Экспресс тест-система определения пепсиновой и химозиновой активности молокосвертывающих ферментов Российский патент 2024 года по МПК G01N21/64 C07K7/06 C12Q1/34 

Изобретение относится к оценке соотношения пепсиновой и химозиновой активности молокосвертывающих ферментов, а также общей молокосвёртывающей активности пепсинов и химозинов и может быть использовано для проверки качества ферментных препаратов, предназначенных для производства сыра и для скрининга образцов с химозиновой и пепсиновой активностью.

Сычужные молокосвертывающие ферменты пепсин и химозин относятся к классу гидролаз, подклассу аспартатных протеаз и производят гидролиз пептидной связи с большей или меньшей специфичностью к боковым радикалам аминокислотных остатков атакуемого сайта субстрата. Катализ осуществляется при помощи активации связанной молекулы воды парой остатков аспарагиновой кислоты активного центра фермента, один из которых протонирован, а другой депротонирован. Ионизационное состояние остатков активного центра фермента обуславливает его pH-профиль активности, сдвинутый в область низких значений pH.

Специфичным субстратом для химозина является сайт Leu-Ser-Phe-Met-Ala-Ile молекулы κ-казеина - основного белка молока, расщепление производится по связи Phe-Met [1]. Пепсин проявляет более широкую субстратную специфичность и способен в том числе гидролизовать пептидную связь между объемными аминокислотными остатками фенилаланина. Тем не менее, использование в качестве субстрата κ-казеина или сухого молока является неудобным при исследовании свойств аспартатных протеаз и не позволяет изучать кинетику гидролиза конкретного сайта в случае широкой специфичности фермента. На данный момент в продаже имеются описанные в работе [2] синтетические хромогенные субстраты производства компании Bachem, содержащие остаток нитрофенилаланина и моделирующие либо сайт κ-казеина (субстрат M-1540 H-Leu-Ser-p-nitro-Phe-Nle-Ala-Leu-OMe), либо сайты широкой специфичности (например, субстрат H-4540 H-Phe-Gly-His-p-nitro-Phe-Phe-Ala-Phe-OMe). Существенным недостатком подобных субстратов является использование неприродной аминокислоты пара-нитро-фенилаланина, а также сравнительно невысокая чувствительность метода оптической спектроскопии при их использовании (коэффициент молярного поглощения продукта ε~ 1000 M^-1×cm^-1), что приводит к повышенному расходу субстрата, увеличению времени ферментативной реакции и, как следствие, времени всего анализа. Имеющиеся конвенциональные методы определения молокосвёртывающей активности препаратов не обладают возможностью дискриминации специфической пепсиновой и химозиновой активности и также сравнительно длительны по времени проведения анализа (занимает не менее 1 часа 12 мин) [3, 4].

Недавно группой ученых Московского Университета разработаны синтетические субстраты для анализа пепсиновой (широкой) субстратной специфичности аспартатных протеаз [5]. Новые субстраты содержат только природные аминокислоты в расщепляемом сайте и используют метод передачи энергии посредством флуоресцентного резонанса (FRET - fluorescence resonance energy transfer). Использование более чувствительной флуориметрии в качестве метода слежения за превращением субстрата сокращает время анализа и позволяет проводить более быструю оценку активности ферментного препарата.

Разработанные Гоптарь и др. пептидные субстраты [5] используют в качестве флуорофора остаток аминобензойной кислоты (Abz), имеющей максимум поглощения при λex = 340 нм и интенсивности флуоресценции при λem = 420 нм и находящийся на N-конце, а в качестве гасителя - N-(2,4-динитрофенил)этилендиамин (Dnp) на C-конце с максимумом поглощения в области 400 нм. Наилучшим из синтезированных субстратов был Abz-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Ala-Dnp, эффективно расщепляемый пепсином по связи Phe-Phe.

Поскольку субстратная специфичность ферментов не является абсолютной, возможно использование неспецифичного пепсинового субстрата для детектирования химозиновой активности, как показано у Гоптарь [5]. Однако, использование единственного субстрата не позволяет различить специфическую пепсиновую и специфическую химозиновую активности, равно как и оценить соотношение этих специфических активностей в ферментном препарате.

Временные рамки исследования по методу Гоптарь [5] и в представленном в изобретении методе сравнимы, поскольку оба метода основаны на непрерывном прямом флуориметрическом детектировании ферментативной активности.

Следует отметить, что в литературе также имеются исследования специфических субстратов химозина, являющихся олигопептидами, полностью состоящими из природных аминокислот [6], и для слежения за кинетикой превращения таких субстратов авторы используют длительный непрямой нингидриновый метод. Также, исследование пептидных субстратов в работе [6] было проведено только с использованием химозина, а неспецифическая активность пепсина по ним оставалась неизвестной. Оценка такой неспецифической активности проведена в другой работе [7], но использованные в ней субстраты аналогичны использованным в работе [2] и содержат модифицированные и неприродные аминокислоты в превращаемом сайте, а в качестве метода детекции активности применена низкочувствительная спектрофотометрия. Авторами [7] показана высокая неспецифическая активность пепсина, приводящая к невозможности использования синтетического химозинового субстрата для дискриминации пепсиновой и химозиновой активности.

Поскольку, как показано у Гоптарь [5], эффективность превращения различных пептидных флуоресцентных субстратов, содержащих одни и те же флуорофор и гаситель, весьма различна, представлялось неочевидным, что использование данных флуорофора и гасителя с сайтом специфичности химозина приведет к специфичному и эффективному субстрату химозина.

Техническим результатом предложенного изобретения является возможность быстрой детекции как пепсиновой, так и химозиновой активности. Для этих целей в настоящей работе был синтезирован аналогичный субстрат, содержащий те же флуорофор и гаситель, но имеющий в линкерной части аминокислотную последовательность специфичного сайта κ-казеина - Abz-Leu-Ser-Phe-Met-Ala-Ile-Dnp. Использование пары аналогичных субстратов с различной эффективностью гидролиза пепсином и химозином позволило создать новый метод определения специфической активности молокосвертывающих аспартатных протеаз.

В предложенном изобретении для определения химозиновой и пепсиновой активности использовались два субстрата: X (Abz-Leu-Ser-Phe-Met-Ala-Ile-Dnp) и P (Abz-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Ala-Dnp), в которых качестве флуорофора на N-конце имеется остаток аминобензойной кислоты (Abz), имеющей максимум поглощения при λex = 340 нм и интенсивности флуоресценции при λem = 420 нм, а в качестве гасителя на C-конце имеется N-(2,4-динитрофенил)этилендиамин (Dnp) с максимумом поглощения в области 400 нм. Чистые пепсин (пепсин свиной очищенный) и химозин (химозин телячий рекомбинантный) обладают преимущественной активностью по субстратам P и X соответственно. Соотношение специфической активности к неспецифической (по другому субстрату) присутствует у обоих ферментов и составляет примерно 1/6 от специфической.

Существо изобретения поясняется прилагаемыми графиками, где на фиг.1 даны спектры испускания негидролизованного и гидролизованного субстрата P до и после добавления пепсина. На фиг. 2 приведены кинетики превращения субстратов X и P очищенным препаратом свиного пепсина. На фиг.3 приведены кинетики превращения субстратов X и P очищенным препаратом химозина коровьего генно-инженерного. На фиг.3 - приведена зависимость соотношения измеряемых величин химозиновой и пепсиновой активностей от увеличения содержания химозина в препарате.

Методика определения пепсиновой и химозиновой активности молокосвертывающих ферментов с помощью предлагаемых субстратов отличается быстротой и надёжностью.

Определение химозиновой и пепсиновой активности с помощью предлагаемых флуоресцентных субстратов требует проведения следующих операций.

1. Приготовление стоковых растворов субстратов и контрольных препаратов.

• Субстрат Х - 0,4 мМ в диметилформамиде (ДМФА)

• Субстрат Р - 0,1 мМ в диметилформамиде (ДМФА)

• Контрольный препарат свиной пепсин очищенный - 10 мг/мл в 0,1 М ацетатном буфере с pH 4,5

• Контрольный препарат химозин говяжий очищенный - 10 мг/мл в 0,1 М ацетатном буфере с pH 4,5

Приготовление реакционной смеси контрольных для препаратов.

в 180 мкл ацетатного буфера добавляется 10 мкл субстрата Р (для измерения пепсиновой активности). Приготовленный образец с субстратом в ацетатном буфере может храниться на комнатной температуре порядка 10 мин.

аналогично готовится образец с субстратом Х (для измерения химозиновой активности),

Непосредственно перед измерением в образцы добавляется контрольный препарат (вносимый объём до 10 мкл). В качестве контрольных препаратов следует использовать очищенные пепсин и химозин. Разведения рекомендуется брать в пределах от 1 мкг/мл до 1 мг/мл в конечной концентрации. Время между добавлением препарата в реакционную смесь и измерением не должно превышать 15 секунд.

Контрольные препараты измеряются последовательно один за другим. Кинетика гидролиза субстратов контрольными препаратами измеряется по интенсивности флуоресценции каждые 5 сек в течение 3 минут. Температура проведения измерений должна быть в диапазоне (21-27°С).

Приготовление и измерение исследуемых образцов.

Образец должен быть без наличия оптически легко детектируемых частиц, взвеси, осадка, опалесценции, большого количества флуоресцирующих соединений в области испускания 420 нм.

следует приготовить 3-4 десятикратных разведений исследуемого препарата,

Каждое разведение исследуемых образцов измеряется с субстратами Х и Р аналогично измерениям контрольных препаратов.

Обработка полученных результатов.

Для обработки используется разведение, дающее линейную зависимость флюоресценции от времени. На основании графиков строится линия тренда (на базе линейной функции). Используя тангенс угла наклона линии тренда, можно получить численную характеристику процесса соответствующего скорости (V) гидролиза субстрата ферментом. Отношение скорости гидролиза субстрата X (V_X) и скорости гидролиза P (V_P) позволяет установить преобладающую активность (пепсиновую или химозиновую).

В качестве образцов сравнения могут быть использованы коммерчески доступные препараты молокосвертывающих ферментов (Табл. 1):

Таблица 1. Использованные препараты молокосвертывающих ферментов.

Название Состав Молоко-свертывающая активность Производитель/источник Пепсин свиной очищенный (раствор) Пепсин свиной 100% - Филиппова И.Ю. (МГУ) Пепсин говяжий Пепсин говяжий не менее 80%, химозин до 15% 105000 МЕ/г ЗАО «Завод эндокринных ферментов» (г. Зеленоград) Энзи-микс Пепсин говяжий не менее 40%, пепсин куриный не более 50%, химозин до 10% 110000 МЕ/г ЗАО «Завод эндокринных ферментов» (г. Зеленоград) Нормаль Пепсин говяжий 40-50%, химозин 50-60% 110000 МЕ/г ЗАО «Завод эндокринных ферментов» (г. Зеленоград) Meito Microbial Rennet («Мейто») Микробиальный реннин 100% ~150000 МЕ/г Meito Sangyo (Япония) ChyMax Химозин говяжий рекомбинантный 100% ~150000 МЕ/г Chr. Hansen A/S (Дания)

Для очищенного пепсина свиного V_X/V_P = 0,23 (измерения проводились при концентрации фермента в образце равной 50 мкг/мл) (Фиг. 2, Табл. 1).

Для очищенного химозина говяжьего V_X/V_P = 7,45 (измерения проводились при концентрации фермента в образце равной 50 мкг/мл) (Фиг. 3, Табл. 1).

Точное сопоставление процентного содержания химозина в препарате соотношению активностей по двум субстратам осуществляется калибровкой по препаратам с известным содержанием пепсина и химозина (Фиг. 4).

Таким образом изобретение позволяет создать высокочувствительный, дешевый и быстрый тест-метод на основе флуоресцентных субстратов для измерения химозиновой и пепсиновой активности молокосвёртывающих препаратов, а также для скрининга молокосвёртывающих ферментов не животного происхождения, аналогичных микробиальному реннину «Мейто».

Использованные источники информации:

1. E. W. Bingham, “Action of rennin on kappa-casein.,” J. Dairy Sci., vol. 58, no. 1, pp. 13-18, 1975.

2. R. Salesse and J. Garnier, “Synthetic peptides for chymosin and pepsin assays: pH effect and pepsin independent-determination in mixtures.,” J. Dairy Sci., vol. 59, no. 7, pp. 1215-1221, 1976.

3. ГОСТ ISO 11815-2015 от 29.05.2015. Молоко. Определение общей молокосвертывающей активности говяжьего сычужного фермента.

4. ISO 11815:2007 | IDF 157:2007 Publication date: 2007-07. Milk — Determination of total milk-clotting activity of bovine rennets.

5. I. A. Goptar’, G. N. Balandina, E. N. Lysogorskaia, and I. Yu. Filippova, “A new approach to the use of fluorogenic dinitrophenyl-containing substrates for determining the proteolytic activity of aspartyl proteinases,” Prikl. Biokhim. Mikrobiol., vol. 43, no. 4, pp. 432-436, 2007.

6. Visser et al. Peptide substrates for chymosin (rennin). “Kinetic studies with peptides of different chain length including parts of the sequence 101-112 of bovine K-casein.” Biochimica et Biophysica Acta, 1976, V.438, pp.265-272.

7. RAYMOND M.N. et al. New Chromophoric Peptide Substrates for Chymosin (Rennin) // J Dairy Sci, 1979, V.62, pp.1719-1725.

Изобретение относится к биотехнологии. Раскрыта экспресс тест-система для определения специфической пепсиновой и химозиновой активности в ферментных препаратах, используемых в производстве сыра, а также общей молокосвёртывающей активности пепсинов и химозинов, состоящая из двух пептидных флуоресцентных субстратов: (Abz-Leu-Ser-Phe-Met-Ala-Ile-Dnp) и (Abz-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Ala-Dnp), в которых в качестве флуорофора на N-конце имеется остаток аминобензойной кислоты (Abz), имеющей максимум поглощения при λex = 340 нм и интенсивности флуоресценции при λem = 420 нм, а в качестве гасителя на C-конце имеется N-(2,4-динитрофенил) этилендиамин (Dnp) с максимумом поглощения в области 400 нм. Изобретение позволяет быстро определять химозиновую и пепсиновую активность ферментных препаратов, используемых при производстве сыра. 4 ил., 1 табл.

Экспресс тест-система для определения специфической пепсиновой и химозиновой активности в ферментных препаратах, используемых в производстве сыра, а также общей молокосвёртывающей активности пепсинов и химозинов, состоящая из двух пептидных флуоресцентных субстратов: (Abz-Leu-Ser-Phe-Met-Ala-Ile-Dnp) и (Abz-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Ala-Dnp), в которых в качестве флуорофора на N-конце имеется остаток аминобензойной кислоты (Abz), имеющей максимум поглощения при λex = 340 нм и интенсивности флуоресценции при λem = 420 нм, а в качестве гасителя на C-конце имеется N-(2,4-динитрофенил) этилендиамин (Dnp) с максимумом поглощения в области 400 нм.