Способ прогноза метастазирования рака яичников на основе набора генов длинных некодирующих РНК Российский патент 2024 года по МПК C12N15/00 C12Q1/68 

Настоящее изобретение относится к области фундаментальной медицины и касается способа прогноза метастазирования серозного рака яичников, далее РЯ, с помощью оценки уровня метилирования набора генов длинных некодирующих РНК (днРНК), а именно: MEGS, ZEB1-AS1, GAS5, ZNF667-AS1, SEMA3B-AS1 и KCNK15-AS1. Заявленный способ основан на анализе метилирования набора из шести генов днРНК и позволяет прогнозировать развитие метастазов РЯ с 98%-ой чувствительностью, 83%-ой специфичностью и высокой достоверностью (AUC=0.786). Для оценки прогноза метастазирования у больных РЯ с указанной точностью необходимо выявление метилирования не менее четырех из шести маркеров данного набора, в ДНК, выделенной из ткани яичников.

К РЯ относят ряд агрессивных гетерогенных опухолей с высокой степенью метастазирования и низкой частотой выявляемости. Согласно статистике, этот вид онкологии был диагностирован не менее чем у 13 тысяч женщин по итогам 2021 года, что, по последним оценкам экспертов в 2021 году в России, составило 6,3% от общего числа случаев рака. При этом смертность от РЯ, составила не менее 50%. Такая же ситуация, по данным статистики GLOBOCAN, по заболеваемости и смертности складывается и в большинстве других стран мира. Основная сложность терапии данного вида онкологии заключается в его гетерогенности, поздней выявляемое™ и бессимптомном протекании. Образование метастазов резко повышает вероятность летального исхода. Своевременное обнаружение метастазов, как и прогноз метастазирования, важно для определения стратегии терапии. Поиск маркеров диагностики и прогноза метастазирования - актуальная задача для борьбы с высокой смертностью от РЯ. Оценка процессов эпигенетической регуляции задействованных молекулярных путей позволяет открыть новые маркеры и терапевтические мишени для своевременной и успешной терапии онкологических заболеваний. Так, развитие методов и технологий геномного анализа позволило в значительной мере оценить перспективы некодирующих РНК (нкРНК), включая микроРНК и днРНК, в регуляции онкогенов и онкосупрессоров, и роль метилирования регуляторных генов нкРНК в злокачественной трансформации, что определяет их клинический потенциал.

Нами впервые показано статистически значимое (р<0.001) повышение уровня метилирования 6 генов днРНК (MEG3, ZNF667-AS1, ZEB1-AS1, GAS5, SEMA3B-AS1 и KCNK15-AS1) в опухолях больных РЯ с метастазами относительно опухолей больных без метастазов. На основе этих 6 генов (MEG3, ZNF667-AS1, ZEB1-AS1, GAS5, SEMA3B-AS1 и KCNK15-AS1) составлен новый набор маркеров и разработан способ прогноза метастазирования РЯ с высокой специфичностью и чувствительностью на основе биопсии или резекционного материала пациенток.

Ранее нами был разработан патент на изобретение [1], в котором представлена панель маркеров для диагностики РЯ, состоящая из 3 маркеров (SSTR5-AS1, KCNK15-AS1 и MAGI2-AS3), составленная на основе повышенного статуса метилирования генов в опухолях больных РЯ относительно тканей яичников от умерших без онкопатологии; рассмотрены возможности применения этих данных для диагностики РЯ. Ранее нами показано также повышение уровня метилирования гена ZNF667-AS1 в первичных опухолях больных РЯ при образовании метастазов РЯ [2]. Данные о различии уровней метилирования генов SEMA3B-AS1, KCNK15-AS1, ZEB1-AS1 и GAS5 в опухолях больных РЯ с метастазами и без метастазов отсутствуют в каких-либо источниках информации. Более того, данные о гиперметилировании гена ZEB1-AS1 в опухолях больных РЯ представлены впервые.

Согласно данным мировых исследований, ранее опубликован ряд работ по разработке способов прогнозирования развития метастазов РЯ. Так, была представлена панель маркеров из 10 белок-кодирующих генов (АЕВР1, COL11A1, COL5A1, COL6A2, LOX, POSTN, SNAI2, THBS2, TIMP3, VCAN), позволяющая диагностировать РЯ, а также прогнозировать его течение по экспрессии этих генов, вплоть до образования метастазов. У этой модели, тем не менее, есть существенный недостаток, который заключается в отсутствии данных о фактической эффективности данной модели [3].

В другом исследовании представлены 11 белковых маркеров (СА125, hK4, hK5, hK6, hK7, hK8, hK10, hK11, hK13, hK14, B7-H4), выделенных из парных образцов ткани пациентов РЯ и индивидов без онкопатологии в анамнезе. В ходе исследований была составлена панель из 5 белковых маркеров с высокой эффективностью прогноза благоприятного ответа на химиотерапию. При этом значение AUC при проведении ROC-анализа составило 0,91 с высокими показателями чувствительности и специфичности (0,87, 0,97). Однако для данной панели не рассмотрен прогноз метастазирования РЯ [4].

Также обращает на себя внимание панель маркеров, полученная по результатам исследования сыворотки, выделенной из крови больных РЯ. Согласно результатам исследования, ученым удалось составить панель маркеров из 4 микроРНК (miR-7, miR-429, miR-25, miR-93) с высокой точностью диагностики РЯ [5]. Панель построена по данным уровня экспрессии этих миРНК у здоровых и больных женщин. Авторы не касаются оценки прогноза метастазирования РЯ.

В исследовании WO 2016/135168 авторами представлено две панели маркеров, основанных на определении статуса метилирования и/или уровня экспрессии ряда генов, кодирующих белки и микроРНК. Одна из панелей имеет высокие (0,89) показатели специфичности и чувствительности диагностики и/или возможной прогрессии любого рака, в частности РЯ [6]. При этом, методология патента не позволяет оценить метастатический потенциал опухоли у пациента.

Другой патент [7] рассматривает в качестве метода оценки прогрессии опухоли яичников профиль изменения метилирования ряда генов, полученных методом полногеномного секвенирования. Однако проект предлагает большой спектр генов, не позволяющий оценить роль каждого гена в патогенезе РЯ, а также не позволяет оценить прогноз течения РЯ.

В качестве ближайшего аналога рассматривается наш более ранний патент RU 2666911 C2, 2016, позволяющий делать прогноз метастазирования РЯ на основе выявления метилирования 3 генов микроРНК из 5 (miR-137, miR-193a, miR-1258, miR-203, miR-127) [8]. Предыдущее исследование позволило определить ключевые элементы одной группы некодирующих РНК, тогда как настоящее исследование позволяет оценить новые маркеры уже другой группы некодирующих РНК. Чувствительность и специфичность этого набора маркеров составили 94% и 81%, соответственно. Однако оценка статуса метилирования генов микроРНК была выполнена в группе из 37 образцов неметастазирующего РЯ и только 17 образцов метастазирующего РЯ. В настоящей заявке способ прогноза метастазирования РЯ основан на исследовании 38 образцов опухолей неметастазирующего рака яичников и 81 образец метастазирующего, что делает результат прогноза более достоверным.

Задача заявляемого изобретения - расширить арсенал клинически удобных методов прогноза метастазирования РЯ с помощью применения новых маркеров на основе группы генов днРНК при использовании малых количеств ДНК.

Задача решена путем:

- разработки заявляемого способа прогноза метастазирования РЯ на основе анализа уровня метилирования набора из шести генов днРНК (MEG3, ZNF667-AS1, ZEB1-AS1, GAS5, SEMA3B-AS1 и KCNK15-AS1) в биопсийных или резекционных образцах опухолей больных РЯ и позволяющего оценить прогноз развития метастазов с высокой точностью, с помощью выявления метилирования четырех или более генов из этого набора.

Прогноз метастазирования РЯ осуществляют по методу:

Собирают образцы ткани опухоли яичников и прилежащей, гистологически неизмененной ткани у лиц, с выявленным онкологическим заболеванием. Выделение и очистку ДНК из образцов ткани яичников проводят методом фенол-хлороформенной экстракции. Качество и точную концентрацию ДНК определяют спектрофотометрически по соотношению оптической плотности при длинах волн 260 и 280 нм. Анализ уровня метилирования генов днРНК проводят с применением бисульфитной конверсии ДНК и количественной метил-специфичной ПЦР (qMSP) с детекцией в реальном времени, как описано в работе [9].

Для оценки значимости различий применяют непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия считают значимыми при р<0.05. При оценке значимости различий в уровне метилирования учитывают пороговый уровень, рассчитанный на основании данных по уровню метилирования каждого гена в образцах РЯ [10]. Затем по этим значениям отбирают образцы опухоли РЯ с уровнем метилирования выше порога, рассчитанного для каждого гена. Далее сравнивают образцы опухолей от больных с метастазами и без метастазов. И методом ROC-анализа определяют набор маркеров, позволяющих наиболее значимо различить пациентов с метастазами и без метастазов. С помощью ROC-анализа рассчитывают также специфичность, чувствительность и значение AUC (Area Under Curve) для набора маркеров и для характеристики заявляемого способа прогноза метастазирования больных РЯ. Расчеты проводят в системе для статистического анализа данных IBM SPSS Statistics 22.

Пример 1. Анализ уровня метилирования шести генов днРНК MEG3, ZNF667-AS1, ZEB1-AS1, GAS5, SEMA3B-AS1 и KCNK15-AS1, используемых в заявляемом способе прогноза метастазирования РЯ.

Статус метилирования каждого гена оценивают с использованием двух пар праймеров, специфичных как к метилированному, так и к неметилированному аллелю (Табл. 1). Используют набор реактивов «qPCRmix-HS SYBR» по протоколу фирмы Евроген. Амплификацию проводят в системе Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System (США) в соответствии с прилагаемым к прибору протоколом. Полноту конверсии ДНК определяют с помощью контрольного локуса АСТВ с использованием олигонуклеотидов специфичных к неконвертированной матрице [9]. Для сравнительного анализа эффективности амплификации также применяют локус АСТВ с использованием олигонуклеотидов, специфичных к конвертированной матрице. В качестве контролей для неметилированных аллелей используют коммерческий препарат ДНК #G1471 (Promega, США). В качестве позитивного контроля 100%-ого метилирования используют коммерческий препарат ДНК #SD1131 (Thermo Scientific, США). Соотношение уровней метилирования и их значимость оценивают с применением непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считают значимыми при p<0.001. Уровень метилирования шести генов днРНК MEG3, ZNF667-AS1, ZEB1-AS1, GAS5, SEMA3B-AS1 и KCNK15-AS1 определен в 81 образце РЯ с метастазами и в 38 образцах РЯ без метастазов (в Табл. 2 приводится пример качественной и количественной оценки уровня статуса и уровня метилирования соответственно).

Пример 2. Оценка различий статуса и уровня метилирования шести генов днРНК MEG3, ZNF667-AS1, ZEB1-AS1, GAS5, SEMA3B-AS1 и KCNK15-AS1 в образцах опухолей больных с метастазами и без.

Для выявления различий гиперметилирования исследуемых генов днРНК MEG3, ZNF667-AS1, ZEB1-AS1, GAS5, SEMA3B-AS1 и KCNK15-AS1 в опухоли с метастазами и без них был выбран пороговый уровень, который рассчитывался для каждого гена на основании данных, полученных для образцов без метастазов (Табл. 2). Пороговый уровень равен N(mean)+2SD, где N(mean) - средний уровень метилирования в выборке (образцы без метастазов), SD - стандартное отклонение [10].

Пример 3. Пример осуществления заявляемого способа прогноза метастазирования у больных РЯ.

Прогноз метастазирования осуществляется по числу выявленных метилированных генов из 6 генов набора у каждой пациентки (Табл. 2, 3).

Пример 4. Оценка чувствительности и специфичности заявляемого способа прогноза образования метастазов РЯ на основе набора маркеров (MEG3, ZNF667-AS1, ZEB1-AS1, GAS5, SEMA3B-AS1 и KCNK15-AS1) с применением ROC-анализа.

Важным свойством заявляемого способа для прогноза образования метастазов при РЯ является высокая специфичность относительно ложно-положительных случаев и высокая чувствительность. С учетом данных по статусу метилирования шести генов (MEG3, ZNF667-AS1, ZEB1-AS1, GAS5, SEMA3B-AS1 и KCNK15-AS1) в образцах пациенток с РЯ, из которых 81 образец имеет метастазы, а 38 не имеет, проведен анализ характеристик набора маркеров методом ROC-анализа, как показано на Фигуре 1. Согласно результатам ROC-анализа, чувствительность и специфичность заявляемого способа прогноза образования метастазов при РЯ составили 97.8% и 83,3%, соответственно, а величина AUC (Area Under the ROC Curve) составила 0,786 (-0,8), что считается показателем высокой точности для набора маркеров. Таким образом, заявляемый способ позволяет осуществить прогноз образования метастазов у больных РЯ с 98%-ой чувствительностью и 83%-ой специфичностью. Согласно параметрам, оценивающим набор маркеров (в частности, критерий >0,2), необходимо и достаточно выявления метилирования четырех любых маркерных генов из шести маркеров данного набора для прогноза возникновения метастазов у больной РЯ с указанной точностью (пример прогноза в Табл. 3).

Заявляемый способ прогноза образования метастазов у больных РЯ характеризуются тем, что

- Позволяет прогнозировать развитие метастазов у больных РЯ с высокой чувствительностью (98%) и специфичностью (83%) при величине AUC=0.8. Рассмотренный ближайший аналог (RU 2666911 C2, 2018) [8] позволяет прогнозировать метастазирование РЯ с чувствительностью 94% и специфичностью 81%, что несколько ниже показателей нового предлагаемого способа (98% и 83%). А главное, оценка статуса метилирования генов микроРНК в патенте (RU 2666911 С2, 2018) была выполнена в группе из 37 образцов неметастазирующего РЯ и только 17 образцов метастазирующего РЯ [8]. Заявляемый способ прогноза метастазирования РЯ основан на исследовании 38 образцов опухолей неметастазирующего РЯ и 81 образца метастазирующего РЯ, что делает результат прогноза более достоверным.

Цитированные источники научно-технической информации:

1. RU 2779550 C1 (2022). Бурденный A.M. и др. «Способ для диагностирования рака яичников на основе набора генов длинных некодирующих РНК».

2. Бурдённый A.M., Филиппова Е.А., Иванова Н.А., Лукина С.С., Пронина И.В.. Логинов В.И., Фридман М.В., Казубская Т.П., Уткин Д.О., Брага Э.А., Кушлинский Н.Е. Гиперметилирование генов новых длинных некодирующих РНК в опухолях яичников и метастазах: двойственный эффект. Бюлл. Эксп. Биол. и Мед. 2021. 171(3). 353-358.

3. Cheon DJ, Orsulic S. Ten-gene biomarker panel: a new hope for ovarian cancer? Biomark Med. 2014; 8(4):523-6. doi: 10.2217/bmm.l4.16. PMID: 24796616; PMCID: PMC4330556.

4. Zheng Y, Katsaros D, Shan SJ, de la Longrais IR, Porpiglia M, Scorilas A, Kim NW, Wolfert RL, Simon I, Li L, Feng Z, Diamandis EP. A multiparametric panel for ovarian cancer diagnosis, prognosis, and response to chemotherapy. Clin Cancer Res. 2007 Dec 1; 13(23):6984-92. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-07-1409. PMID: 18056174.

5. Meng X, Joosse SA, Müller V, Trillsch F, Milde-Langosch K, Manner S, Geffken M, Pantel K, Schwarzenbach H. Diagnostic and prognostic potential of serum miR-7, miR-16, miR-25, miR-93, miR-182, miR-376a and miR-429 in ovarian cancer patients. Br J Cancer. 2015 Nov 3; 113(9):1358-66. doi: 10.1038/bjc.2015.340. Epub 2015 Sep 22. PMID: 26393886; PMCID: PMC4815782.

6. WO 2016/135168 2016.09.01 (2016). Burwinkel Barbara et. al. Biomarker panel for the detection of cancer.

7. NL №2511408 Камалакаран С. et. al. «Способ анализа нарушений, связанных с раком яичников»

8. RU 2666911 C2 (2018). Логинов В.И. и др. «Способ для прогнозирования метастазирования рака яичников на основе группы генов микроРНК».

9. Hattermann K., Mehdorn Н.М., Mentlein R., Schultka S., Held-Feindt J. A methylation-specific and SYBR-green-based quantitative polymerase chain reaction technique for 06-methylguanine DNA methyltransferase promoter methylation analysis. Analytical Biochemistry. 2008. Vol.377, N 1, 62-71. doi 10.1016/j.ab.2008.03.014. PMID: 18384736.

10. Lehmann U, Berg-Ribbe I, Wingen LU, Brakensiek K, Becker T, Klempnauer J, Schlegelberger B, Kreipe H, Flemming P. Distinct methylation patterns of benign and malignant liver tumors revealed by quantitative methylation profiling. Clin Cancer Res. 2005;ll(10):3654-60. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-04-2462. PMID: 1589756.

Изобретение относится к области биомедицины, в частности молекулярной и клинической онкологии. Предложен способ прогноза метастазирования рака яичников на основе шести генов длинных некодирующих РНК MEG3, ZNF667-AS1, ZEB1-AS1, GAS5, SEMA3B-AS1 и KCNK15-AS1 путем выявления метилирования не менее четырех маркеров. Заявляемый способ позволяет осуществить прогноз образования метастазов при раке яичников с высокой чувствительностью и специфичностью. 1 ил., 3 табл., 3 пр.

Способ прогноза метастазирования рака яичников на основе шести генов длинных некодирующих РНК MEG3, ZNF667-AS1, ZEB1-AS1, GAS5, SEMA3B-AS1 и KCNK15-AS1 путем выявления метилирования не менее четырех из шести маркеров набора.