кодирующей последовательности. Промотор наряду с другими транскрипционными и трансляционными регуляторными последовательностями нуклеиновых кислот (также называемыми “контрольные последовательности”), необходим для экспрессии последовательности ДНК, которая представляет интерес.

Такая кассета экспрессии представлена с множеством сайтов рестрикции для встраивания пестицидной последовательности, транскрипция которой будет регулироваться регуляторными участками.

Кассета экспрессии будет включать в 5'-3' направлении транскрипции участок инициации транскрипции и трансляции (т.е. промотор), последовательность ДНК по настоящему изобретению и участок терминации транскрипции и трансляции (т.е. участок терминации), функциональные в растениях. Промотор может быть нативным или аналогичным, или чужеродным или гетерологичным для растения-хозяина и/или для последовательности ДНК по настоящему изобретению. Кроме того, промотор может быть природной последовательностью или, в качестве альтернативы, синтетической последовательностью. Если промотор является “нативным” или “гомологичным” для растения-хозяина, то предполагается, что промотор обнаруживается в нативном растении, в которое вводят промотор. Если промотор является “чужеродным” или “гетерологичным” относительно последовательности ДНК по настоящему изобретению, предполагается, что промотор не является нативным или встречающимся в природе промотором для функционально связанной последовательности ДНК по настоящему изобретению.

Участок терминации может быть нативным относительно участка инициации транскрипции, может быть нативным относительно функционально связанной последовательности ДНК, представляющей интерес, может быть нативным относительно растения-хозяина или может быть получен из другого источника (т. e. чужеродный или гетерологичный для промотора, последовательности ДНК, представляющей интерес, растения-хозяина или какой-либо их комбинации). Подходящие участки терминации доступны из Ti-плазмиды A. tumefaciens, такие как участки терминации октопинсинтазы и нопалинсинтазы. См. также Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Balias et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; и Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

При необходимости ген(гены) можно оптимизировать для повышения экспрессии в трансформированной клетке-хозяине. То есть гены можно синтезировать с применением предпочтительных для клетки-хозяина кодонов или можно синтезировать с применением кодонов с периодичностью использования кодона, предпочтительной для хозяина. Как правило, содержание GC в гене будет повышено. См., например, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 в отношении рассмотрения использования кодонов, предпочтительных для хозяина. Из уровня техники доступны способы синтеза генов, предпочтительных для растений. См., например, патенты США №№ 5380831 и 5436391, публикацию патента США № 20090137409, и Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, включенные в настоящий документ посредством ссылки.

В одном варианте осуществления пестицидный белок для экспрессии нацеливают в хлоропласт. Таким образом, там где пестицидный белок не вводят непосредственно в хлоропласт, кассета экспрессии будет дополнительно содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую транзитный пептид для направления пестицидного белка в хлоропласты. Такие транзитные пептиды известны из уровня техники. См., например, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; и Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

Пестицидный ген, подлежащий нацеливанию в хлоропласт, можно оптимизировать для экспрессии в хлоропласте с учетом отличий по использованию кодонов между растительным ядром и этой органеллой. Таким образом, нуклеиновые кислоты, представляющие интерес, можно синтезировать с применением кодонов, предпочтительных для хлоропласта. См., например, патент США № 5380831, включенный в настоящий документ посредством ссылки.

Трансформация растений

Способы настоящего изобретения включают введение нуклеотидной конструкции в растение. Под "введением" подразумевают представление растению нуклеотидной конструкцией таким образом, чтобы конструкция попадает во внутреннее пространство клетки растения. Способы настоящего изобретения не требуют чтобы применялся особый способ введения нуклеотидной конструкции в растение, за исключением того, что нуклеотидная конструкция попадает во внутреннее пространство по меньшей мере одной клетки растения. Из уровня техники известны способы введения нуклеотидных конструкций и/или полипептидов в растения, в том числе без ограничений способы стабильной трансформации, способы временной трансформации и способы трансформации, опосредованной вирусами.

Под “растением” подразумевают целое растение, органы растения (например, листья, стебли, корни и т.д.), семена, растительные клетки, части растения для вегетативного размножения, зародыши и их потомство. Растительные клетки могут быть дифференцированными или недифференцированными (например клетками каллюса, клетками суспензионных культур, протопластами, клетками листьев, клетками корней, клетками флоэмы, пыльцой).

"Трансгенные растения", или "трансформированные растения", или "стабильно трансформированные" растения, или клетки, или ткани относятся к растениям, у которых в растительную клетку встроили или интегрировали экзогенные последовательности нуклеиновых кислот или фрагменты ДНК. Эти последовательности нуклеиновых кислот включают таковые, которые являются экзогенными или отсутствуют в нетрансформированной растительной клетке, а также последовательности, которые могут быть эндогенными или присутствовать в нетрансформированной растительной клетке. “Гетерологичный”, как правило, относится к последовательностям нуклеиновых кислот, которые не являются эндогенными для клетки или части нативного генома, в котором они присутствуют, а были добавлены в клетку путем заражения, трансфекции, микроинъекции, электропорации, бомбардировки микрочастицами и т.п.

Трансгенные растения по настоящему изобретению экспрессируют одну или несколько новых последовательностей токсина, раскрытых в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления белок или нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению преимущественно комбинируют в растениях с другими генами, которые кодируют белки или РНК, которые обеспечивают таким растениям пригодные агрономические свойства. Среди генов, которые кодируют белки или РНК, которые обеспечивают трансформированным растениям пригодные агрономические свойства, можно отметить последовательности ДНК, кодирующие белки, которые обеспечивают толерантность к одному или нескольким гербицидам, и другие, которые обеспечивают толерантность к определенным насекомым, те, которые обеспечивают толерантность к определенными заболеваниям, и ДНК, которые кодируют РНК, которые обеспечивают контроль насекомых или нематод, и т.п. Такие гены, в частности, описаны в опубликованных заявках на патент РСТ W091/02071 и WO95/06128, и в патенте США 7923602, и публикации заявки на патент США № 20100166723, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Среди последовательностей ДНК, кодирующих белки, которые обеспечивают трансформированным растительным клеткам и растениям толерантность к определенным гербицидам, можно отметить ген bar или PAT или ген Streptomyces coelicolor, описанный в WO 2009/152359, который обеспечивает толерантность к гербицидам на основе глуфосината, ген, кодирующий подходящий EPSPS, который обеспечивает толерантность к гербицидам, обладающих EPSPS в качестве мишени, таким как глифосат и его соли (US 4535060, US 4769061, US 5094945, US 4940835, US 5188642, US 4971908, US 5145783, US 5310667, US 5312910, US 5627061, US 5633435), ген, кодирующий глифосат-н-ацетилтрансферазу (например, US 8222489, US 8088972, US 8044261, US 8021857, US 8008547, US 7999152, US 7998703, US 7863503, US 7714188, US 7709702, US 7666644, US 7666643, US 7531339, US 7527955 и US 7405074), ген, кодирующий глифосат-оксидоредуктазу (например, US 5463175) или ген, кодирующий белок, толерантный к ингибитору HPPD (например, ген толерантности к ингибитору HPPD, описанный в WO 2004/055191, WO 199638567, US 6791014, WO 2011/068567, WO 2011/076345, WO 2011/085221, WO 2011/094205, WO 2011/068567, WO 2011/094199, WO 2011/094205, WO 2011/145015, WO2012056401 и РСТ/US2013/59598 ).

Среди последовательностей ДНК, кодирующих подходящий EPSPS, который обеспечивает толерантность к гербицидам, которые обладают EPSPS в качестве мишени, конкретнее можно отметить ген, который кодирует растительный EPSPS, в частности, EPSPS маиса, особенно EPSPS маиса, которая содержит две мутации, особенно мутацию в положении аминокислоты 102 и мутацию в положении аминокислоты 106 (W02004/074443), и который описан в заявке на патент США № 6566587, в дальнейшем называемый двойным мутантом EPSPS маиса или 2mEPSPS, или ген, который кодирует EPSPS, выделенный из Agrobacterium, и который описан последовательностью под SEQ ID №: 2 и последовательностью под SEQ ID №: 3 в патенте США № 5633435, также названый СР4.

Среди последовательностей ДНК, кодирующих подходящий EPSPS, который обеспечивает толерантность к гербицидам, которые обладают EPSPS в качестве мишени, конкретнее можно отметить ген, который кодирует EPSPS GRG23 из Arthrobacter globiformis, а также мутантов GRG23 ACE1, GRG23 ACE2 или GRG23 ACE3, особенно мутантов или вариантов GRG23, как описано в WO 2008/100353, таких как GRG23(ace3)R173K SEQ ID № 29 в WO 2008/100353.

В случае последовательностей ДНК, кодирующих EPSPS, конкретнее - кодирующих описанные выше гены, последовательность, кодирующая эти ферменты, преимущественно предшествует последовательности, кодирующей транзитный пептид, в частности, “оптимизированный транзитный пептид”, описанный в патентах США №№ 5510471 или 5633448.

Иллюстративные признаки толерантности к гербицидам, которые можно комбинировать с последовательностью нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, дополнительно включают по меньшей мере один ингибитор ALS (ацетолактатсинтазы) (WO2007/024782); мутантный ген Arabidopsis ALS/AHAS (патент США № 6855533); гены, кодирующие 2,4-D-монооксигеназы, обеспечивающие толерантность к 2,4-D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) посредством метаболизации (патент США № 6153401); и гены, кодирующие дикамба-монооксигеназы, обеспечивающие толерантность к дикамба (3,6-дихлор-2-метоксибензойная кислота) посредством метаболизации (US 2008/0119361 и US 2008/0120739).

В различных вариантах осуществления нуклеиновая кислота по настоящему изобретению пакетируется с одним или несколькими генами, обеспечивающими толерантность к гербицидам, в том числе одним или несколькими генами толерантности к гербицидам на основе ингибитора HPPD и/или одним или несколькими генами толерантности к глифосату и/или глуфосинату.

Среди последовательностей ДНК, кодирующих белки, относящиеся к свойствам толерантности к насекомым, конкретнее можно отметить белки Bt, которые широко описаны в литературе и хорошо известны специалисту в данной области. Можно также отметить белки, выделенные из бактерий, таких как Photorhabdus (WO 97/17432 и WO 98/08932).

Среди таких последовательностей ДНК, кодирующих белки, которые представляют интерес, которые обеспечивают новые свойства толерантности к насекомым, конкретнее можно отметить белки Bt Cry или VIP, которые широко описаны в литературе и хорошо известны специалисту в данной области. Они включают белок Cry1F или гибриды, полученные из белка Cry1F (например, гибридные белки Cry1A-Cry1F, описанные в US 6326169; 6281016; 6218188, или их токсичные фрагменты), белки типа Cry1A или их токсичные фрагменты, предпочтительно белок Cry1Ac или гибриды, полученные из белка Cry1Ac (например, гибридный белок Cry1Ab-Cry1Ac, описанный в US 5880275) или белок Cry1Ab или Bt2 или его инсектицидные фрагменты, как описано в EP 451878, белки Cry2Ae, Cry2Af или Cry2Ag, как описано в WO 2002/057664 или их токсичные фрагменты, белок Cry1A105, описанный в WO 2007/140256 (SEQ ID № 7) или его токсичный фрагмент, белок VIP3Aal9 с номером доступа NCBI ABG20428, белок VIP3Aa20 с номером доступа NCBI ABG20429 (SEQ ID № 2 в WO 2007/142840), белки VIP3A, получаемые в объектах хлопчатника COT202 или COT203(WO2005/054479 и WO2005/054480, соответственно), белки Cry, как описано в WO 2001/47952, белок VIP3Aa или его токсичный фрагмент, как описано в Estruch et al. (1996), ProcNatl Acad SciU S A. 28;93(11):5389-94 и US 6291156, инсектицидные белки из Xenorhabdus (как описано в WO 98/50427), Serratia (особенно, из S. entomophila) или штаммов видов Photorhabdus, таких как белки Tc из Photorhabdus, как описано в WO 98/08932 (например, Waterfield et al., 2001, Appl Environ Microbiol. 67(11):5017-24; Ffrench-Constant and Bowen, 2000, Cell Mol Life Sci.; 57(5):828-33). Кроме того, в настоящий документ включены любые варианты или мутанты любого из этих белков, отличающиеся по какой-либо (1-10, предпочтительно 1-5) из аминокислотам из любых вышеуказанных последовательностей, особенно, последовательности их токсичного фрагмента или которые слиты с транзитным пептидом, таким как транзитный пептид, направляющий в пластиду, или другой белок или пептид.

В различных вариантах осуществления нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть объединена в растениях с одним или несколькими генами, обеспечивающими необходимый признак, такой как толерантность к гербицидам, толерантность к насекомым, толерантность к засухам, борьба с нематодами, эффективность использования воды, эффективность использования азота, улучшенная пищевая ценность, устойчивость к заболеваниям, улучшенный фотосинтез, улучшенное качество волокна, толерантность к стрессу, улучшенное размножение и т.п.

Особенно пригодные трансгенные объекты, которые можно объединять с генами по настоящему изобретению в растениях тех же видов (например, путем скрещивания или путем повторной трансформации растения, содержащего другой трансгенный объект с химерным геном по настоящему изобретению), включают объект 531/PV-GHBK04 (хлопчатник, контроль насекомых, описан в W0 2002/040677), объект 1143-14A (хлопчатник, контроль насекомых, не депонирован, описан в WO 2006/128569); объект 1143-5 IB (хлопчатник, контроль насекомых, не депонирован, описан в WO 2006/128570); объект 1445 (хлопчатник, толерантный к гербицидам, не депонирован, описан в US-A 2002-120964 или WO 2002/034946); объект 17053 (рис, толерантный к гербицидам, депонирован как PTA-9843, описан в WO 2010/117737); Объект 17314 (рис, толерантный к гербицидам, депонирован как PTA-9844, описан в WO 2010/117735); объект 281-24-236 (хлопчатник, контроль насекомых, толерантный к гербицидам, депонирован как PTA-6233, описан в WO 2005/103266 или US-A 2005-216969); объект 3006-210-23 (хлопчатник, контроль насекомых, толерантный к гербицидам, депонирован как PTA-6233, описан в US-A 2007-143876 или WO 2005/103266); объект 3272 (кукуруза, качественный признак, депонирован как PTA-9972, описан в WO 2006/098952 или US-A 2006-230473); объект 33391 (пшеница, толерантный к гербицидам, депонирован как PTA-2347, описан в WO 2002/027004), объект 40416 (кукуруза, контроль насекомых, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-11508, описан в WO 11/075593); объект 43A47 (кукуруза, контроль насекомых, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-11509, описан в WO 2011/075595); объект 5307 (кукуруза, контроль насекомых, депонирован как ATCC PTA-9561, описан в WO 2010/077816); объект ASR-368 (полевица, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-4816, описан в US-A 2006-162007 или WO 2004/053062); объект B16 (кукуруза, толерантный к гербицидам, не депонирован, описан в US-A 2003-126634); объект BPS-CV127-9 (соя, толерантный к гербицидам, депонирован как NCIMB № 41603, описан в WO 2010/080829); объект BLR1 (масличный рапс, восстановление мужской стерильности, депонирован как NCIMB 41193, описан в WO 2005/074671), объект CE43-67B (хлопчатник, контроль насекомых, депонирован как DSM ACC2724, описан в US-A 2009-217423 или WO 2006/128573); объект CE44-69D (хлопчатник, контроль насекомых, не депонирован, описан в US-A 2010-0024077); объект CE44-69D (хлопчатник, контроль насекомых, не депонирован, описан в WO 2006/128571); объект CE46-02A (хлопчатник, контроль насекомых, не депонирован, описан в WO 2006/128572); объект COT102 (хлопчатник, контроль насекомых, не депонирован, описан в US-A 2006-130175 или WO 2004/039986); объект COT202 (хлопчатник, контроль насекомых, не депонирован, описан в US-A 12007-067868 или WO 2005/054479); объект COT203 (хлопчатник, контроль насекомых, не депонирован, описан в WO 2005/054480); объект DAS21606-3/1606 (соя, толерантный к гербицидам, депонирован как PTA-11028, описан в WO 2012/033794), объект DAS40278 (кукуруза, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-10244, описан в WO 2011/022469); объект DAS-44406-6/pDAB8264.44.06.1 (соя, толерантный к гербицидам, депонирован как PTA-11336, описан в WO 2012/075426), объект DAS-14536-7/pDAB8291.45.36.2 (соя, толерантный к гербицидам, депонирован как PTA-11335, описан в WO 2012/075429), объект DAS-59122-7 (кукуруза, контроль насекомых, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA 11384, описан в US-A 2006-070139); объект DAS-59132 (кукуруза, контроль насекомых, толерантный к гербицидам, не депонирован, описан в WO 2009/100188); объект DAS68416 (соя, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-10442, описан в WO 2011/066384 или WO 2011/066360); объект DP-098140-6 (кукуруза, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-8296, описан в US-A 2009-137395 или WO 08/112019); объект DP-305423-1 (соя, качественный признак, не депонирован, описан в US-A 2008-312082 или WO 2008/054747); объект DP-32138-1 (кукуруза, система гибридизации, депонирован как ATCC PTA-9158, описан в US-A 2009-0210970 или WO 2009/103049); объект DP-356043-5 (соя, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-8287, описан в US-A 2010-0184079 или WO 2008/002872); объект EE-1 (баклажан, контроль насекомых, не депонирован, описан в WO 07/091277); объект FI117 (кукуруза, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC 209031, описан в US-A 2006-059581 или WO 98/044140); объект FG72 (соя, толерантный к гербицидам, депонирован как PTA-11041, описан в WO 2011/063413), объект GA21 (кукуруза, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC 209033, описан в US-A 2005-086719 или WO 98/044140); объект GG25 (кукуруза, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC 209032, описан в US-A 2005-188434 или WO 98/044140); объект GHB119 (хлопчатник, контроль насекомых, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-8398, описан в WO 2008/151780); объект GHB614 (хлопчатник, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-6878, описан в US-A 2010-050282 или WO 2007/017186); объект GJ11 (кукуруза, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC 209030, описан в US-A 2005-188434 или WO 98/044140); объект GM RZ13 (сахарная свекла, устойчивость к вирусам, депонирован как NCIMB-41601, описан в WO 2010/076212); объект H7-1 (сахарная свекла, толерантный к гербицидам, депонирован как NCIMB 41158 или NCIMB 41159, описан в US-A 2004-172669 или WO 2004/074492); объект JOPLIN1 (пшеница, толерантный к заболеваниям, не депонирован, описан в US-A 2008-064032); объект LL27 (соя, толерантный к гербицидам, депонирован как NCIMB41658, описан в WO 2006/108674 или US-A 2008-320616); объект LL55 (соя, толерантный к гербицидам, депонирован как NCIMB 41660, описан в WO 2006/108675 или US-A 2008-196127); объект LLcotton25 (хлопчатник, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-3343, описан в WO 2003/013224 или US-A 2003-097687); объект LLRICE06 (рис, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC 203353, описан в US 6468747 или WO 2000/026345); объект LLRice62 (рис, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC 203352, описан в WO 2000/026345), объект LLRICE601 (рис, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-2600, описан в US-A 2008-2289060 или WO 2000/026356); объект LY038 (кукуруза, качественный признак, депонирован как ATCC PTA-5623, описан в US-A 2007-028322 или WO 2005/061720); объект MIR162 (кукуруза, контроль насекомых, депонирован как PTA-8166, описан в US-A 2009- 300784 или WO 2007/142840); объект MIR604 (кукуруза, контроль насекомых, не депонирован, описан в US-A 2008-167456 или WO 2005/103301); объект MON15985 (хлопчатник, контроль насекомых, депонирован как ATCC PTA-2516, описан в US-A 2004-250317 или WO 2002/100163); объект MON810 (кукуруза, контроль насекомых, не депонирован, описан в US-A 2002-102582); объект MON863 (кукуруза, контроль насекомых, депонирован как ATCC PTA-2605, описан в WO 2004/011601 или US-A 2006-095986); объект MON87427 (кукуруза, контроль опыления, депонирован как ATCC PTA-7899, описан в WO 2011/062904); объект MON87460 (кукуруза, толерантный к стрессу, депонирован как ATCC PTA-8910, описан в WO 2009/111263 или US-A 2011-0138504); объект MON87701 (соя, контроль насекомых, депонирован как ATCC PTA-8194, описан в US-A 2009-130071 или WO 2009/064652); объект MON87705 (соя, качественный признак, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-9241, описан в US-A 2010-0080887 или WO 2010/037016); объект MON87708 (соя, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-9670, описан в WO 2011/034704); объект MON87712 (соя, урожайность, депонирован как PTA-10296, описан в WO 2012/051199), объект MON87754 (соя, качественный признак, депонирован как ATCC PTA-9385, описан в WO 2010/024976); объект MON87769 (соя, качественный признак, депонирован как ATCC PTA-8911, описан в US-A 2011-0067141 или WO 2009/102873); объект MON88017 (кукуруза, контроль насекомых, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-5582, описан в US-A 2008-028482 или WO 2005/059103); объект MON88913 (хлопчатник, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-4854, описан в WO 2004/072235 или US-A 2006-059590); объект MON88302 (масличный рапс, толерантный к гербицидам, депонирован как PTA-10955, описан в WO 2011/153186); объект MON88701 (хлопчатник, толерантный к гербицидам, депонирован как PTA-11754, описан в WO 2012/134808); объект MON89034 (кукуруза, контроль насекомых, депонирован как ATCC PTA-7455, описан в WO 07/140256 или US-A 2008-260932); объект MON89788 (соя, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-6708, описан в US-A 2006-282915 или WO 2006/130436); объект MS11 (масличный рапс, контроль опыления, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-850 или PTA-2485, описан в WO 2001/031042); объект MS8 (масличный рапс, контроль опыления, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-730, описан в WO 2001/041558 или US-A 2003-188347); объект NK603 (кукуруза, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-2478, описан в US-A 2007-292854); объект PE-7 (рис, контроль насекомых, не депонирован, описан в WO 2008/114282); объект RF3 (масличный рапс, контроль опыления, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-730, описан в WO 2001/041558 или US-A 2003-188347); объект RT73 (масличный рапс, толерантный к гербицидам, не депонирован, описан в WO 2002/036831 или US-A 2008-070260); объект SYHT0H2/SYN-000H2-5 (соя, толерантный к гербицидам, депонирован как PTA-11226, описан в WO 2012/082548), объект T227-1 (сахарная свекла, толерантный к гербицидам, не депонирован, описан в WO 2002/44407 или US-A 2009-265817); объект T25 (кукуруза, толерантный к гербицидам, не депонирован, описан в US-A 2001-029014 или WO 2001/051654); объект T304-40 (хлопчатник, контроль насекомых, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-8171, описан в US-A 2010- 077501 или WO 2008/122406); объект T342-142 (хлопчатник, контроль насекомых, не депонирован, описан в WO 2006/128568); объект TC1507 (кукуруза, контроль насекомых, толерантный к гербицидам, не депонирован, описан в US-A 2005-039226 или WO 2004/099447); объект VIP1034 (кукуруза, контроль насекомых, толерантный к гербицидам, депонирован как ATCC PTA-3925, описан в WO 2003/052073); объект 32316 (кукуруза, контроль насекомых, толерантный к гербицидам, депонирован как PTA-11507, описан в WO 2011/084632); объект 4114 (кукуруза, контроль насекомых, толерантный к гербицидам, депонирован как PTA-11506, описан в WO 2011/084621); объект EE-GM3/FG72 (соя, толерантный к гербицидам, ATCC номер доступа PTA-11041) необязательно пакетирован с объектом EE-GM1/LL27 или объектом EE-GM2/LL55 (WO 2011/063413 A2), объект DAS-68416-4 (соя, толерантный к гербицидам, ATCC номер доступа PTA-10442, WO 2011/066360 A1), объект DAS-68416-4 (соя, толерантный к гербицидам, ATCC номер доступа PTA-10442, WO 2011/066384 A1), объект DP-040416-8 (кукуруза, контроль насекомых, ATCC номер доступа PTA-11508 WO 2011/075593 A1), объект DP-043A47-3 (кукуруза, контроль насекомых, ATCC номер доступа PTA-11509, WO 2011/075595 A1), объект DP-004114-3 (кукуруза, контроль насекомых, ATCC номер доступа PTA-11506, WO 2011/084621 Al), объект DP-032316-8 (кукуруза, контроль насекомых, ATCC номер доступа PTA-11507, WO 2011/084632 A1), объект MON-88302-9 (масличный рапс, толерантный к гербицидам, ATCC номер доступа PTA-10955, WO 2011/153186 A1), объект DAS-21606-3 (соя, толерантный к гербицидам, ATCC номер доступа PTA-11028, WO 2012/033794 A2), объект MON-87712-4 (соя, качественный признак, ATCC номер доступа PTA-10296, WO 2012/051199 A2), объект DAS-44406-6 (соя, толерантность к пакету гербицидов, ATCC номер доступа PTA-11336, WO 2012/075426 A1), объект DAS-14536-7 (соя, толерантность к пакету гербицидов, ATCC номер доступа PTA-11335, WO 2012/075429 A1), объект SYN-000H2-5 (соя, толерантный к гербицидам, ATCC номер доступа PTA-11226, WO 2012/082548 A2), объект DP-061061-7 (масличный рапс, толерантный к гербицидам, номер депонирования не доступен, WO 2012071039 A1), объект DP-073496-4 (масличный рапс, толерантный к гербицидам, номер депонирования не доступен, US 2012131692), объект 8264.44.06.1 (соя, толерантность к пакету гербицидов, номер доступа PTA-11336, WO 2012075426 A2), объект 8291.45.36.2 (соя, толерантность к пакету гербицидов, номер доступа PTA-11335, WO 2012075429 A2), объект SYHT0H2 (соя, ATCC номер доступа. PTA-11226, WO 2012/082548A2), объект MON88701 (хлопчатник, ATCC номер доступа PTA-11754, WO 2012/134808A1), объект KK179-2 (люцерна, ATCC номер доступа PTA-11833, WO 2013/003558 A1), объект pDAB8264.42.32.1 (соя, толерантность к пакету гербицидов, ATCC номер доступа PTA-11993, WO 2013/010094 A1), объект MZDT09Y (кукуруза, ATCC номер доступа PTA-13025, WO 2013/012775 A1).

Трансформация растительных клеток может быть осуществлена одной из нескольких методик, известных из уровня техники. Пестицидный ген по настоящему изобретению может быть модифицирован для достижения или усиления экспрессии в растительных клетках. Как правило, конструкция, которая экспрессирует такой белок, должна содержать промотор для запуска транскрипции гена, а также 3' нетранслируемый участок для терминации транскрипции и полиаденилирования. Организация таких конструкций хорошо известна из уровня техники. В некоторых случаях может быть пригодным создать ген так, что полученный пептид секретируется внутри растительной клетки или иначе нацелен на таковую. Например, ген можно создать так, чтобы он содержал сигнальный пептид для облегчения переноса пептида в эндоплазматический ретикулум. Также может быть предпочтительно создана растительная кассета экспрессии, содержащая такой интрон так, что для экспрессии требуется процессинг мРНК интрона.

Как правило эта “растительная кассета экспрессии” будет встраиваться в “вектор трансформации растения”. Этот вектор трансформации растения может содержать один или несколько ДНК-векторов, необходимых для трансформации растения. Например, установившейся практикой в данной области является использование векторов трансформации растений, которые содержат более одного непрерывного сегмента ДНК. В уровне техники эти векторы зачастую называют “бинарными векторами”. Бинарные векторы, а также векторы с плазмидами-помощниками наиболее часто применяются при трансформации, опосредованной Agrobacterium, при этом размер и сложность сегментов ДНК, необходимых для достижения эффективной трансформации, являются очень большими, и предпочтительным является разделение функций на отдельных молекулах ДНК. Бинарные векторы, как правило, содержат плазмидный вектор, который содержит действующие в цис-положении последовательности, требуемые для переноса Т-ДНК (как, например, левой границы и правой границы), селектируемый маркер, который создают таким образом, что он может экспрессироваться в растительной клетке, и “ген, представляющий интерес” (ген, разработанный таким образом, что он может экспрессироваться в растительной клетке, из которой необходимо получить трансгенные растения). Также в этом плазмидном векторе присутствуют последовательности, необходимые для репликации в бактериях. Действующие в цис-положении последовательности расположены так, чтобы обеспечить возможность эффективного переноса в растительные клетки и экспрессии в них. Например, ген селектируемого маркера и пестицидного гена расположены между левой и правой границами. Часто второй плазмидный вектор содержит действующие в транс-положении факторы, которые опосредуют перенос T-ДНК из Agrobacterium в растительные клетки. Эта плазмида часто содержит функции вирулентности (гены Vir), что обеспечивает возможность заражения растительных клеток Agrobacterium и перенос ДНК путем расщепления по граничным последовательностям и переноса ДНК, опосредованного vir, как понятно из уровня техники (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Несколько типов штаммов Agrobacterium (например, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105 и т.п.) можно применять для трансформации растений. Второй плазмидный вектор не является необходимым для трансформации растений другими способами, такими как бомбардировка микрочастицами, микроинъекция, электропорация, с помощью полиэтиленгоиколя и т.п.

В целом, способы трансформации растений включают перенос гетерологичной ДНК в целевые растительные клетки (например, незрелые или зрелые зародыши, суспензионные культуры, недифференцированный каллюс, протопласты и т.п.), с последующим применением соответствующего отбора с максимальным пороговым значением (в зависимости от гена селектируемого маркера) для выделения трансформированных растительных клеток из группы нетрансформированной клеточной массы. Эксплантаты, как правило, переносят на свежую порцию той же среды и культивируют обычным способом. Впоследствии трансформированные клетки дифференцируются в побеги после помещения в среду для регенерации, дополненную средством отбора с максимальным пороговым значением. Побеги затем переносят на селективную среду для выращивания растений с получением укоренившихся побегов или саженцев. Затем трансгенный саженец выращивают до зрелого растения и получают фертильные семена (например, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Эксплантаты, как правило, переносят на свежую порцию той же среды и культивируют обычным способом. Общее описание методик и способов для получения трансгенных растений приведены в Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 и Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Поскольку трансформированный материал содержит множество клеток, как трансформированные, так и нетрансформированные клетки присутствуют в любой части подвергнутого воздействию целевого каллюса или ткани, или группы клеток. Возможность уничтожать нетрансформированные клетки и обеспечивать размножение трансформированных клеток приводит в результате к трансформированным растительным культурам. Зачастую, возможность удаления нетрансформированных клеток является ограничивающим фактором для быстрого получения трансформированных растительных клеток и успешного получения трансгенных растений.

Протоколы трансформации, а также протоколы для введения нуклеотидных последовательностей в растения могут варьировать в зависимости от типа растения или растительной клетки, т.е. однодольных или двудольных, на которые нацелена трансформация. Получение трансгенных растений можно осуществлять одним из нескольких способов, в том числе без ограничения микроинъекцией, электропорацией, прямым переносом гена, встраиванием в растительные клетки гетерологичной ДНК с помощью Agrobacterium (трансформация, опосредованная Agrobacteriuin), бомбардировкой растительных клеток гетерологичной чужеродной ДНК, прикрепленной к частицам, баллистическим ускорением частиц, трансформацией с применением обработки аэрозолем (опубликованная заявка на патент США № 20010026941; патент США № 4945050; международная публикация WO 91/00915; опубликованная заявка на патент США № 2002015066), трансформацией Lecl и различными другими способами переноса ДНК, прямо не опосредованными частицами.

Способы трансформации хлоропластов известны из уровня техники. См., например, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. Способ основан на доставке генной пушкой ДНК, содержащей селектируемый маркер, и нацеливании ДНК в геном пластид с помощью гомологичной рекомбинации. Кроме того, трансформацию пластид можно осуществлять трансактивацией молчащего трансгена, находящегося в пластидах, путем экспрессии, осуществляемой преимущественно в определенной ткани, РНК-полимеразы, кодируемой ядерным геномом и функционирующей в пластиде. О такой системе было сообщено в McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

После интеграции гетерологичной чужеродной ДНК в растительные клетки затем применяют соответствующий отбор с максимальным пороговым значением в среде для уничтожения нетрансформированных клеток и отделения и размножения предположительно трансформированных клеток, которые переживают эту обработку с отбором, посредством регулярного переноса на свежую среду. При помощи продолжающегося пассирования и проверки при помощи соответствующего отбора идентифицируют и размножают клетки, которые трансформированы плазмидным вектором. Затем можно применять молекулярные и биохимические способы для подтверждения присутствия интегрированного гетерологичного гена, представляющего интерес, в геноме трансгенного растения.

Из клеток, которые были трансформированы, можно вырастить растения в соответствии с традиционными способами. См., например, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Эти растения можно затем выращивать и опылять с помощью либо той же самой трансформированной линии, либо других линий, и идентифицировать полученный гибрид, который характеризуется конститутивным проявлением указанной необходимой фенотипической характеристики. Можно вырастить два или более поколений, чтобы убедиться в том, что экспрессия требуемой фенотипической характеристики стабильно поддерживается и наследуется, а затем собрать семена, чтобы убедиться в том, что была достигнута экспрессия необходимой фенотипической характеристики. Таким образом, в настоящем изобретении представлено трансформированное семя (также называемое “трансгенным семенем”), имеющее нуклеотидную конструкцию по настоящему изобретению, например, кассету экспрессии по настоящему изобретению, стабильно встроенную в его геном.

Оценка трансформации растений

После введения гетерологичной чужеродной ДНК в растительные клетки трансформацию или интеграцию гетерологичного гена в геном растения подтверждают при помощи различных способов, таких как анализ нуклеиновых кислот, белков и метаболитов, связанных с интегрированным геном.

ПЦР-анализ представляет собой быстрый способ скрининга трансформированных клеток, ткани или побегов в отношении присутствия встроенного гена на ранней стадии перед высаживанием в почву (Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). ПЦР осуществляют с применением олигонуклеотидных праймеров, специфичных к гену, который представляет интерес, или к исходным последовательностям вектора на основе Agrobacterium и т.п.

Трансформацию растений можно подтвердить с помощью саузерн-блот анализа геномной ДНК (Sambrook and Russell, 2001, выше). В целом, общую ДНК экстрагируют из трансформанта, разрезают соответствующими ферментами рестрикции, фракционируют в агарозном геле и переносят на нитроцеллюлозную или найлоновую мембрану. Затем мембрану или “блот” анализируют с помощью зонда, например, целевого фрагмента ДНК с радиоактивной меткой P для подтверждения интеграции внедренного гена в геном растения в соответствии со стандартными методиками (Sambrook and Russell, 2001, выше).

При нозерн-блот анализе РНК выделяют из специфических тканей трансформанта, фракционируют в агарозном геле, содержащем формальдегид, и переносят на найлоновый фильтр в соответствии со стандартными методиками, которые обычно применяются в области техники (Sambrook and Russell, 2001, выше). Экспрессию РНК, кодируемой пестицидным геном, затем тестировали при помощи гибридизации фильтра с радиоактивным зондом, полученным из пестицидного гена, посредством способов, известных из уровня техники (Sambrook and Russell, 2001, выше).

Вестерн-блот, биохимические анализы и подобные можно осуществлять в отношении трансгенных растений для подтверждения присутствия белка, кодируемого пестицидным геном, при помощи стандартных методик (Sambrook and Russell, 2001, выше), с применением антител, которые связываются с одним или несколькими эпитопами, присутствующими на пестицидном белке.

Пестицидная активность в растениях

В другом аспекте настоящего изобретения можно получить трансгенные растения, экспрессирующие пестицидный белок, который обладает пестицидной активностью. Для получения трансгенных растений могут быть применены способы, описанные выше в качестве примера, но то, каким образом получают трансгенные растения, не является решающим фактором для настоящего изобретения. На усмотрение экспериментатора могут быть применены способы, известные или описанные в уровне техники, такие как трансформация, опосредованная Agrobacterium, биолистическая трансформация и способы, не опосредованные частицами. Растения, экспрессирующие пестицидный белок, можно выделять стандартными способами, описанными в уровне техники, например, трансформацией каллюса, отбором трансформированного каллюса и регенерацией фертильных растений из такого трансгенного каллюса. В таком процессе в качестве селектируемого маркера можно применять любой ген при условии, что его экспрессия в растительных клетках обеспечивает возможность идентифицировать или отобрать трансформированные клетки.

Для использования с растительными клетками было разработано большое количество маркеров, таких как устойчивость к хлорамфениколу, аминогликозиду G418, гигромицину или подобным. В качестве селектируемых маркеров также могут быть использованы другие гены, которые кодируют продукт, участвующий в метаболизме хлоропластов. Например, могут найти особое применение гены, которые обеспечивают устойчивость растений к гербицидам, таким как глифосат, бромоксинил или имидазолинон. Такие гены были описаны (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (ген нитрилазы, устойчивость к бромоксинилу); и Sathasivan et al. (1990) Nacl. Acids Res. 18:2188 (ген AHAS, устойчивость к имидазолинону). Кроме того, гены, раскрытые в настоящем документе, пригодны в качестве маркеров для оценки трансформации бактериальных или растительных клеток. Способы выявления наличия трансгена в растении, органе растения (например, листьях, стеблях, корнях и т.п.), семенах, растительной клетке, частях растения для вегетативного размножения, зародыше или их потомстве хорошо известны из уровня техники. В одном варианте осуществления наличие трансгена выявляют посредством тестирования пестицидной активности.

Фертильные растения, экспрессирующие пестицидный белок, могут быть протестированы на пестицидную активность, и растения, у которых наблюдается оптимальная активность, отобраны для дополнительной селекции. Способы оценки активности против вредителей доступны из уровня техники. Как правило, белок смешивают и применяют в анализах питания. См., например, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

Настоящее изобретение можно применять для трансформации любых видов растений, в том числе без ограничений однодольных и двудольных растений. Примеры растений, которые представляют интерес, включают без ограничения кукурузу (маис), сорго, пшеницу, подсолнечник, томат, крестоцветные, перцы, картофель, хлопчатник, рис, сою, сахарную свеклу, сахарный тростник, табак, ячмень и масличный рапс, Brassica sp., люцерну, рожь, просо, сафлор, арахис, батат, маниоку, кофе, кокос, ананас, цитрусовые деревья, какао, чай, банан, авокадо, инжир, гуаяву, манго, маслину, дынное дерево, анакард, макадамию, миндаль, овес, овощи, декоративные растения и хвойные деревья.

Овощные культуры включают без ограничения томаты, салат-латук, зеленую фасоль, фасоль Лима, горох и члены рода Curcumis, такие как огурец, мускусную дыню и мускусный арбуз. Декоративные растения включают без ограничения азалию, гортензию, гибискус, розы, тюльпаны, желтые нарциссы, петунии, гвоздику, пуансеттию и хризантему. Предпочтительно растения по настоящему изобретению представляют собой сельскохозяйственные культуры (например, маис, сорго, пшеницу, подсолнечник, томат, крестоцветные, перцы, картофель, хлопчатник, рис, сою, сахарную свеклу, сахарный тростник, табак, ячмень, масличный рапс и т.п.).

Применение в пестицидном контроле

Из уровня техники известны общие способы применения штаммов, содержащих нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению или ее вариант, при контроле вредителей или при создании других организмов в качестве пестицидных агентов. См., например, патент США № 5039523 и EP 0480762 A2.

Штаммы Bacillus, содержащие нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению или ее вариант, или микроорганизмы, которые были генетически изменены так, что содержат пестицидный ген по настоящему изобретению и белок, могут быть использованы для защиты сельскохозяйственных культур и продуктов от вредителей. В одном аспекте настоящего изобретения целые, т.е. нелизированные клетки организма, продуцирующего токсин (пестицид), обрабатывают реагентами, которые продлевают активность токсина, продуцируемого в клетке, при применении клетки в среде целевого вредителя(ей).

В качестве альтернативы, пестицид получают введением пестицидного гена в клеточный хозяин. Экспрессия пестицидного гена непосредственно или косвенно приводит к внутриклеточному продуцированию и сохранению пестицида. В одном аспекте настоящего изобретения эти клетки затем обрабатывают в условиях, которые продлевают активность токсина, продуцируемого в клетке, при применении клетки в среде целевого вредителя(ей). Полученный продукт сохраняет токсичность токсина. Эти инкапсулированные естественным путем пестициды затем можно составлять в соответствии с традиционными методиками внесения в среду пребывания целевого вредителя, например, в почву, воду или на листья растений. См., например, EPA 0192319 и ссылки, приведенные в нем. В качестве альтернативы, можно составить клетки, экспрессирующие ген по настоящему изобретению, таким образом, чтобы обеспечить применение получаемого материала в качестве пестицида.

Активные ингредиенты по настоящему изобретению обычно применяют в виде композиций и их можно применять по отношению к возделываемой площади или растению, подлежащему обработке, одновременно или последовательно с другими соединениями. Эти соединения могут представлять собой удобрения, средства борьбы с сорняками, криопротекторы, поверхностно-активные вещества, детергенты, пестицидные мыла, масла, применяемые во время состояния покоя, полимеры и/или составы с носителем с замедленным высвобождением или биоразлагаемым носителем, который обеспечивает длительное дозирование в целевой области после однократного внесения состава. Они также могут представлять собой селективные гербициды, химические инсектициды, вируциды, микробиоциды, амебоциды, пестициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды, моллюскоциды или смеси из нескольких этих препаратов, при необходимости, вместе с дополнительными приемлемыми с точки зрения сельского хозяйства носителями, поверхностно-активными веществами или вспомогательными средствами, способствующими внесению, традиционно используемыми в области техники, связанной с получением составов. Подходящие носители и вспомогательные средства могут быть твердыми или жидкими и соответствуют веществам, обычно используемым в технологии составления, например, природным или регенерированным минеральным веществам, растворителям, диспергирующим веществам, смачивающим средствам, веществам, придающим клейкость, связующим или удобрениям. Аналогично, составы можно готовить в виде съедобных “приманок” или формировать в “ловушки” для вредителей, что обеспечивает питание или заглатывание целевым вредителем пестицидного состава.

Способы внесения активного ингредиента по настоящему изобретению или агрохимической композиции по настоящему изобретению, которая содержит по меньшей мере один из пестицидных белков, продуцируемых бактериальными штаммами по настоящему изобретению, включают нанесение на листья, дражирование семян и внесение в почву. Количество внесений и норма внесения зависит от интенсивности заражения соответствующим вредителем.

Композицию можно составлять в виде порошка, дуста, таблетки, гранулы, распыляемого раствора, эмульсии, коллоида, раствора и т.п., и ее можно приготовить при помощи таких традиционных способов как высушивание, лиофилизация, гомогенизация, экстракция, фильтрация, центрифугирование, осаждение или концентрирование культуры клеток, содержащих полипептид. Во всех таких композициях, которые содержат по меньшей мере один такой пестицидный полипептид, полипептид может присутствовать в концентрации от приблизительно 1% до приблизительно 99% по весу.

Чешуекрылых, полужесткокрылых, двукрылых или жесткокрылых вредителей можно уничтожать или снижать их количество в указанной области при помощи способов по настоящему изобретению, или средства можно вносить профилактически на область окружающей среды для предотвращения заражения восприимчивым вредителем. Предпочтительно, вредитель заглатывает пестицидно эффективное количество полипептида или контактирует с ним. Под "пестицидно эффективным количеством" подразумевают количество пестицида, которое может приводить к гибели по меньшей мере одного вредителя или к заметно сниженному росту, питанию или нормальному физиологическому развитию вредителя. Это количество будет варьировать в зависимости от таких факторов, как, например, специфических целевых вредителей, подлежащих контролю, специфической среды, местоположения, растения, культуры или сельскохозяйственного сайта, подлежащего обработке, условий окружающей среды и способа, нормы, концентрации, стабильности и количества внесений пестицидно-эффективной полипептидной композиции. Составы также могут варьировать в зависимости от климатических условий, экологических соображений и/или частоты внесения и/или тяжести заражения вредителями.

Описанные пестицидные композиции можно получать путем составления либо суспензии бактериальных клеток, кристаллов и/или спор, либо выделенного белкового компонента с необходимым носителем, приемлемым с точки зрения сельского хозяйства. Композиции можно составлять перед введением с помощью надлежащих способов, таких как лиофилизация, сублимационная сушка, высушивание, или в водном носителе, среде или подходящем растворителе, таком как солевой раствор или другой буфер. Составленные композиции могут находиться в форме дуста, или гранулированного материала, или суспензии в масле (растительном или минеральном), или водной эмульсии или эмульсии масло/вода, или в виде смачиваемого порошка, или в комбинации с каким-либо другим материалом носителя, подходящим для сельскохозяйственного применения. Подходящие носители, приемлемые с точки зрения сельского хозяйства, могут быть твердыми или жидкими и хорошо известны из уровня техники. Термин “приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель” охватывает все вспомогательные средства, инертные компоненты, диспергирующие вещества, поверхностно-активные вещества, вещества, придающие клейкость, связующие и т.п., которые обычно применяются в технологии составления пестицидов; причем они хорошо известны специалистам по составлению пестицидов. Составы можно смешивать с одним или несколькими твердыми или жидкими вспомогательными веществами и получать при помощи различных способов, например, путем равномерного перемешивания, смешивания и/или размалывания пестицидной композиции с подходящими вспомогательными средствами с применением традиционных методик составления. Подходящие составы и способы внесения описаны в патенте США № 6468523, включенном в настоящий документ посредством ссылки.

“Вредитель” включает без ограничений насекомых, грибы, бактерии, нематод, клещей, иксодовых клещей и т.п. Насекомые-вредители включают насекомых, выбранных из отрядов Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, и т.п., особенно Coleoptera, Lepidoptera, и Diptera.

Отряд Coleoptera включает подотряды Adephaga и Polyphaga. Подотряд Adephaga включает надсемейства Caraboidea и Gyrinoidea, тогда как подотряд Polyphaga включает надсемейства Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea, и Curculionoidea. Надсемейство Caraboidea включает семейства Cicindelidae, Carabidae и Dytiscidae. Надсемейство Gyrinoidea включает семейство Gyrinidae. Надсемейство Hydrophiloidea включает семейство Hydrophilidae. Надсемейство Staphylinoidea включает семейства Silphidae и Staphylinidae. Надсемейство Cantharoidea включает семейства Cantharidae и Lampyridae. Надсемейство Cleroidea включает семейства Cleridae и Dermestidae. Надсемейство Elateroidea включает семейства Elateridae и Buprestidae. Надсемейство Cucujoidea включает семейство Coccinellidae. Надсемейство Meloidea включает семейство Meloidae. Надсемейство Tenebrionoidea включает семейство Tenebrionidae. Надсемейство Scarabaeoidea включает семейства Passalidae и Scarabaeidae. Надсемейство Cerambycoidea включает семейство Cerambycidae. Надсемейство Chrysomeloidea включает семейство Chrysomelidae. Надсемейство Curculionoidea включает семейства Curculionidae и Scolytidae.

Отряд Diptera включает подотряды Nematocera, Brachycera и Cyclorrhapha. Подотряд Nematocera включает семейства Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae и Cecidomyiidae. Подотряд Brachycera включает семейства Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae и Dolichopodidae. Подотряд Cyclorrhapha включает инфраотряды Aschiza и Aschiza. Инфраотряд Aschiza включает семейства Phoridae, Syrphidae и Conopidae. Инфраотряд Aschiza включает секции Acalyptratae и Calyptratae. Секция Acalyptratae включает семейства Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae и Drosophilidae. Секция Calyptratae включает семейства Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae и Sarcophagidae.

Отряд Lepidoptera включает семейства Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae и Tineidae.

Нематоды включают паразитических нематод, таких как галловые, цистообразующие и ранящие нематоды, в том числе Heterodera spp., Meloidogyne spp., и Globodera spp.; в частности, представителей цистообразующих нематод, в том числе без ограничения, Heterodera glycines (соевая цистообразующая нематода); Heterodera schachtii (цистообразующая нематода свеклы); Heterodera avenae (цистообразующая нематода злаков); и Globodera rostochiensis и Globodera pailida (цистообразующие нематоды картофеля). Ранящие нематоды включают Pratylenchus spp.

Полужестокрылые вредители (которые включают виды, которые определяют как Hemiptera, Homoptera или Heteroptera) включают без ограничения Lygus spp., такие как слепняк западный (Lygus hesperus), клоп луговой (Lygus lineolaris) и зеленый слепняк (Lygus elisus); тля, такая как тля персиковая зеленая (Myzus persicae), тля хлопковая (Aphis gossypii), тля вишневая (Myzus cerasi), тля соевая (Aphis glycines Matsumura); бурая цикадка (Nilaparvata lugens) и рисовая цикадка зеленая (Nephotettix spp.), и щитники, такие как щитник зеленый (Acrosternum hilare), коричневый мраморный щитник (Halyomorpha halys), южный зеленый овощной клоп (Nezara viridula), рисовый клоп (Oebalus pugnax), щитник красноногий (Pentatoma rufipes), щитник европейский (Rhaphigaster nebulosa) и килевик (Troilus luridus).

Насекомые-вредители основных сельскохозяйственных культур по настоящему изобретению включаютследующие. Маис: Ostrinia nubilalis, огневка кукурузная; Agrotis ipsilon, совка-ипсилон; Helicoverpa zea, совка хлопковая; Spodoptera frugiperda, совка травяная; Diatraea grandiosella, огневка кукурузная юго-западная; Elasmopalpus lignosellus, малая кукурузная огневка; Diatraea saccharalis, огневка сахарного тростника; Diabrotica virgifera, западный кукурузный жук; Diabrotica longicornis barberi, северный кукурузный жук; Diabrotica longicornis howardi, южный кукурузный жук; Melanotus spp., проволочники; Cyclocephala borealis, дупляк северный (личинка хруща); Cyclocephala immaculata, дупляк южный (личинка хруща); Popillia japonica, хрущик японский; Chaetocnema pulicaria, земляная кукурузная блошка; Sphenophorus maidis, долгоносик маисовый; Rhopalosiphum maidis, тля кукурузная листовая; Anuraphis maidiradicis, тля кукурузная корневая; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Melanoplus femurrubrum, краснобедрая кобылка; Melanoplus sanguinipes, кобылка мексиканская; Hylemya platura, муха ростковая; Agromyza parvicornis, кукурузная минирующая мушка; Anaphothrips obscrurus, трипс злаковый; Solenopsis milesta, муравей-вор; Tetranychus urticae, обыкновенный паутинный клещ. Сорго: Chilo partellus, огневка сорго; Spodoptera frugiperda, совка травяная; Spodoptera cosmioides; Spodoptera eridania; Helicoverpa zea, совка хлопковая; Elasmopalpus lignosellus, малая кукурузная огневка; Feltia subterranea, совка зернистая; Phyllophaga crinita, личинка хруща; Eleodes, Conoderus и Aeolus spp., проволочники; Oulema melanopus, пьявица красногрудая; Chaetocnema pulicaria, кукурузная земляная блошка; Sphenophorus maidis, долгоносик маисовый; Rhopalosiphum maidis, тля кукурузная листовая; Sipha flava, тля желтая сахарного тростника; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Contarinia sorghicola, галлица сорговая; Tetranychus cinnabarinus, красный паутинный клещ; Tetranychus urticae, обыкновенный паутинный клещ. Пшеница: Pseudaletia unipunctata, совка луговая; Spodoptera frugiperda, совка травяная; Elasmopalpus lignosellus, малая кукурузная огневка; Agrotis orthogonia, совка прямоугольная; Elasmopalpus lignosellus, малая кукурузная огневка; Oulema melanopus, пьявица красногрудая; Hypera punctata, долгоносик точечный; Diabrotica undecimpunctata howardi, южный кукурузный жук; русская пшеничная тля; Schizaphis graminum, тля злаковая обыкновенная; Macrosiphum avenae, тля листовая; Melanoplus femurrubrum, краснобедрая кобылка; Melanoplus differential, кобылка отличительная; Melanoplus sanguinipes, кобылка мексиканская; Mayetiola destructor, гессенская мушка; Sitodiplosis mosellana, галлица злаковая оранжевая; Meromyza americana, личинка американской меромизы; Hylemya coarctata, муха озимая; Frankliniella fusca, трипс табачный; Cephus cinctus, пилильщик хлебный; Aceria tulipae, луковичный клещ тюльпанов. Подсолнечник: Suleima helianthana, листовертка подсолнечниковая; Homoeosoma electellum, огневка подсолнечниковая; Zygogramma exclamationis, совка подсолнечниковый листоед; Bothyrus gibbosus, жук морковный; Neolasioptera murtfeldtiana, галлица подсолнечниковая. Хлопчатник: Heliothis virescens, хлопковая совка; Helicoverpa zea, коробочный червь; Spodoptera exigua, совка малая; Pectinophora gossypiella, розовый коробочный червь; Anthonomus grandis, долгоносик хлопковый; Aphis gossypii, тля хлопковая; Pseudatomoscelis seriatus, слепняк хлопковый; Trialeurodes abutilonea; белокрылка окаймленная; Lygus lineolaris, клоп луговой; Melanoplus femurrubrum, краснобедрая кобылка; Melanoplus differentialis, кобылка отличительная; Thrips tabaci, трипс луковый; Franklinkiella fusca, трипс табачный; Tetranychus cinnabarinus, красный паутинный клещ; Tetranychus urticae, обыкновенный паутинный клещ. Рис: Diatraea saccharalis, огневка сахарного тростника; Spodoptera frugiperda, совка травяная; Spodoptera cosmioides, Spodoptera cosmioides; Helicoverpa zea, совка хлопковая; Colaspis brunnea, листоед виноградный; Lissorhoptrus oryzophilus, долгоносик рисовый водяной; Sitophilus oryzae, долгоносик рисовый; Nephotettix nigropictus, рисовая цикадка; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Acrosternum hilare, щитник зеленый; Chilu suppressalis, огневка азиатская стеблевая. Соя: Pseudoplusia includens, совка соевая; Anticarsia gemmatalis, гусеница вельветовых бобов; Plathypena scabra, совка клеверная; Ostrinia nubilalis, огневка кукурузная; Agrotis ipsilon, совка-ипсилон; Spodoptera exigua, совка малая; Spodoptera cosmioides, Spodoptera cosmioides; Heliothis virescens, хлопковая совка; Helicoverpa zea, коробочный червь; Epilachna varivestis, мексиканская фасолевая коровка; Myzus persicae, тля персиковая зеленая; Empoasca fabae, цикадка картофельная; Acrosternum hilare, щитник зеленый; Melanoplus femurrubrum, краснобедрая кобылка; Melanoplus differentialis, кобылка отличительная; Hylemya platura, личинка мухи ростковой; Sericothrips variabilis, трипс соевый; Thrips tabaci, трипс табачный; Tetranychus turkestani, туркестанский паутинный клещ; Tetranychus urticae, обыкновенный паутинный клещ. Ячмень: Ostrinia nubilalis, огневка кукурузная; Agrotis ipsilon, совка-ипсилон; Schizaphis graminum, тля злаковая обыкновенная; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Acrosternum hilare, щитник зеленый; Euschistus servus, клоп коричневый вонючий; Euschistus heros, неотропический клоп коричневый вонючий; Delia platura, личинка мухи ростковой; Mayetiola destructor, гессенская мушка; Petrobia latens, петробия многоядная. Масличный рапс: Brevicoryne brassicae, тля капустная; Phyllotreta cruciferae, блошка крестоцветная; Mamestra configurata, совка латуковая; Plutella xylostella, моль капустная; Delia ssp., личинки корневые.

Способы повышения урожайности растений

Представлены способы повышения урожайности растения. Способы включают получение растения или растительной клетки, экспрессирующих полинуклеотид, кодирующий пестицидную полипептидную последовательность, раскрытую в данном документе, и выращивание растения или его семени в поле, зараженном вредителем (или подверженном заражению), по отношению к которому указанный полипептид обладает пестицидной активностью. В некоторых вариантах осуществления полипептид обладает пестицидной активностью против чешуекрылого, жесткокрылого, двукрылого, полужесткокрылого или нематодного вредителя, и указанное поле заражено чешуекрылым, полужесткокрылым, жесткокрылым, двукрылым или нематодным вредителем. Как определяется в данном документе, “урожайностью” растения называют качество и/или количество биомассы, продуцируемой растением. Под "биомассой" подразумевают любой оцененный продукт растения. Повышением продуцирования биомассы является любое улучшение урожайности измеренного продукта растения. Повышение урожайности растения имеет несколько коммерческих применений. Например, повышение биомассы листьев растения может повышать урожайность листовых овощей для потребления человеком или животными. Кроме того, повышение биомассы листьев можно применять для повышения производства фармацевтических или промышленных продуктов растительного происхождения. Повышение урожайности может включать любое статистически значимое повышение, в том числе без ограничения, по меньшей мере 1% повышение, по меньшей мере 3% повышение, по меньшей мере 5% повышение, по меньшей мере 10% повышение, по меньшей мере 20% повышение, по меньшей мере 30% повышение, по меньшей мере 50% повышение, по меньшей мере 70% повышение, по меньшей мере 100% или большее повышение урожайности по сравнению с растением, не экспрессирующим пестицидную последовательность. В определенных способах урожайность растения повышается в результате улучшенной устойчивости к вредителю растения, экспрессирующего пестицидный белок, описанный в настоящем документе. Экспрессия пестицидного белка приводит к сниженной способности вредителя к заражению или питанию.

Растения можно также обрабатывать одной или несколькими химическими композициями, в том числе одним или несколькими гербицидами, инсектицидами или фунгицидами. Иллюстративные химические композиции включают следующее. Гербициды для овощных/фруктовых культур: атразин, бромацил, диурон, глифосат, линурон, метрибузин, симазин, трифлуралин, флуазифоп, глуфосинат, галосульфурон от Gowan, паракват, пропизамид, сетоксидим, бутафенацил, галосульфурон, индазифлам. Инсектициды для фрутовых/овощных культур: альдикарб, Bacillus thuriengiensis, карбарил, карбофуран, хлорпирифос, циперметрин, дельтаметрин, абамектин, цифлутрин/бета-цифлутрин, эсфенвалерат, лямбда-цигалотрин, ацеквиноцил, бифеназат, метоксифенозид, новалурон, кромафенозид, тиаклоприд, динотефуран, флуакрипирим, спиродиклофен, гамма-цигалотрин, спиромезифен, спиносад, ринаксипир, циазипир, трифлумурон, спиротетрамат, имидаклоприд, флубендиамид, тиодикарб, метафлумизон, сульфоксафлор, цифлуметофен, цианопирафен, клотианидин, тиаметоксам, спиноторам, тиодикарб, флоникамид, метиокарб, эмамектин-бензоат, индоксакарб, фенамифос, пирипроксифен, фенбутатин-оксид. Фунгициды для фруктовых/овощных культур: аметокрадин, азоксистробин, бентиаваликарб, боскалид, каптан, карбендазим, хлорталонил, медь, циазофамид, цифлуфенамид, цимоксанил, ципроконазол, ципродинил, дифеноконазол, диметоморф, дитианон, фенамидон, фенгексамид, флуазинам, флудиоксонил, флуопиколид, флуопирам, флуоксастробин, флуоксапироксад, фолпет, фосетил, ипродион, ипроваликарб, изопиразам, крезоксим-метил, манкозеб, мандипропамид, металаксил/мефеноксам, метирам, метрафенон, миклобутанил, пенконазол, пентиопирад, пикоксистробин, пропамокарб, пропиконазол, пропинеб, проквиназид, протиоконазол, пираклостробин, пириметанил, квииноксифен, спироксамин, сера, тебуконазол, тиофанат-метил, трифлоксистробин. Гербициды для злаковых культур: 2.4-D, амидосульфурон, бромоксинил, карфентразон-Е, хлортолурон, хлорсульфурон, клодинафоп-P, клопиралид, дикамба, диклофоп-М, дифлуфеникан, феноксапроп, флорасулам, флукарбазон-NA, флуфенацет, флупиросульфурон-М, флуроксипир, флуртамон, глифосат, иодсульфурон, иоксинил, изопротурон, МСРА, мезосульфурон, метсульфурон, пендиметалин, пиноксаден, пропоксикарбазон, просульфокарб, пироксулам, сульфосульфурон, тифенсульфурон, тралкоксидим, триасульфурон, трибенурон, трифлуралин, тритосульфурон. Фунгициды для злаковых культур: азоксистробин, биксафен, боскалид, карбендазим, хлороталонил, цифлуфенамид, ципроконазол, ципродинил, димоксистробин, эпоксиконазол, фенпропидин, фенпропиморф, флуопирам, флуоксастробин, флуквинконазол, флуксапироксад, изопиразам, крезоксим-метил, метконазол, метрафенон, пентиопирад, пикоксистробин, прохлораз, пропиконазол, проквиназид, протиоконазол, пираклостробин, квиноксифен, спироксамин, тебуконазол, тиофанат-метил. Инсектициды для злаковых культур: диметоат, лямбда-цигалотрин, дельтаметрин, альфа-циперметрин, бета-цифлутрин, бифентрин, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, ацетамиприд, динетофуран, клорфирифос, пиримикарб, метиокарб, сульфоксафлор. Гербициды для маиса: атразин, алахлор, бромоксинил, ацетохлор, дикамба, клопиралид, (S-)диметенамид, глуфосинат, глифосат, изоксафлутол, (S-)метолахлор, мезотрион, никосульфурон, примисульфурон, римсульфурон, сулкотрион, форамсульфурон, топрамезон, темботрион, сафлюфенацил, тиенкарбазон, флуфенацет, пироксасульфон. Инсектициды для маиса: карбофуран, хлорпирифос, бифентрин, фипронил, имидаклоприд, лямбда-цигалотрин, тефлутрин, тербуфос, тиаметоксам, клотианидин, спиромезифен, флубендиамид, трифлумурон, ринаксипир, дельтаметрин, тиодикарб, β-цифлутрин, циперметрин, бифентрин, люфенурон, тебупиримфос, этипрол, циазипир, тиаклоприд, ацетамиприд, динетофуран, авермектин. Фунгициды для маиса: азоксистробин, биксафен, боскалид, ципроконазол, димоксистробин, эпоксиконазол, фенитропан, флуопирам, флуоксастробин, флуксапироксад, изопиразам, метконазол, пентиопирад, пикоксистробин, пропиконазол, протиоконазол, пираклостробин, тебуконазол, трифлоксистробин. Гербициды для риса: бутахлор, пропанил, азимсульфурон, бенсульфурон, цигалофоп, даимурон, фентразамид, имазосульфурон, мефенацет, оксазикломефон, пиразосульфурон, пирибутикарб, квинклорак, тиобенкарб, инданофан, флуфенацет, фентразамид, галосульфурон, оксазикломефон, бензобициклон, пирифталид, пеноксулам, биспирибак, оксадиаргил, этоксисульфурон, претилахлор, мезотрион, тефурилтрион, оксадиазон, феноксапроп, пиримисульфан. Инсектициды для риса: диазинон, фенобукарб, бенфуракарб, бупрофезин, динотефуран, фипронил, имидаклоприд, изопрокарб, тиаклоприд, хромафенозид, клотианидин, этипрол, флюбендиамид, ринаксипир, дельтаметрин, ацетамиприд, тиаметоксам, циазипир, спиносад, спиноторам, эмамектин-бензоат, циперметрин, хлорпирифос, этофенпрокс, карбофуран, бенфуракарб, сульфоксафлор. Фунгициды для риса: азоксистробин, карбендазим, карпропамид, диклоцимет, дифеноконазол, эдифенфос, феримзон, гентамицин, гексаконазол, гимексазол, ипробенфос (IBP), изопротиолан, изотианил, касугамицин, манкозеб, метоминостробин, орисастробин, пенцикурон, пробеназол, пропиконазол, пропинеб, пироквилон, тебуконазол, тиофанат-метил, тиадинил, трициклазол, трифлоксистробин, валидамицин. Гербициды для хлопчатника: диурон, флуометурон, MSMA, оксифлуорфен, прометрин, трифлуралин, карфентразон, клетодим, флуазифоп-бутил, глифосат, норфлуразон, пендиметалин, пиритиобак-натрий, трифлоксисульфурон, тепралоксидим, глуфосинат, флумиоксазин, тидиазурон. Инсектициды для хлопчатника: ацефат, альдикарб, хлорпирифос, циперметрин, дельтаметрин, абамектин, ацетамиприд, эмамектин бензоат, имидаклоприд, индоксакарб, лямбда-цигалотрин, спиносад, тиодикарб, гамма-цигалотрин, спиромезифен, пиридалил, флоникамид, флубендиамид, трифлумурон, ринаксипир, бета-цифлутрин, спиротетрамат, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, динетофуран, флубендиамид, трифлумурон, ринаксипир, бета-цифлутрин, спиротетрамат, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, динетофуран, флубендиамид, циазипир, спиносад, спиноторам, гамма-цигалотрин, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5H)-он, тиодикарб, авермектин, флоникамид, пиридалил, спиромезифен, сульфоксафлор. Фунгициды для хлопчатника: азоксистробин, биксафен, боскалид, карбендазим, хлорталонил, медь, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробин, эпоксиконазол, фенамидон, флуазинам, флуопирам, флуоксастробин, флуксапироксад, ипродион, изопиразам, изотианил, манкозеб, манеб, метоминостробин, пентиопирад, пикоксистробин, пропинеб, протиоконазол, пираклостробин, квинтозен, тебуконазол, тетраконазол, тиофанат-метил, трифлоксистробин. Гербициды для сои: алахлор, бентазон, трифлуралин, хлоримурон-этил, хлорансулам-метил, феноксапроп, фомесафен, флуазифоп, глифосат, имазамокс, имазаквин, имазетапир, (S-)метолахлор, метрибузин, пендиметалин, тепралоксидим, глуфосинат. Инсектициды для сои: лямбда-цигалотрин, метомил, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, ацетамиприд, динетофуран, флубендиамид, ринаксипир, циазипир, спиносад, спиноторам, эмамектин-бензоат, фипронил, этипрол, дельтаметрин, β-цифлутрин, гамма- и лямбда-цигалотрин, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5H)-он, спиротетрамат, спинодиклофен, трифлумурон, флоникамид, тиодикарб, бета-цифлутрин. Фунгициды для сои: азоксистробин, биксафен, боскалид, карбендазим, хлорталонил, медь, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробин, эпоксиконазол, флуазинам, флуопирам, флуоксастробин, флутриафол, флуксапироксад, изопиразам, ипродион, изотианил, манкозеб, манеб, метконазол, метоминостробин, миклобутанил, пентиопирад, пикоксистробин, пропиконазол, пропинеб, протиоконазол, пираклостробин, тебуконазол, тетраконазол, тиофанат-метил, трифлоксистробин. Гербициды для сахарной свеклы: хлоридазон, десмедифам, этофумезат, фенмедифам, триаллат, клопиралид, флуазифоп, ленацил, метамитрон, квинмерак, циклоксидим, трифлусульфурон, тепралоксидим, квизалофоп. Инсектициды для сахарной свеклы: имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, ацетамиприд, динетофуран, дельтаметрин, β-цифлутрин, гамма/лямбда-цигалотрин, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5H)-он, тефлутрин, ринаксипир, циаксипир, фипронил, карбофуран. Гербициды для канолы: клопиралид, диклофоп, флуазифоп, глуфосинат, глифосат, метазахлор, трифлуралин, этаметсульфурон, квинмерак, квизалофоп, клетодим, тепралоксидим. Фунгициды для канолы: азоксистробин, биксафен, боскалид, карбендазим, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробин, эпоксиконазол, флуазинам, флуопирам, флуоксастробин, флусилазол, флуксапироксад, ипродион, изопиразам, мепикват-хлорид, метконазол, метоминостробин, паклобутразол, пентиопирад, пикоксистробин, прохлораз, протиоконазол, пираклостробин, тебуконазол, тиофанат-метил, трифлоксистробин, винклозолин. Инсектициды для канолы: карбофуран, тиаклоприд, дельтаметрин, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, ацетамиприд, динетофуран, β-цифлутрин, гамма и лямбда-цигалотрин, тау-флувалериат, этипрол, спиносад, спиноторам, флубендиамид, ринаксипир, циазипир, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5H)-он.

Способы введения гена по настоящему изобретению в другое растение

Также в настоящем документе представлены способы введения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в другое растение. Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению или ее фрагмент могут быть введены во второе растение с помощью рекуррентного отбора, обратного скрещивания, скрещивания потомства, линейного отбора, массового отбора, мутационной селекции и/или отбора, улучшенного исследованием генетических маркеров.

Таким образом, в одном варианте осуществления способы настоящего изобретения включают скрещивание первого растения, содержащего нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, со вторым растением для получения потомства растений F1 и отбора потомства растений F1, которые содержат нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Способы могут дополнительно включать скрещивание отобранного потомства растений с первым растением, содержащим нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, для получения потомства растений, полученных обратным скрещиванием, и отбора потомства растений, полученных обратным скрещиванием, которые содержат нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Способы оценки пестицидной активностью представлены в других разделах данной заявки. Способы могут дополнительно включать повторение этих стадий один или несколько раз подряд, для получения отобранного второго или более высокого потомства растений, полученных обратным скрещиванием, которые содержат нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.

В способе настоящего изобретения, для получения необходимого фенотипа, может быть применен любой способ скрещивания, включающий отбор растений. В некоторых вариантах осуществления растения F1 могут быть самоопыляемыми для получения поколения F2 после расщепления. Затем отдельные растения, которые представляют необходимый фенотип (например, пестицидная активность), можно отбирать в каждом поколении (F3, F4, F5, и т.п.) до того момента, когда признаки будут гомозиготными или фиксированными в скрещиваемой популяции.

Второе растение может представлять собой растение, имеющее желаемый признак, такой как толерантность к гербицидам, толерантность к насекомым, толерантность к засухам, борьба с нематодами, эффективность использования воды, эффективность использования азота, улучшенная пищевая ценность, устойчивость к заболеваниям, улучшенный фотосинтез, улучшенное качество волокна, толерантность к стрессу, улучшенное размножение и т.п. Второе растение может быть элитным объектом, как описано в других разделах данной заявки.

В различных вариантах осуществления части растений (целые растения, органы растений (например, листья, стебли, корни и т.п.), семена, растительные клетки, части растения для вегетативного размножения, зародыши и т.п.) могут быть собраны после полученного однократного скрещивания и либо размножены, либо собраны для дальнейшего применения (например в качестве продуктов питания, кормов, биотоплива, масла, муки, муки крупного помола и т.п.).

Способы получения растительного продукта

Настоящее изобретение также относится к способу получения товарного продукта, включающему сбор и/или измельчение зерна сельскохозяйственной культуры, содержащей нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, для получения товарного продукта. Агрономически и экономически важное вещество продуктов и/или композиций, включает без ограничения корм для животных, сырьевые товары, и растительные продукты и отходы производства, которые предназначены для применения в качестве пищи для потребления человеком или для применения в композициях и сырьевых товарах, которые предназначены для потребления человеком, в частности, продукты нежизнеспособных семян/зерна, в том числе (полу)обработанные продукты, полученные из такого зерна/семян, где указанный продукт представляет собой или включает все или обработанные семена или зерно, корм для животных, кукурузную или соевую муку крупного помола, кукурузную или соевую муку, кукурузу, кукурузный крахмал, соевую муку крупного помола, соевую муку, хлопья, соевый белковый концентрат, изоляты соевого белка, текстурированный концентрат соевого белка, косметику, продукты по уходу за волосами, соевую ореховую пасту, соевый сыр, ферментированный соевый продукт, гидролизованный соевый белок, взбитые сливки, жир для обжаривания, лецитин, пригодные для питания целые соевые бобы (сырые, жареные или в виде зеленых соевых бобов), соевый йогурт, соевый сыр, тофу, юба, а также в качестве приготовленных, очищенных, на пару, запеченных или пропаренных зерен и тому подобное, подразумеваются как находящиеся в объеме настоящего изобретения, если вещество этих продуктов и композиций содержит детектируемые количества нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностей, изложенных в настоящем документе, в качестве диагностики любого растения, содержащего такие нуклеотидные последовательности.

Следующие примеры представлены для иллюстрирования, а не для ограничения.

ЭКСПЕРПИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРИМЕРЫ

Пример 1. Обнаружение новых пестицидных генов у Bacillus thuringiensis

Новые пестицидные гены идентифицировали у бактериальных штаммов, перечисленных в табл. 1, с применением следующих стадий.

- Получение суммарной ДНК из штамма. Суммарная ДНК содержит как геномную ДНК, так и внехромосомную ДНК. Внехромосомная ДНА содержит смесь некоторых или всех из следующих: плазмиды различного размера; фаговые хромосомы; другие не охарактеризованные внехромосомные молекулы.

- Секвенирование ДНК. Суммарную ДНК секвенировали с помощью способа секвенирования нового поколения.

- Идентификация предполагаемых генов токсина посредством анализа гомологии и/или других компьютерных анализов.

- При необходимости завершающую стадию обработки последовательности интересующего гена выполняли с помощью одной из нескольких стратегий ПЦР или клонирования (например, TAIL-PCR).

Таблица 1
Новые гены, идентифицированные в бактериальных штаммах Штамм Название гена Молекулярный
Вес (кДа) Ближайший
гомолог Нуклеотидный SEQ ID № Аминокислотный SEQ ID № ATX68363 Axmi368 86,9 87,6%
Cry13Aal 1 21 Axmi368.2* 22 ATX64783 Axmi400 132,9 89% Cry1Dal 2 23 Axmi400.2* 24 Axmi400 (усеченный) 87% Cry1Dal 3 25 Axmi400.2 (усеченный)* 26 ATX29161 Axmi402 73,3 32% Axmi057, 31% Cry32Dal 4 27 Axmi402.2* 28 Axmi402.3* 29 Axmi402.4* 30 Axmi402.5* 31 ATX29161 Axmi403 139,7 60% Axmil03, 57% Cry32Aal 5 32 Axmi403.2* 33 Axmi403.3* 34 Axmi403.4* 35 Axmi403.5* 36 Axmi403.6* 37 Axmi403.7* 38 Axmi403 (усеченный) 58% Axmil03, 37% Cry32Aal 6 39 Axmi403,2 (усеченный)* 40 Axmi403,3 (усеченный)* 41 Axmi403,4 (усеченный)* 42 Axmi403,5 (усеченный)* 43 Axmi403,6 (усеченный)* 44 Axmi403,7 (усеченный)* 45 ATX67447 Axmi404 137,1 68% Cry1Ahl 7 46 Axmi404.2* 47 Axmi404.3* 48 Axmi404 (усеченный) 52% Cry1Acl 49 Axmi404.2 (усеченный)* 8 50 Axmi404.3 (усеченный) * 51 ATX52424 Axmi405 87,6 48% Cry9Aal 9 52 Axmi405.2* 10 53 Axmi405.3* 54 Axmi405.4* 55 Axmi405.5* 56 ATX66842 Axmi416 133 71,3% Cry1Ail 11 57 Axmi416(усеченный) 64,7% Cry1Ail 12 58 ATX68363 Axmi417 35,9 56% Axmi194, 23% Cry55Aa2 13 59 Axmi417.2* 60 Axmi417.3* 61 Axmi417.4* 62 Axmi417 (усеченный) 14 63 Axmi417.2 (усеченный)* 64 ATX65158 Axmi423 43,3 43% Cry15Aa1 15 65 Axmi423 (усеченный) 16 66 ATX66410 Axmi424 138,9 94% Axmi221z, 60% Cry1Aa9 17 67 Axmi424 (усеченный) 18 68 ATX66854 Axmi425 140 90% Cry1Bal 19 69 Axmi425.2* 70 Axmi425.3* 71 Axmi425 (усеченный) 95% Cry1Ba1 20 72 Axmi425,2 (усеченный)* 73 Axmi425,3 (усеченный)* 74 * Представляет белок, который кодируется, начиная с сайта инициации, расположенного ниже, и “(усеченный)” указывает на то, что белок имеет С-концевое усечение.

Пример 2. Экспрессия и очистка

Ген, кодирующий каждую из аминокислотных последовательностей, изложенных в таблице 2, амплифицировали с помощью ПЦР из соответствующего штамма, перечисленного в таблице 1, с применением ДНК-полимеразы HERCULASE® II Fusion с праймерами, включающими AscI линкер на 3'-конце. Амплифицированный продукт ПЦР разрезали с помощью AscI и лигировали в вектор pMalC4X. Клон подтверждали секвенированием и плазмиду трансформировали в компетентные клетки B121. Одну колонию инокулировали в среду LB и культивировали при 37°С до достижения логарифмической фазы и индуцировали с помощью 0,5 мМ IPTG при 20°С в течение 18 часов. Очищенный белок расщепляли с помощью фактора Ха в соотношении 1:50 при комнатной температуре в течение ночи. Очищенный белок подвергали биоанализу, применяя против выбранного насекомого-вредителя в соответствии со стандартном протоколом. Результаты показаны ниже в таблице 2. Вредители перечислены в таблице 3, а система оценок - после таблицы 3.

Таблица 2
Результаты биоанализа (оценка задержки роста и смертности) SEQ ID № Ae BCW CA DBM ECB FAW Hv Hz SBA SBL SCB SWCB VBC Axmi368 21 4,4 Axmi400 (усеченный) 25 2,3 3,4 2,3 3,4 Axmi402 27 3,3 2,1 1,1 Axmi403 (усеченный) 39 2,3 2,3 1,1 Axmi404.2 (усеченный) 50 4,4 4,4 4,3 1,0 2,0 1,0 2,2 4,4 1,0 1,1 1,1 Axmi405.2 53 2,2 2,2 3,1 2,0 Axmi416 (усеченный) 58 3,2 4,4 1,0 2,0 4,2 2,1 4,4 1,1 4,2 4,2 Axmi417 (усеченный) 63 3,4 4,4 3,4 3,0 Axmi423 (усеченный) 66 4,4 2,2 2,1 4,4 3,4 3,1 2,0 Axmi424 (усеченный) 68 2,2 3,4 4,4 3,0 1,0 3,4 4,4 4,3 Axmi425 (усеченный) 72 4,4 2,2 2,1 3,3 4,4 3,1 1,0

Таблица 3
Насекомые в панели биоанализа Ae Комар желтолихорадочный Aedes aegypti BCW Совка-ипсилон Agrotis ipsilon CA Тля хлопковая Aphis gossypil DBM Моль капустная Plutella xylostella ECB Огневка кукурузная Ostrinia nubilalis FAW Совка травяная Spodoptera frugiperda Hv Табачная листовертка Heliothis virescens Hz Хлопковая совка Helicoverpa zea SBA Соевая тля Aphis glycines SBL Соевая совка Pseudoplusia includens SCB Огневка сахарного тростника Diatraea saccharalis SWCB Огневка кукурузная юго-западная Diatraea grandiosella VBC Гусеница вельветовых бобов Anticarsia gemmatalis

Оценки задержки роста:

0 = активность отсутствует;

1 = отсутствие однообразной задержки роста;

2 = незначительная однообразная задержка роста (75% от размера контролей);

3= сильная однообразная задержка роста (74-26% от размера контролей);

4 = полная однообразная задержка роста (мене 25% от размера контролей).

Оценки смертности:

0 = активность отсутствует;

1 = смертность до 25%;

2 = смертность до 50%;

3 = смертность до 75%;

4 = смертность более 75%.

Пример 3. Дополнительный анализ пестицидной активности

Нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению могут быть протестированы на их способность продуцировать пестицидные белки. Способность пестицидного белка действовать в качестве пестицида на вредителя зачастую оценивают большим количеством способов. Один из способов, хорошо известных из уровня техники, представляет собой осуществление анализа с питанием. В таком анализе с питанием экспонируют вредителя с образцом, содержащим либо тестируемые соединения, либо контрольные образцы. Зачастую это осуществляют помещением тестируемого материала или подходящего разведения такого материала на материал, который вредитель поглотит, такой как искусственная питательная среда. Тестируемый материал может быть составлен из жидкости, твердого вещества или взвеси. Тестируемый материал может быть помещен на поверхность и затем оставлен для высушивания. В качестве альтернативы, тестируемый материал может быть смешан с растопленной искусственной питательной средой, затем разложен в камере для проведения анализа. Камера для проведения анализа может представлять собой, например, чашку, ванну или лунку планшета для микротитрования.

Анализы с сосущими вредителями (например, тлей) могут включать отделение тестируемого материала от насекомого посредством фрагментации, в идеале - части, которая может быть проколота частями сосущего ротового аппарата сосущего насекомого для поглощения тестируемого материала. Зачастую тестируемый материал смешивают со стимулятором питания, таким как сахароза, для усиления поглощения тестируемого соединения.

Другие типы анализов могут включать микроинъекцию тестируемого материала в ротовой аппарат или кишечник вредителя, а также разработку трансгенных растений с последующим тестированием способности вредителя питаться трансгенным растением. Тестирование растения может включать выделение обычно поедаемых частей растения, например небольшие садки, прикрепленные к листу, или выделение целых растений в садки, содержащие насекомых.

В данной области известны и другие способы и подходы для анализа вредителей, и их можно найти, например, в Robertson and Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, FL. В качестве альтернативы, анализы часто описываются в журналах "Arthropod Management Tests" и "Journal of Economic Entomology" или обсуждаются членами Энтомологического Сообщества Америки (ESA).

В некоторых вариантах осуществления участки ДНК, кодирующие участки пестицидных белков, обладающие токсичностью, раскрытые в настоящем документе, по отдельности клонируют в экспрессирующий вектор E. coli pMAL-C4x позади гена malE кодирующего белок, связывающий мальтозу (МВР). Эти слияния внутри рамки считывания приводят к экспрессии в Е. coli белков слияния МВР-Axmi.

Для экспрессии в E. coli, клетки BL21*DE3 трансформировали отдельными плазмидами. Единичные колонии инокулировали в среду LB, дополненную карбенициллином и глюкозой, и выращивали в течение ночи при 37°С. На следующий день свежую среду инокулировали с 1% культуры в течение ночи и выращивали при 37°С до достижения логарифмической фазы. Впоследствии культуры индуцировали с помощью 0,3 мМ IPTG в течение ночи при 20°С. Каждый клеточный осадок суспендировали в 20 мМ буфере Tris-HCl, рН 7,4+200 мМ NaCl+200 мМ DTT + ингибиторы протеаз и обрабатывали ультразвуком. Анализ посредством электрофореза в SDS-PAGE применяли для подтверждения экспрессии белков слияния.

Суммарные бесклеточные экстракты загружали в колонку с амилозой, прилагаемую к жидкостной экспресс-хроматографии белков (FPLC) для аффинной очистки белков слияния MBP-axmi. Связавшийся белок слияния элюировали со смолы с помощью 10 мМ раствора мальтозы. Очищенные белки слияния затем расщепляли либо с помощью фактора Ха, либо трипсина, для удаления аминоконцевого остатка МВР с белка Axmi. Расщепление и растворимость белков определяли с помощью SDS-PAGE.

Пример 4. Нацеливание генов для экспрессии в растении

Кодирующие области генов по настоящему изобретению соединяют с подходящими промоторными и терминаторными последовательностями для экспрессии в растениях. Такие последовательности хорошо известны из уровня техники, и они могут включать актиновый промотор риса или убиквитиновый промотор маиса для экспрессии в однодольных растениях, промотор Arabidopsis UBQ3 или промотор CaMV 35S для экспрессии в двудольных растениях и терминаторные последовательности nos или PinII. Методики для получения и подтверждения конструкций промотор-ген-терминатор также хорошо известны из уровня техники.

В одном аспекте настоящего изобретения разрабатывают и получают синтетические последовательности ДНК. Эти синтетические последовательности имеют измененную нуклеотидную последовательность относительно исходной последовательности, но кодируют белки, которые по существу идентичны исходной последовательности.

В другом аспекте настоящего изобретения создают модифицированные версии синтетических генов таким образом, чтобы нацелить полученный пептид на органеллу растения, такую как эндоплазматический ретикулум или апопласт. Пептидные последовательности, нацеливающие белки слияния на органеллы растений, известны из уровня техники. Например, N-концевой участок гена кислой фосфатазы белого люпина Lupinus albus (GENBANK® ID GE14276838, Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606) известен из уровня техники как нацеливающий гетерологичные белки на эндоплазматический ретикулум. Если получаемый белок слияния также содержит последовательность удержания в эндоплазматическом ретикулуме, содержащую на С-конце пептид N-конец-лизин-аспарагиновая кислота-глутаминовая кислота-лейцин (т.е. мотив “KDEL”, SEQ ID № 75), то белок слияния будет нацелен на эндоплазматический ретикулум. При отсутствии на С-конце белка слияния последовательности, нацеливающей на эндоплазматический ретикулум, белок будет нацелен на эндоплазматический ретикулум, но будет, в конечном счете, изолирован в апопласт.

Таким образом, этот ген кодирует белок слияния, который содержит тридцать одну аминокислоту на N-конце гена кислой фосфатазы, полученного из белого люпина Lupinus albus (GENBANK® ID GL14276838, Miller et al., 2001, выше), является слитым с N-коневой аминокислотной последовательностью по настоящему изобретению, а также KDEL последовательностью (SEQ ID № 75) на С-конце. Таким образом, полученный белок, как прогнозируют, будет нацелен на эндоплазматический ретикулум растения после экспрессии в растительной клетке.

Растительные кассеты экспрессии, описанные выше, комбинируются с соответствующим селектируемым маркером растения для облегчения отбора трансформированных клеток и тканей, и лигируются в векторы трансформации растений. Они могут включать бинарные векторы из трансформации, опосредованной Agrobacterium, или простые плазмидные векторы для аэрозольной или биолистической трансформации.

Пример 5. Трансформация сои

Трансформация сои достигается с применением способов, хорошо известных из уровня техники, таких как те, которые описаны с применением трансформации эксплантатов половины семян сои, опосредованной Agrobacterium tumefaciens, с применением, в основном, способа, описанного Paz et al. (2006), Plant cell Rep. 25:206. Трансформанты идентифицировали, применяя темботрион в качестве маркера для отбора. Наблюдали появление зеленых побегов и в качестве индикатора описывали толерантность к гербициду изоксафлутолу или темботриону. Толерантные трансгенные побеги будут показывать нормальное озеленение по сравнению с побегами сои дикого типа, не обработанными изоксафлутолом или темботрионом, при этом побеги сои дикого типа обработаны таким же количеством изоксафлутола или темботриона будут полностью обесцвечены. Это указывает на то, что присутствие белка HPPD обеспечивает толерантность к гербицидам ингибитора HPPD, подобно изоксафлутолу или темботриону.

Толерантные зеленые побеги переносили в среду для выращивания или прививали. Укорененные проростки переносили в теплицу после периода акклиматизации. Растения, содержащие трансген, затем опрыскивали гербицидами на основе ингибитора HPPD, такими как, например, темботрион с нормой 100 г а.и./га или мезотрион с нормой 300 г а.и./га дополненных сульфатом аммония, сложным метиловым эфиром рапсового масла. Через десять дней после внесения, симптомы, связанные с применением гербицида, оценивали и сравнивали с симптомами, наблюдаемыми на растениях дикого типа при тех же условиях.

Пример 6. Установление и отбор растения хлопчатника Т0

Трансформация хлопчатника обеспечивается применением способов, хорошо известных из уровня техники, особенно предпочтителен способ, описанный в публикации заявки на патент РСТ WO 00/71733. Регенерированные растения переносили в теплицу. После периода акклиматизации, достаточно выросшие растения опрыскивали гербицидами на основе ингибитора HPPD, такими как, например, эквивалентные темботриону с нормой 100 или 200 г а.и./га, дополненные сульфатом аммония и сложным метиловым эфиром рапсового масла. Через семь дней после нанесения распылением, симптомы, связанные с обработкой гербицидом, оценивали и сравнивали с симптомами, наблюдаемыми на растениях хлопчатника дикого типа, подвергшихся такой же обработке при тех же условиях.

Пример 7. Трансформация клеток маиса генами пестицидного белка, описанными в настоящем документе

Початки маиса собирали через 8-12 дней после опыления. Из початков выделяли зародыши и эти зародыши размером 0,8-1,5 мм предпочтительно использовали для трансформации. Зародыши высеивали щитком вверх на подходящую инкубационную среду, такую как среда DN62A5S (3,98 г/л солей N6; 1 мл/л витаминов N6 (1000x исходного раствора); 800 мг/л L-аспарагина; 100 мг/л мио-инозитола; 1,4 г/л L-пролина; 100 мг/л казаминовых кислот; 50 г/л сахарозы; 1 мл/л 2,4-D (1 мг/мл исходного раствора)). Однако, среда и соли, отличные от DN62A5S, также пригодны и известны из уровня техники. Зародыши инкубировали в течение ночи при 25°С в темноте. Однако, отсутствует необходимость инкубировать зародыши per se в течение ночи.

Полученные эксплантаты переносили в квадратные лунки (30-40 на чашку), переносили на осмотическую среду и выдерживали в течение приблизительно 30-45 минут, затем переносили на пластину для инжекции (см., например, публикацию WO/0138514 и патент США № 5240842).

Конструкции ДНК, предназначенные для введения генов по настоящему изобретению в растительные клетки, вводятся в ткани растения, с применением аэрозольного лучевого инжектора, с применением условий, главным образом описанных в публикации РСТ WO/0138514. После инжекции зародыши инкубировали в течение приблизительно 30 мин на осмотической среде и помещали на инкубационную среду на ночь при 25°С в темноте. Чтобы избежать чрезмерного повреждения эксплантатов процедурой инжекции, их инкубировали в течение по меньшей мере 24 часов перед переносом в среду для регенерации. Зародыши затем помещали в среду для восстановительного периода на приблизительно 5 дней при 25°С в темноте, затем переносили на селективную среду. Эксплантаты инкубировали в селективной среде в течение периода до восьми недель в зависимости от природы и особенностей конкретно используемого отбора. После периода отбора полученный каллюс переносили на среду для созревания зародыша до обнаружения образования зрелых соматических зародышей. Полученные зрелые соматические зародыши затем помещали в слабоосвещенное место и инициировали процесс регенерации способами, известными из уровня техники. Полученные побеги оставляли для укоренения в среде для выращивания и полученные растения переносили в горшки для рассады и размножали как трансгенные растения.

Материалы
Среда DN62A5S Компоненты На литр Источник Основная смесь солей Chu N6 (Прод. № C 416) 3,98 г/л Phytotechnology Labs Раствор витаминов Chu N6 (Прод. № C 149) 1 мл/л (1000x исходного раствора) Phytotechnology Labs L-аспарагин 800 мг/л Phytotechnology Labs Мио-инозитол 100 мг/л Sigma L-пролин 1,4 г/л Phytotechnology Labs Казаминовые кислоты 100 мг/л Fisher Scientific Сахароза 50 г/л Phytotechnology Labs 2,4-D (Прод. № D-7299) 1 мл/л (1 мг/мл исходного раствора) Sigma

С помощью 1 N KOH/1 N KCl доводили рН раствора до 5,8, добавляли Gelrite (Sigma) до достижения концентрации 3 г/л и среду автоклавировали. После охлаждения до 50°С добавляли 2 мл/л исходного раствора нитрата серебра с концентрацией 5 мг/мл (Phytotechnology Labs).

Пример 8. Трансформация генов по настоящему изобретению в растительных клетках посредством трансформации, опосредованной Agrobacterium

Початки собирали через 8-12 дней после опыления. Из початков выделяли зародыши и эти зародыши размером 0,8-1,5 мм предпочтительно использовали для трансформации. Зародыши высеивали щитком вверх на подходящую инкубационную среду и инкубировали в течение ночи при 25°С в темноте. Однако, отсутствует необходимость инкубировать зародыши per se в течение ночи. Зародыши приводили в контакт со штаммом Agrobacterium, содержащим соответствующие векторы для переноса, опосредованного Ti плазмидой, в течение приблизительно 5-10 минут, а затем высевали на среду и сокультивировали в течение приблизительно 3 дней (22°C в темноте). После сокультивирования, эксплантаты переносили в среду для восстановительного периода на 5 дней (при 25°С в темноте). Эксплантаты инкубировали в селективной среде в течение периода до восьми недель в зависимости от природы и особенностей конкретно используемого отбора. После периода отбора полученный каллюс переносили на среду для созревания зародыша до обнаружения образования зрелых соматических зародышей. Полученные зрелые соматические зародыши затем помещали в слабоосвещенное место и инициировали процесс регенерации способами, известными из уровня техники.

Пример 9. Трансформация риса

Незрелые семена риса, содержащие зародыши на желаемой стадии развития, собирали из растений-доноров, выращенных в контролируемых условиях в теплице. После стерилизации семян, незрелые зародыши выделяли и предварительно индуцировали на твердой среде в течение 3 дней. После предварительной индукции, зародыши погружали на несколько минут в суспензию Agrobacterium, несущих необходимые векторы. Затем зародыши сокультивировали на твердой среде, содержащей ацетосирингон и инкубировали в темноте в течение 4 дней. Эксплантаты затем переносили в первую селективную среду, содержащую в качестве селективного агента фосфинотрицин. После примерно 3 недель, щитки с развивающимся каллюсом разрезали на несколько меньших кусочков и переносили в ту же селективную среду. Последующие субкультивирования осуществляли приблизительно каждые 2 недели. После каждого субкультивирования, активно растущий каллюс разрезали на меньшие кусочки и инкубировали на второй селективной среде. После нескольких недель каллюс, отчетливо обладающий толерантностью к фосфинотрицину, переносили в регенерационную селективную среду. Полученные проростки культивировали на среде MS с половинной концентрацией для их полного роста в длину. Растения в конечном итоге переносили в почву и выращивали в теплице.

Все публикации и заявки на патент, упомянутые в настоящем описании, ориентированы на уровень квалификации специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Все публикации и заявки на патент включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент конкретно и отдельно была включена посредством ссылки.

Хотя в целях ясности понимания вышеприведенное изобретение было довольно подробно описано посредством иллюстрации и примера, очевидно, что на практике можно осуществлять определенные изменения и модификации в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Athenix Corp.

Bayer CropScience LP

Thayer, Rebecca

Roberts, Kira

Sampson, Kimberly

Lehtinen, Duane

Peters, Cheryl

Magalhaes, Leonardo

Dunn, Ethan

<120> ГЕНЫ ТОКСИНОВ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> 2916693-20178WO01

<150> 61/774,110

<151> 2013-03-07

<150> 61/774,627

<151> 2013-03-08

<150> 61/774,629

<151> 2013-03-08

<150> 61/774,635

<151> 2013-03-08

<150> 61/774,638

<151> 2013-03-08

<150> 61/774,642

<151> 2013-03-08

<150> 61/774,645

<151> 2013-03-08

<150> 61/774,647

<151> 2013-03-08

<150> 61/774,650

<151> 2013-03-08

<150> 61/774,655

<151> 2013-03-08

<150> 61/774,659

<151> 2013-03-08

<160> 75

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 2382

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 1

atgacttgtc aattacaagc gcaaccactt attccctata acgtactagc aggagttcca 60

actagtaata caggtagtcc aatcggcaat gcaggtaatc aatttgatca gtttgagcaa 120

accgttaaag agctcaagga agcatgggaa gcgttccaaa aaaacggaag tttctcatta 180

gcagctcttg aaaagggatt tgatgcagca atcggaggag gatcctttga ttatttaggt 240

ttagttcaag ccggcctagg attagttggt acgctaggcg ccgcaatccc tggtgtttca 300

gtggcagtgc ctcttattag catgcttgtt ggtgtttttt ggccaaaggg cacaaacaac 360

caagaaaacc ttattacagt tattgataag gaagttcaga gaatactaga tgaaaagcta 420

tctgatcagt taataaagaa attgaacgca gatttaaatg cttttacgga cctagtaact 480

cgtttggaag aagtaataat agatgcaact ttcgagaatc acaagcctgt actacaagta 540

agtaaatcaa attatatgaa agtggattca gcatatttct caacaggagg tattcttact 600

cttggcatga gtgattttct tactgatacc tattcaaagc ttaccttccc attatatgta 660

ctaggcgcaa ctatgaaact ttcagcatat catagttata tacaattcgg aaatacatgg 720

cttaataaag tttatgattt atcatcagat gagggaaaaa caatgtcgca ggctttagca 780

cgagctaaac agcatatgcg ccaagacata gcattttata caagccaagc tttaaacatg 840

tttactggga atctcccttc attatcatct aataaatatg caattaatga ctataatgta 900

tacactcgag caatggtatt gaatggctta gatatagtag caacatggcc taccctatat 960

ccagatgact attcgtctca gataaaactg gagaaaacac gcgtgatctt ttcagatatg 1020

gtcgggcaaa gtgagagtag agatggcagc gtaacgatta aaaatatttt tgacaataca 1080

gattcacatc aacatggatc cataggtctc aattcaatct cttatttccc agatgagtta 1140

cagaaagcac aacttcgcat gtatgattat aatcacaaac cttattgtac ggactgtttc 1200

tgctggccgt atggagtgat tttaaactat aacaagaata cctttagata tggcgataat 1260

gatccaggtc tttcaggaga cgttcaactc ccagcaccta tgagtgtagt taatgcccaa 1320

actcaaacag cccaatatac agatggagaa aacatatgga cagatactgg ccgcagttgg 1380

ctttgtactc tacgtggcta ctgtactaca aactgttttc caggaagagg ttgttataat 1440

aatagtactg gatatggaga aagttgcaat caatcacttc caggtcaaaa aatacatgca 1500

ctatatcctt ttacacaaac aaatgtgctg ggacaatcag gcaaactagg attgctagca 1560

agtcatattc catatgacct aagtccgaac aatacgattg gtgacaaaga tacagattct 1620

acgaatattg tcgcaaaagg aattccagtg gaaaaagggt atgcatccag tggacaaaaa 1680

gttgaaatta tacgagagtg gataaatggt gcgaatgtag ttcaattatc tccaggccaa 1740

tcttggggaa tggattttac caatagcaca ggtggtcaat atatggtccg ctgtcgatat 1800

gcaagtacaa acgatactcc aatctttttt aatttagtgt atgacggggg atcgaatcct 1860

atttataacc agatgacatt ccctgctaca aaagagactc cagctcacga ttcagtagat 1920

aacaagatac taggcataaa aggaataaat ggaaattatt cactcatgaa tgtaaaagat 1980

tctgtcgaac ttccatctgg gaaatttcat gtttttttca caaataatgg atcatctgct 2040

atttatttag atcgacttga gtttgttcct ttaggaaaac catcccctgg tgttttatat 2100

tctggttctt atgatcttat gggatcacag tatgctagcg ttctttttaa cgaccaaaat 2160

gcctcctata ccacagtttc tataaatggg gtatctgatg cacatagtac ctcaggaagt 2220

attactcttt ttaataatga gacattagta aaaggatttg atgtaccagg ttcaggtcaa 2280

agttatcaat attctaatgt aactgtgcct ccttataata gagtcaatat gacgaaaggc 2340

acctatgctg aactttcagg ttctgtaaca attaaaggaa at 2382

<210> 2

<211> 3519

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 2

gtgctaaaat taagaaaacg gaggtatttt atggagggaa ataatctaaa tcaatgcata 60

ccttacaatt gtttaagtaa tcctaaggac ataatattag gtgatgaaag gctagaaact 120

ggtaatactg tagcagacat taccttaggg attgtcaatc tattgttttc tgagtttgtt 180

cctggtggag gctttatact aggattactg gatttaatat gggggtctat aggtcgttcc 240

caatgggatc tatttctgga acagattgaa caattgatta agcaaagaat agaagaattt 300

gctaggaatc aggcaatttc aaggttggag gggctaagcg atctttataa gacctatgct 360

agagcgttta gcgattggga ggcagatccg actaatccag cattaaggga agaaatgcgt 420

atacaattta atgacatgaa tagtgctatc ataacggctc tcccactttt tagagttcaa 480

aattatgaag ttgctctttt atctgtttat gttcaagctg caaacttaca tttatctatt 540

ttaagagatg tttcagtctt tggagaaaga tggggatatg atacagcaac tatcaataat 600

cgctatagtg acttaactag ccttattcat gtttatacta atcattgtgt ggatacgtat 660

aatcagggat taaggcgttt ggaaggtcgt tttcttaccg attggattgt atataatcgt 720

ttccgaagac aattaacaat ttcagtatta gatattgttg cattttttcc aaattatgat 780

attcgaacat atccaattca aacagctact cagctaacga gggaaatcta tctggattta 840

ccttttatta atgaaaatct ttctcctgca gcaagctatc cctcattctc agatgctgaa 900

agtgctataa tcaggagtcc tcatttagtg gactttttaa atagcttcac tatttataca 960

gatagtcttg ctcgatattt atattgggga gggcatcggg tgaattttac ccgttcagga 1020

gttactactt ttatacaatc accactatat ggaagggaag gaaatgcaga gcgttctgta 1080

attatttcgg catcatctag cgtaccaata tttagaacac tttcatatgt tactggcctt 1140

gacaatgcaa atcctgtagc tggaattgaa ggagtggaat tccaaaatac tataagtaga 1200

agtatctatc gtaaaagtgg tccaattgat tcttttaatg aattaccacc tcaagatgcc 1260

agtgtatctc cttcaattgg gtatagtcac cgtttatgtc atgccacatt tttagaacgg 1320

attagtggac caagaattgc aggtgtcgtt ttttcctgga cacatcgtag tgctagccct 1380

actaatgaag taagttcatc tagaattaca caaattccat gggtaaaggc gcatactctt 1440

gcgtctggtg cctccgttat taaagggcct ggatttacag gtggagatat actaactagg 1500

aataccttag gcgaactggg aactttaaga gtaacttttg caggaagatt atcacaaagt 1560

tattatatac gtttccgtta tgcttccgta gctaatagga gtggtatatt tagctattca 1620

cagccaactt catatggaat ttcctttcca aaaactatgg atgcaaatga atcattaaca 1680

tctcgttcat ttgcacttgc tacacttgct acaccgctaa cctttagaag gcaagaagaa 1740

ttaaatctac aaataccatc aggtacttat atagatcgaa ttgagtttgt tccagtcgat 1800

gaaaccttta caacagaatc tgatctggat agagcacaac aggcggtgaa tgcgctgttt 1860

acttcttcca atcaaatcgg cttaaaaaca gatgtgacgg attatcatat tgatcaagta 1920

tccaatttag tggattgttt atcggatgaa ttttgtctgg atgaaaaaaa agaattgtcc 1980

gagaaagtca aacatgcgaa gcgacttagt gatgagcgga atttacttca agatccaaac 2040

tttagaggga tcaatagaca actagaccgt ggctggagtg gaagtacgga tattaccatc 2100

caaggaggag atgacgtatt caaagagaat tacgttacac taccaggtac ctttgatgag 2160

tgctatccaa cgtatttata tcaaaaaata gatgagtcga aattaaaagc ctatacccgt 2220

tatcaattaa gagggtatat cggggatagt caagacttag aaatctattt aattcgttac 2280

aatgcaaaac acgaaatagt aaatgtacca ggtacaggga gtttatggcc tctttctgta 2340

gaaaattcaa ttggaccttg tggagaaccg aatcgatgcg cgccacacct tgaatggaat 2400

cctaatctag agtgttcttg cagagaaggg gaaaaatgtg cccatcattc ccatcatttc 2460

tccttggaca ttgatgttgg atgtacagac ttaaatgagg acttaggtgt atgggcgata 2520

ttcaagatta agacgcaaga tggccatgca agactaggaa atctagagtt tctcgaagag 2580

aaaccattag taggggaagc actagctcgt gtgaaaagag cggagaaaaa atggagagac 2640

aaacgtgaaa aattggaatt ggaaacaaat attgtttata aagaggcaaa agaatctgta 2700

gatgctttat ttgtaaactc tcaatatgat agattacaag cggataccaa catcgcgatg 2760

attcatgcgg cagataaacg cgttcatagc attcgagaag catatcttcc agagttatct 2820

ataattccgg gtgtaaatgc gggcattttc gaagaattag agggacgtat ttacacagcc 2880

tactctctat atgatgcgag aaatgtcatt aaaaatggcg atttcgataa tggcttatta 2940

tgctggaacg tgaaagggca tgtagatgta gaagaacaaa acaatcaccg ttcagttctg 3000

gttatcccag aatgggaagc agaagtgtca caagaagttc gtgtctgtcc aggacgtggc 3060

tatatccttc gtgttacagc gtacaaagag ggatatggag agggctgcgt aacgatccat 3120

gagatcgaag acaatacaga cgaactgaaa ttcagcaact gtgtagaaga ggaagtatat 3180

ccaaacaaca cggtaacgtg taatgattat actgcgactc aagaagaata tgagggtacg 3240

tacacttctc gtaatcgagg atatgacgga gcctatgaaa gcaattcttc tgtaccagct 3300

gattatgcat cagcctatga agaaaaagcg tatacagatg gaagaagaga gaatccttgt 3360

gaatctaata gaggatatgg ggattacgcg ccactaccag ctggttatgt gacaaaggaa 3420

ttagagtact tcccagaaac cgataaggta tggattgaga tcggagaaac ggaaggaaca 3480

ttcattgtgg atagtgtgga attactcctt atggaggaa 3519

<210> 3

<211> 1767

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 3

atggagggaa ataatctaaa tcaatgcata ccttacaatt gtttaagtaa tcctaaggac 60

ataatattag gtgatgaaag gctagaaact ggtaatactg tagcagacat taccttaggg 120

attgtcaatc tattgttttc tgagtttgtt cctggtggag gctttatact aggattactg 180

gatttaatat gggggtctat aggtcgttcc caatgggatc tatttctgga acagattgaa 240

caattgatta agcaaagaat agaagaattt gctaggaatc aggcaatttc aaggttggag 300

gggctaagcg atctttataa gacctatgct agagcgttta gcgattggga ggcagatccg 360

actaatccag cattaaggga agaaatgcgt atacaattta atgacatgaa tagtgctatc 420

ataacggctc tcccactttt tagagttcaa aattatgaag ttgctctttt atctgtttat 480

gttcaagctg caaacttaca tttatctatt ttaagagatg tttcagtctt tggagaaaga 540

tggggatatg atacagcaac tatcaataat cgctatagtg acttaactag ccttattcat 600

gtttatacta atcattgtgt ggatacgtat aatcagggat taaggcgttt ggaaggtcgt 660

tttcttaccg attggattgt atataatcgt ttccgaagac aattaacaat ttcagtatta 720

gatattgttg cattttttcc aaattatgat attcgaacat atccaattca aacagctact 780

cagctaacga gggaaatcta tctggattta ccttttatta atgaaaatct ttctcctgca 840

gcaagctatc cctcattctc agatgctgaa agtgctataa tcaggagtcc tcatttagtg 900

gactttttaa atagcttcac tatttataca gatagtcttg ctcgatattt atattgggga 960

gggcatcggg tgaattttac ccgttcagga gttactactt ttatacaatc accactatat 1020

ggaagggaag gaaatgcaga gcgttctgta attatttcgg catcatctag cgtaccaata 1080

tttagaacac tttcatatgt tactggcctt gacaatgcaa atcctgtagc tggaattgaa 1140

ggagtggaat tccaaaatac tataagtaga agtatctatc gtaaaagtgg tccaattgat 1200

tcttttaatg aattaccacc tcaagatgcc agtgtatctc cttcaattgg gtatagtcac 1260

cgtttatgtc atgccacatt tttagaacgg attagtggac caagaattgc aggtgtcgtt 1320

ttttcctgga cacatcgtag tgctagccct actaatgaag taagttcatc tagaattaca 1380

caaattccat gggtaaaggc gcatactctt gcgtctggtg cctccgttat taaagggcct 1440

ggatttacag gtggagatat actaactagg aataccttag gcgaactggg aactttaaga 1500

gtaacttttg caggaagatt atcacaaagt tattatatac gtttccgtta tgcttccgta 1560

gctaatagga gtggtatatt tagctattca cagccaactt catatggaat ttcctttcca 1620

aaaactatgg atgcaaatga atcattaaca tctcgttcat ttgcacttgc tacacttgct 1680

acaccgctaa cctttagaag gcaagaagaa ttaaatctac aaataccatc aggtacttat 1740

atagatcgaa ttgagtttgt tccagtc 1767

<210> 4

<211> 1965

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 4

atgacccaca atgacaacaa taataaattc gaaatcaagg atactggtac caagccaagg 60

tccccccttg caaatgcacc aggtcctaca tggcaaaata taaataatag agatgtagag 120

acatttggat caatagaaat tgcgggaaaa gtagtttcag gcgttataag ctcagttata 180

aaatctttaa gacaacaagc gcaaatagat aaaatagtag caatcgtcgt ggttgaagtc 240

tttgaagtgc tttggcctgt cctagaaggt atgtggtatg cgatgatgga tgctgtagaa 300

attatgattc aggaagccat tacaactgcg gtaagaagta aagcacaagc agaattaaat 360

ggcattcgca atgcccttgt actctttcaa caagctttcg acgactggga aaaaaattca 420

gataatccac aattacaaga tcgtgtaaga aggcaattta ctgcgacaaa tacattaatt 480

caattcgcca tgtcttcctt tgcagttcca ggttttcaag tcccattact cgttgtatat 540

gctcaagcgg ccaacctaca tttactgttt ttacgagagg ctgttgtact tggagaaaag 600

tgggggatga gtcgagaaga ggtagatgat tattataatg gagaacttgg actaactgag 660

ctcacacaat catacacgaa tcactgcaca aattggtatc atgagggatt agcgcaatca 720

atgaaattaa acccgagtgt aacaatacta gaacagtgga atttatataa tgactttaga 780

agagaaatga cgattatgat cttagatatt gtagcgttat ggccgacata tgatgtcaag 840

ttatatcccg caggaaccaa aacagagctc acacgaataa tatatacgcc attaatggga 900

gttttggaag atagtagttc tataagtgcc acaaggaaag aatatggtaa tatagcggct 960

ataaatcagc aagatggagc tacgacgatt ccaccagcat tatttatatg gttggagaaa 1020

caaattgtat atccgtataa caatctcata tatagttatc aaaatttcca aaaaaccaca 1080

tttggtaaag tgatgaatgg cactatattc ggaagtaata gcgagaaaca cctaacaaat 1140

cccataagta ttccgattga tgcagagtca tatgatgttt ataaagttga tacatcatat 1200

tcagcaaaga tggaaattaa aagttcacca attcataaac tagtatacta tcgctcaaaa 1260

gaacaacaag aaagtataat cagtaccaat acatcaaaag gtccaattga tcaggtgtct 1320

gaaatagcaa atgaaggata tcaagattat agtcattgtc ttgctcatat ggcggggtgg 1380

gtatcgattg cttacgggac gggtctgacc gagaagcctt atttagtccc atataattta 1440

gcactaggat ggacgtatgc aaatgttgat cccgtgaata gtatagcacc cgatgcaata 1500

acccaaattc cagcagtgaa aggggataaa gtaattggta ttccagaaga agaggctatt 1560

ttgggcgagg taactgcgat acaaggacct gggtttacag gaggaaattt agtaggattg 1620

ttcgctggtg ctgaattaca tatgaaagtt acaaatccag taagtaatgt tgcaggatat 1680

caaatgagaa ttcgttatgc gaacaatcac ccaacgatac ttgctgtcag ctatcaaggt 1740

gtagaaacat cctcaggtaa atttgacgtt ccagttacgt attctggtga ttttaaaact 1800

aagctaacat ataatgcctt taaatttaaa gaagctatta ttataccttc accattaaga 1860

gaagagattg ctgatatagt attgcgtaat gaaggtgata gcaatctcct tatcgataaa 1920

attgaactca tcccaatgga tttttggagg catgagcaat gcaat 1965

<210> 5

<211> 3717

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 5

atgaatcaac agcataacaa tgaatatgaa atcatgagta ctggcgacat gggctatcag 60

ccaaggtatc ccttttcgaa tgcacctggt gctgaattgc aacagatgca ttacaaagat 120

tggatggata tgtgtgcaga tggagagtcg ggaaaaacgt ttgcagacct tacagttcag 180

gagggagtca ctatagctgt aagtattgca gcggcaattc ttagtgtacc atttccagta 240

acagcagcgg gattaagtat tatctcttta ctagttccat actggtggcc agagacagca 300

gtaactcccg gtactccctc tgcgcaagtt acatgggaaa aatttatgag tgctgcggaa 360

aatctcagta atacacaaat tgtagcgagt aaacgatcag atgccattgc tagatggcaa 420

ggtatacaaa ccttaggaag agactatttt caagcgcaat gtgactggct acaagatcaa 480

aataatgaac tcaaaaaaag taaattacgg gaggcatttg atgacttcga agattattta 540

aaagtgtcaa tgccattctt tcgtgcgcaa ggctttgaaa ttcctatgtt agctatgtat 600

gcacaagctg cgaatatgca cttacttttg ctaagagagg ttgtccagaa tggtgtgggt 660

tgggggttcc agcaatacga agttgaccga tattattcca atacagaccc ttttttaggg 720

aaccctggac tattacaact attagaagga tatacggact attgtgtaaa atggtataat 780

gcaggtttac gacaacaata cgaaaataat agatacaatt gggatgcatt caatgatttc 840

cgtagagata tgattataat ggtattagat attgtatctt tatggccaac ttatgatccg 900

aagcgctatc ccctacctac aaaatcacaa cttacacgaa ctgtgtatac cgatttagta 960

ggtttttctg gaaatagcga gtacctacaa atagacattg aacgtgcaga acaagcgcta 1020

gtccagaaac ctggtctatt tacctggctg cgtgagctaa gtttcgagct ggggccactg 1080

tcgcgaatta attttgtaag aggaagacaa atagtcttca attataccgg aagttccgat 1140

aggtatgaag agaccaaggg gaatcttgga gaaactagag aaactgttgt tattccggca 1200

ccggatgtag gggatgacat ctggaggatt agcactcaag ttaacaccta tcagatacca 1260

aatgctactt ttgttagagg ctggaatttt tcttttactc aatcattaga tcaaaaaata 1320

gcttggcgga cagaatattc acccgaaata gtgatgcagg gattgtcttg tcacggacct 1380

tctgtgagtt cttgtaacct ttgtatcagt aacagtccgt gtagaagtat tactcctaac 1440

tatagctccc cttgtgatga caagttggtt tatagtcatc gattttcata tttaggagcc 1500

ggacttaaat ccgatttaac aacgttgatt tattttagct acggatggac ccatgtaagc 1560

gcagatgcaa acaatttgat agatcctaaa aagattaccc aaatcccagc cgtaaagggg 1620

gattatttag ggagaaatgc ccgtgttata aaaggacctg gaagtacagg tggagatcta 1680

gtccaacttt ccgatggaac cgaaagagga actctgggca tcaaactaac aaaaccacca 1740

ggaagtcaca gctatcgtgt aagaatacgt tatgcaagta atacgcgaac tcaacttgag 1800

attatttggg gagaagatta cgatagcgtt atagttcctg ctactacaac tgatataaca 1860

aatctcacct ataataaatt cgggtacttc gaaatccgcg tttttagtta taattcatca 1920

agcgaagaag aagacttaat aagagtggat gctacgggtt ctttcatcct cgacaaaatc 1980

gaattcattc caattgaggg atcagtggat gaatatcaag caaatcagga tctagaaaaa 2040

gcaaaaaagg ccgtgaatgc cttgtttaca ggtgatgcga aaagtgcgct aaaattgagc 2100

atcacaggct acatagtgga tcaagctgcc aactttgtgg aatgtgtatc agatgaattc 2160

catgcccaag aaaaaatgat cctattggat caagtgaaat tcgcgaaacg actgagtcaa 2220

gcacgcaatc tattaaacta tggggatttt gaatcctcag attggtcggg agagaatgga 2280

tggagaacca gtcctcatgt ccatgtggca tctaataatc caatctttaa agggcgctat 2340

ctccacatgc caggtgcgat gagccctcaa ttctctaaca atacctatcc aacgtatgcg 2400

tatcaaaaag tggatgagtc aaaattaaag tcctataccc gttacctcgt acgtggactt 2460

gttggaaata gtaaagatct agaattactg gtggaacgat atggaaaaga tgtacatgtg 2520

gaaatggatg taccaaatga tattcaatat acattaccaa cgaatgactg tggtggcttt 2580

gatcgatgta aaccagtatc gtatcaaaca ggaacttctt cgtacaaatc gtgtggatgc 2640

aagaacaacg acacgtatca gaatggaatg catctatcta aatcatgtgg ttgcaaaaaa 2700

gatccacatg tcttcaccta ccatattgac acaggatgcg tggatcaaga agaaaactta 2760

ggtctattct ttgcattaaa aatcgcaagt gaaaatggta tggcgaacat tgataacctg 2820

gaaatcattg aggcacagcc gttaaaaggg gaagccttgg ctcgtgtgaa aaaacgagaa 2880

cagaaatgga aacaggaaat ggcgcaaaaa cttttacgaa cagagaaagc tgtacaagca 2940

gcgaaagatg cactgcagac tctattcaca aacgcgcagt acaatcgtct caaatttgaa 3000

accctgttcc cacaaattgt ccatgcagag aaactcgtac agcagatccc atatgcgtac 3060

catccattct tgagcgggac gctgtcaact gtaccaggta tgaattttga aatcatccaa 3120

caactattgg cagtgattgg aaatgcccgt acattatacg agcaacgaaa tctcttgcgt 3180

actggtacat tcagctcagg taccggaagt tggaaagtga cagaaggtgt aaaggtgcag 3240

ccactgcaag acacatctgt tctggttctg tcggaatgga gtcatgaagc gtcccagcag 3300

ttacacatgg atccagatcg cggatatgta ttacgtgtaa cagcgcgaaa agaaggcgga 3360

ggaaaaggga ctgtcaccat gagtgactgt gcagactaca cggagacact gacctttaca 3420

tcatgtgact ataacacgta tggttcccaa acgatgacaa gtggtacatt atctggattt 3480

gtgacgaaga cgttagaaat tttcccagat acggatcgga ttcgaattga tattggggaa 3540

accgaaggaa cgttccaagt agaaagtgtg gaattgattt gtatggaaca gatggaggac 3600

gacttatata atatggcggg gaacgtggcg gaagagatgc aagttctaca gcaatctcgt 3660

tccggtagcc acacattaga tcctttatgt aacacaagaa ttggcgagtt cgattgt 3717

<210> 6

<211> 1995

<212> ДНК

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 6