ПРОИЗВОДНЫЕ ОПИОРФИННОГО ПЕПТИДА КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ИНГИБИТОРЫ ЭКТОПЕПТИДАЗ, УЧАСТВУЮЩИХ В ДЕГРАДАЦИИ ЭНКЕФАЛИНОВ Российский патент 2015 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 A61P25/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к модифицированным опиорфинным пептидам в качестве новых ингибиторов металло-эктопептидаз.

Уровень техники

Цинковые эктопептидазы регулируют рецептор-зависимую активность нейронных и гормональных медиаторов, участвующих в регуляции важных физиологических функций у млекопитающих. Они локализованы на поверхности клеток в нервной и соматических тканях и катализируют постсекреторный процессинг или метаболизм нейропептидов и регуляторных пептидов (Roques, BP, Noble, F, Dauge, V, Foumie-Zaluski, MC & Beaumont, А. (1993) Pharmacol Rev 45, 87-146. Turner, AJ, Isaac, RE & Coates, D. (2001) BioEssays 23, 261-269).

Известными из числа этих нейронных и/или гормональных пептидных сигналов являются субстанция Р (SP) и энкефалины, которые вовлечены в рецептор-зависимое модулирование поведенческих адаптивных ответов на стрессовые или угрожающие стимулы окружающей среды. Они больше всего регулируют спинальный (спинномозговой) процессинг ноцицептивной информации и аналгезирующие механизмы, эмоциональные и/или мотивационные ответы, тревожность, агрессию и явление нейроиммунного воспаления (Dickenson, АН. (1995) Br J Anaesth 75, 193-200. Sora, I, Takahashi, N, Funada, M, Ujike, H, Revay, RS, Donovan, DM, Miner, LL & Uhl, GR. (1997) Proc Nati Acad Sci USA 94, 1544-1549; Konig, M, Zimmer, AM, Steiner, H, Holmes, PV, Crawley, JN, Brownstein, MJ & Zimmer, A. (1996) Nature 383, 535-538; Filliol, D, Ghozland, S, Chluba, J, Martin, M, Matthes, HW, Simonin, F, Befort, K, Gaveriaux-Ruff, C, Dierich, A & LeMeur, M, et al. (2000) Nat Genet 25, 195-200).

Вследствие физиологической важности и критической роли цинковых эктопептидаз в модулировании функциональной эффективности нижележащих (downstream) нейронных и гормональных сигналов необходимо сосредоточиться на том, что контролирует их активность и, в результате, полный регуляторный каскад. Исходя из патофизиологической и терапевтической точек зрения и вследствие возможности разработки новых потенциальных лекарственных средств стимулируется также открытие расположенных выше (upstream) регуляторов активности эктопептидаз.

Специфический для мозга гептапептид, получивший название спинорфин, был выделен из спинного мозга коров и охарактеризован на основе его ингибирующей активности по отношению к эктоферментам, разрушающим энкефалин, таким как нейтральная эндопептидаза (NEP; ЕС 3.4.24.11 [ЕС]) и аминопептидаза N (AP-N; ЕС 3.4.11.2 [ЕС]) (Nishimura, К & Hazato, Т. (1993) Biochem Biophys Res Commun 194, 713-719; Yamamoto, Y, Ono, H, Ueda, A, Shimamwa, M, Nishimura, K & Hazato, T. (2002) Curr Protein Pept Sci 3, 587-599). Кроме того, мы охарактеризовали сиалорфин крыс, пептидный медиатор, участвующий в адаптации к изменениям окружающей среды у крыс. Крысиный сиалорфин представляет собой эндокринный пептидный сигнал, экспрессия которого активируется с помощью андрогенной регуляции и секреция которого усиливается при адренергически-опосредованном ответе на стресс под влиянием условий окружающей среды у самцов крыс. Он является физиологическим ингибитором мембрано-связанной NEP активности у крыс и является сильным ингибитором болевой чувствительности у крыс (Rougeot, С, Rosinski-Chupin, I, Njamkepo, E & Rougeon, F. (1994) Eur J Biochem 219, 765-773; Rougeot, С, Vienet, R, Cardona, A, Le Doledec, L, Grognet, JM & Rougeon, F. (1997) Am J Physiol 273, R1309-R1320.; Rougeot, C, Rosinski-Chupin, I & Rougeon, F. (1998) in Biomedical Reviews eds. Chaldakov, GN & Mathison, R. (Bulgarian-American Center, Vama, Bulgaria,) Vol 9, pp.17-32; Rosinski-Chupin, I, Huauime, JF, Rougeot, С & Rougeon, F. (2001) Endocrinology 142, 4550-4559; Rougeot, С, Messaoudi, M, Hermitte, V, Rigault, AG, Blisnick, T, Dugave, C, Desor, D & Rougeon, F. (2003) Proc Nati AcadSci USA 100, 8549-8554).

Ранее мы показали, что человеческий нативный пептид опиорфин (QRFSR-пептид), в настоящее время впервые описанный у человека, является эффективным двойным ингибитором двух энкефалин-инактивирующих эктопептидаз, нейтральной эндопептидазы NEP (ЕС 3.4.24.11) и аминопептидазы AP-N (ЕС 3.4.11.2) (Wisner et al. Proc Nati Acad Sci USA, Nov. 2006, 103 (47): 17979-84).

Производные опиорфинного пептида описаны ранее, смотри, например, Wisner et al. Proc Nati Acad Sci USA, Nov. 2006, 103 (47): 17979-84 и имеют основную пептидную последовательность QRFSR.

Таким образом, эта последовательность и последовательность, определенная следующей формулой, могут быть модифицированы: X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg, где X1 представляет атом Н или аминокислоту Tyr, Х2 представляет Gln или Glp, когда X1 представляет собой Н, или Х2 представляет Gln, когда X1 представляет собой Tyr или Cys. Предпочтительной является QRFSR, YQRFSR и/или CQRFSR, наиболее предпочтительной - QRFSR. Понятно, что Glp является пироглутаматом, Tyr или Y представляет собой тирозин. Gln или Q представляет собой глутамин, Arg или R представляет собой аргинин, Phe или F представляет собой фенилаланин, Ser или S представляет собой серин, и Cys или С для цистеина. Эти пептиды описаны в международной патентной заявке, опубликованной как WO 2005090386.

Раскрытие изобретения

Изобретение предоставляет новые производные опиорфина и функциональную характеристику in vitro с использованием высокоселективных биохимических методов исследования.

Краткое описание чертежей

Фиг.1-4 Кинетические кривые гидролиза соответствующих FRET-пептидных субстратов с помощью рекомбинантного hNEP или hAP-N в присутствии носителя или в присутствии 50 мкМ QRFSR-пептидных аналогов. Каждая точка представляет интенсивность сигнала, выраженную в RFU (относительная единица флуоресценции), которая пропорциональна количеству образованных метаболитов, как функцию времени реакции (мин).

Фиг.5: Ингибирование QRFSR-пептидными аналогами гидролиза соответствующих FRET-пептидных субстратов с помощью чистого рекомбинантного человеческого hNEP или AP-N. Каждый столбик представляет процент восстановленного интактного субстрата, вычисленного как процент скорости без ингибитора - скорость в присутствии ингибитора/скорость без ингибитора, которая была измерена в отсутствие или в присутствии 50 мкМ QRFSR-пептидных аналогов.

Фиг.6: Ингибирование QRFSR-пептидным аналогом гидролиза соответствующих FRET-пептидных субстратов с помощью чистого рекомбинантного человеческого hNEP или AP-N. Каждый столбик представляет процент восстановленного интактного субстрата, вычисленного как процент скорости без ингибитора - скорость в присутствии ингибитора/скорость без ингибитора, которая была измерена в отсутствие или в присутствии 50 мкМ QRFSR-пептидных аналогов.

Фиг.7-8: Ингибирование QRFSR-пептидным аналогом гидролиза соответствующих FRET-пептидных субстратов с помощью чистого рекомбинантного человеческого hNEP или AP-N. Каждый столбик представляет процент восстановленного интактного субстрата, вычисленного как процент скорости без ингибитора - скорость в присутствии ингибитора/скорость, без ингибитора, которая была измерена в отсутствие или в присутствии 50 мкМ QRFSR-пептидных аналогов.

Фиг.9: Концентрационно-зависимое ингибирование пептидом CQRFSR гидролиза соответствующих FRET-пептидных субстратов с помощью чистого рекомбинантного человеческого hNEP или AP-N. Каждая точка представляет процент восстановленного интактного субстрата, вычисленного как процент скорости без ингибитора-скорость в присутствии ингибитора/скорость без ингибитора, которая была измерена в отсутствие или в присутствии разных концентраций CRFSR-пептида, нанесенных в мкМ (log-шкала).

Фиг.10: Концентрационно-зависимое ингибирование пептидом QRFS[O-октаноил]R гидролиза соответствующих FRET-пептидных субстратов с помощью чистого рекомбинантного человеческого hNEP или AP-N. Каждая точка представляет процент восстановленного интактного субстрата, вычисленного как процент скорости без ингибитора-скорость в присутствии ингибитора/скорость без ингибитора, которая была измерена в отсутствие или в присутствии разных концентраций QRFS[O-октаноил]R - пептида нанесенного в мкµМ (log-шкала).

Фиг.11: Концентрационно-зависимое ингибирование пептидом Y(PE12)QRFSR (т.е. Y-[NH-(CH₂)₁₂-CO]-QRFSR) гидролиза соответствующих FRET-пептидных субстратов с помощью чистого рекомбинантного человеческого hNEP или AP-N. Каждая точка представляет процент восстановленного интактного субстрата, вычисленного как процент скорости без ингибитора - скорость в присутствии ингибитора/скорость без ингибитора, которая была измерена в отсутствие или в присутствии разных концентраций Y(РЕ12)QRFSR-пептида, нанесенных в Log мкМ.

Фиг.12-17: Кинетические кривые гидролиза соответствующих FRET-пептидных субстратов с помощью рекомбинантных hNEP или hAP-N в присутствии носителя или в присутствии от 1 до 50 мкМ CQRFSR или CQRFS[O-октаноил]R опиофин-пептидных аналогов. Каждая точка представляет интенсивность сигнала, выраженную в RFU (относительная единица флуоресценции), которая была пропорциональна количеству образованных метаболитов, как функцию времени реакции (мин).

Фиг.18: Концентрационно-зависимое ингибирование пептидом CQRFSR гидролиза соответствующих FRET-пептидных субстратов с помощью чистого рекомбинантного человеческого hNEP или AP-N. Каждая точка представляет процент восстановленного интактного субстрата, вычисленного как процент скорости без ингибитора-скорость в присутствии ингибитора/скорость без ингибитора, которая была измерена в отсутствие или в присутствии разных концентраций CRFSR-пептида, нанесенных в мкМ (log-шкала).

Фиг.19: Концентрационно-зависимое ингибирование Y[PE12]QRFSR-COOH пептидом (т.е. Y-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR) гидролиза соответствующих FRET-пептидных субстратов с помощью чистого рекомбинантного человеческого hNEP или АР-N. Каждая точка представляет процент восстановленного интактного субстрата, вычисленного как процент скорости без ингибитора-скорость в присутствии ингибитора/скорость без ингибитора, которая была измерена в отсутствие или в присутствии разных концентраций Y(PE12)QRFSR-COOH пептида, нанесенных в мкМ (log-шкала).

Фиг.20: Концентрационно-зависимое ингибирование C[PE6]QRFSR-COOH пептидом (т.е. C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR) гидролиза соответствующих FRET-пептидных субстратов с помощью чистого рекомбинантного человеческого hNEP или AP-N. Каждая точка представляет процент восстановленного интактного субстрата, вычисленного как процент скорости без ингибитора-скорость в присутствии ингибитора/скорость без ингибитора, которая была измерена в отсутствие или в присутствии разных концентраций C[PE6]QRFSR-COOH пептида, нанесенных в мкМ (log шкала).

Фиг.21: Концентрационно-зависимое ингибирование пептидом C(PE12)QRFSR-СООН (т.е. C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR) гидролиза соответствующих FRET-пептидных субстратов с помощью чистого рекомбинантного человеческого hNEP или AP-N. Каждая точка представляет процент восстановленного интактного субстрата, вычисленного как процент скорости без ингибитора-скорость в присутствии ингибитора/скорость без ингибитора, которая была измерена в отсутствие или в присутствии разных концентраций C(PE12)QRFSR-COOH пептида, нанесенных в мкМ (log шкала).

Фиг.22: Концентрационно-зависимое ингибирование пептидом C[PE6]QRF[S-O-Октаноил]R (т.е. С-(-HN(СН₂)₆-СО-)-QRP-S(O-октаноил)-R) гидролиза соответствующих FRET-пептидных субстратов с помощью чистого рекомбинантного человеческого hNEP или AP-N. Каждая точка представляет процент восстановленного интактного субстрата, вычисленного как процент скорости без ингибитора-скорость в присутствии ингибитора/скорость без ингибитора, которая была измерена в отсутствие или в присутствии разных концентраций С[РЕ6]QRF[S-O-Октаноил]R - пептида, нанесенных в мкМ (log шкала).

Фиг.23: Концентрационно-зависимое ингибирование пептидом C[PE6]QRF[S-O-Октаноил]R (т.е. C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRF-S(O-октаноил)-R) гидролиза субстанции Р, физиологического NEP-субстрата, мембрано-связанным человеческим NEP, экспрессированным эпителиальными клетками LNCaP в культуре. Каждая точка представляет процент восстановленного интактного субстрата, вычисленного как процент скорости без ингибитора-скорость в присутствии ингибитора/скорость без ингибитора, которая была измерена в отсутствие или в присутствии разных концентраций С[РЕ6]QRF[S-O-Октаноил]R - пептида, нанесенных в нМ (log шкала).

Осуществление изобретения

Теперь изобретение предоставляет модифицированные варианты этих пептидов, где каждый или комбинации аминокислотных остатков, которые составляют данный опиорфинный пептид, модифицированы одной или более функциональными группами.

Неограничивающие примеры таких модифицированных опиорфинных пептидов включают:

NH2-QRFSR-CONH2;

NH2-QRGPR-COOH;

NH2-QHNPR-COOH;

NH2-QR(4БромF)SR-COOH (т.е. NH2-QR-F[4Br]-SR-COOH, где -F[4Br]- представляет собой фенилаланин, фенильная группа которого замещена в пара-положении атомом брома, так что -F[4Br]- имеет следующую формулу:

N-(Ацетил)QRFSR-COOH;

N-(C8-полиэтилен)QRFSR-COOH;

N-(биотин-C6)QRFSR-COOH;

NH2-dRdSdFdRdQ-COOH (ретроинверсия D-энантиомер);

NH2-YQRFSR-COOH;

NH2-Y-(C6-полиэтилен)QRFSR-COOH;

NH2-Y-(C12-полиэтилен)ORFSR-СООН;

NН2-ORF[S-O-С8-полиэтилен]R-СООН;

NH2-CQRFSR-COOH;

NH2-CQRF[S-O-C8-полиэтилен]R-COOH;

МН2-СОРР[S-O-С12-полиэтилен]R-СООН;

NH2-C-(C8-полиэтилен)QRFSR-COOH;

NH2-C-(C12-полиэтилен)QRFSR-СООН;

NH2-С-(С8-полиэтилен)QRFSR-0-С8-полиэтилен]К-СООН;

NH2-[СВ2]ОКР[8-0-С8-полиэтилен]К-СООН;

NH2-С-(С8-полиэтилен)QRFS[β3R]-СООН;

NH2-C[dQ]RF[S-O-C8-полиэтилен][dR]-COOH;

NH2-C-(C8-полиэтилен)QRFS[dR];

NH2-[dC]QRF[S-O-C8-полиэтилен][dR]-COOH;

NH2-[CB2]QRF[S-O-C8-полиэтилен][B3R]-COOH;

[CQRFSR]2 как цистин-дипептид через дисульфидную связь;

Glp-RFSR-СООН;

NH2-QRYSR-COOH;

NH2-QRF[4F]SR-COOH, где -F[4F]- представляет собой фенилаланин, фенильная группа которого замещена в пара-положении атомом фтора, так что -F[4F]- имеет следующую формулу:

NH2-QKFSR-COOH;

NH2-QRFSK-COOH;

NH2-C-(C6-полиэтилен)QRFSR-COOH;

NH2-С-(С6-полиэтилен)-QRFS[S-O-С8-полиэтилен]Р-СООН;

NH2-С-(С12-полиэтилен)QRFS[S-O-С8-полиэтилен]К-СООН;

NH2-C[PE12]QRFS-dR-COOH;

NH2-C-(C12-полиэтилен)-QRFS[S-O-С8-полиэтилен]-β3R-СООН;

NH2-С-(С8-полиэтилен)-QRFS[S-O-С8-полиэтилен]-β3R-СООН,

где

Cβ2 замещает природный остаток цистеина β2-цистеином, включая остаток метилена смежный с углеродом Сα около α-карбонильной группы цистеина (H₂N(-CH₂-SH)-CH₂-СО-);

β3R замещает природный остаток аргинина β3-аргинином, включая остаток метилена смежный с углеродом Сα около α-аминной группы аргинина (-NH-CH₂-C[-(CH₂)₃-NH-C(NH)(NH₂)]-COOH);

[S-O-С8-полиэтилен] и [S-O-октаноил] означает серин, в котором гидроксильная группа замещена октаноильной группой;

[S-O-C12-полиэтилен] означает серин, в котором гидроксильная группа замещена додеканоильной группой;

С6, С8 или С 12 - полиэтилен соответствует спэйсеру из 6, 8 или 12 этиленовых углеводов ((-HN-(CH₂)₆-CO-, -HN-(CH₂)₈-CO- и (-HN-(CH₂)₁₂-CO- соответственно).

В вышеприведенных пептидах NH2- представляет концевую аминогруппу пептида, а СООН - концевую карбоксигруппу (-CO-NH2, когда концевая функция является амидной функцией). Вышеприведенный список также можно прочитать как:

QRFSR-NH₂;

QRGPR;

QHNPR;

(Ацетил)QRFSR;

C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFSR;

биотин-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR;

dR-dS-dF-dR-dQ;

YQRFSR;

Y-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR;

Y-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR;

QRF-S(O-октаноил)-R;

CQRFSR;

CQRF-S(O-октаноил)-R;

CQRJF-S(O-додеканоил)-R;

C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFSR;

C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR;

C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRF-S(O-октаноил)-R;

[Cβ2]QRF-S(О-октаноил)-R;

C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFS-[β3R];

C-[dQ]-RF-S(O-октаноил)-[dR];

C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFS-[dR];

[dC]-QRF-S(O-октаноил)-[dR];

[Сβ2]-QRF-S(O-октаноил)-[β3R];

[CQRFSR]2;

Glp-RFSR;

QRYSR;

QR-F[4F]-SR, где -F[4F]- представляет собой фенилаланин, фенильная группа которого замещена в пара-положении атомом фтора;

QR-F[4Br]-SR, где -F[4Br]- представляет собой фенилаланин, фенильная группа которого замещена в пара-положении атомом брома;

QKFSR;

QRFSK;

C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR;

C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRF-S(O-октаноил)-R;

C(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)QRF-S(O-октаноил)-R;

C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFS-dR;

C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRF-S(O-октаноил)-β3R;

C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRF-S(O-октаноил)β3R,

где:

Cβ2 представляет собой H₂N(-CH₂-SH)-CH₂-CO-;

β3R представляет собой -NH-CH₂-C[-(CH₂)₃-NH-C(NH)(NH₂)]-COOH;

-S(-О-октаноил) означает серии, в котором гидроксильная группа замещена октаноильной группой;

-S(-О-додеканоил) означает серин, в котором гидроксильная группа замещена додеканоильной группой. Следующие определения используются на протяжении текущей заявки.

"Пептид" представляет собой молекулу, состоящую из линейно расположенных аминокислотных остатков, связанных друг с другом в линейном порядке с помощью пептидных связей. Такой линейный порядок может необязательно быть циклическим, т.е. концы линейного пептида или боковые цепи аминокислот в пептиде могут быть соединены, например, с помощью химической связи. Такие пептиды могут дополнительно включать вторичные, третичные или четвертичные структуры, а также межмолекулярные связи с другими пептидами или другими непептидными молекулами. Такие межмолекулярные связи могут осуществляться, без ограничения, при помощи ковалентного связывания (например, через дисульфидные связи), или путем хелатообразования, электростатических взаимодействий, гидрофобных взаимодействий, водородного связывания, ион-дипольных взаимодействий, диполь-дипольных взаимодействий или любой комбинации вышеупомянутого.

Любая аминокислота из следующих пептидов может быть в L-конфигурации или D-конфигурации. В частности, полный пептид может быть или в L или D конфигурации. Углеводородная цепь необязательно может содержать дополнительную метиленовую группу по сравнению с природной аминокислотой, так что аминокислоты также могут быть р аминокислотами, более точно β2 или β3 аминокислотами. Например, R может представлять одну из следующих аминокислот: 1R (т.е. L-Arg), dR (т.е. D-Arg), β3R или β2R. Любая аминокислота из нижеследующих пептидов также может быть аза-аминокислотой или β-аза-аминокислотой.

"F(X)" означает фенилаланин, фенильная группа которого замещена одним или более атомами галогена, предпочтительно фтором, предпочтительный Р(Х) имеет одну из следующих формул:

"S(OAlk)" означает серин, гидроксильная группа которого замещена линейной или разветвленной алкильной группой, имеющей от 1 до 20 атомов углерода (т.е. "Alk"), предпочтительно октаноильной или додеканоильной группой. В настоящей заявке S(O-С8-полиэтилен) или S(O-C8) означает серин, гидроксильная группа которого замещена октаноильной группой.

"С-[линкер]-" означает Cys-[NH-(CH₂)_n-CO]-, где n является целым числом между 1 и 20, предпочтительно между 4 и 15, 6, 8 или 12 является особенно предпочтительным. В настоящей заявке "С-(С6-полиэтилен)" или "С[РЕ6]" означает Cys-[NH-(CH₂)₆-CO]-; "С-(С8-полиэтилен)" или "C[PE8]" означает Cys-[NH-(CH₂)₈-CO]-; и "С-(С12-полиэтилен)" или "С[РЕ12]" означает Cys-[NH-(CH₂)₁₂-CO]-.

"Y-[линкер]-" означает Tyr-[NH-(CH₂)_n'-CO]-, где n' является целым числом между 1 и 20, предпочтительно между 4 и 15, 6, 8 или 12 является особенно предпочтительным. В настоящей заявке "Y-(С8-полиэтилен)" или "Y[PE8]" означает Tyr-[NH-(СН₂)₈-СО]-; "Y-(С8-полиэтилен)" или "Y[PE8]" означает Tyr-[NH-(CH₂)₈-CO]-; и "Y-(C12-полиэтилен)" или "Y[PE12]" означает Tyr-[NH-(CH₂)₁₂-CO]-.

"Ингибирующая активность" пептидного производного изобретения по отношению к отдельной пептидазе может быть легко оценена специалистом в данной области, например, или с помощью измерения значений Ki или значений IC₅₀. В частности, когда определены значения IC₅₀, относительные ингибирующие активности двух модифицированных опиорфинных пептидов можно сравнить путем измерения значения IC₅₀ каждого модифицированного опиорфинного пептида по отношению к данной пептидазе в заданных экспериментальных условиях (один и тот же буфер, те же самые концентрации пептидазы и субстрата) и путем сравнения указанных значений IC₅₀ модифицированных опиорфинных пептидов со значением IC₅₀ опиорфина в одинаковых экспериментальных условиях.

Изобретение касается пептидного производного формулы (I):

- ζ представляет собой атом водорода, тирозин, Y-[линкер]- или Zn хелатную группу, такую как цистеин, С-[линкер]-, N-ацетил-цистеин, N-меркаптоацетил (HS-CH₂-CO-), гидроксамовая кислота (HO-NH-CO-) или необязательно замещенный гидроксихинолин,

- AA₁ представляет собой Q или Glp,

- АА₂ представляет собой К, R или Н, предпочтительно R,

- АА₃ представляет собой Y, G, N, F или F(X), предпочтительно F или F(X),

- АА₄ представляет собой Р, S или S(OAlk), предпочтительно S или S(OAlk),

- АА₅ представляет собой К или R, предпочтительно R,

- С-[линкер]- означает Cys-[NH-(CH₂)_n-CO]-, где n представляет собой целое число между 1 и 20, n является предпочтительно 6, 8 или 12,

- Y-[линкер]- означает Tyr-[NH-(CH₂)_n'-CO]-, где n' представляет собой целое число между 1 и 20, n' является предпочтительно 6, 8 или 12,

- F(X) означает фенилаланин, фенильная группа которого замещена одним или более атомами галогена,

- S(OAlk) означает серин, гидроксильная группа которого замещена линейной или разветвленной алкильной группой, имеющей от 1 до 20 атомов углерода,

- указанный AA₁, AA₂, АА₃, АА₄ и AA₅ независимо может находиться или в L-конфигурации или D-конфигурации, и любой один из AA₁, AA₂, АА₃, АА₄ и АА₅ необязательно может быть β-аминокислотой, аза-аминокислотой или β-аза-аминокислотой;

где, если пептидное производное содержит цистеин, указанное пептидное производное необязательно представляет собой димер, при условии, что пептид не является QRFSR, QHNPR, QRGPR, YQRFSR или GlpRFSR.

Как правило, в пептидных производных согласно изобретению AA₁, AA₂, АА₃, АА₄ и АА₅ независимо находятся или в L-конфигурации или D-конфигурации, и любой один из AA₁, AA₂, АА₃, АА₄ и АА₅ необязательно может быть β-аминокислотой, аза-аминокислотой или β-аза-аминокислотой.

В одном варианте осуществления по меньшей мере один из AA₁, AA₂, АА₃, АА₄ и АА₅ является β-аминокислотой.

В другом варианте осуществления все из числа AA₁, АА₂, АА₃, АА₄ и АА₅ являются β-аминокислотами.

В некотором варианте, по меньшей мере, один из числа AA₁, AA₂, АА₃, АА₄ и АА₅ является аза-аминокислотой. В другом варианте все из числа AA₁, АА₂, АА₃, АА₄ и АА₅ являются аза-аминокислотами.

В некотором варианте, по меньшей мере, один из числа AA₁, AA₂, АА₃, АА₄ и АА₅ является β-аза-аминокислотой. В другом варианте все из числа AA₁, АА₂, АА₃, АА₄ и АА₅ являются β-аза-аминокислотой.

В одном варианте пептидное производное содержит цистеин и представляет собой димер, в котором два атома серы двух цистеинов связаны с помощью дисульфидной связи. Например, [CQRFSR]₂ представляет собой димер пептидного производного CQRFSR, аминокислоты (цистеин) которого соединены с помощью дисульфидной связи.

В предпочтительном варианте осуществления, когда £; представляет собой гидроксихинолин, пептидное производное имеет следующую формулу:

Пептидные производные формулы (I) представляют собой модифицированные опиорфинные пептиды, которые предпочтительно имеют ингибирующую активность по отношению к нейтральной эндопептидазе NEP и/или аминопептидазе AP-N. Предпочтительными пептидными производными формулы (I) являются:

CQRFSR,

QRF(X)SR,

QRGPR,

QHNPR,

QRFPR,

QRFS(OAlk)R, предпочтительно QRFS(O-октаноил)R,

C-[линкер]-QRFSR, предпочтительно C-[NH-(CH₂)₆-CO]-QRFSR, C-[NH-(CH₂)₈-CO]-QRFSR,

или C-[NH-(CH₂)₁₂-CO]-QRFSR,

QRYSR,

QKFSR,

QRFSK,

C-[линкер]-QRFSR, предпочтительно C-[NH-(CH₂)₆-CO]-QRFSR, С-[NH-(СН₂)₈-СО]-QRFSR, или C-[NH-(CH2)i2-CO]-QRFSR,

[CQRFSR]₂

C-[NH-(CH₂)₆-CO]-QRFS(OAlk)R, предпочтительно C-[NH-(CH₂)₆-CO]-QRFS(O-октаноил)R и

Y-[NH-(CH₂)₁₂-CO]-QRTSR.

В некотором варианте осуществления изобретение касается пептидного производного формулы (II):

где:

- ζ^a представляет собой атом водорода или Zn хелатную группу, такую как цистеин, С-[линкер]-, N-ацетил-цистеин, N-меркаптоацетил (HS-CH₂-CO-), гидроксамовая кислота (HO-NH-CO-) или необязательно замещенный гидроксихинолин,

- AA^a ₂ представляет собой R или Н, предпочтительно R,

- AA^a ₃ представляет собой G, N, F или F(X), предпочтительно F,

- указанные Q, AA₂, АА₃, Р и R независимо могут находиться или в L-конфигурации или D-конфигурации, и любой один из Q, АА₂, АА₃, Р и R необязательно может быть β-аминокислотой, аза-аминокислотой или β-аза-аминокислотой;

где, если пептидное производное содержит цистеин, указанное пептидное производное необязательно является димером,

при условии, что пептид не является QHNPR или QRGPR.

Указанное пептидное производное формулы (II) представляет собой модифицированный опиорфинный пептид и является предпочтительно ингибитором AP-N человека. В частности он может обладать ингибирующей активностью по отношению к AP-N более высокой (предпочтительно, по меньшей мере, в 6 раз, в 8 раз или 10 раз) чем его ингибирующая активность по отношению к активности(ям) NEP эндопептидазы и/или карбоксипептидазы. Предпочтительными пептидными производными формулы (II) являются:

QRGPR,

QHNPR и

QRFPR.

В одном варианте осуществления изобретение касается пептидного производного формулы (III):

где:

- ζⁿ представляет собой атом водорода, тирозин или У-[линкер]-,

- AA₁ представляет собой Q или Glp, предпочтительно Q,

- AAⁿ ₂ представляет собой К или R, предпочтительно R,

- AAⁿ ₃ представляет собой Y, F или F(X), предпочтительно F или F(X),

- AAⁿ ₄ представляет собой S или S(OAlk),

- AAⁿ ₅ представляет собой К или R, предпочтительно R,

указанные AA₁, AA₂, АА₃, АА₄ и AA₅ могут независимо находиться или в L-конфигурации или D-конфигурации, и любой один из числа AA₁, AA₂, АА₃, АА₄ и АА₅ необязательно может быть р-аминокислотой, аза-аминокислотой или β-аза-аминокислотой;

при условии, что пептид не является QRFSR, QHNPR, YQRFSR или GlpRFSR.

Указанное пептидное производное формулы (III) представляет собой модифицированный опиорфинный пептид и предпочтительно является ингибитором NEP человека. В частности, он может обладать ингибирующей активностью по отношению к активности(ям) NEP эндопептидазы и/или карбоксипептидазы более высокой (предпочтительно, по меньшей мере, в 6 раз, 8 раз, или 10 раз), чем его ингибирующая активность по отношению к AP-N.

В одном варианте изобретение касается пептидного производного формулы (IIIa):

где:

- AA₁ представляет собой Q или Glp,

- AAⁿ ₃ представляет собой F или F(X),

- AAⁿ ₅ представляет собой К или R, предпочтительно R,

при условии, что пептид не является QRFSR, QHNPR, YQRFSR или GlpRFSR.

Предпочтительными пептидными производными формулы (III) или (IIIa) являются:

QRYSR,

QRF(X)SR,

QKFSR,

QRFSK,

QRFS(OAlk)R, предпочтительно QRFS(O-октаноил)R и

Y-[NH-(CH₂)₁₂-CO]-QRFSR.

В некотором варианте изобретение касается пептидного производного формулы (IV):

где:

- ζ^m представляет собой атом водорода или Zn хелатную группу, такую как цистеин, С-[линкер]-, N-ацетил-цистеин, N-меркаптоацетил (HS-CH₂-CO-), гидроксамовая кислота (HO-NH-CO-) или необязательно замещенный гидроксихинолин,

- AA^m ₃ представляет собой F или F(X), предпочтительно F(X),

- AA^m ₄ представляет собой S или S(OAlk), предпочтительно S или S(OAlk),

- указанные Q, R, АА₃, АА₄ и R независимо могут находиться или в L-конфигурации или D-конфигурации, и любой один из числа Q, R, АА₃, АА₄ и R необязательно может быть β-аминокислотой, аза-аминокислотой или β-аза-аминокислотой;

где, если пептидное производное содержит цистеин, указанное пептидное производное необязательно является димером,

при условии, что пептид не является QRFSR или YQRFSR.

Пептидные производные формулы (IV) представляют собой модифицированные опиорфинные пептиды, которые предпочтительно являются двойными ингибиторами NEP человека и AP-N человека, так как они демонстрируют значимую ингибирующую активность по отношению и к NEP человека и AP-N человека.

Предпочтительными пептидными производными формулы (IV) являются:

CQRFSR,

[CQRFSR]₂,

C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR;

C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR;

С-[линкер]-QRF-S(O-октаноил)-R, предпочтительно C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRF-S(O-октаноил)-R, C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRF-S(O-октаноил)-R или C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRF-S(O-октаноил)-R;

QRF(X)SR и

QRFS(OAlk)R, предпочтительно ORFS(O-октаноил)R.

Предпочтительно, пептидные производные изобретения здесь представляют собой модифицированные опиорфинные пептиды и обладают ингибирующей активностью по отношению к нейтральной эндопептидазе NEP и/или аминопептидазе AP-N. Наиболее предпочтительно, модифицированные опиорфинные пептиды изобретения обладают ингибирующей активностью по отношению к эндопептидазе NEP и аминопептидазе АР-N.

Пептидные производные согласно настоящему изобретению можно получить обычным способом с помощью синтеза пептидов в жидкой или твердой фазе путем последовательных соединений различных аминокислотных остатков, которые необходимо включить (от N-концевой области к С-концевой области в жидкой фазе или от С-концевой области к N-концевой области в твердой фазе), где N-концевые области и химически активные боковые цепи предварительно блокированы обычно применяемыми группами.

Что касается твердофазного синтеза, в частности можно использовать метод, описанный Memfield. Альтернативно, также можно использовать метод, описанный Houbenweyl в 1974.

Пептидные производные согласно настоящему изобретению также можно получить, используя методы генной инженерии, при условии, что они состоят из природных аминокислот.

Модификации по отношению к опиорфинным пептидам включают химические (например, содержащие дополнительные химические фрагменты, такие как метил, полиэтилен C₂, C₄, С₆, C₈, С₁₀, С₁₂ и его полиэтиленгликоль, и/или гликозилированные формы и пептидомиметики (например, низкомолекулярное соединение, которое напоминает пептид по структуре и/или функции (смотри, например, Abell, Advances in Ammo Acid Mimetics and Peptidomimetics, London: JAI Press (1997); Gante, Peptidmimetica -massgeschneiderte Enzyminhibitoren Angew. Chem. 106: 1780-1802 (1994); и Olson et al., J. Med. Chem. 36: 3039-3049 (1993)).

Другие модификации, которые могут быть введены в пептидные производные изобретения, включают использование неприродных аминокислот, D аминокислоты, β₂ аминокислоты, β₂ аминокислоты, аза-аминокислоты или β-аза-аминокислоты вместо L аминокислоты, конформационные ограничения, изостерическое замещение, циклизацию или другие модификации. Другими примерами являются примеры, когда одна или более амидная связь заменяется неамидной связью и/или одна или более аминокислотная боковая цепь заменяется другим химическим фрагментом, или один или более из числа N-конца, С-конца или одна или более боковая цепь защищена защитной группой, и/или двойные связи и/или циклизация и/или стереоспецифичность помещена в аминокислотную цепь для увеличения жесткости или связывающей способности.

Исходя из кристаллической структуры домена связывания металло-эктопептидазы, на который нацелено пептидное производное изобретения, миметики также можно получить путем разработки лекарственных средств с помощью компьютерного моделирования (Oefiier et al. J. Mol. Biol. (2000) 296 (2): 341-9; Gomeni et al. Eur. J. Pharm. Sci. (2001) 13 (3): 261-70; Kan, Curr Top Med Chem (2002), 2 (3): 247-69).

Другие модификации включают:

- защиту NH₂ и СООН гидрофильных групп путем этерификации (СООН) липофильными спиртами или путем амидирования (СООН) и/или ацетилирования (NH₂) или добавления карбоксиалкильной или ароматической гидрофобной цепи NH₂ конце;

- ретроинверсионные изомеры (retroinversion isomers) CO-NH амидных связей или метилирование (или кетометилен, метиленокси, гидроксиэтилен) амидных групп;

- вставку -[HN-(CH₂)_n-CO-]- фрагментов между двумя аминокислотами, причем n является целым числом от 1 до 20, предпочтительно 6, 8 или 12.

Нуклеиновые кислоты, также называемые полинуклеотидами, такие как молекулы ДНК или РНК, которые кодируют пептиды, включая пептидные производные, содержащие природные аминокислоты, определенные выше, также являются частью изобретения, кроме того, принимая во внимание вырождение генетического кода. Предпочтительно, нуклеиновая кислота содержит последовательность, которая кодирует пептидное производное, состоящее из природных аминокислот.

Нуклеиновые кислоты изобретения включают последовательности, которые поддаются гибридизации с любой из вышеуказанных последовательностей или их комплементарными последовательностями в строгих условиях гибридизации, имеются в виду условия гибридизации и промывки при 68°С в 0.2×SSC, при 42°С в 50% формамиде, 4×SSC, или при условиях, которые дают уровни гибридизации, эквивалентные уровням, наблюдаемым при любых из этих двух условий.

Настоящее изобретение дополнительно касается векторов клонирования и/или экспрессии, содержащих нуклеиновокислотную последовательность изобретения и к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту или указанный вектор, т.е. клетке-хозяину, в которую, по меньшей мере, один из этих векторов был перенесен. Вектор экспрессии согласно изобретению содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую пептид, включая пептидное производное, или протеин изобретения, причем указанная нуклеиновокислотная последовательность является функционально связанной с элементами, дающими возможность ее экспрессии. Данный вектор предпочтительно содержит промоторную последовательность, сигналы для инициации и терминации трансляции, а также соответствующие области для регуляции трансляции. Его введение (вставка) в клетку-хозяина может быть неустойчивым (временным) или стабильным. Вектор также может содержать специфические сигналы для секреции транслированного белка.

Клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими, включая, но, не ограничиваясь этим, клетки бактерий, грибов, растений, клетки насекомых, клетки млекопитающих, включая коммерчески доступные клеточные линии. Предпочтительными примерами клеток-хозяев являются COS-1, НЕК клетки, 293 клетки или клетки СНО.

Настоящее изобретение дополнительно предоставляет антитела, моноклональные или поликлональные, или их фрагменты, специфически направленные против (т.е. которые специфически распознают) модифицированных опиорфинных пептидов, описанных здесь. Такие антитела можно, например, использовать для исследования фармакокинетических свойств пептидных производных изобретения.

Термин "антитело" в его разных грамматических формах используется здесь для того, чтобы говорить о молекулах иммуноглобулина и иммунологически активных частях молекулы иммуноглобулина, т.е. молекулах, которые содержат антигенсвязывающий активный центр антитела или паратоп. Примерами молекул антител являются интактные молекулы иммуноглобулина, главным образом интактные молекулы иммуноглобулина и части молекулы иммуноглобулина, включая части, известные в данной области, как Fab, Fab', F(ab')₂ и F(v).

Методики получения поликлональных антител также хорошо известны. Обычно такие антитела можно получить путем введения пептидного производного, включая конъюгированное пептидное производное настоящего изобретения, подкожно белым новозеландским кроликам, у которых впервые брали кровь для получения преиммунной сыворотки. Антигены можно вводить в общем объеме 50 мкл на одно место в десяти разных местах иди по крайней мере в пяти разных местах. Затем через пять недель после первой инъекции у кроликов берут кровь и периодически подвергают их повторной стимуляции тем же самым антигеном, введенным подкожно в концентрации в пять раз более низкой, чем первичная инъекция, с максимумом (концентрации), зависящим от качества иммунного ответа, три раза каждые шесть недель. Затем образец сыворотки отбирают каждые 10 дней после каждой повторной стимуляции. Затем поликлональные антитела извлекают из сыворотки с помощью аффинной хроматографии с использованием соответствующего антигена для улавливания антитела. Эта и другие методики получения поликлональных антител раскрыта в Е.Harlow, et. al., editors. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988).

"Моноклональное антитело" в его разных грамматических формах относится к популяции молекул антител, которые содержат только один вид антигенсвязывающего активного центра, способного к иммунной реакции с особенным эпитопом. Моноклональное антитело, таким образом, обычно обнаруживает единственную связывающую способность в отношении любого эпитопа, с которым оно вступает в иммунную реакцию. Моноклональное антитело может, следовательно, содержать молекулу антитела, имеющую множество антигенсвязывающих активных центров, каждый иммуноспецифический в отношении другого эпитопа, например биспецифическое моноклональное антитело.

Лабораторные способы получения моноклональных антител хорошо известны в данной области техники (смотри, например, Harlow et al., выше). Моноклональные антитела (Mab) можно получить путем иммунизации млекопитающего, например, мыши, крысы, кролика, козы, человека и тому подобного, в отношении (против) пептидных производных настоящего изобретения, включая конъюгированные пептидные производные. Клетки, вырабатывающие антитела, в иммунизированном млекопитающем выделяют и объединяют (сливают) с миеломными или гетеромиеломными клетками для получения гибридных клеток (гибридом). Гибридомные клетки, вырабатывающие моноклональные антитела, используются в качестве источника желательных моноклональных антител.

Несмотря на то, что Mab могут вырабатываться культурой гибридом, изобретение не является ограниченным таким образом. Также рассматривается использование Mab, которые вырабатываются с помощью экспрессии нуклеиновой кислоты, клонированной из гибридомы. То есть нуклеиновая кислота, экспрессирующая молекулы, секретируемые гибридомой, может быть перенесена в другую клеточную линию, чтобы получить трансформант. Трансформант генотипически отличается от первоначальной гибридомы, но также способен вырабатывать молекулы антител этого изобретения, включая иммунологически активные фрагменты целых молекул антител, соответствующих молекулам, секретируемым гибридомой. Кроме того, литература предоставляет способы создания химерных антител, гуманизированных антител, одноцепочечных антител и тому подобных вариантов на основном иммунореактивном фрагменте антитела. Все это рассматривается в рамках изобретения, поскольку раскрывается и заявляется класс и специфичность антитела, не принимая во внимание определенный вариант структуры, который может создать специалист в данной области техники.

Модифицированные опиорфинные пептиды могут быть включены в состав фармацевтических композиций вместе с фармацевтически приемлемым переносчиком. Например, фармацевтические композиции являются пригодными для местного, орального, подъязычного, парентерального, интраназального, внутривенного, внутримышечного, подкожного, чрескожного или внутриглазного введения и других.

Модифицированные опиорфинные пептиды, описанные выше, пригодны для лечения болезней или расстройств, при которых необходимо модулирование активности мембранной металло-эктопептидазы, конкретнее мембранной цинковой металлопептидазы, например, NEP и AP-N.

Природные NEP субстраты представляют собой, главным образом, пептидные гормоны - энкефалины, субстанцию Р, брадикинин, ангиотензин II и предсердный натрийуретческий пептид, который играет ключевую роль в контроле центрального и периферического восприятия боли, явления воспаления, минерального обмена и/или артериального тонуса (Roques et al., Pharmacol Rev. 1993; 45 (1): 87-146).

Конкретнее, нейтральная эндопептидаза, NEP 24-11, распространена и в нервной и в периферических тканях млекопитающих, причем на периферии, в частности, она есть в изобилии в почках и плаценте. В этих тканях металлопептидаза клеточной поверхности NEP участвует в постсекреторном процессинге и метаболизме нейропептидов, соматических иммунорегуляторных пептидов и пептидов-гормонов. Посредством контролирования активных уровней циркулирующих или секретируемых регуляторных пептидов, NEP модулирует их физиологическое рецепторно-опосредованное действие. Следовательно, мембраносвязанная NEP участвует в регуляции активности сильных вазоактивных пептидов, таких как субстанция Р, брадикинин (ВК), предсердный натрийуретческий пептид (ANP) и ангиотензин II (АН); сильных воспалительных/иммунорегуляторных пептидов, таких как субстанция Р и ВК и fMet-Leu-Phe (fMLP); сильных опиоидных нейропептидов, таких как Met и Leu-энкефалины (Enk) и сильных пептидов, регулирующих минеральный обмен и гомеостаз жидкостей, таких как ANP, натрийуретический пептид С-типа (CNP) и натрийуретический пептид В-типа (BNP). Однако уровни этих пептидов изменяются на протяжении NEP-индуцированного образования/деградации только в областях, где они высвобождаются тонически (tonically) или где их высвобождение вызывается некоторым стимулом.

С интегративной точки зрения биологическая активность NEP существует, чтобы контролировать активные уровни пептидергических сигналов, вовлеченных в регуляцию артериального давления, феномен воспаления, эмоциональные состояния и водно-минеральный гомеостаз, а также контроль боли. С клинической точки зрения это подтверждает факт, что NEP является важной мишенью лекарственных препаратов при различных болезненных состояниях. Например, с помощью ингибирования NEP и APN, и в связи с этим увеличения уровней и продолжительности действия центральных или периферических эндогенных опиоидов, можно получить аналгезирующий (болеутоляющий) эффект или антидепрессантный или психостимулирующий эффект. Основным преимуществом изменения концентраций эндогенных регуляторных пептидов с помощью применения ингибиторов NEP и/или AP-N является то, что фармакологические эффекты вызываются только в рецепторных сайтах, активированных с помощью природных лигандов, и критически зависят от их тонического или индуцированного стимулом высвобождения, которое случается при специфических ситуациях в окружающей среде, поведенческих и психопатологических стрессовых ситуациях (Roques et al, 1993).

Примерами мембранной металлопептидазы млекопитающих, кроме NEP, являются NEP2, ЕСЕ (эндотелин-превращающие ферменты), в частности ЕСЕ1 и ЕСЕ2, антиген клеточной поверхности эритроцитов KELL и продукт гена РЕХ, связанный с гипофосфатемическим рахитом, сцепленным с Х-хромосомой, и AP-N (аминопептидаза N).

NEP2 в особенности распространен в нервной системе и генитальных тканях.

AP-N представляет собой убиквитарный фермент, присутствующий в большом разнообразии органов человека, тканей и типов клеток (эндотелиальные, эпителиальные фибробласты, лейкоциты) и, в частности, имеется в изобилии в почках и центральной нервной системе. Установленные субстраты включают Ангиотензин III (Ang III); нейропептиды, включая энкефалины и эндорфины; и гормоны, включая каллидан и соматостатин. AP-N представляет собой многофункциональный фермент, связанный с онкогенезом, иммунной системой, болью, регулированием артериального кровяного давления и т.д. AP-N также участвует в удалении (trimming) антигена и процессе антиген-презентации. Эти функции способствуют модулированию биоактивных пептидных ответов (устранение боли, высвобождение вазопрессина) и оказывают влияние на иммунные функции и основные биологические события (клеточную пролиферацию, секрецию, инвазию, ангиогенез), таким образом, предоставляя варианты лечения многих видов болезней.

Ингибирование ВСЕ имеет значимое применение при лечении гипертензии и предотвращении и лечении атеросклероза.

Ингибирование AP-N вместе с NEP имеет важное применение при лечении боли и депрессии, тревожности, sedation (успокоение) и социо-сексуальных эмоциональных расстройств.

Ингибирование связанной с этим мембранной металлопептидазы оказывает терапевтические эффекты при лечении новообразований, а именно рака яичника, колоректального рака, рака мозга, легких, поджелудочной железы, желудка и меланомы, и уменьшает число случаев метастазирования, атеросклероза и/или гипертензии.

Ингибирование связанной с этим мембранной металлопептидазы сопровождается эффектами облегчения боли. Такими антиноцицептивными действиями на острую боль являются аналгезирующие эффекты, а также эффекты на хроническую воспалительную боль, такую как при артрите или воспалительной болезни кишечника, боль после оперативного вмешательства и невропатическую тяжелую боль, связанную или нет с раком и/или терапией рака.

Кроме того, ожидается, что Ингибирование бактериальной или вирусной металлопептидазы имеет противоинфекционные эффекты.

Металлопептидазы играют важную роль в инвазии ткани хозяина болезнетворными организмами и иммунологическом и воспалительном процессах, например, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Porphyromonas gingivalis и Legionella pneumophila.

К тому же, бактериальные металлопептидазы, особенно цинковые металлопептидазы играют важную роль при болезнях, вызванных протеолитическими токсинами, такими как токсины В. anthracis (Anthrax летальный фактор) и нейротоксины С. tetanum и botulinum.

Другие металлопептидазы играют важную роль при разных инфекциях, таких как инфекции, вызванные HIV (FR 2707169).

Значение ингибиторов протеиназ для лечения бактериальных или вирусных болезней можно найти в J. Potempa и J. Travis.

Другие роли металлопептидаз раскрыты в Turner et al, 2001; Kenny et al, 1977; Kenny et al, 1987; Beaumont et al, 1996.

Одной целью настоящего изобретения является обеспечение обезболивания или антидепрессантной терапии с помощью модифицированных опиорфинных пептидов, которые действуют путем ингибирования NEP и AP-N на периферическом, спинальном и/или супраспинальном уровнях и терапии, таким образом, увеличивающей уровни и продолжительность действия центральных и периферических эндогенных опиоидов, включая энкефалины. Предполагается лечение боли, особенно острой и хронической боли, висцеральной воспалительной и невропатической боли.

Лечение какого-либо водно-минерального дисбаланса также является целью изобретения. В числе болезней-мишеней можно упомянуть расстройства, связанные с костями, зубами, почками, околощитовидной железой, поджелудочной железой, кишечником, слизистой оболочкой желудка, предстательной железой и слюнными железами, причиной которых является водно-минеральный дисбаланс.

В частности расстройство можно выбрать из гипер- или гипо-паратироидизма, остеопороза, панкреатита, литиаза подчелюстной железы, почечнокаменной болезни и остеодистрофии.

Лечение расстройств, связанных с нарушением межличностных взаимодействий и поведения, дополнительно представляет интерес. Различные ментальные расстройства описаны в WO 02/051434.

В частности изобретение подходит при любом расстройстве, выбранном из группы, состоящей из реакции избегания, расстройства сознания, аутистического расстройства, синдрома гиперактивности с дефицитом внимания, расстройства пробуждения, анаклитической депрессии, ослабленного межличностного функционирования и взаимоотношения с внешним миром, шизоидного расстройства личности, шизофрении, депрессивного расстройства, пониженного интереса к окружающей обстановке, ослабленной социальной активности, связанной с сексуальностью, и ослабленного сексуального поведения, включая преждевременное семяизвержение, сверхактивную сексуальность и эректильную дисфункцию.

Изобретение также относится к использованию пептидов или пептидных производных согласно изобретению в качестве психостимулирующих средств. Соответственно предотвращение или лечение нарколепсии, гиперсомнии, навязчивого неконтролируемого беспокойства, расстройств настроения, таких как депрессивное расстройство или отдельный случай большого депрессивного расстройства, или повторяющееся большое депрессивное расстройство, биполярное расстройство I или II типа, дистимическое расстройство и циклотимическое расстройство.

Болезни, при которых необходимо модулирование мембранной металлопептидазы, также включают гипертензию, атеросклероз, новообразование, воспалительный артрит и болезнь кишечника.

Также осуществляется лечение инфекций. В частности, значение ингибиторов протеиназ для лечения бактериальных или вирусных болезней можно найти в J. Potempa and Travis.

Модифицированные опиорфинные пептиды, описанные выше, также пригодны для контролирования иммуно-воспалительных ответов.

Модифицированные опиорфинные пептиды, как определено выше, также пригодны как натрийуретическое средство или мочегонное средство.

Таким образом, настоящее изобретение предпочтительно предоставляет пептидные производные, как определено выше, для применения при лечении болезни или расстройства, выбранного из группы, состоящей из боли, депрессивных расстройств, ослабленной социальной активности, связанной с сексуальностью, и нарушенного сексуального поведения.

Другой целью настоящего изобретения является применение вышеуказанных пептидных производных или нуклеиновых кислот как заменителей при лечении наркотической зависимости, особенно наркотической зависимости от морфия.

Действительно, исследования подтвердили, что восприимчивость к наркотической зависимости и развитие подкрепления (reward) и лекарственной зависимости является, по меньшей мере, частично, результатом предсуществующих или индуцированных изменений и/или дефекта эндогенной опиоидной системы. В этом отношении, использование модифицированных опиорфинных пептидов или нуклеиновой кислоты для усиления эффектов эндогенных энкефалинов будет снижать различные побочные явления (соматические признаки синдрома отмены), вызванные перерывом в постоянном введении морфия или героина.

Предпочтительные болезни или расстройства, которые можно лечить пептидными производными изобретения включают боль, депрессивные расстройства, ослабленную социальную активность, связанную с сексуальностью, и нарушенное сексуальное поведение.

Изобретение дополнительно относится к применению средства, которое модулирует взаимодействие между эндогенным протеином BPLP или maturation product (продуктом созревания), например, природным опиорфином QRFSR, и мембранной металлопептидазой, для приготовления терапевтической композиции с целью предотвращения или лечения болезней, при которых необходимо модулирование активности указанной мембранной металлопептидазы.

Изобретение предоставляет способ скрининга соединений in vitro по их способности связываться с участком связывания NEP и/или APN для протеина BPLP или пептида QRFSR. Подробности этой методики описаны, например, в заявке США порядковый номер 10/593,071, опубликованной 15 сентября 2006, также опубликованной как WO 2005/090386, а также в международной патентной заявке РСТ/ЕР2009/050567, содержание которых включено в данное описание путем отсылки.

Другой целью настоящего изобретения является способ определения относительного сродства модифицированных опиорфинных пептидов, которые специфически связываются с NEP и/или AP-N участками связывания, к протеину BPLP, или продуктам созревания (или пептид, который сохраняет специфичность связывания или физиологическую активность протеина BPLP или его продуктов созревания), как описано, например, в заявке США порядковый номер 10/593,071, опубликованной 15 сентября 2006, содержание которой включено в данное описание путем отсылки.

Примеры

Пример 1: Способы биохимических исследований

Формальное кинетическое исследование было проведено для каждой пробы с использованием мониторинга флуоресценции в реальном времени гидролиза специфического субстрата. Для каждой 96-луночной адаптированной флуоресцентной модели были определены все параметры, обеспечивающие исследование ферментативной активности NEP человека и AP-N человека, при условиях начального измерения скорости.

1 - Источники эктопептидаз человека, hNEP и hAP-N

Рекомбинатный NEP человека и рекомбинатный AP-N человека (свободные от их соответствующих N-концевого цитозольного и трансмембранного сегмента), которые были куплены у компании R&D Systems, были использованы в качестве чистого источника пептид азы.

2 - Субстраты и синтетические ингибиторы

Активность амино-, карбоксиди- и эндо-пептидаз оценивали in vitro с помощью измерения разрушения следующих синтетических селективных субстратов:

- Abz-dR-G-L-EDDnp FRET-пептид, то есть изнутри потушенный флуоресцентный субстрат, специфичный для активности NEP-эндопептидазы, был синтезирован Thermo-Fisher Scientific (Германия).

- Abz-R-G-F-K-DnpOH FRET-пептид, то есть изнутри потушенный флуоресцентный субстрат, специфичный для активности NEP-карбоксидипептидазы, был синтезирован Thermo-Fisher Scientific (Германия)

- Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-пептид (Мса-ВК2), то есть внутримолекулярно потушенный флуорогенный пептид, структурно связанный с брадикинином, который является селективным субстратом для измерения активности NEP и ЕСЕ, был куплен у компании R&D Systems.

FRET представляет собой зависимую от расстояния передачу энергии от донора-флуорофора (Abz=орто-аминобензоил или Мса=7-метоксикумарин-4-ил-ацетил) на акцептор-флуорофор (DnpOH=2,4-динитрофенил или EDDnp=2,4-динитрофенил этилен диамин).

- L-аланин-Мса, Ala-Mca, флуорогенный субстрат для измерения активности аминопептидазы был куплен у компании Sigma.

Путем измерения скорости гидролиза этих субстратов с помощью растворимых эктопептидаз в присутствии и отсутствие различных доступных селективных синтетических ингибиторов пептидаз оценивали специфичность каждой пробы фермента: - тиорфан (ингибитор NEP) (Bachem), - бестатин (ингибитор АР) (Calbiochem).

3 - Измерение активности пептидаз с использованием 96-луночного адаптированного флуориметрического способа анализа

Согласно условиям начального измерения скорости, время, рН и температуру инкубации, а также концентрации фермента и субстрата определяли для каждого исследования. Гидролиз субстратов измеряли путем мониторинга в реальном времени скорости их метаболизма двумя пептидазами в присутствии или отсутствие испытываемого ингибирующего соединения (концентрации в пределах от 1 до 50 мкМ). Они были добавлены в прединкубационную среду. Фоновую скорость аутолиза субстрата, представляющую собой флуоресцентный сигнал, полученный при отсутствии фермента, вычитали, чтобы вычислить начальную скорость в RFU (относительная единица флуоресценции)/мин.

Измерение активности NEP-эндопвптидазы с использованием FRET-специфического пептид-субстрата, Abz-dR-G-L-EDDnp.

При использовании черных half-area 96-луночных микропланшетов стандартная реакция содержала фермент (12,5 нг) в 100 мМ Трис-HCl рН 7, содержащий 200 мМ NaCl (конечный объем 100 мкл). Субстрат (конечная концентрация 15 мкМ) добавляли после предварительной инкубации в течение 10 мин при 28°С, и немедленно исследовали кинетику появления флуоресцентного сигнала (RFU) в течение 40 минут при 28°С (последовательные измерения с интервалом 2,3 мин) с помощью флуорометрического микропланшетного ридера (монохроматор Infinite 200-Tecan) при длинах волн возбуждения и излучения 320 нм и 420 нм, соответственно.

При условиях измерения начальной скорости интенсивность сигнала была прямо пропорциональна количеству метаболитов, образованных в течение 20-40 мин периода времени реакции. Таким образом, в отсутствие ингибитора начальную скорость rhNEP -опосредованного специфического эндопротеолиза Abz-dR-G-L-EDDnp, вычисляли из линейной регрессии (наклон=NEP активность в присутствии носителя/ время инкубаии) как 8218±2878 RFU/мин/мкг rhNEP, n=3 независимых определения.

Измерение активности NEP-карбоксипептидазы с использованием FRET-специфического пептид-субстрата Abz-R-G-F-K-DnpOH.

При использовании черных half-area 96-луночных микропланшетов стандартная реакция содержала фермент (2,5 нг) в 100 мМ Трис-HCl рН 7, содержащий 200 мМ NaCl (конечный объем 100 мкл). Субстрат (конечная концентрация 4 мкМ) добавляли после предварительной инкубации в течение 10 мин, и немедленно исследовали кинетику появления флуоресцентного сигнала (RFU) в течение 40 минут при 28°С (последовательные измерения с интервалом 2,3 мин) с помощью флуорометрического ридера при длинах волн возбуждения и излучения 320 нм и 420 нм.

При этих условиях измерения начальной скорости опосредованный NEP человека специфический гидролиз Abz-R-G-F-K-DnpOH был оценен при 59796±18685 RFU/мин/мкг rhNEP, n=4 независимых определения. Активность NEP-карбоксидипептидазы, исследованная с помощью субстрата Abz-R-G-F-K-DnpOH, на Фигурах 5-8 называется "NEP-CDP1 активность".

Кроме того, внутримолекулярно потушенный флуорогенный пептид, Мса-ВК2 (10 мкМ), подвергали гидролизу с помощью 5 нг rhNEP при тех же самых экспериментальных условиях, как описанные ранее. При этих условиях hNEP-фермент действовал на Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH, главным образом, как карбоксидипептидаза, преимущественно расщепляя связь A-F, а также как эндопептидаза, расщепляя связь G-F. При условиях измерения начальной скорости опосредованный NEP человека специфический гидролиз Мса-ВК2 оценивали при 121910±24755 RFU/мин/мкг rhNEP, n=3 независимых определения. Активность NEP-карбокидипептидазы, исследованная с помощью субстрата Abz-R-G-F-K-DnpOH, на Фигурах 5-8 называется "NEP-CDP2 активность".

Измерение активности AP-N-эктопептидазы с помощью субстрата Ala-Mca. При использовании черных half-area 96-луночных микропланшетов стандартная реакция содержала фермент (4 нг) в 100 мМ Трис-HCl рН 7,0 (конечный объем 100 мкл). Субстрат Ala-Mca (конечная концентрация 25 мкМ) добавляли после предварительной инкубации в течение 10 мин при 28°С и кинетику появления сигнала наблюдали в течение 40 мин при 28°С с помощью флуориметрического ридера при длинах волн возбуждении и эмиссии 380 нм и 460 нм. Интенсивность сигнала была прямопропорциональна количеству метаболитов, образованных в течение 10-40 мин периода времени реакции. При этих условиях измерения начальной скорости опосредованный AP-N человека аминопротеолиз Ala-Mca вычисляли прямо (из наклона: активность AP-N при отсутствии ингибитора как функция времени инкубации) как 147042±44657 RFU/мин/мкг rhAP-N, п=3 независимых определения.

Другие FRET-пептидные субстраты для оценки активности NEP карбоксипептидазы описаны в Barros et al. Biol. Chem., 2007, 388: 447-455.

Пример 2: Результаты биохимических исследований

1 - Скрининг опиорфиновых пептид-производных на hNEP и hAP-N

Соединения были проверены три раза при конечной концентрации 50 мкМ.

Фигуры 1-9 показывают результаты биохимических исследований на NEP эндопептидазной и карбоксипептидазной активностях и AP-N активности с различными пептидными производными изобретения.

Были исследованы различные опиорфинные пептидо-аналоги относительно их ингибирующей активности по отношению к двум мембрано-связанным эктоферментам, NEP (специфические активности эндопептидазы и карбоксипептидазы) и APN с применением селективного ферментного флуоресцентного анализа: FRET-based Enzyme на моделях in vitro, ранее разработанный и утвержденный в лаборатории (РСТ заявка РСТ/поданная 18 января 2009, включена в данное описание путем отсылки).

Были исследованы следующие соединения. В нижеприведенных соединения NH2-представляет концевую аминогруппу пептида, а СООН - концевую карбоксигруппу пептида.

- NH2-QRFSR-CONH2 (опиорфин); NH2-QRGPR-COOH; NH2-QHNPR-COOH;

NH2-QR(4BpoMF)SR-COOH (т.е. QRF(4Br)SR); NH2-QRFPR-COOH: они показывают предпочтение ингибирования для AP-N человека и слабую ингибирующую активность в отношении NEP человека

- N-(Ацетил)QRFSR-COOH; N-(С8-полиэтилен)QRFSR-СООН;

N-(биотин-С6-полиэтилен)QRFSR-СООН: они показывают слабую ингибирующую активность в отношении AP-N человека и NEP с предпочтением в отношении NEP эндопептидазной активности

- NH2-dRdSdFdRdQ-COOH (ретроинверсия D-энантиомер): он не показал значительной ингибирующей активности в отношении AP-N человека и NEP с предпочтением для AP-N активности

- NH2-YQRFSR-COOH; NH2-Y-(С6-полиэтилен)QRFSR-СООН;

NH2-Y-(C12-полилен)QRFSR-COOH: они продемонтрировали предпочтение ингибирования для человеческой NEP эндопептидазной активности, в частности Y-(C12-полиэтилен)QRFSR

- NH2-QRF[S-O-C8-полиэтилен]R-COOH; NH2-CQRFSR-COOH: они были активными двойными ингибиторами человеческой NEP (специфической эндопептидазной и карбоксипептидазной активностей) и AP-N.

Другими модифицированными опиорфинными пептидами являются:

NH2-CQRF[S-O-C8-полиэтилен]R-COOH;

NH2-CQRF[S-O-C12-полиэтилен]Р-СООН

NH2-С-(С8-полиэтилен)QRFSR-СООН;

NH2-C-(C 12-полиэтилен)QRFSR-СООН

NH2-С-(С8-полиэтилен)QRF[S-O-С8-полиэтилен]R-СООН

NH2-[Cβ2]QRF[S-O-C8-полиэтилен]R-COOH

NH2-C-(C8-полиэтилен)QRFS[133R]-COOH

NH2-C[dC]QRF[S-O-C8-полиэтилен][dR]-COOH

NH2-C-(C8-полиэтилен)QRFS[dR]

NH2-[dC]QRF[S-0-C8-полиэтилен][dR]-COOH

NH2-[Cβ2]QRF[S-O-C8-полиэтилен][β3R]-COOH

[CQRFSR]2 как цистин-дисульфид по дисульфидной связи.

2- Конценрационно-зависимое ингибированив отобранных опиорфинных пептид-производных на hNEP и hAP-N

CQRFSR-COOH пептид (Фигуры 9 и 18)

Пептид CQRFSR-COOH концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Abz-dR-G-L-EDDnp, опосредованный активностью rhNEP-эндопептидазы: r²=0.97, n=18 точек определения, при значении IC50 7±3 мкМ.

Пептид CQRFSR-COOH концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Abz-R-G-F-K-DnpOH опосредованный активностью rhNEP: r²=0,99; n=18 точек определения, при значении IC50 6±1 µM.

Пептид CQRFSR-COOH концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Ala-AMC, опосредованный активностью rhAP-N: r²=0,99; n=30 точек определения, при значении IC50 0,8±0,1 µМ.

Пептид CQRFSR-COOH концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-пептида (Мса-ВК2), опосредованный активностью rhNEP: r²=0,99; n=16 точек определения, при значении IC50 17±2 µМ.

Следовательно, модификация N-концевого положения пептида NH2-QRFSR с помощью образования амидной связи с аминокислотой цистеином (тиоловая функциональная группа является сильной Zn-хелатной группой) приводит к соединению (CQRFSR пептид), показывающему усиленную ингибирующую активность по отношению к hAP-N (в 10-раз по сравнению с QRFSR нативным пептидом) и по отношению к hNEP (в 5-раз).

QRF[S-O-Октаноил]R пептид (Фигура 10)

Пептид QRF[S-O-C8]R концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Abz-dR-G-L-EDDnp, опосредованный rhNEP-эндопептидазной активностью: r²=0.98, n=18 точек определения, при значении IC50 2,8±0,2 µМ.

Пептид QRF[S-O-C8]R концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Abz-R-G-F-K-DnpOH, опосредованный активностью rhNEP: r²=0.99, n=18 точек определения, при значении IC50 12±5 µМ.

Пептид QRF[S-O-C8]R концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Ala-AMC, опосредованный активностью rhAP-N: r²=0.99, n=20 точек определения, при значении IC50 10±1 µМ.

Пептид QRF[S-O-C8]R концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-пептида (Мса-ВК2), опосредованный активностью rhNEP: r²=0.99, n=18 точек определения, при значении IC50 14±4 µМ.

Y-[амино-додекановокислотный ciraucepj-QRFSR пептид (Фигуры 11 и 19)

Пептид Y(PE12)QRFSR-COOH концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Abz-dR-G-L-EDDnp, опосредованный rhNEP-эндопептидазной активностью: r²=0.98, n=18 точек определения, при значении IC50 10±1 µM.

Пептид Y(PE12)QRFSR-COOH концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Abz-R-G-F-K-DnpOH, опосредованный активностью rhNEP: r²=0.99, n=18 точек определения, при значении IC50 24±2 µМ.

Пептид Y(PE12)QRFSR-COOH концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Ala-AMC, опосредованный активностью rhAP-N: r²=0.99, n=20 точек определения, при значении IC50 122±20 µM.

Пептид Y(PE12)QRFSR-COOH концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-пептида (Мса-ВК2), опосредованный активностью rhNEP: r²=0.99, n=18 точек определения, при значении IC 5031±2 µМ.

Таким образом, предпочтение ингибирования в отношении человеческой NEP эндопептидазной активности Y-(С12-полиэтилен)ОРР8Р было подтверждено.

C[PE6]QRFSR пептид (РЕ6=амино-гексановая кислота) (Фигура 20)

Пептид C[PE6]QRFSR-COOH концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Abz-dR-G-L-EDDnp, опосредованный rhNEP-эндопептидазной активностью: r²=0.98, n=18 точек определения, при значении IC50 40±5 µM.

Пептид C[PE6]QRFSR-COOH концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Abz-R-G-F-K-DnpOH, опосредованный активностью rhNEP: r²=0.99, n=18 точек определения, при значении IC50 около 217.

Пептид C[PE6]QRFSR-COOH концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Ala-AMC, опосредованный активностью rhAP-N: r²=0.99, n=20 точек определения, при значении IC50 0,8±0,1 мкМ.

Пептид C[PE6]QRFSR-COOH концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH FRET-пептида (Мса-ВК2), опосредованный активностью rhNEP: r²=0.99, n=18 точек определения, при значении IC50 около 227 мкМ.

С-[амино-додекановокислотный спэйсер]-QRFSR пептид (Фигура 21)

Пептид C[PE12]QRFSR-COOH концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Abz-dR-G-L-EDDnp, опосредованный rhNEP-эндопептидазной активностью: r²=0.96, n=24 точек определения, при значении IC50 5,7±0,5 мкМ.

Пептид C[PE12]QRFSR-COOH концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Abz-R-G-F-K-DnpOH, опосредованный активностью rhNEP: r²=0.97, n=30 точек определения, при значении IC50 19±2 мкМ.

Пептид C[PE12]QRFSR-COOH концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Ala-AMC, опосредованный активностью rhAP-N: r=0.98, n=27 точек определения, при значении IC50 0,8±0,1 мкМ.

С-[амино-гексановокислотный спэйсер]-QRFS[O-Октаноил]R пептид (Фигура 22)

Пептид C[PE6]QRF[S-O-Октаноил]R концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Abz-dR-G-L-EDDnp, опосредованный rhNEP-эндопептидазной активностью: r²=0.99, n=27 точек определения, при значении IC50 759±56 нМ.

Пептид С[РЕ6]QRF[S-O-Октаноил]R концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Abz-R-G-F-K-DnpOH, опосредованный активностью rhNEP: r=0.99, n=27 точек определения, при значении IC50 848±58 нМ.

Пептид С[РЕ6]ОРР[S-O-Октаноил]R концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Ala-AMC, опосредованный активностью rhAP-N: r²=0.99, n=24 точек определения, при значении IC50 1,7±0,1 мкМ.

В биологически релевантном исследовании in vitro, с использованием субстанции Р, физиологического субстрата NEP, и мембран клеток человека в качестве источника hNEP, пептидное производное С[РЕ6]QRF[S-O-Октаноил]R концентрационно-зависимым образом предотвращало распад субстанции Р, опосредованный мембрано-связанной hNEP-эндопептидазной активностью: r2=0.95, n=13 точек определения, при значении IC50 1,6±0,4 мкМ (по меньшей мере 5-кратное увеличение ингибирующей способности по сравнению с опиорфинным нативным пептидом в том же самом тесте) (Фигура 23).

[CQRFSR] дипептид ([CQRFSR]₂)

Дипептид [CQRFSR] концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Abz-dR-G-L-EDDnp, опосредованный rhNEP-эндопептидазной активностью: r²=0.87, n=24 точек определения, при значении IC50 1,4±0,5 мкМ.

Дипептид [CQRFSR] концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Abz-R-G-F-K-DnpOH, опосредованный активностью rhNEP: r²=0.99, n=27 точек определения, при значении IC50 3,3±0,2 мкМ.

Дипептид [CQRFSR] концентрационно-зависимым образом предотвращал распад Ala-AMC, опосредованный активностью rhAP-N: r²=0.99, n=24 точек определения, при значении IC50 0,8±0,1 мкМ.

Таблица 1: Суммарное изложение значений IC50 различных пептидов и пептидных производных на активности NEP и AP-N Опиофиновые производные IC50, мкМ по отношению к hAP-N IC50, мкМ по отношению к hNEP-эндопептидазе IC50, мкМ по отношению к hNEP-карбоксипептидазе Y-[PE12]QRFSR 122±20 10±1 24±2/31±2 QRFS[O-C8]R 10±1 2.8±0.2 12±5/14±4 CQRFSR 0.8±0.1 7±3 6±1/17±2 C-[PE6]-QRFSR 0.8±0.1 40±5 ~220 C-[PE12]-QRFSR 0.8±0.1 5.7±0.5 19±2 C-[PE6]-QRFS[O-C8]R 1.7±0.1 0.76±0.06 0.85±0.06 [CQRFSR]2 0.8±0.1 1.4±0.5 3.3±0.2

Все вместе данные показали значение N-концевой а-аминогруппы пептида NH2-QRFSR для ингибирующей активности опиорфина в отношении к AP-N человека.

В самом деле, по сравнению с опиорфин-QRFSR нативным пептидом, его ацетилирование (Ac-QRFSR) или циклизация (pGlu-RFSR), его октаноилирование (С8-QRFSR) или биотинилирование (биотин-С6)ОРР8Р, приводит к соединениям, демонстрирующим слабую ингибирующую активность в отношении к hAP-N.

Однако, по сравнению с опиорфин-QRFSR нативным пептидом, два соединения pGlu-RFSR и C8-QRFSR проявляют, по меньшей мере, равноценную, если не лучшую ингибирующую активность относительно hNEP человека.

Эти данные дополнительно демонстрируют значение свободных карбоксильных концов пептида QRFSR-COOH для его ингибирующей активности в отношении hNEP, особенно в отношении карбоксипептидазной активности NEP по сравнению с опиорфин (QRFSR) нативным пептидом, амидирование (QRFSR-CONH2) приводит к соединению, демонстрирующему слабую ингибирующую активность в отношении активности hNEP.

Остаток Phe пептида QRFSR является важным для ингибирующей активности опиорфина в отношении пептидазных активностей hNEP и hAP-N. Действительно, по сравнению с опиорфин (QRFSR) нативным пептидом, замена остатка Туг на Phe (QRYSR) приводит к соединению, показывающему 6-кратное снижение ингибирующей активности для hAP-N и небольшое снижение ингибирующей активности в отношении NEP человека.

Однако интересно, что замена остатка 4-фтор-Phe на Phe (QR[4F]FSR) приводит к соединению, демонстрирующему только 2-кратное снижение ингибирующей активности в отношении hNEP и эквивалентную ингибирующую активность в отношении hAP-N по сравнению с опиорфин-QRFSR нативным пептидом. Наоборот, замена остатка (4Бромо-Phe) или Phe (QR[4Br]FSR) приводит к соединению, показывающему слабую ингибирующую активность в отношении NEP человека.

Модификация центральных остатков RFS пептида QRFSR оказывает влияние на ингибирующую активность опиорфина в отношении hNEP, следовательно, по сравнению с опиорфин-QRFSR нативным пептидом, соединения QRGPR, QHNPR и QRFPR проявляют эквивалентную ингибирующую активность для AP-N человека и слабую ингибирующую активность в отношении NEP человека.

Кроме того, результаты показывают значение гуанидиний-иона остатка Arg в положении 2 пептида QRFSR для ингибирующей активности опиорфина в отношении hAPN. По сравнению с опиорфин-QRFSR нативным пептидом замена е-амина остатка Lys (QKFSR) на Arg2 приводит к соединению, показывающему более чем 10-кратное снижение ингибирующей активности в отношении hAP-N и небольшое уменьшение ингибирующей активности в отношении NEP человека.

Подобным образом гуанидиний-ион остатка Arg в положении 5 пептида QRFSR является важным для ингибирующей активности опиорфина в отношении hAPN, по сравнению с опиорфин-QRFSR нативным пептидом, замена е-амина остатка Lys на Arg5 (QRFSK) приводит к соединению, показывающему 10-кратное снижение ингибирующей активности для hAP-N и эквивалентную ингибирующую активность для NEP человека.

Интересно, что этерификация гидроксильной группы остатка серина пептида QRFSR октановой кислоты (QRF[октаноил-серин]R) приводит к соединению, показывающему эквивалентную ингибирующую активность в отношении hAP-N по сравнению с опиорфин-QRFSR нативным пептидом и усиливает ингибирующую активность в отношении hNEP-эндо и карбоксиди-пептидазной активностей (по меньшей мере, в 10-раз большую ингибирующую активность, чем опиорфин нативный пептид) (см. Фиг.19).

Пример 3: Установление in vitro сильных биоактивных пептидо-миметиков опиорфина, которые потенциально могли бы продемонстрировать in vivo свойства биодоступности, превосходящие нативный пептид

1. Возможная выгода в биологической абсорбции: транс-мембранный транспорт (прохождение эпителиальной и эндо-эпителиальной клеточной мембраны)

Модификации опиорфин-пептида добавлением химических гидрофобных фрагментов, таких как полиэтилен С6, С8, С10 или С12 спэйсеры, позволят увеличить эффективность его биологической абсорбции in vivo к мембранам. Было показано, что среди всех проверенных соединений NH2-QRF[S-O-Октаноил]R-COOH - NH2-Y(PE12)QRFSR-COOH (РЕ=[СН2]n; РЕ12=амино-додекановая кислота) являются эффективными двойными ингибиторами активностей NEP человека (специфические эндопептидазная и карбоксидипептидазная активности) и AP-N.

2. Возможная выгода в метаболической стабильности: димер цистина: [CQRFSR]₂

Димер пептида [CQRFR] показал, по меньшей мере, 2-кратное увеличение ингибирующей активности в отношении hNEP-эндо и карбоксидипептидазной активностей по сравнению с мономерным пептидом CQRFSR. Димерная последовательность позволит защитить производное соединение от разрушения циркулирующей аминопептидазой.

Очевидно, что в свете вышеупомянутых идей возможны многочисленные модификации и варианты настоящего изобретения. Поэтому понятно, что в рамках прилагаемых пунктов формулы изобретения изобретение может быть применено на практике иным способом, чем конкретно описанный здесь.

Настоящее изобретение относится к модифицированным опиорфинным пептидам в качестве новых ингибиторов металло-эктопептидаз. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 23 ил., 1 табл., 3 пр.

1. Пептидное производное формулы (I):

в которой:
- ζ представляет собой атом водорода, тирозин, Y-[линкер]-, цистеин, С-[линкер]-;
- AA₁ представляет собой Q;
- АА₂ представляет собой R;
- АА₃ представляет собой F или F(X);
- АА₄ представляет собой S или S(OAlk);
- АА₅ представляет собой R;
- С-[линкер]-означает Cys-[NH-(CH₂)_n-CO]-, где n представляет собой целое число между 1 и 20;
- Y-[линкер]- означает Tyr-[NH-(CH₂)_n'-CO]-, где n′ представляет собой целое число между 1 и 20;
- F(X) означает фенилаланин, фенильная группа которого замещена одним или более атомами галогена,
- S(OAlk) означает серин, гидроксильная группа которого замещена линейной или разветвленной алканоильной группой, имеющей от 1 до 20 атомов углерода,
- указанный AA₁, АА₂, АА₃, АА₄ и АА₅ независимо может находиться или в L-конфигурации или D-конфигурации, и любой один из AA₁, АА₂, АА₃, АА₄ и АА₅ необязательно может быть β-аминокислотой, аза-аминокислотой или β-аза-аминокислотой;
где, если пептидное производное содержит цистеин, указанное пептидное производное необязательно представляет собой димер,
при условии, что пептид не является QRFSR, YQRFSR или CQRFSR.

2. Пептидное производное по п.1 формулы (III):

в которой:
- ζⁿ представляет собой атом водорода, тирозин или Y-[линкер]-;
- AA₁ представляет собой Q;
- $$A{A}_2^n$$ представляет собой R;
- $$A{A}_3^n$$ представляет собой F или F(X);
- $$A{A}_4^n$$ представляет собой S или S(OAlk);
- $$A{A}_5^n$$ представляет собой R;
- Y-[линкер]-, F(X) и S(OAlk) такие, как определено в п.1,
- указанные AA₁, АА₂ ⁿ, АА₃ ⁿ, АА₄ ⁿ и АА₅ ⁿ могут независимо находиться или в L-конфигурации или D-конфигурации, и любой один из числа АА₁, АА₂ ⁿ, АА₃ ⁿ, АА₄ ⁿ и АА₅ ⁿ необязательно может быть β-аминокислотой, аза-аминокислотой или β-аза-аминокислотой;
при условии, что пептид не является QRFSR или YQRFSR.

3. Пептидное производное по п.1 формулы (IV):

в которой:
- ζ^m представляет собой атом водорода, цистеин или С-[линкер]-;
- $$A{A}_3^m$$ представляет собой F или F(X);
- $$A{A}_4^m$$ представляет собой; S или S(OAlk);
- С-[линкер]-, F(X) и S(OAlk) такие, как определено в п.1,
указанные Q, R, АА₃ ^m, АА₄ ^m и R независимо могут находиться или в L-конфигурации или D-конфигурации, и любой один из числа Q, R, АА₃ ^m, АА₄ ^m и R необязательно может быть β-аминокислотой, аза-аминокислотой или β-аза-аминокислотой;
где, если пептидное производное содержит цистеин, указанное пептидное производное необязательно является димером,
при условии, что пептид не является QRFSR или CQRFSR.

4. Пептидное производное по п.1, которое представляет собой
C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFSR;
Y-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR;
Y-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR;
QRF-S(O-октаноил)-R;
CQRF-S(O-октаноил)-R;
CQRF-S(O-додеканоил)-R;
C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFSR;
C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFSR;
C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRF-S(O-октаноил)-R;
C-[dQ]-RF-S(O-октаноил)-[dR];
C-(-HN-(CH₂)₈-CO-)-QRFS-[dR];
[dC]-QRF-S(O-октаноил)-[dR];
[CQRFSR]₂;
QR-F[4F]-SR, где -F[4F]- представляет собой фенилаланин, у которого фенильная группа замещена в пара-положении атомом фтора;
QR-F[4Br]-SR, где -F[4Br]- представляет собой фенилаланин, у которого фенильная группа замещена в пара-положении атомом брома;
C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRFSR;
C-(-HN-(CH₂)₆-CO-)-QRF-S(O-октаноил)-R;
C(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)QRF-S(O-октаноил)-R;
C-(-HN-(CH₂)₁₂-CO-)-QRFS-dR;
где:
-S(-O-октаноил) означает серин, у которого гидроксильная группа замещена октаноильной группой,
-S(-О-додеканоил) означает серин, у которого гидроксильная группа замещена додеканоильной группой.

5. Пептидное производное по любому из пп.1-4, которое обладает ингибирующей активностью в отношении нейтральной эндопептидазы NEP и/или аминопептидазы AP-N.

6. Пептидное производное по п.2, которое обладает ингибирующей активностью в отношении NEP человека.

7. Пептидное производное по п.3, которое является двойным ингибитором нейтральной эндопептидазы NEP и аминопептидазы AP-N.

8. Фармацевтическая композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении человеческой нейтральной эндопептидазы NEP и/или аминопептидазы APN, содержащая эффективное количество по меньшей мере одного производного пептида по любому из пп.1-7 и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Способ лечения болезни или расстройства у субъекта, нуждающегося в таком лечении, при котором необходимо модулирование активности мембранной металло-эктопептидазы, включающий введение субъекту одного или более пептидного производного(ых) по любому из пп.1-7 в количестве, эффективном для лечении болезни или расстройства.

10. Способ по п.9, в котором мембранная металло-эктопептидаза представляет собой мембранную цинк-металлопептидазу.

11. Способ по п.9 или 10, в котором мембранная металло-эктопептидаза представляет собой NEP и/или AP-N.

12. Способ по любому из пп.9-11 для лечения болезни или расстройства, выбранного из группы, состоящей из боли, депрессивных расстройств, ослабленной социальной активности, связанной с сексуальностью, и нарушенного сексуального поведения.

13. Пептидное производное по любому из пп.1-7, для применения при лечении болезни или расстройства, при которых необходимо модулирование активности мембранной металло-эктопептидазы.

14. Пептидное производное по п.13, в котором мембранная металло-эктопептидаза представляет собой мембранную цинк-металлопептидазу.

15. Пептидное производное по п.13 или 14, в котором мембранная металло-эктопептидаза представляет собой NEP и/или AP-N.

16. Пептидное производное по любому из пп.13-15 для применения при лечении болезни или расстройства, выбранного из группы, включающей боль, депрессивные расстройства, ослабленную социальную активность, связанную с сексуальностью, и нарушенное сексуальное поведение.

17. Нуклеиновая кислота, которая содержит последовательность, кодирующую пептидное производное по любому из пп.1-7, когда указанное пептидное производное состоит из природных аминокислот.